Summary
在这里, 我们提出了一个非侵入性评估的卵母细胞发育能力在他们的体外成熟从生发泡到中期 II 阶段。该方法将时间推移成像与粒子图像测速 (PIV) 和神经网络分析相结合。
Abstract
不孕诊所将受益于选择发育能力的vs不称职的卵母细胞使用非侵入性程序, 从而改善整体妊娠结局。我们最近开发了一种基于显微活体观察的小鼠卵母细胞在他们的体外成熟从胚泡 (问) 到中期 II 阶段, 然后分析的细胞质运动在这段时间内发生。在这里, 我们提出了这个程序的详细协议。卵母细胞从完全生长的窦卵泡中分离出来, 在15小时内培养为37摄氏度和 5% CO2的时间失效分析显微镜。图片以8分钟的间隔拍摄。利用粒子图像测速 (PIV) 方法对图像进行分析, 计算每个卵母细胞在整个培养期内的细胞质运动速度 (CMVs) 剖面。最后, 通过一个数学分类工具 (前馈人工神经网络, 文芳) 来喂养每个卵母细胞的 CMVs, 预测配子发育能力或不称职的概率, 精度为91.03%。该协议, 为鼠标设置, 现在可以测试其他物种的卵母细胞, 包括人类。
Introduction
女性不孕症是一种影响越来越多的妇女的病理学。根据世界卫生组织的数据, 大约20% 的夫妇是不孕, 40% 是由于女性不孕。此外, 在美国或意大利接受癌症治疗的妇女中, 有三人 (分别为30万年和3万岁) 发育过早卵巢衰竭。
预防癌症患者不孕症的策略是在肿瘤治疗前, 卵巢卵泡的分离和冷冻保存, 其次是 "体外" 成熟 (病媒) 在细胞产业部的阶段 (即对产业部的转变)。无创性的卵母细胞发育能力标志物的提供将改善受精和发育过程, 以及整个妊娠成功1,2。
根据 supravital fluorochrome 赫斯特33342的染色后观察到的染色质构型, 哺乳动物完全生长的卵母细胞被归类为被包围的核仁 (SN) 或未被包围的核仁 (诺基亚)3。除了不同的染色质组织, 这两种类型的卵母细胞显示许多形态学和功能差异3,4,5,6,7,8 ,9, 包括它们的减数分裂和发展能力。当从子房分离并成熟的体外时, 这两种卵母细胞都达到了产业部的阶段, 在精子受精后, 发展到2细胞阶段, 但只有有 SN 染色质组织的人才能发展到足月 9。虽然作为选择称职的vs不称职卵母细胞的分类方法是好的, 但主要的缺点是 fluorochrome 本身的诱变效应, 最重要的是用于其检测的紫外线光可能存在于细胞上。
由于所有这些原因, 我们寻找其他与 SN 或诺基亚的染色质构象相关的非侵入性标记, 可以替代赫斯特的使用, 同时保持相同的高分类精度。胞质运动速度 (CMVs) 的时间推移观察是细胞状态的一个显著特征。例如, 最近的研究表明, 在受精时记录的 CMVs 与小鼠和人类受精卵完成植入前和足月发育的能力之间的联系10,11。
基于这些早期的研究, 我们这里描述一个平台, 以识别发育能力或不称职的老鼠完全生长的卵母细胞5,6,7,8。该平台基于三主要步骤: 1) 从窦卵泡分离出的卵母细胞首先根据其染色质构型分类, 无论是被包围的核仁 (SN) 或未被包围的核仁 (诺基亚);2) 采用粒子图像测速仪 (PIV) 对各单卵母细胞的 CMVs 时间推移图像进行分析;3) 通过对盲分类12、13的前馈人工神经网络 (文芳), 分析了 PIV 获得的数据。我们详细介绍了为鼠标准备的程序中最关键的步骤, 使其可供测试并用于其他哺乳动物物种 (例如,牛、猴和人类)。
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Protocol
所有涉及动物的程序均由帕维亚大学的机构动物保育和使用及伦理委员会批准。动物在22°c 的情况下被维护了, 60% 空气湿气和一个光/黑暗的周期 12:12 h。
1.Ovary 隔离
- 注射腹腔2四-十一周老 CD1 雌性小鼠与 10 U 卵泡刺激激素与无菌1毫升胰岛素注射器。
- 等46-48 小时。
- 用肌肉注射50毫克/千克的 Zoletil (Tiletamina 和 Zolazepan cloridrate) 来称量老鼠和麻醉。弄死颈椎脱位。
- 用一对解剖钳抓住腹壁覆盖的皮肤。用剪刀切开皮肤和身体壁, 用镊子拉开切口。
- 用一双镊子, 将内脏移到一旁, 精确定位子宫角, 并将卵巢放在肢体上。
- 用钟表匠钳轻轻握住卵巢, 用剪刀把韧带剪到子宫。重复与其他卵巢。
- 将收集到的卵巢移植到35毫米细胞培养皿中, 其中含有1毫升的 M2 隔离培养基, 在37摄氏度、5% CO2的空气中预热。
- 用细剪刀在显微镜下取出脂肪和输卵管。
2. 卵丘卵母细胞复合物的分离
- 使用无菌镊子和1G 无菌胰岛素针穿刺卵巢表面, 直到窦性卵母细胞复合物 (COCs) 被动释放。
- 用嘴控制的手拉巴斯德微 (直径200µm) 收集 COCs 超过三层的卵丘细胞, 并将它们转化为300µL 的新鲜 M2 培养基。
- 用手拉的巴斯德微 (直径80µm) 去除卵母细胞周围的卵丘细胞, 轻轻吹打进进出出几秒钟,
- 反复将卵母细胞从20µL 的 M2 培养基中转移到另一个, 直到卵丘细胞完全消除。
3. 基于染色质组织的卵母细胞分类
- 准备赫斯特33342染色溶液在最后浓度0.05 µg/毫升在 M2 培养基开始从母亲溶液5毫克/毫升稀释 1x PBS。
- 在35毫米培养皿盖子的底部放置3.5 µL 微滴赫斯特染色溶液。
- 将每个卵母细胞转移到赫斯特染色滴, 将盘子放到预热的 (37 °c) 加热板上, 用深色盖子盖住, 以避免光线的暴露。
- 在室温下孵化10分钟后, 用荧光显微镜观察卵母细胞在紫外光 (330-385 nm) 下的10X 放大倍数, 不超过1-2 秒。
- 将卵母细胞归类为被包围的核仁 (SN) (图 1A), 如果它们在核仁周围呈现一圈赫斯特阳性染色质。
- 将卵母细胞归类为不被包围的核仁 (诺基亚), 如果它们的核仁没有被赫斯特阳性的染色质包围, 并且在细胞核内显示分散的异色斑点 (图1B)。
4. 基于神经网络的卵母细胞分类
- 制备四2µL 液滴, 辅以5% 种热灭活胎牛血清, 2 毫米 l-谷氨酰胺, 5 毫米牛磺酸, 100 的 U/毫升青霉素, 75 µg/毫升链霉素和23.5 µg/µL 丙酮酸钠成35毫米玻璃底部培养皿和覆盖他们与预热 (37 °c) 和预平衡矿物油, 以避免介质蒸发。
注: 如果使用活细胞筛选系统, 请使用7毫米 x 7 毫米的绘制网格作为指南, 将水滴保持在特定的距离。 - 将 3-4 卵母细胞转移到每个下落。
- 将玻璃底部培养皿放入一个活细胞筛选系统中, 配备定时记录软件 (参见材料表), 它允许在温度稳定 (37 摄氏度) 和 CO 2 的环境中观察卵母细胞成熟度.浓度 (5%)。
- 打开定时记录软件。在屏幕上, 一个窗口出现在左侧的卵母细胞的活体拍摄和右侧的所有设置按钮上。
- 选择卵母细胞的中心, 将其定位在屏幕中心。必要时调整焦点。
- 选择Ph 值按钮并将直径灯设置为 192;曝光时间为1/125s;增益到1.99;和分辨率 1600 x 1200。
- 选择FL2并将直径指示灯设置为5;曝光时间为3 s;增益到2.37;和分辨率 1600 x 1200。
- 选择 "新建点" 按钮, 以记录区域性放置中的卵母细胞位置。对文化下降中的每个卵母细胞重复相同的例程。
- 选择时间并将捕获周期设置为8 min和总时间到15 h。
- 选择开始时间间隔以启动录制周期。
- 打开 MATLAB 软件并编写 > >cell_piv;然后选择PIV 工具。
- 选择包含录制影片的文件夹, 然后选择任何. jpeg 文件以加载整个图像序列。对于每个卵母细胞, 通过单击选择区域工具选择感兴趣的区域 (ROI)。
- 在 "文件" 菜单中选择进程 PIV 。选择查看器工具按钮。
注意: 该程序将计算 ROI 中的速度向量, 并自动生成一个数据文件, 保存为. 席子文件。 - 选择要打开的. 席子文件。选择按钮选择 ROI 工具, 并在卵母细胞的轮廓周围绘制一个圆圈。单击 "文件" 菜单下的 "保存"。
注意: 此区域中的向量现在显示, 并且图形窗口中的平均大小数据更新为新的 ROI。 - 打开记录到电子表格中的整个时间间隔帧的收集的平均震级数据, 在行、帧序列和列上, 对每个单卵母细胞进行分析。
- 将诺基亚和 SN 卵母细胞的数据组织成10个子群。
- 利用9子群对前馈人工神经网络进行迭代 (文芳) 和1子群的盲检测训练。
- 重复9次, 更改盲测试样本 (10 倍验证)。
- 打开 MATLAB, 运行自定义脚本main , 并在请求时插入具有培训数据 (train.txt) 的文件名、用于培训的诺基亚和 SN 卵母细胞数以及要分析的时间间隔 (通常从帧1-2 到框架 112-113)。
- 按enter执行培训。
- 使用测试数据 (test.txt) 插入文件的名称。
- 在 MATLAB 工作区中打开矢量test_outputs_cyt 。
注: 屏幕上出现一个窗口, 显示在第一行中, 为诺基亚和 SN 卵母细胞获取真实阳性 (TP 或真诺基亚) 和误报 (FP 或假诺基亚) 的概率;相反, 在第二行中, 分别为诺基亚和 SN 卵母细胞获取假阴性 (FN 或 false sn) 和真正的底片 (TN 或真 sn) 的概率。 - 使用公式: (tp + tn)/(tp + FN + tn), 计算文芳精度, 以百分比表示。
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Representative Results
图 2显示了一个代表性的发育能力和不称职的卵母细胞, 分别在开始 (在) 和在病媒治疗过程的末尾 (产业部)。全生长小鼠卵母细胞的病媒在 15 h 培养期间发生。时间推移观察记录减数分裂的进展, 检测主要的减数分裂事件, 包括 GVBD 和第一极性体的挤压。
200多名发育能力的vs不称职的卵母细胞的分析和比较显示减数分裂进展的时间差异。具体地说, 在 GVBD 的卵母细胞中, 1-2 个时间推移帧的延迟很大, 而 PB1 挤出则发生15帧延迟。尽管有这些差异, 变异率太高, 不能让单卵母细胞分类。因此, 该程序是用数学分类工具实现的。
图 3显示了使用的数学分类工具的方案, 称为前馈人工神经网络 (文芳)。对于每个卵子喂养通过, 文芳同时给出的可能性, 配子是一个发育能力和概率, 它是一个无能的卵母细胞。在我们的实验中, 文芳对小鼠卵母细胞进行了平均精度为91.03% 的分类。
图 1.有代表性的 SN 和诺基亚的卵母细胞赫斯特 33342.在 fluorochrome 赫斯特33342的隔离和染色后, 完全生长的卵母细胞被归类为被包围的核仁 (SN) (A) 或不被包围的核仁 (诺基亚) (B), 这取决于不同的存在 (箭头) 或缺席, 分别是一个环的赫斯特阳性染色质周围的核仁。缩放栏: 5 µm请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.时间推移图像的粒子图像测速分析.对113个时移帧进行了分析, 结果表明, PIV 分析显示在明亮场图像的下面。该图显示了记录过程的开始 (和) 和结束 (产业部)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.前馈人工神经网络的示意图表示.文芳是用于将卵母细胞归类为发育能力或无能的数学工具。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
有几个关键步骤, 你应该照顾, 同时执行此协议与鼠标卵母细胞以及其他物种。一旦从卵泡中分离出来, 卵母细胞就应该立即转移到记录滴中, 因为与伴卵丘细胞的分离触发了对产业转移的开始。对本议定书可能的修改可能是将 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBMX) 添加到用于 COCs 隔离的 M2 介质中。IBMX 防止了即时触发的问-产业转移, 并允许同步的整个实验组的卵母细胞。
在我们的实验中使用的活体细胞筛选系统 (参见材料表) 将成熟度下降的数量限制为 4, 每滴卵母细胞4个, 因此每个实验总共有16个卵母细胞。这一限制可以用其他时间失效的活细胞筛查系统来克服, 商业上可以使用, 并配备了几个文化室。
根据我们的经验, 帧与下面的记录间隔是一个关键点。经过一些初步的实验, 我们每8分钟拍摄一次图像, 因为这是最短的时间窗口, 允许清晰地观察在 vescicle 的转变过程中发生的重大事件, 如生发的破裂和挤压第一个极性的身体。当观察其他物种的卵母细胞时, 这个时间窗可能需要重估。
这种方法的缺点是卵母细胞在没有周围的积云细胞的情况下的培养, 因为后者是已知的, 以进一步改善对产业间的转变。在这方面, 我们的实验室现在正在测试对报告的协议的轻微修改, 包括在卵丘细胞饲养层上的无卵丘卵母细胞的培养。
根据其性质, 文芳有一个固定的数量的两个输入 (分析的巨细胞病毒模块的数量) 和产出 (无论是发育能力或不称职的卵子) 神经元, 但隐藏神经元的数量是由调查员通过试验和纠正选择获得最佳预测性能的方法。在我们的例子中, 我们尝试了不同数量的隐藏神经元, 并发现三给出了最好的结果。此外, 文芳分析需要大量的输入数据 (在我们的实验112的巨细胞病毒模块), 以获得可靠的统计数字。可能的改进可能会减少必要的输入数据的数量, 这是使用替代分类工具, 如支持向量机、树袋或 KNN 分类器。当文芳分析显示其鲁棒性时, 可以从该过程中消除步骤1。
该协议, 为鼠标设置, 可以测试其他物种的卵母细胞, 包括人类。此外, 可以利用时间推移记录与 PIV 和神经网络分析相结合的方法, 观察受精卵10、11和前体胚胎中的 CMVs, 以评估其进一步发展潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作使成为可能多亏了支持: 帕维亚大学悬浮角速度陀螺仪 2016;帕尔马大学 2014, 2016;并运动提供必要的 plasticware 进行这项研究。我们感谢夏恩温莎博士 (英国布里斯托尔大学工程学院) 提供 Cell_PIV 软件。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
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