Summary
Hier presenteren we een protocol voor niet-invasieve beoordeling van ontwikkelingsstoornissen bekwaamheid oöcyt uitgevoerd tijdens hun rijping in vitro van het vesikel germinal aan de metafase-II. Deze methode combineert time-lapse imaging met particle image velocimetry (PIV) en neurale netwerk analyses.
Abstract
Onvruchtbaarheid klinieken zou profiteren van de mogelijkheid om te kiezen van ontwikkelingsachterstand bevoegde vs. incompetent eicellen met behulp van niet-invasieve procedures, dus de verbetering van de algehele uitkomst van de zwangerschap. We onlangs ontwikkelde een methode van de classificatie gebaseerd op microscopische levende observaties van muis eicellen tijdens hun rijping in vitro van de germinal Vesikel (GV) naar de metafase-II fase, gevolgd door de analyse van de cytoplasmatische bewegingen Deze time-lapse periode optreedt. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen van deze procedure. Eicellen zijn geïsoleerd van volgroeide follikelgroei follikels en gekweekte voor 15u binnen een microscoop voorzien voor time-lapse analyse bij 37 ° C en 5% CO2. Foto's zijn genomen op 8 min intervallen. De beelden worden geanalyseerd met behulp van de Particle Image Velocimetry (PIV) methode die berekent, voor elke oöcyt, het profiel van cytoplasmatische beweging snelheden (CMVs) die zich voordoen gedurende de cultuur. Tot slot, de CMVs van elke één oöcyt worden gevoed via een wiskundige indeling-hulpprogramma (Feed-forward kunstmatig neuraal netwerk, FANN), die de kans op een gameet ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente met een nauwkeurigheid van 91.03% voorspelt. Dit protocol, ingesteld voor de muis, kon nu worden getest op de eicellen van andere soorten, inclusief de mens.
Introduction
Vrouwelijke onvruchtbaarheid is een pathologie die een steeds groter aantal vrouwen treft. Volgens de World Health Organization zijn ongeveer 20% van de paren onvruchtbaar, met een 40% als gevolg van vrouwelijke onvruchtbaarheid. Bovendien is eenderde van de vrouwen kankerbehandelingen ondergaan (300.000/jaar en 30.000/jaar in de VS of Italië, respectievelijk) ontwikkelen van prematuur ovarieel falen.
Een strategie ter voorkoming van onvruchtbaarheid bij kankerpatiënten is het isolement en de cryopreservatie van ovariële follikels voordat de oncologische behandeling, gevolgd door in vitro maturatie (GODT) van GV eicellen naar de MII fase (GV-naar-MII overgang). De beschikbaarheid van niet-invasieve merkers van oöcyt developmental bevoegdheid zou verbeteren de bevruchting en de ontwikkelings processen en de algehele zwangerschap succes1,2.
Op basis van de configuratie van de chromatine waargenomen na kleuring met de supravital fluorescerende Hoechst 33342, zoogdieren volgroeide eicellen worden geclassificeerd als een omgeven Nucleolus (SN) of een niet omgeven Nucleolus (NSN)3. Naast de organisatie van hun verschillende chromatine weer deze twee soorten eicellen vele morfologische en functionele verschillen3,4,5,6,7,8 ,9, met inbegrip van hun bevoegdheid Meiotische en ontwikkelingsproblemen. Als geïsoleerd van het ovarium en verviel in vitro, beide typen van oöcyten reach de MII-fase, en na inseminatie behandeld zijn sperma ontwikkelen naar de fase 2-cel, maar alleen degenen met een SN chromatine organisatie kunnen ontwikkelen tot en met9van de termijn. Hoewel goed als een indelingsmethode voor het selecteren van bevoegde vs. incompetent eicellen, is het belangrijkste nadeel de mutagene werking die de fluorescerende zelf en, vooral, het UV-licht wordt gebruikt voor de detectie zou kunnen op de cellen hebben.
Om al deze redenen, we hebben gezocht naar andere niet-invasieve merkers die is gekoppeld aan de SN of NSN chromatine conformatie die het gebruik van Hoechst met behoud van dezelfde hoge classificatie nauwkeurigheid kan vervangen. De time-lapse waarneming van cytoplasmatische beweging snelheden (CMVs) is in opkomst als een functie kenmerkend voor de status van de cel. Bijvoorbeeld, recente studies aangetoond dat de associatie tussen CMVs opgenomen op het moment van bevruchting en de capaciteit van muis en mens zygoten volledige pre-implantatie te voldragen ontwikkeling10,11.
Op basis van deze eerdere studies, beschrijven we hier een platform voor de erkenning van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen5,6,7,8. Het platform is gebaseerd op drie hoofdstappen: 1) eicellen geïsoleerd uit follikelgroei follikels zijn eerst ingedeeld op basis van hun chromatine configuratie ofwel als een omgeven nucleolus (SN) of een niet-omringd nucleolus (NSN); 2) time-Lapse beelden van CMVs die zich voordoen tijdens de overgang van de GV-naar-MII van elke één oöcyt worden genomen en geanalyseerd met particle image velocimetry (PIV); en 3) de gegevens die zijn verkregen met PIV worden geanalyseerd met een Feed-forward kunstmatige neurale netwerk (FANN) voor blind classificatie12,13. Wij geven details van de belangrijkste stappen van de procedure die is ontworpen voor de muis om het beschikbaar worden getest en worden gebruikt voor andere soorten zoogdieren (bijvoorbeeld runderen, aap en mens) klaar te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik en ethische commissies aan Universiteit van Pavia. Dieren werden onderhouden onder omstandigheden van 22 ° C, luchtvochtigheid van 60% en een licht/donker cyclus van 12:12 h.
1. eierstok isolatie
- Intraperitoneally 2 vier-tot-elf weken oude CD1 vrouwelijke muizen met 10 U van follikelstimulerend hormoon met een steriele 1 mL insuline spuit te injecteren.
- 46-48 h wachten.
- Weeg de muis en anesthetize met een intramusculaire injectie van 50 mg/kg Zoletil (Tiletamina en Zolazepan cloridrate). Euthanaseren door cervicale dislocatie.
- Het begrijpen van de huid die betrekking hebben op de buikwand met behulp van een paar dissectie pincet. De huid en lichaam muur knippen met een schaar en trek de snede open met een tang.
- Met behulp van een pincet, verplaatsen de ingewanden opzij, de baarmoeder horens lokaliseren en lokaliseren van de eierstokken op hun extremiteit.
- Zachtjes Houd het ovarium horlogemaker pincet gebruiken en gebruik van schaar te snijden van de ligament naar de baarmoeder. Herhaal met de andere eierstok.
- Breng de verzamelde eierstokken in een 35-mm cel cultuur petrischaal met 1 mL van M2 isolatie medium vooraf bij 37 ° C, 5% CO2 in lucht opgewarmd.
- Verwijder het vet en het oviduct met fijne schaar onder een stereomicroscoop.
2. isolatie van Cumulus oöcyt complexen
- Het aanprikken van de eierstokken oppervlak met behulp van steriele pincet en een 1G steriele insuline naald tot follikelgroei cumulus oöcyt complexen (COCs) zijn passief vrijgegeven.
- Verzamelen COCs met meer dan drie lagen van cumulus cellen met behulp van een mond-gecontroleerde hand-getrokken Pasteur micropipet (200 µm in diameter) en ze vervolgens overbrengen naar een daling van de 300 µL van verse M2 medium.
- De cellen van de cumulus rondom de eicellen met behulp van een hand-getrokken Pasteur micropipet (80 µm in diameter) verwijderen door zachtjes pipetteren in en uit gedurende enkele seconden,
- Herhaaldelijk eicellen van een daling van de 20 µL van M2 medium te overbrengen naar een andere, totdat cumulus cellen worden volledig geëlimineerd.
3. chromatine oöcyt organisatie gebaseerde indeling
- Bereiden Hoechst 33342 kleurstofoplossing op een eindconcentratie van 0,05 µg/mL in M2 middellange vanaf een moeder-oplossing van 5 mg/mL verdund in 1 x PBS.
- Plaats 3.5 µL micro druppels van Hoechst kleurstofoplossing aan de onderkant van een 35 mm petrischaal deksel.
- Elke één oöcyt overboeken naar een Hoechst kleuring drop, zet de schotel op een voorverwarmde (37 ° C) Verwarming bord en bedek het met een donkere deksel om te voorkomen dat lichte expositie.
- Na 10 min van incubatie bij kamertemperatuur, observeren de eicellen met een fluorescentie Microscoop op 10 X vergroting onder UV-licht (330-385 nm), voor niet meer dan 1-2 s.
- Eicellen te classificeren als een omgeven nucleolus (SN) (figuur 1A), als ze een ring van Hoechst-positieve chromatine rondom de nucleolus presenteren.
- Eicellen te classificeren als een niet omgeven nucleolus (NSN), als hun nucleolus wordt niet omringd door Hoechst-positieve chromatine en shows hétérochromatique plekken binnen de kern (figuur 1B verspreiden).
4. neurale netwerk-gebaseerde oöcyt classificatie
- Bereiden vier 2 µL druppels van α-MEM medium aangevuld met 5% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 2 mM L-glutamine, 5 mM taurine, 100 U/mL penicilline, 75 µg/mL streptomycine en 23,5 µg/µL natrium pyruvaat in een 35-mm glas onderste petrischaal en bestrijk ze met voorverwarmde (37 ° C) en vooraf zijn geëquilibreerd minerale olie om te voorkomen dat middelgrote verdamping.
Opmerking: Als een levende cel-screening-systeem gebruikt, houd de druppels op een bepaalde afstand met behulp van een getekende raster van 7 x 7 mm als leidraad. - Overdracht 3 - 4 eicellen tot elke druppel.
- Plaats de glazen bodem petrischaal in een levende cel-screening systeem, voorzien van time-lapse opnamesoftware (Zie Tabel of Materials), waardoor de waarneming van de oöcyt rijping in een omgeving met stabiele temperatuur (37 ° C) en CO2 concentratie (5%).
- De time-lapse opnamesoftware niet openen. Op het scherm verschijnt een venster met een live opname van de oöcyt aan de linker kant en de instelling alle knoppen aan de rechterkant.
- Selecteer het midden van de oöcyt te plaatsen in het midden van het scherm. Focus aanpassen indien nodig.
- Selecteer de knoop van de Ph en de Lamp van de DIA ingesteld op 192; de belichtingstijd te 1/125 s; de krijgen tot 1.99; en de resolutie tot 1600 x 1200.
- Selecteer FL2 en de Lamp van de DIA ingesteld op 5; de belichtingstijd voor 3 s; de krijgen tot 2.37; en de resolutie tot 1600 x 1200.
- Selecteer de knop New wijs om het opnemen van het standpunt van de oöcyt in de daling van de cultuur. Herhaal dezelfde routine voor elke oöcyt binnen de daling van de cultuur.
- Selecteer tijd en stel de overname cyclus op 8 min en de totale tijd om 15u.
- Selecteer time-lapse starten om te beginnen met de opname-cyclus.
- Open de software MATLAB en schrijf >>cell_piv; en selecteer vervolgens de PIV-Tool.
- Kies de map met de opgenomen film en selecteer een van de JPEG-bestanden te laden van de hele Afbeeldingsvolgorde. Selecteer voor elke oöcyt, de regio van belang (ROI) door te klikken op het gereedschap gebied selecteren.
- Selecteer Proces PIV in het menu bestand. Selecteer de knop Viewer Tool .
Opmerking: Het programma berekent de vectoren van de snelheid binnen de ROI en automatisch produceert een gegevensbestand, opgeslagen als een .mat-bestand. - Selecteer het bestand .mat te openen. Selecteer de knop Selecteer ROI tool en teken een cirkel rond de omtrek van de oöcyt. Klik op opslaan in het menu bestand.
Opmerking: De vectoren in deze regio worden nu weergegeven en de gegevens van de gemiddelde omvang in de graph-venster bijgewerkt voor deze nieuwe ROI. - Open de gegevens verzameld van de gemiddelde omvang van de hele time-lapse frames opgenomen in een werkblad, met de rijen, de framereeks en op de kolommen, elke één oöcyt geanalyseerd.
- De gegevens van zowel NSN en SN eicellen ingedeeld in subgroepen van 10.
- 9 subgroepen kunt trainen de feed-forward kunstmatig neuraal netwerk iteratief (FANN) en 1 subgroep voor het testen van de blind.
- Herhaal een ander 9 keer, veranderen de blinde testen monster (10-fold Kruis-validatie).
- MATLAB open, rennen de op maat gemaakte script- belangrijkste en, desgevraagd, invoegen de naam van het bestand met de trainingsgegevens (train.txt), het aantal NSN en SN eicellen gebruikt voor de opleiding en de time-lapse interval om te worden geanalyseerd (meestal vanaf frame # 1-2 om frame # 112-113).
- Druk op enter om uit te voeren van de opleiding.
- Invoegen de naam van het bestand met de testgegevens (test.txt).
- Open het vector test_outputs_cyt in MATLAB werkruimte.
Opmerking: Er verschijnt een venster op het scherm weergegeven, in de eerste rij, de kans op het verkrijgen van True Positives (TP of ware NSN) en valse positieven (FP of valse NSN) voor NSN en SN eicellen, respectievelijk; in plaats daarvan, in de tweede rij, de kans op het verkrijgen van valse negatieven (FN of valse SN) en echte negatieven (TN of ware SN) voor NSN en SN eicellen, respectievelijk. - Gebruik de formule: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), voor de berekening van de FANN nauwkeurigheid, uitgedrukt als een percentage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont een representatieve ontwikkelingsachterstand bevoegde en incompetent oöcyt, respectievelijk aan het begin (GV) en aan het einde (MII) van de GODT-procedure. GODT van volgroeide muis eicellen optreedt tijdens 15u cultuur. De Time-Lapse observatie registreert de progressie van meiose en grote Meiotische evenementen, waaronder de GVBD en de extrusie van de eerste polar lichaam detecteert.
De analyse en vergelijking van meer dan tweehonderd ontwikkelingsachterstand bevoegde vs. incompetent eicellen toonde tijdsverschillen in de progressie van de meiose. Specifiek, is NSN eicellen, GVBD aanzienlijk vertraagd van 1-2 time-lapse frames, overwegende dat de extrusie PB1 treedt op met een vertraging van 15 beelden. Ondanks deze verschillen is de variabiliteit te hoog om één-oöcyt classificatie. Om deze reden werd de procedure uitgevoerd met een wiskundige indeling gereedschap.
Figuur 3 toont een schema van de wiskundige indeling tool gebruikt, benoemde Feed-forward kunstmatige neurale netwerk (FANN). Voor elke oöcyt gevoed via, geeft FANN tegelijkertijd de kans dat de gameet een ontwikkelingsachterstand bevoegd is en de kans dat er een incompetente oöcyt. Onze experimenten, de FANN muis eicellen met een gemiddelde nauwkeurigheid van 91.03% ingedeeld.
Figuur 1 . Representatieve SN en NSN eicellen gekleurd met Hoechst 33342. Na isolatie en kleuring met de fluorescerende Hoechst 33342, volgroeide eicellen worden ingedeeld als omgeven nucleolus (SN) (A) of niet omringd nucleolus (NSN) (B), afhankelijk van de aanwezigheid (pijl) of afwezigheid, respectievelijk van een ring van Hoechst-positieve heterochromatin rondom de nucleolus. Schaal bar: 5 µm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Particle Image Velocimetry analyse van Time-Lapse images. De resultaten van de analyse van de PIV staan hieronder het beeld helder-veld voor elk van de 113 time-lapse frames geanalyseerd. De figuur toont het begin (GV) en het einde (MII) van het opnameproces. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Schematische weergave van de Feed-forward kunstmatig neuraal netwerk. FANN is het wiskundig hulpmiddel gebruikt voor het classificeren van eicellen als ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetent. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen een zorgen moet voor tijdens het uitvoeren van dit protocol met muis eicellen alsook met die van andere soorten. Het geïsoleerde uit hun follikels eicellen overgedragen moeten worden onmiddellijk in de opname druppels, zoals de scheiding van de metgezel-cumulus triggers cellen het begin van de overgang van de GV-naar-MII. Een mogelijke wijziging van het huidige protocol zou de toevoeging van 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) naar de M2 medium gebruikt voor isolatie van de COCs. IBMX verhindert de directe gang van de GV-naar-MII overgang en staat een synchronisatie van de hele experimentele groep van eicellen.
De levende cel-screening systeem gebruikt in onze experimenten (Zie Tabel van materialen) beperkt het aantal rijping druppels naar 4 met 4 eicellen per druppel, dus tot een totaal van 16 eicellen per experiment. Deze beperking kan worden overwonnen met behulp van andere time-lapse levende cel-screening-systemen, commercieel beschikbaar en voorzien van verschillende kamers van de cultuur.
Gebaseerd op onze ervaring, is het opname-interval tussen een frame en de volgende een kritiek punt. Na een aantal voorbereidende experimenten hebben we beelden elke 8 min want dit was de minimumtijd venster waardoor de duidelijke observatie van de belangrijke gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de overgang van de GV-naar-MII, zoals de germinal vescicle-verdeling en de extrusie van het eerste polar lichaam. Het venster van deze tijd wellicht worden geïndexeerd wanneer observeren eicellen van andere soorten.
Een nadeel van deze methode is de cultuur van eicellen in de afwezigheid van hun omliggende cellen van cumulus, zoals deze bekend zijn om de overgang van de GV-naar-MII verder te verbeteren. Aan dit verband test ons laboratorium nu een lichte wijziging van de gemelde protocol door met inbegrip van de cultuur van cumulus-vrije eicellen op een cumulus cellen feeder laag.
Door de aard ervan, de FANN heeft een vast aantal zowel input (het aantal geanalyseerde CMV modules) en output (ofwel een ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente oöcyt) neuronen, maar het aantal verborgen neuronen is gekozen door de onderzoeker door middel van een proces en correctie aanpak te verkrijgen van de beste prestaties van de voorspelling. In ons geval, we geëxperimenteerd met verschillende aantallen verborgen neuronen en vond dat drie gaf de beste resultaten. FANN analyses vereist ook een groot aantal invoergegevens (in onze experimenten 112 CMV modules) te verkrijgen van een robuuste statistiek. Een mogelijke verbetering die het aantal nodige invoergegevens verminderen kan is het gebruik van alternatieve indeling tools, zoals Support Vector Machine, boom-tas, of Pauw classificaties. Als de FANN analyse zijn robuustheid blijkt, kan stap 1 van de procedure worden geëlimineerd.
Dit protocol, ingesteld voor de muis, zou kunnen worden getest op de eicellen van andere soorten, inclusief de mens. Bovendien, de combinatie van time-lapse opname met PIV en neuraal netwerk analyses kunnen worden misbruikt voor de observatie van CMVs in zygoten10,11 en voor inplanting embryo's voor de evaluatie van hun verdere ontwikkelings potentieel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd mogelijk gemaakt dankzij steun van: Universiteit van Pavia FRG 2016; Universiteit van Parma FIL 2014 2016; en Kinesis voor het verstrekken van de plasticware nodig om deze studie te verrichten. Wij danken Dr. Shane Windsor (Faculteit Ingenieurswetenschappen, Universiteit van Bristol, UK) voor het verstrekken van de Cell_PIV software.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
