Summary
כאן, אנו מציגים עבור הערכה בלתי פולשני של מיומנות התפתחותית oocyte שבוצעה במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal לשלב השני מפה של פרוטוקול. שיטה זו משלבת הדמיה בצילום מואץ עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV) וניתוחים רשת עצבית.
Abstract
מרפאות פוריות ירוויחו היכולת לבחור כשיר מבחינת לעומת oocytes כשירים באמצעות הליכים פולשנית, ובכך לשפר את התוצאה הכוללת של ההריון. לאחרונה פיתחנו שיטת סיווג המבוסס על תצפיות חיים מיקרוסקופיים של העכבר oocytes במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal (GV) ועד השלב השני מפה של, ואחריו הניתוח של התנועות cytoplasmic המתרחשים במהלך תקופה זו זמן לשגות. כאן, אנו מציגים נתונים היסטוריים הפרוטוקולים של הליך זה. Oocytes מבודד זקיקים antral וחוה, תרבותי עבור h 15 בתוך מיקרוסקופ מצויד לניתוח זמן לשגות-CO 37 ° C ו-5%2. תמונות נלקחים במרווחים של 8 דקות. התמונות ניתוח בשיטת Velocimetry תמונת החלקיקים (PIV) מחשבת, עבור כל oocyte, הפרופיל של מהירויות התנועה Cytoplasmic (CMVs) המתרחשים לאורך כל תקופת תרבות. בסופו של דבר, CMVs של כל יחיד oocyte מוזנים דרך סיווג מתמטית כלי (רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה, FANN), אשר מנבאת את ההסתברות של תא רבייה להיות נכה או לא מוכשר עם דיוק של 91.03%. פרוטוקול זה, להגדיר עבור העכבר, עכשיו נבדק על oocytes של מינים אחרים, כולל בני אדם.
Introduction
פוריות נשית היא מחלה המשפיעה על מספר גדל והולך של נשים. בסביבות על פי ארגון הבריאות העולמי, 20% של זוגות הם עקרים, עם 40% עקב בעיות פוריות נשית. בנוסף, שליש אחד של נשים שעברו טיפולים בסרטן (300,000 לשנה ו- 30,000 שנה בארצות הברית או איטליה, בהתאמה) לפתח שחלות מוקדמת.
אסטרטגיה כדי למנוע בעיות פוריות אצל חולי סרטן הוא בידוד הקפאה קריוגנית של זקיקי השחלה לפני הטיפול אונקולוגית, ואחריו במבחנה ההבשלה (IVM) של oocytes GV לבמה MII (GV-כדי-MII המעבר). הזמינות של סמנים לא פולשנית של מיומנות התפתחותית oocyte תשפר ההפריה, תהליכים התפתחותיים, הכוללת הריון הצלחה1,2.
בהתבסס על תצורת כרומטין שלהם נצפתה לאחר צביעת עם fluorochrome supravital Hoechst 33342, יונקים oocytes וחוה מסווגים מוקף גרעינון (SN) או לא מוקף גרעינון (NSN)3. מלבד ארגון כרומטין שונים שלהם, אלו שני סוגים של oocytes להציג הרבה הבדלים מורפולוגיים ופונקציונליים3,4,5,6,7,8 ,9, כולל את היכולות meiotic והפיתוחים שלהם. כאשר מבודד מן השחלה, התבגר במבחנה, הן סוג של oocytes להגיע לשלב MII, ולפתח הזרעה זרע, לשלב 2 תאים, אך רק אלו עם ארגון כרומטין SN עלולים לפתח המונח9. אמנם טוב כשיטה סיווג לבחירת המוסמכת נ' oocytes לא מוכשר, אולם החיסרון העיקרי הוא ההשפעה של ה מוטגני fluorochrome עצמה ו, ומעל לכל, את האור האולטרה סגול המשמש לצורך זיהוי שלו שאולי על התאים.
מכל הסיבות האלה, חיפשנו סמנים אחרים לא פולשנית המשויך קונפורמציה כרומטין SN או NSN יכול להחליף את השימוש Hoechst תוך שמירה על דיוק גבוהה סיווג אותו. התבוננות בצילום מואץ תנועה Cytoplasmic מהירויות (CMVs) מתגלה כמו תכונה ייחודית של מצב התא. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שהקשר בין CMVs להקליט בזמן ההפריה והיכולת של האדם מופרות של עכבר preimplantation מלאה, פיתוח מלא לטווח10,11.
בהתבסס על מחקרים אלה קודמות, נתאר כאן פלטפורמה עבור ההכרה של עכבר נכה כשיר או לא מוכשר oocytes לבגרות5,6,7,8. הפלטפורמה מבוססת על שלושה שלבים עיקריים: 1) Oocytes מבודד antral זקיקים מסווגים הראשון המבוסס על כרומטין בתצורה שלהם או של גרעינון מוקף (SN) או של גרעינון מוקף לא (NSN); 2) תמונות בצילום מואץ של CMVs המתרחשים במהלך המעבר GV-כדי-MII של כל יחיד oocyte נלקח וניתח עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV); ו- 3) נתונים שהושגו עם PIV מנותחים עם הזנה-קדימה מלאכותי עצבית רשת (FANN) עבור סיווג עיוור12,13. אנחנו נותנים פרטים על השלבים הקריטיים ביותר של ההליך מיועד העכבר שיהיה מוכן זמין להיות נבדק, המשמש עבור יונקים אחרים (למשל, שור, קופים, בני אדם).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש ו ועדות אתיות ב אוניברסיטת פאביה. בעלי חיים היו נשמרים בתנאים של 22 מעלות צלזיוס, לחות האוויר 60% מחזור/כהה 12:12 h.
1. השחלה בידוד
- מזריקים intraperitoneally 2 4-ל-11 בת שבוע CD1 הנשי עכברים עם 10 U של זקיק מגרה הורמון עם מזרק אינסולין עקר 1 מ"ל.
- . אני לא. h 46-48
- שוקל את העכבר, עזים ומתנגד עם זריקה תוך שרירית של 50 מ"ג/ק"ג של Zoletil (cloridrate Tiletamina, Zolazepan). המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.
- לתפוס את העור המכסה לקיר הבטן בעזרת זוג מלקחיים לנתיחה. לחתוך את העור ופתח לגוף החומה עם זוג מספריים ומשוך את החתך עם מלקחיים.
- בעזרת זוג מספריים, להעביר האומץ הצידה, לאתר את הקרניים הרחם לשפה השחלות ב ממעמדם.
- בעדינות להחזיק את השחלה בעזרת מלקחיים שען, להשתמש במספריים לחתוך רצועה שלה אל הרחם. חזור עם השחלה אחרים.
- העברת השחלות שנאספו לתוך התא 35 מ מ תרבות פטרי המכילות 1 מ"ל של M2 בידוד בינוני להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באוויר.
- להסיר את השומן את oviduct באמצעות מספריים בסדר תחת stereomicroscope.
2. בידוד של מתחמי Oocyte תלולית
- לנקב פני השטח השחלות באמצעות פינצטה סטרילי, מחט סטרילית אינסולין 1G עד מתחמי oocyte antral cumulus (COCs) משתחררים פסיבי.
- לאסוף את COCs עם יותר משלוש שכבות של תאים cumulus באמצעות שבשליטת הפה משך ידו פסטר micropipette (200 מיקרומטר בקוטר) ולהעביר אותם לתוך טיפת 300 µL בינוני M2 טריים.
- להסיר את התאים cumulus המקיפים את oocytes באמצעות micropipette פסטר משך ידו (80 מיקרומטר בקוטר) על-ידי בעדינות pipetting שם במשך כמה שניות.
- שוב ושוב להעביר oocytes טיפה 20 µL של M2 בינוני עוד אחד, עד cumulus תאים בוטלו לחלוטין.
3. סיווג המבוסס על הארגון Oocyte כרומטין
- להכין פתרון מכתימים Hoechst 33342 ריכוז הסופי של µg/mL 0.05 ב- M2 בינונית החל מפתרון אמא של 5 מ"ג/מ"ל מדולל ב- 1 x PBS.
- במקום 3.5 µL מיקרו טיפות Hoechst מכתים פתרון בחלק התחתון של מכסה פטרי 35 מ מ.
- להעביר לכל oocyte יחיד לתוך Hoechst צביעת טיפה, למקם את המנה לצלחת חימום מראש ומחוממת (37 מעלות צלזיוס), לכסות את זה עם מכסה כהה כדי להימנע תערוכות אור.
- לאחר 10 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, לבחון את oocytes עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות בהגדלה X 10 תחת אור UV (330-385 ננומטר), עבור לא יותר מ- 1-2 s.
- כשידור oocytes גרעינון מוקף (SN) (איור 1 א'), אם הם מציגים טבעת של כרומטין Hoechst-חיוביות המקיפים את גרעינון.
- לסווג את oocytes כמו גרעינון לא מוקף (NSN), אם שלהם גרעינון שאינו מוקף Hoechst-חיוביות כרומטין ומעוררים מראה כתמים heterochromatic בתוך הגרעין (איור 1B).
4. סיווג Oocyte מבוססי-רשת עצבית
- להכין ארבעה µL 2, טיפות מדיום α-מ בתוספת 5% לא פעיל חום העובר שור סרום, 2 מ מגלוטמין, טאורין 5 מ מ, 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 75, נתרן µg/µL 23.5 פירובט לתוך כוס 35 מ מ בתחתית צלחת פטרי ולכסות אותם עם ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), שמן מינרלי equilibrated מראש כדי למנוע אידוי בינוני.
הערה: אם משתמשים במערכת התא-הקרנה בשידור חי, לשמור על הטיפות במרחק מסוים באמצעות רשת מצוירות של 7 מ"מ x 7 מ"מ כקו מנחה. - העברת 3 - 4 oocytes על כל טיפה.
- מקום בתחתית הכוס פטרי לתוך מערכת ההקרנה-תא חי, המצוידים בתוכנת הקלטה בצילום מואץ (ראה טבלה של חומרים), מה שמאפשר התבוננות oocyte ההבשלה בסביבה עם טמפרטורה יציבה (37 ° C) ו CO2 הריכוז (5%).
- פתח את תוכנת הצריבה זמן לשגות. על המסך מופיעה חלון עם שוט בשידור חי את oocyte, בצד שמאל, כל הלחצנים הגדרה בצד ימין.
- בחר מרכז oocyte כדי להציבו במרכז המסך. כוונן פוקוס במידת הצורך.
- בחר בלחצן ה-Ph והגדר את המנורה DIA 192; זמן החשיפה 1/125 s; רווח כדי 1.99; את הרזולוציה כדי 1600 x 1200.
- בחר FL2 ולהגדיר את המנורה DIA 5; זמן החשיפה 3 s; רווח כדי 2.37; את הרזולוציה כדי 1600 x 1200.
- בחר בלחצן הצבע החדשה כדי להקליט את מיקום oocyte בתוך הטיפה תרבות. חזור על שגרה זהה עבור כל oocyte בתוך הטיפה תרבות.
- בחר זמן ולהגדיר את רכישת מחזור 8 דקות , הזמן הכולל 15 h.
- בחר להתחיל בצילום מואץ להתחיל מחזור הקלטה.
- פתח את תוכנת MATLAB ולכתוב >>cell_piv; ולאחר מכן בחר את הכלי PIV.
- לבחור את התיקייה המכילה את הסרט המוקלט, בחר את כל הקבצים קבצי jpeg כדי לטעון את רצף התמונה כולה. עבור כל oocyte, בחר את האזור בעל עניין (ROI) על ידי לחיצה על בחר אזור הכלי.
- בחר תהליך PIV בתפריט קובץ. בחר בלחצן ' הכלי מציג .
הערה: התוכנית יחשב את הווקטורים מהירות בתוך רועי ומייצרת באופן אוטומטי קובץ נתונים, לשמור כקובץ .mat. - בחר את הקובץ .mat. בחר בלחצן ' ' רועי בחר כלי וצייר מעגל סביב קווי המתאר של oocyte. לחץ על שמור בתפריט קובץ.
הערה: הווקטורים באזור זה מוצגים כעת, לעדכן את הנתונים מגניטודה רשע בחלון גרף עבור רועי החדש הזה. - פתח הנתונים שנאספו הגודל הממוצע של המסגרות כל זמן לשגות הקליט לתוך גיליון אלקטרוני, עם, על השורות, הרצף מסגרת ועל, העמודות, oocyte יחיד לכל מנותח.
- לארגן את הנתונים של oocytes NSN וגם SN תת-קבוצות 10.
- השתמש תת-קבוצות 9 כדי לאמן את רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה iteratively (FANN) ולקבוצת המשנה 1 בדיקה עיוורת.
- אני חוזר עוד 9 פעמים, שינוי המדגם בדיקה עיוורת (10-fold קרוס-אימות).
- MATLAB, להריץ את הסקריפט מחוייט הראשי ופתוח, על פי בקשה, להוסיף את השם של הקובץ עם הנתונים הדרכה (train.txt), מספר oocytes NSN וגם SN המשמש את מרווח זמן לשגות והדרכה כדי להיות מנותח (בדרך כלל, מתוך מסגרת מס ' 1-2 להפליל # 112-113).
- לחץ על הזן כדי לבצע את האימונים.
- להוסיף את השם של הקובץ עם הנתונים הבדיקה (test.txt).
- פתח את וקטור test_outputs_cyt בסביבת MATLAB.
הערה: חלון מופיעה על המסך מציג, בשורה הראשונה, ההסתברות להשיג אמת תוצאות חיוביות (TP או נכון NSN) חיוביות שגויות (FP או כוזב NSN) עבור oocytes NSN וגם SN, בהתאמה; במקום זאת, בשורה השניה, ההסתברות לקבל שווא שליליות (FN או SN שווא). ותשלילים אמיתי (TN או SN נכון) עבור oocytes NSN וגם SN, בהתאמה. - להשתמש בנוסחה: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), כדי לחשב את רמת הדיוק של FANN, מבוטא באחוזים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מציג נציג התפתחותי מוסמך ולא יוצלח oocyte, בהתאמה בהתחלה (GV) ובסופו של דבר (MII) של ההליך IVM. IVM של העכבר לבגרות oocytes מתרחשת במהלך 15 h תרבות. התצפית זמן לשגות מתעדת את ההתקדמות של מיוזה ומזהה האירועים meiotic הגדולים, כולל GVBD את ההבלטה של הגוף הקוטב הראשון.
ניתוח והשוואה בין יותר מ 200 - נכה המוסמכת נ' oocytes כשירים הראו הבדלי הזמן ההתקדמות של מיוזה. באופן ספציפי, ב- NSN oocytes, GVBD באופן משמעותי מתעכב של 1-2 מסגרות זמן לשגות, ואילו ההבלטה PB1 מתרחשת עם עיכוב 15 מסגרות. למרות הבדלים אלה, ההשתנות היא גבוהה מדי כדי לאפשר סיווג יחיד-oocyte. מסיבה זו, ההליך בוצע עם כלי הסיווג מתמטית.
איור 3 מראה ערכה של הכלי סיווג מתמטיות שימוש, בשם הזנה-קדימה מלאכותי עצבית רשת (FANN). עבור כל oocyte מוזן דרך, FANN נותן בו זמנית את ההסתברות כי תא רבייה היא המוסמכת נכה, ההסתברות שזה כשירים oocyte. בניסויים שלנו, מסווגים FANN העכבר oocytes עם דיוק הממוצע של 91.03%.
איור 1 . נציג oocytes SN, NSN מוכתם Hoechst 33342. בעקבות בידוד מכתים עם fluorochrome Hoechst 33342, מסווגים oocytes לבגרות כמו מוקף גרעינון (SN) (א) או לא מוקף גרעינון (NSN) (B), תלוי בנוכחות (חץ) או היעדרות, בהתאמה, של טבעת של הטרוכרומטין Hoechst-חיוביות המקיפים את גרעינון. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . חלקיק ניתוח התמונה Velocimetry של תמונות בצילום מואץ. התוצאות של הניתוח PIV מוצגים להלן התמונה בהיר-שדה עבור כל אחד מסגרות זמן לשגות 113 מנותח. האיור מציג ההתחלה (GV) וסופו (MII) של תהליך ההקלטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . ייצוג סכמטי של רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה. FANN הוא כלי מתמטי המשמש לסיווג oocytes בתור התפתחותי כשיר או לא מוכשר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר שלבים קריטיים אחד אמור לטפל תוך כדי ביצוע פרוטוקול זה עם העכבר oocytes, כמו גם עם אלה של מינים אחרים. ברגע מבודד זקיקים שלהם, oocytes מיד יועברו לתוך הטיפות הקלטה, כמו פרידה תלולית לוויה תאים המפעילים תחילת המעבר GV-כדי-MII. שינוי אפשרי בפרוטוקול הנוכחי יכול להיות התוספת של 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (IBMX) למדיום M2 המשמש לבידוד COCs. IBMX מונעת את מפעילה מיידית של המעבר GV-כדי-MII ומאפשרת סנכרון של הקבוצה כל ניסיוני של oocytes.
מערכת ההקרנה-תא חי שימוש בניסויים שלנו (ראה טבלה של חומרים) מגביל את מספר טיפות ההבשלה 4 עם oocytes 4 לכל טיפה, ובכך לסך של oocytes 16 לכל ניסוי. מגבלה זו יכולה להיות להתגבר תוך שימוש בצילום מואץ בשידור חי תא-הקרנה מערכות אחרות, זמינים מסחרית ומצוידים מספר לשכות תרבות.
על סמך הניסיון שלנו, המרווח הקלטה בין מסגרת להלן הוא נקודה קריטית. לאחר מספר ניסיונות ראשוניים, לקחנו תמונות כל 8 דקות כי זה היה חלון הזמן המינימלי שמותר התצפית ברור של האירועים המרכזיים המתרחשים במהלך המעבר GV-כדי-MII, כגון פירוט vescicle נבטי ההבלטה של הגוף הקוטב הראשון. חלון הזמן הזה ייתכן שתצטרך המקראית בעת התבוננות oocytes של מינים אחרים.
החיסרון של שיטה זו היא התרבות של oocytes בהיעדר תאיהם cumulus שמסביב, כמו האחרון ידועים לשפר עוד יותר את המעבר GV-כדי-MII. ל בעניין זה, שלנו הוא עכשיו בדיקות המעבדה שינוי קל בפרוטוקול שדווחה על-ידי הכללת התרבות של נטול cumulus oocytes על שכבת מזין תאים קומולוס.
במהותה, FANN יש מספר קבוע של הקלט (מספר מודולים CMV שנותחה) והן נוירונים פלט (או של נכה כשיר או לא מוכשר oocyte), אך מספר הנוירונים מוסתר נבחר על ידי החוקר דרך המשפט תיקון גישה כדי להשיג את הביצועים הטובים ביותר של חיזוי. במקרה שלנו, אנחנו ניסויים עם מספרים שונים של נוירונים נסתרת ומצא כי שלוש נתן את התוצאות הטובות ביותר. גם, ניתוחים FANN לדרוש מספר רב של נתוני הקלט (במודולים שלנו ניסויים 112 CMV) להשיג סטטיסטיקה חזקים. שיפור אפשרי זה יכול להפחית את מספר נתוני הקלט הדרוש הוא השימוש של כלים חלופיים, כגון מכונת וקטורים תומכים, עץ-באג, או מסווגים KNN. כאשר הניתוח FANN מדגים את החוסן שלה, שלב 1 יכול להימחק מן ההליך.
פרוטוקול זה, להגדיר עבור העכבר, נבדק על oocytes של מינים אחרים כולל בני אדם. יתר על כן, השילוב של זמן לשגות הקלטה עם PIV, רשת עצבית ניתוחים ניתן לנצל עבור הצפיה CMVs מופרות10,11 , של העוברים על ההערכה של שלהם עוד יותר הפוטנציאל ההתפתחותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נעשתה התאפשרה הודות לתמיכה על ידי: אוניברסיטת פאביה FRG 2016; האוניברסיטה של פארמה FIL 2014, 2016; Kinesis לאספקת plasticware את הצורך לבצע את המחקר הזה. אנו מודים ד"ר שיין וינדזור (הפקולטה להנדסה, אוניברסיטת בריסטול, אנגליה) למתן את התוכנה Cell_PIV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
