Summary
Este protocolo ilustra as etapas consecutivas importantes, necessárias para avaliar a pertinência de monitoramento parâmetro de vitalidade e os processos de reparação do DNA em reviving esporos de Bacillus subtilis após o tratamento com plasma de baixa pressão de tracking proteínas através do tempo-resolvido microscopia confocal e microscopia eletrônica de reparo de DNA marcado com fluorescência.
Abstract
Esterilização plasma é uma alternativa promissora para os métodos de esterilização convencionais para fins de exploração espacial e industrial, clínica. Descargas de baixa pressão plasma (LPP) contenham um amplo espectro de espécies ativas, que levam a inativação microbiana rápida. Para estudar a eficiência e a mecanismos de esterilização por LPP, usamos os esporos do Bacillus subtilis organismo teste por causa de sua extraordinária resistência contra procedimentos de esterilização convencionais. Descrevemos a produção de monocamadas de esporos de b. subtilis , o processo de esterilização por plasma de baixa pressão em um reator de plasma indutivo duplo, a caracterização da morfologia dos esporos usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e o análise da germinação e consequência de esporos por microscopia de células vivas. Um alvo principal das espécies de plasma é material genómico (DNA) e reparo de lesões de DNA induzida por plasma sobre avivamento esporo é crucial para a sobrevivência do organismo. Aqui, podemos estudar a capacidade de germinação dos esporos e o papel do DNA reparo durante a germinação dos esporos e consequência natural após o tratamento com LPP rastreando fluorescente etiquetado DNA reparo proteínas (RecA) com microscopia de fluorescência confocal tempo-resolvido. Tratados e monocamadas de esporos não tratados são ativadas para a germinação e visualizadas com um microscópio invertido confocal célula viva ao longo do tempo a seguir a reação dos esporos individuais. Nossas observações revelam que a fração de germinação e superando os esporos é dependente da duração do LPP-tratamento, atingindo um mínimo após 120 s. RecA-YFP fluorescência (proteína de fluorescência amarela) foi detectada apenas em alguns esporos e desenvolvida em toda a superando as células com uma ligeira elevação no LPP-tratados esporos. Além disso, algumas das bactérias vegetativas derivado LPP-tratados esporos mostrou um aumento no citoplasma e tendiam a lyse. Os métodos descritos para análise de esporos individuais podem ser exemplares para o estudo de outros aspectos da germinação de esporos e consequência.
Introduction
Dos principais objetivos da exploração espacial é a busca de assinaturas de formas de vida e biomoléculas em outros planetas e luas em nosso sistema solar. A transferência de microorganismos ou biomoléculas de origem terrestre, de áreas críticas de exploração é de risco especial para o impacto do desenvolvimento e integridade das missões de deteção de vida em planetas como Marte e Europa1. As diretrizes internacionais de proteção planetária, estabelecida pelo Comité de pesquisa espacial (sistema) em 1967, impor normas rigorosas em missões tripuladas e robóticas para outros planetas, suas luas, asteroides e outros corpos celestes e regular o limpeza e esterilização de uma nave espacial e componentes de hardware crítico prévios para lançar a fim de eliminar a contaminação de microorganismos terrestres e evitar contaminação cruzada de corpos celestes2. Na última década, a aplicação de plasmas não térmicos ganhou ampla atenção na pesquisa biomédica e nutricional, bem como em aplicações de voo espacial3,4,5. Esterilização plasma é uma alternativa promissora aos métodos convencionais de esterilização que oferece rápida e eficiente de inactivação microbiana6, sendo suave para sensíveis e materiais lábeis de calor. Descargas de plasma contêm uma mistura de agentes reativos como os radicais livres, partículas carregadas, neutro/excitado átomos fótons no ultravioleta (UV) e espectro ultravioleta de vácuo (VUV) que levam a inativação microbiana rápida3. Neste estudo, utilizamos o plasma de baixa pressão gerada pelo duplo plasma indutivo de baixa pressão (DICP) fonte7,8 para inactivar endósporos de Bacillus subtilis distribuídos na superfície de ensaio de vidro.
Bactérias gram-positivas da família bacilos são amplamente distribuídas em habitats naturais do solo, sedimentos e ar, bem como em ambientes incomuns, tais como instalações de sala limpa e a estação espacial internacional9,10 ,11. A característica mais distinta do gênero Bacillus é a capacidade de formar altamente resistentes endósporos dormentes (doravante referidos como esporos) para sobreviver a condições desfavoráveis, tais como esgotamento de nutrientes12. Os esporos são geralmente muito mais resistentes do que suas contrapartes de célula vegetativa de uma variedade de tratamentos e estresses ambientais, incluindo o calor, UV, radiação gama, dessecação, ruptura mecânica e produtos químicos tóxicos, tais como oxidantes fortes ou agentes de mudança de pH (revistos em referências13,14) e, portanto, são objetos ideais para testar a eficiência dos métodos de inativação microbiana. Desde que o DNA genômico é um alvo principal do tratamento de bactérias15,16, o reparo de lesões de DNA induzida por plasma plasma (por exemplo, quebras de dupla cadeia de DNA) em cima do esporo revival é crucial para a sobrevivência de bactérias13, 17.
Assim, estudamos a capacidade de germinação dos esporos e o papel do reparo de DNA durante a germinação dos esporos e consequência natural após ter tratado os esporos com plasma de argônio de baixa pressão por seguintes esporos individuais e reparar sua expressão de DNA marcado com fluorescência proteína RecA com microscopia de fluorescência confocal tempo-resolvido. Nós damos uma instrução passo a passo da preparação de esporos de b. subtilis em monocamadas para alcançar resultados reprodutíveis, o tratamento de monocamadas de esporo com plasma de baixa pressão para esterilização, a preparação de esporos de plasma Tratado para avaliação ultraestrutural usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e análise de microscopia célula viva ao nível dos esporos individuais em concerto com o monitoramento do DNA ativo reparar processos que ocorrem dentro da célula em resposta a um tratamento de plasma.
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Protocol
1. produção de esporos de bacillus subtilis e purificação
- Para a produção de esporos, transferir uma cultura da noite 5 mL das respectivas estirpe de b. subtilis , suplementada com antibióticos apropriados, para 200 mL dose dupla Schaeffer esporulação meio líquido (por litro caldo nutriente de 16G, KCl 2 g, 0,5 g de MgSO 4* 7 H2O, 2ml 1 M Ca (NO3)2, 2 mL 0,1 M MnCl2 * • 4 H2O, 2ml 1 mM Filipa4, 2 mL de glicose 50% (p/v)18) e cultivá-lo com aeração vigorosa a 37 ° C por 72 h ou até > 95% da cultura tem esporulada. Os esporos dos seguintes estirpes são utilizados: b. subtilis PY79 (tipo selvagem) b. subtilis PY79ΔrecA:: neo (deficiência de proteína de reparo do DNA RecA) PY79 de b. subtilis recA-yfp:: gato (RecA fundido com amarelo proteína fluorescente [YFP]19).
- Colheita de esporos por centrifugação por 15 min a 3.000 x g em tubos de 50 mL e purificar as amostras através de etapas de lavagem repetida (até 15 vezes) usando água destilada estéril H2O e cheque para o status de pureza e germinação por microscopia de contraste de fase. Garantir que as suspensões de esporos consistem fora de fase-brilhante esporos (> 99%) e são livres das células vegetativas (hastes), esporos germinados (aparência preto / cinza) e os restos celulares, caso contrário mais experimentos de microscopia podem ser perturbados. Lave a amostra até pureza desejada seja alcançada.
- Determinado o título de esporos por chapeamento fora 50 µ l de 10 vezes diluições em série na LB-ágar (ou seja: uso 30 µ l da amostra + 270 µ l água estéril para uma 01:10 diluição. Tome 30 µ l da diluição específica a 270 µ l H2O para uma diluição de 1: 100 e assim por diante) para calcular o UFC (unidades formadoras) e incubar as placas a 37 ° C durante a noite. Após a determinação do UFC, ajuste a amostra de 109 esporos por mL, concentrando ou diluindo com água estéril.
2. amostra preparação de aerossol-depositado Bacillus subtilis Spores
Nota: Acumulação e sobreposição de esporos podem levar a efeitos de sombreamento durante o tratamento, em última análise, resultando em cinética de inativação falsificados. Para minimizar esse problema, prepare amostras de esporos por uma técnica de deposição de aerossol20. Brevemente, controle o bocal do dois-substância de alta precisão com um temporizador elétrico que regula a taxa de transferência de líquidos em concerto com o fluxo de gás pressurizado portador (aqui N2). Disperse a amostra de líquido injetada através da saída do bocal usando o fluxo de gás nitrogênio.
- Coloque um portador de amostra em forma de slides microscópicos esterilizados (para cinética de sobrevivência) ou redondo lamelas de 25 mm (para o seguimento fluorescente de reparação do ADN processos/cLSM; laser confocal, microscopia eletrônica de varredura) dentro o aerossol accionado electricamente, unidade de pulverização em alinhamento com o bico. A concentração de esporos usado precisa corresponder a uma cem vezes da concentração final desejada.
- Transferir 1 mL da cultura de esporos para entrada de fluido do bocal e iniciar o processo de pulverização de 0.1 s a uma pressão de 1,3 bar. A suspensão de esporos pulverizado (1 x 107) forma uma película fina do slide microscópicas que seca rapidamente em segundos para formar uma monocamada de esporo uniformemente distribuídos. Armazene os portadores de amostra tratada em um recipiente estéril à temperatura ambiente.
3. baixa pressão tratamento de Plasma
- Preparar o sistema de plasma para o tratamento de amostras biológicas e operar o sistema em 5 Pa com plasma de argônio em 500 W por 5 min. Por isso, todas as superfícies do sistema são limpos e aquecidas. Isto reduz a degola de moléculas do ar ambiente, ou seja, nitrogênio, oxigênio e água, enquanto o sistema de ventilação. Após o pré-tratamento do sistema, a câmara de ventilação e coloque as amostras cuidadosamente no centro do vaso reator com a ajuda de prateleiras de vidro.
- Use pelo menos três repetições biológicas. Fechar a câmara e evacuar abaixo 2 pa. em seguida, preencher o gás de processo na câmara. Regular a pressão no sistema para 5 PA.
- Após o tempo definido de processo, desligue a alimentação de energia e gás e cuidadosamente desafogar o sistema para evitar soprando as amostras do porta-amostra. Após a ventilação, retirar as amostras e coloque as amostras para o próximo parâmetro no sistema. Para não-tratados com plasma controles expõem amostras a vácuo só (5 Pa) na presença do gás processo equivalente para o tempo mais longo de plasma aplicada.
4. recuperação e avaliação da sobrevivência de esporos
- Preparar uma solução de autoclavado 10% do acetato de polyvinyl (PVA) e cobrir o transportador de amostra cuidadosamente com aproximadamente 500 µ l e deixe-os secar ao ar por 4 h. tira a camada de PVA secas (agora contendo a amostra de esporos) usando Pinças esterilizadas e transferi-lo para um 2 mL tubo de reação. Adicionar 1 mL de água estéril para o tubo e dissolver a camada PVA via num Vortex. Este procedimento leva a > 95% de recuperação de esporos e não afeta sua capacidade de germinação21.
- Serialmente, dilua a amostra em 01:10 em água estéril em uma placa de 96 poços (ou seja, 270 µ l estéril H2O + diluição de amostra/ex 30 µ l). Placa de 50 µ l de cada diluição em ágar nutriente do caldo lisogenia (LB), incubar as placas a 37 ° C durante a noite e enumerar o número de colônias crescidas (CFU).
5. ao vivo celular microscopia e acompanhamento dos processos de reparação do DNA na germinação de esporos
- Para experimentos de germinação, preparar uma 1 mm espessura 1,5% LB-ágar almofada, fervendo a 700 µ l médio e pipeta-a em uma placa de Petri estéril de microscopia. Depois de 10 min, cortar um 8 x 8 mm x 1 almofada mm LB-ágar com um bisturi estéril e transferir o ágar cuidadosamente em cima de monocamadas de esporos que estão descansando em lamelas de vidro de 25mm.
Nota: Este passo é crucial para visualização de esporos individuais e permitir seguir sua reação, para a ativação de germinação induzida por agar nutriente. Assim, o LB-ágar serve dois propósitos, (1) para corrigir os esporos na superfície, que evita a relocalization ao longo da superfície e fora de foco ótico e (2) para ativar o esporo para a germinação. - Depois de cobrir a amostra com ágar-ágar, transferir a lamela de vidro rapidamente em uma câmara de imagens e microscópio as amostras com um microscópio confocal de varredura a laser automatizado com sistema ótico invertido usando um 63 X / 1.3 avião apocromático objectivo de imersão de óleo.
-
Realizar imagens de fluorescência (YFP) com uma excitação de 514 nm e emissão de comprimento de onda pode ser detectado entre 520 e 560 nm.
- Gravar imagens do brilhante-campo no modo usando um dos multiplicadores do foto (caminho de luz) de verificação.
- Gravar o lapso de tempo série com uma potência de laser de 2,6% e definir a abertura confocal para 5 unidades arejadas e com uma frequência de amostra de 1 frame por 30 s de 0 h às 5 h, dependendo da experiência. É de particular interesse que altas doses de monocromática a laser iluminação em 514 nm completamente inibir a germinação (Figura 1A, B).
- Mantenha as amostras a 37 ° C (umidade do ar ambiente) em uma fase de aquecimento durante todo o processo de geração de imagens. Use pelo menos três réplicas biológicas para cada condição. Em caso de agregação de esporos, distribuição de várias camadas de esporos ou a contaminação por partículas de poeira, bloqueio do tratamento plasma ("sombrear") pode ocorrer e permitir a germinação dos esporos sombreados (Figura 1C, D).
Figura 1: possíveis problemas observaram durante a microscopia de fluorescência confocal célula viva de plasma Tratado esporos. (A, B) Inibição da germinação dos esporos por altas doses de monocromático (514 nm) iluminação a laser. (A) visão geral (3 x 3 quadros costurados) de b. subtilis (LAS72, RecA-YFP) esporos 180 min após o início da germinação. O quadro no meio foi exposto em intervalos de 30 s a altas doses de luz de laser (514 nm, potência do laser 70%), Considerando que as regiões circundantes (= quadros) não foram iluminadas (imagem mesclada de campo claro canal e RecA-YFP fluorescência; ordenou estruturas foram causados pelo uso de 35 milímetros de imagens de pratos com uma grade impressa 500 µm). (B) demonstra um 4 X vista ampliada da fronteira entre a região iluminada e não-iluminado, mostrando que os esporos, que foram expostos a altas doses de iluminação laser monocromática não germinam e crescem, Considerando que esporos em regiões não-iluminado recuperar totalmente para bactérias vegetativas expressando fluorescência RecA-YFP (sinal verde). (C, D) Esporos coberto por partículas de contaminantes ou várias camadas de esporos (setas) parece proteger esporos subjacentes de inactivação pelo tratamento de plasma e permitir a sua germinação e a consequência ("efeito de sombreamento"). (C) esporos foram tratados por plasma para 60 s e imagem 180 min após o início da germinação ou em (D) para 120 s e fotografada após 240 min. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. microscopia eletrônica (SEM)
- Use microscopia eletrônica para fornecer informação ultraestrutural sobre a morfologia da superfície de esporos de plasma Tratado em comparação com controles não tratados. Casaco de monocamadas de esporos secos em lamelas com ouro-paládio (3 nm) usando uma camada por pulverização catódica. Use um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo de imagem as amostras, operadas na tensão de aceleração 5 kV incluindo um detector de elétrons de secundária na lente para revelar o contraste de topografia.
7. análise de dados
- Determine a sobrevivência de esporos do quociente N/N0, onde N é a média de UFC das amostras tratadas e N0 é a média CFU de controles de vácuo não tratadas. Plotar a inativação de esporos por tratamento de plasma de argônio em função do tempo (em segundos). Expressar todos os dados como médias e desvios-padrão (n = 3).
- Analise imagens obtidas por imagens de células vivas, usando o software de imagem. Quantificar a percentagem de germinação de esporos e superando após tratamento de plasma, contagem de esporos em quadros representativos no início do experimento, bem como após 4 h. Para determinação de significância em ensaios de sobrevivência de esporos, use ANOVA One-Way-testes (análise de variância) com software estatístico). Valores de P < 0.05 são considerados como estatisticamente significativo.
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Representative Results
Sobrevivência dos tratados com plasma b. subtilis esporos
Tratamento de plasma de esporos do b. subtilis utilizadas neste estudo show uma diminuição na sobrevivência com o aumento da duração do tratamento a plasma (Figura 2). Esporos da estirpe expressando o recA-gene fundido a YFP mostrou curvas de sobrevivência semelhante a esporos da estirpe selvagem tipo, indicando que a modificação genética não tem nenhum efeito significativo sobre a vitalidade bacteriana. Esporos da estirpe RecA-deficientes apresentam uma maior sensibilidade em relação a tratamento de plasma em comparação com esporos da estirpe selvagem tipo, demonstrando que a presença do gene RecA é reduzindo a perda induzida por plasma de vitalidade. Curto especialmente tratamento de plasma de 15 s (P <0,003) e 30 s (P < 0,004) causar uma diminuição significativa da vitalidade em estirpes de RecA-deficiente em comparação com o tipo selvagem e RecA-YFP estirpes. Após 90 s de tratamento de plasma, a vitalidade de todas as estirpes é reduzido em aproximadamente três ordens de magnitude.
Figura 2: Sobrevivência de b. subtilis esporos de estirpes diferentes após o tratamento com plasma de argônio low-pressure. Sobrevivência (CFU média de plasma Tratado esporos/média CFU de vácuo esporos tratados; barras de erro representam o desvio padrão) é plotada contra a duração do tratamento de plasma. PY79 (tipo selvagem; círculos fechados), LAS72 (RecA-YFP; círculos cinzento) e LAS24 (ΔrecA; abrir círculos). A análise estatística mostrou não houve diferença significativa na sobrevivência de esporos entre PY79 (sem modificações RecA) e LAS72 (RecA-YFP-fusion).
Análise ultraestrutural de esporos tratados com plasma por SEM
Para ter uma ideia do impacto morfológica do plasma tratamento sobre os esporos, microscopia eletrônica (SEM) foi usado para analisar a morfologia superficial dos esporos de plasma Tratado em comparação com esporos de vácuo-tratadas (controle). A superfície exterior de esporos de b. subtilis revelar características longitudinais cume-como estruturas que são constantemente visíveis em todos os tratados e não tratados esporos (Figura 3). Tratamento de plasma até 30 s induz sem alterações significativas da morfologia superficial dos esporos em comparação com o controle (Figura 3A-C). Aumentando a duração do tratamento de plasma (60-240 s) leva a uma superfície mais granular de esporos (Figura 3D-F) e pequenas rachaduras e fissuras podem ser observadas em esporos tratados para 120 ou 240 s. Além disso, pequenos glóbulos surgem nas superfícies de esporos (120 240 tratamentos de s, Figura 3E, Fe s), que é causada por material lançado do casaco, córtex ou do interior do núcleo22. Esses glóbulos de cobrem o spore inteiro e podem ser encontrados nas estruturas em forma de veia, bem como sobre superfícies intermediárias.
Figura 3: SEM de esporos de b. subtilis (LAS72, RecA-YFP) pulverizado sobre as lamelas de vidro após o tratamento de plasma de baixa pressão. Esporos expostos ao vácuo somente e não para plasma (controle) são mostrados em (A). (B-F) Esporos que foram tratados por plasma com o aumento da duração (15, 30, 60, 120 e 240 s). Esporos que foram tratados com plasma 60 s ou aparecem mais mais granular em sua superfície de controle esporos ou esporos que foram tratados plasma para 15 e 30 s. rachaduras e fissuras (setas brancas) são visíveis na superfície dos esporos tratados plasma para 120 ou 240 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Viver a microscopia célula de plasma-Tratado de b. subtilis spores
Microscopia de célula viva de reviver esporos de cepas de b. subtilis expressando a proteína de reparo marcado com fluorescência RecA (RecA-YFP) é realizada a fim de analisar a capacidade de germinação e a expressão de RecA-YFP de esporos individuais em resposta ao tratamento de plasma. Aqui, usamos o tempo-resolvido microscopia de varredura a laser confocal para acompanhar a germinação, desenvolvimento e progressão em estado vegetativo de esporos tratados com plasma (Figura 4) em relação a problemas potencialmente conhecidos, por exemplo, sombreamento efeitos ou o inibição da germinação por altas doses de iluminação laser monocromática (Figura 1). Esporos expostos ao vácuo única (controle, Figura 4,A-C), apresentam alguns sinais fluorescentes durante Estados iniciais do revival de esporos (0 - 65 min, não mostrado). Observa-se um aumento na intensidade de fluorescência, muito provavelmente devido ao acúmulo de RecA-YFP, em ≥ 65 min quando as células vegetativas são formadas e primeiras células começam a dividir. Todas essas células do porto um sinal de fluorescência acumulado pelo menos uma posição dentro de cada célula. Quase todos os esporos (98 ± 2%; 589 ± 14, n = 4) tratados com vácuo, como um controle germinar e desenvolver uma morfologia celular em forma de haste com um comprimento bastante uniforme de células individuais (Figura 4B-C). Em contraste com esporos em controles de vácuo, esporos trataram por 15 s com plasma já mostram uma capacidade reduzida de germinação de menos de 75 ± 4% (197 ± 8 esporos, n = 3, Figura 4D-F), indicando que o tratamento de plasma induz dano em esporos dormentes, que impede a germinação. Além disso, a morfologia das células de superando é diferente da morfologia das células em controles. As células crescem também em hastes extensivamente longas (mais do que em relação ao controle) ou permanecem pequenas e ficar com o casaco de esporos (Figura 4G-eu). Além disso, mais células alongadas lyse com o aumento do tamanho da célula (cabeças de seta branca, Figura 4F). Sinais de fluorescência de RecA-YFP dentro das células parecem ser ligeiramente aumentada em comparação com os sinais em células de controle (Figura 4C, F), mas não houve diferença significativa pode ser observada (não mostrada). Esporos que eram plasma trataram por 30 s germinar até 25 ± 6% (99 ± 4 esporos, n = 3) e as células vegetativas são notavelmente atrasadas em crescimento em comparação com esporos de controle e esporos após 15 s de plasma-tratamento. As células vegetativas são bastante pequenas e em forma de haste, mas variam em comprimento (Figura 4G-eu). No entanto, as células de todos os tamanhos podem lisar durante os tempos de incubação mais como visto para amostras após 15 s de plasma-tratamento. Após 60 s de plasma-tratamento inferior a 2% ± 2% (8 ± 8 esporos, n = 3) esporos são capazes de formar as células vegetativas (Figura 4J-L). Esporos que são plasma-tratada para 90, 120 ou 240 s pode ser analisado, mas eles mostram nenhuma consequência ou qualquer mudança nos níveis de fluorescência de RecA-YFP (não mostrado).
Figura 4: Confocal-varredura a laser viver microscopia célula de esporos de b. subtilis de uma estirpe expressando RecA-YFP após tratamento de plasma e o início da germinação. Os esporos foram seguidos ao longo do tempo (uma imagem por 30 s) e são mostradas imagens para pontos de tempo 0, 2 e 4 h. (A-C) Esporos tratadocom com vácuo somente e não com plasma (controle) germinam e crescem para fora para as células vegetativas (B) e entram na fase de crescimento exponencial (C). (D-L) Esporos tratados para duração diferente com o plasma de baixa pressão argônio apresentaram diferenças significativas em sua consequência em comparação com os esporos do controle (veja texto para detalhes). Tratamento de s (D-F), 15 (cabeças de seta branca representam as células vegetativas, que recentemente lysed), (G-eu) 30 s tratamento (cabeças de seta preta Visualizar as células vegetativas, que eram pequenas e ficar com o casaco de esporos) e tratamento de s (J-L), 60 depois 0 h, 2 h e 4 h tempo de recuperação de esporos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Esterilização de superfícies utilizando baixa temperatura, baixa pressão plasma é uma alternativa promissora para procedimentos de esterilização bastante convencional, tais como o tratamento com radiação ionizante a radiação, produtos químicos (por exemplo, gases como H2O2 ou óxido de etileno) ou calor seco e úmido,23. Métodos de esterilização comum principalmente fornecem uma esterilização eficaz, mas eles são conhecidos por influenciar o material tratado e representam um risco potencial para o operador. Plasma de baixa pressão oferece uma rápida e homogénea inativação biológica usando a composição de vários componentes tais como fótons UV, elétrons livres, íons e átomos ou moléculas (por exemplo, ROS), sair. Portanto, LPP pode ser aplicado a materiais sensíveis, calor e à corrosão, tais como polímeros termoplásticos para implantes, instrumentos eletrônicos ou 3D-estruturas complexas. No presente trabalho, demonstrar a aplicação de um tal sistema de teste, no quais monocamadas de pulverizado b. subtilis esporos20 são tratados em um reator de plasma de baixa pressão particular que foi descrito recentemente no detalhe7. Exame microscópico do brilhante-campo de esporos tratados com plasma pode ser suficiente para a obtenção de uma estimativa global da eficiência da esterilização. No entanto, estamos interessados no direcionamento dos mecanismos subjacentes de plasma de baixa pressão e sua influência na inativação de esporos em um nível molecular. Em combinação com microscopia de fluorescência-rastreamento permite-nos lançar luz sobre os detalhes desta resposta molecular particular em esporos tratados com plasma e potencialmente nos dar insights sobre o mecanismo de inativação fundamentais de plasma de baixa pressão.
Aqui, focalizamos a análise da eficiência de plasma-tratamento e efeitos usando microscopia célula viva, que permite seguir esporos individuais após o início da germinação. Notavelmente, esta abordagem particular revela um par de novos resultados que não pode ser fornecido pela revitalização da população inteira de esporos usando a determinação do número de telemóvel ou CFU de medição. Primeiro de tudo, plasma-tratamento de esporos não só afeta a capacidade da consequência de forma dose-dependente, conforme o esperado da medida de sobrevivência, por determinação de CFUs, mas também a morfologia das células vegetativas, que frequentemente desenvolvem grandes varas incapazes para septos forma de acordo com a adequada divisão celular junto com pequenas células degola no spore (15 s de plasma-tratamento) ou células em um comprimento reduzido (30 s de plasma-tratamento). Observações de células com comprimento reduzido não mostraram nenhuma recuperação ao comprimento da célula normal em pontos de tempo mais tarde. Além disso, vivo celular revela que a maioria das células morfologicamente alteradas lyse em fases posteriores da observação de imagem. Isto significa que danos adquirido pelos esporos durante o tratamento de plasma só é eficaz em fases posteriores da revitalização do esporo, presumivelmente devido a danos no DNA e que a maquinaria utilizada para a germinação e a consequência é mais robusta para esterilização plasma do que as máquinas necessárias para o crescimento vegetative. Notavelmente, a expressão da proteína RecA de reparação de DNA parece ser baixo e quase ausente nos esporos e desenvolve-se durante a fase vegetativa e consequência conforme indicado por um aumento na fluorescência de RecA-YFP17. No entanto, até mesmo uma expressão de RecA ligeiramente aumentada em superando tratados com plasma esporos, em comparação com esporos de controle, não ajuda a resgatar a vitalidade celular quantitativamente, porque a maioria das células lyse ou estourar depois de consequência natural, especialmente depois de mais de 3 h de incubação. Este efeito pode ser visualizado usando filmes de célula viva de imagens de lapso de tempo de esporos germinadas. Não podemos excluir que este efeito é subestimado pela condição particular de cultivo onde as células são forçadas em uma monocamada usando uma cobertura fina de ágar-ágar.
Outro resultado da análise por microscopia célula viva é que partículas contaminações (por exemplo, partículas de poeira, outros esporos) na superfície de monocamada esporo podem proteger os esporos subjacentes dos efeitos prejudiciais do plasma. Em tais casos até mais plasma-tratamento parece ser ineficiente. Desde que tais contaminações são difíceis de evitar completamente, estratégias de plasma-tratamento alternativo devem ser testadas, por exemplo, usando a rotação planetária durante o tratamento de plasma em conjunto com duração prolongada do tratamento. A análise por SEM indica que o brasão de esporos é perfurado com duração maior de plasma-tratamento que está em consonância com a teoria dos efeitos mediados por plasma na questão22,24. Um tempo de exposição prolongada (> 240 s) de plasma pode até perfurar as partículas contaminantes e, portanto, podem danificar e inactivar os esporos subjacentes.
O protocolo apresentado por microscopia célula viva da germinação dos esporos e a consequência pode ser apropriado para outros estudos também. Cobrir os esporos com uma fina camada de ágar obriga os esporos em um plano ótico distinto e restringe o movimento lateral. Ambos os efeitos garantem que os esporos e células superando permanecer dentro do quadro de imagem selecionado. Abordagens semelhantes foram descritas antes25 mas fornecem que menos flexibilidade do que o método descrito aqui que permite escolher praticamente qualquer transportador de amostra (por exemplo, uma lâmina de vidro, lamela ou placa de Petri). Em nossas mãos outras bactérias vegetativas poderiam ser analisadas por microscopia de células vivas, usando o método agar-coberta). Em qualquer caso, cuidadosos controle de experimentos devem ser realizados para avaliar possíveis efeitos de danos foto durante a célula viva da imagem latente, porque observamos que altas doses de luz laser monocromática completamente inibem a germinação dos esporos. Além de encurtar o tempo de iluminação, ou seja, aumentando os intervalos de observação, este fenômeno pode ser evitado por reduzir a intensidade do laser e/ou abertura da abertura confocal (pinhole).
Em resumo, entre as técnicas utilizadas para estudar a eficiência do tratamento de plasma no modelo de pulverizado b. subtilis monocamadas de esporos, células vivas microscopia fornece insights únicos em eventos celulares durante o revival de Esporo e oferece a possibilidade para analisar a dinâmica das proteínas marcado com fluorescência. Além disso, a preparação da amostra particular, ou seja, coberta de esporos com uma fina camada de ágar-ágar, poderia ser paradigmático para a geração de imagens de outros microorganismos por microscopia de células vivas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores Andrea Schröder agradecer a excelente assistência técnica durante as partes deste trabalho e Nikea J. Ulrich pela sua assistência durante a gravação do vídeo. Gostaríamos também de agradecer a Lyle A. Simmons por sua generosa doação das estirpes de Bacillus subtilis : LAS72 e LAS24. Este trabalho foi financiado em partes por subsídios desde a Fundação de pesquisa alemã (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) para PA (AW 7/3-1) e RM (MO 2023/2-1) e o DLR concedem vida de ISS DLR-FuW-Projekt, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R. e R.M.). F.M.F. foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da escola de Helmholtz espaço Life Sciences Research (SpaceLife) no centro aeroespacial alemão (DLR), em Colónia, na Alemanha, que foi financiado pela Associação Helmholtz (Helmholtz-Gemeinschaft) durante um período de seis anos ( N º de Grant VH-ko-300) e recebeu fundos adicionais do DLR, incluindo o Conselho Executivo aeroespacial e o Instituto de Medicina Aeroespacial. Os resultados deste estudo serão incluídos na tese de doutorado de Felix M. Fuchs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
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