Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione non invasiva della competenza di sviluppo dell'oocita eseguita durante la loro maturazione in vitro dalla vescicola germinale per la fase di metafase II. Questo metodo combina immagini time-lapse con particle image velocimetry (PIV) e analisi di rete neurale.
Abstract
Cliniche per l'infertilità trarrebbe vantaggio dalla possibilità di selezionare inerente allo sviluppo competente vs incompetente ovociti utilizzando procedure non invasive, migliorando così il risultato complessivo di gravidanza. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di classificazione basato sull'osservazione diretta al microscopio oocytes del mouse durante la loro maturazione in vitro dalla vescicola germinale (GV) per la fase di metafase II, seguita dall'analisi dei movimenti citoplasmatici che si verificano durante questo periodo di time-lapse. Qui, presentiamo protocolli dettagliati di questa procedura. Gli ovociti sono isolati da follicoli antrali adulte e coltivati per 15 h all'interno di un microscopio equipaggiato per l'analisi time-lapse a 37 ° C e 5% CO2. Immagini sono prese ad intervalli di 8 min. Le immagini vengono analizzati utilizzando il metodo di Particle Image Velocimetry (PIV) che calcola, per ogni prelievo di ovociti, il profilo delle velocità di movimento citoplasmatica (CMVs) che si verificano durante tutto il periodo di cultura. Infine, il CMVs di ogni singolo ovocita sono alimentati attraverso uno strumento di classificazione matematica (rete neurale Feed-forward, FANN), che predice la probabilità di un gamete essere inerente allo sviluppo competente o incompetente con una precisione di 91.03%. Questo protocollo, impostare per il mouse, potrebbe ora essere testato su ovociti di altre specie, compreso gli esseri umani.
Introduction
Infertilità femminile è una patologia che colpisce un numero crescente di donne. Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, circa il 20% delle coppie sono infertili, con un 40% a causa di infertilità femminile. In aggiunta, un terzo delle donne che subiscono trattamenti contro il cancro (300.000/anno e 30.000/anno negli USA o in Italia, rispettivamente) sviluppare insufficienza ovarica prematura.
Una strategia per prevenire l'infertilità in malati di cancro è l'isolamento e la crioconservazione dei follicoli ovarici prima del trattamento oncologico, seguita da maturazione in vitro (IVM) di ovociti GV alla fase MII (transizione GV-a-MII). La disponibilità di marcatori non invasivi di competenza di sviluppo dell'ovocita migliorerebbe la fertilizzazione e processi di sviluppo e il generale gravidanza successo1,2.
Basato sulla loro configurazione cromatinica osservato dopo colorazione con fluorocromo supravital Hoechst 33342, mammiferi adulti ovociti sono classificati come un nucleolo circondato (SN) o un nucleolo non circondato (NSN)3. Oltre a loro nell'organizzazione cromatinica diversi, questi due tipi di ovociti visualizzano molte differenze morfologiche e funzionali3,4,5,6,7,8 ,9, tra cui la loro competenza meiotica e inerente allo sviluppo. Quando isolato dall'ovaia e maturato in vitro, entrambi tipo di ovociti raggiungono la fase MII e dopo l'inseminazione di spermatozoi, sviluppare alla fase 2 celle, ma solo quelli con un'organizzazione della cromatina SN può sviluppare a termine9. Anche se buono come un metodo di classificazione per la selezione competente vs incompetente ovociti, lo svantaggio principale è l'effetto mutageno che il fluorocromo stesso e, soprattutto, la luce UV utilizzato per la sua individuazione potrebbe avere sulle cellule.
Per tutte queste ragioni, abbiamo cercato altri marcatori non invasivi associati con la conformazione cromatinica SN o NSN che potrebbe sostituire l'uso di Hoechst pur mantenendo la stessa accuratezza di classificazione alta. L'osservazione di time-lapse di citoplasmico velocità di movimento (CMVs) sta emergendo come una caratteristica distintiva dello stato della cella. Ad esempio, recenti studi hanno dimostrato che l'associazione fra CMVs registrato al momento della fecondazione e la capacità di mouse e zigoti umani di preimpianto completo e pieno-termine sviluppo10,11.
Basato su questi studi precedenti, descriviamo qui una piattaforma per il riconoscimento del mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente ovociti adulto5,6,7,8. La piattaforma è basata su tre fasi principali: 1) ovociti isolati da follicoli antrali prima vengono classificati in base alla loro configurazione della cromatina sia come un nucleolo circondato (SN) o un nucleolo non-circondato (NSN); 2) time-lapse immagini di CMVs che si verificano durante la transizione di GV-a-MII di ogni singolo ovocita vengono presi ed analizzati con particle image velocimetry (PIV); e 3) i dati ottenuti con PIV sono analizzati con un Feed-forward artificiale Neural Network (FANN) per classificazione cieco12,13. Diamo dettagli delle fasi più critiche della procedura progettata per il mouse per renderlo pronto disponibile per essere testato e utilizzato per altre specie di mammiferi (ad es., bovino, scimmie e gli esseri umani).
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso e comitati etici presso Università di Pavia. Animali sono stati mantenuti in condizioni di 22 ° C, umidità 60 %) e un ciclo luce/buio di 12:12 h.
1. ovaia isolamento
- Iniettare per via intraperitoneale 2 quattro a undici settimana-vecchio femminili topi CD1 con 10 U di ormone follicolo-stimolante con una siringa da insulina 1 mL sterile.
- Attendere 46-48 h.
- Pesare il mouse e anestetizzare con un'iniezione intramuscolare di 50 mg/kg di Zoletil (Tiletamina e Zolazepan cloridrato). Eutanasia di dislocazione cervicale.
- Afferrare la pelle che copre la parete addominale usando un paio di pinze per dissezione. Tagliare la pelle e la parete del corpo con un paio di forbici e aprite l'incisione con il forcipe.
- Utilizzando un paio di pinzette, spostare le budella a parte, i corni uterini di individuare e localizzare le ovaie alle loro estremità.
- Delicatamente tenere l'ovaia usando pinze orologiaio e usare le forbici per tagliare il legamento all'utero. Ripetere con l'altra ovaia.
- Trasferire le ovaie raccolte in una capsula di Petri cultura 35 mm cella contenente 1 mL di M2 isolamento medio pre-riscaldato a 37 ° C, 5% CO2 presente nell'aria.
- Rimuovere il grasso e l'ovidotto utilizzando forbici bene sotto un microscopio stereoscopico.
2. isolamento di complessi cumulo degli ovociti
- Perforare la superficie ovarica utilizzando pinzette sterili e un ago da insulina sterile 1G fino a complessi di antral cumulo degli ovociti (COC) passivamente vengono rilasciati.
- Raccogliere i contraccettivi orali combinati con più di tre strati di cellule del cumulo utilizzando una controllata bocca tirata a mano Pasteur micropipetta (200 µm di diametro) e trasferirli in una goccia di 300 µ l di terreno di M2 nuovo.
- Rimuovere le cellule del cumulo che circondano gli ovociti utilizzando una micropipetta Pasteur tirata a mano (80 µm di diametro) pipettando delicatamente dentro e fuori per alcuni secondi,
- Ripetutamente trasferire ovociti da una goccia di 20 µ l di M2 medium ad un altro, fino a quando le cellule del cumulo sono completamente eliminate.
3. classificazione basata sull'organizzazione degli ovociti cromatina
- Preparare soluzione colorante Hoechst 33342 ad una concentrazione finale di 0,05 µ g/mL in M2 media a partire da una soluzione madre di 5 mg/mL diluito in PBS 1X.
- Posizionare 3,5 µ l micro gocce di Hoechst macchiatura soluzione nella parte inferiore di un coperchio di scatola di Petri di 35 mm.
- Trasferire ogni singolo ovocita in una goccia di colorazione di Hoechst, posizionare il piatto su una piastra di riscaldamento pre-riscaldata (37 ° C) e coprire con un coperchio scuro per evitare esposizione luce.
- Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, è necessario osservare gli ovociti con un microscopio a fluorescenza a 10 ingrandimenti alla luce UV (330-385 nm), per non più di 1-2 s.
- Classificare gli ovociti come un nucleolo circondato (SN) (Figura 1A), se presentano un anello della cromatina di Hoechst-positiva che circonda il nucleolo.
- Classificare gli ovociti come un nucleolo non circondato (NSN), se loro nucleolo non è circondato da cromatina Hoechst-positivo e spettacoli disperdono heterochromatic macchie all'interno del nucleo (Figura 1B).
4. neural Network-Based ovocita classificazione
- Preparare quattro 2 µ l gocce di medium di α-MEM supplementato con siero bovino fetale inattivati 5%, 2 mM L-Glutammina, taurina di 5 mM, penicillina U/mL 100, 75 µ g/mL di streptomicina e 23,5 µ µ g/l sodio piruvato in un bicchiere da 35 mm inferiore di Petri e coprirli con pre-riscaldata (37 ° C) e l'olio minerale pre-equilibrato per evitare l'evaporazione media.
Nota: Se si utilizza un sistema di screening cellulare dal vivo, mantenere le gocce a una distanza specifica utilizzando una griglia disegnata di 7 x 7 mm come linea guida. - Trasferimento 3 - 4 ovociti ad ogni goccia.
- Inserire il fondo di vetro di Petri in un sistema cellulare-proiezione live, dotato di software di registrazione time-lapse (Vedi Tabella materiali), che permette l'osservazione di maturazione degli ovociti in un ambiente con temperatura stabile (37 ° C) e CO2 concentrazione (5%).
- Aprire il software di registrazione time-lapse. Sullo schermo viene visualizzata una finestra con una ripresa dal vivo dell'ovocita sul lato sinistro e tutti i pulsanti di impostazione sul lato destro.
- Selezionare il centro dell'ovocita per posizionarlo al centro dello schermo. Se necessario, regolare la messa a fuoco.
- Selezionare il pulsante di Ph e impostata la Lampada diametro 192; il tempo di esposizione di 1/125 s; il guadagno - 1,99; e la risoluzione di 1600 x 1200.
- Selezionare FL2 e impostare la Lampada diametro a 5; il tempo di esposizione di 3 s; il guadagno - 2,37; e la risoluzione di 1600 x 1200.
- Selezionare il pulsante New punto al fine di registrare la posizione di ovocita all'interno della goccia di cultura. Ripetere la stessa routine per ogni ovocita all'interno della goccia di cultura.
- Selezionare ora e impostare il ciclo di acquisizione a 8 min e il tempo totale di 15 h.
- Selezionare Start Time-lapse per avviare il ciclo di registrazione.
- Aprire il software MATLAB e scrivere >>cell_piv; e quindi selezionare lo Strumento di PIV.
- Scegliere la cartella contenente il film registrato e selezionare i file. jpeg per caricare la sequenza intera immagine. Per ogni ovocita, selezionare la regione di interesse (ROI) facendo lo strumento selezione area.
- Nel menu File, selezionare Processo PIV . Selezionare il pulsante Strumento Visualizzatore .
Nota: Il programma consente di calcolare i vettori di velocità all'interno il ROI e produce automaticamente un file di dati salvato in un file. mat. - Selezionare il file. mat da aprire. Selezionare il pulsante strumento ROI selezionare e disegnare un cerchio attorno al contorno dell'ovocita. Scegliere Salva dal menu File.
Nota: I vettori in questa regione sono ora visualizzati e i dati di media grandezza nella finestra del grafico aggiornato per questo nuovo ROI. - Aperto i dati raccolti in magnitudine dei frame intero time-lapse registrati in un foglio di calcolo, con le righe, la sequenza di fotogrammi e, sulle colonne, ogni singolo ovocita analizzato.
- Organizzare i dati degli ovociti sia NSN e SN in 10 sottogruppi.
- Utilizzare 9 sottogruppi per addestrare la rete neurale feed-forward artificiale in modo iterativo (FANN) e 1 sottogruppo per blind test.
- Ripetere un altro 9 volte, cambiando il campione di prova cieco (10 volte la convalida incrociata).
- Aprire MATLAB, eseguire script su misura principale e, su richiesta, inserire il nome del file con i dati di training (train.txt), il numero di ovociti NSN e SN utilizzato per la formazione e l'intervallo di time-lapse da analizzare (in genere, da telaio n. 1-2 al telaio n. 112-113).
- Premere immettere per effettuare la formazione.
- Inserire il nome del file con i dati di prova (test. txt).
- Aprire il vettore test_outputs_cyt nell'area di lavoro MATLAB.
Nota: Viene visualizzata una finestra sullo schermo che mostra, in prima fila, la probabilità di ottenere veri positivi (TP o vero NSN) e falsi positivi (FP o False NSN) per ovociti NSN e SN, rispettivamente; invece, nella seconda riga, la probabilità di ottenere falsi negativi (FN o SN False) e veri negativi (TN o vero SN) per ovociti NSN e SN, rispettivamente. - Utilizzare la formula: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), per calcolare la precisione FANN, espressa in percentuale.
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Representative Results
La figura 2 Mostra un rappresentanza ovocita inerente allo sviluppo competente e incompetente, rispettivamente all'inizio (GV) e alla fine della procedura IVM (MII). IVM di ovociti di topo adulto si verifica durante la coltura di 15 h. L'osservazione di time-lapse registra la progressione della meiosi e rileva gli eventi meiotici principali, tra cui il GVBD e l'estrusione del primo corpo polare.
L'analisi e il confronto di più di duecento inerente allo sviluppo competente vs incompetente ovociti ha mostrato differenze di tempo nella progressione della meiosi. In particolare, in ovociti NSN, GVBD è significativamente ritardata di 1-2 fotogrammi time-lapse, mentre l'estrusione PB1 avviene con un ritardo di 15 fotogrammi. Nonostante queste differenze, la variabilità è troppo elevata per consentire la classificazione di singolo-ovocita. Per questo motivo, la procedura è stata implementata con uno strumento di classificazione matematica.
La figura 3 Mostra uno schema dello strumento matematico di classificazione utilizzato, denominato Feed-forward artificiale Neural Network (FANN). Per ogni ovocita alimentato attraverso, FANN dà contemporaneamente la probabilità che il gamete è un inerente allo sviluppo competente e la probabilità che si tratti di un ovocita incompetente. Nei nostri esperimenti, la FANN classificati oocytes del mouse con una precisione media di 91.03%.
Figura 1 . Rappresentante ovociti SN e NSN colorati con Hoechst 33342. A seguito di isolamento e colorazione con fluorocromo Hoechst 33342, adulti ovociti sono classificati sia come circondato nucleolo (SN) (A) o non circondato nucleolo (NSN) (B), a seconda della presenza (freccia) o assenza, rispettivamente, di un anello di Eterocromatina di Hoechst-positiva che circonda il nucleolo. Barra della scala: 5 µm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Particle Image Velocimetry analisi di time-lapse immagini. I risultati dell'analisi PIV sono mostrati sotto l'immagine di campo chiaro per ciascuno dei 113 frame time-lapse analizzati. La figura mostra l'inizio (GV) e alla fine (MII) del processo di registrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Rappresentazione schematica della rete neurale artificiale Feed-forward. FANN è lo strumento matematico utilizzato per classificare gli ovociti come inerente allo sviluppo competente o incompetente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono diversi passaggi critici uno dovrebbe prendersi cura di durante l'esecuzione di questo protocollo con oocytes del mouse nonché con quelle di altre specie. Una volta isolato dai loro follicoli, ovociti dovrebbero essere immediatamente trasferiti nelle gocce di registrazione, come la separazione del cumulus compagno cellule trigger l'inizio della transizione GV-a-MII. Un'eventuale modifica del presente protocollo potrebbe essere l'aggiunta di 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) al M2 mezzo utilizzato per l'isolamento di COC. IBMX previene l'attivazione immediata della transizione GV-a-MII e permette una sincronizzazione del gruppo intero sperimentale degli ovociti.
Il sistema live di cella di screening utilizzato nei nostri esperimenti (Vedi Tabella materiali) limita il numero di gocce di maturazione per 4 con 4 ovociti per goccia, così a un totale di 16 ovociti per esperimento. Questa limitazione potrebbe essere superata utilizzando altri sistemi cellulari-screening live time-lapse, commercialmente disponibili e dotati di parecchi alloggiamenti di cultura.
Basandoci sulla nostra esperienza, l'intervallo di registrazione tra un fotogramma e il seguente è un punto critico. Dopo una serie di esperimenti preliminari, abbiamo preso immagini ogni 8 minuti perché questo era l'intervallo di tempo minimo che ha permesso l'osservazione libera dei grandi eventi che si verificano durante la transizione di GV-a-MII, ad esempio la ripartizione delle vescicole germinali e l'estrusione del primo corpo polare. Questa finestra di tempo potrebbe essere necessario essere rivalutati quando osservando gli ovociti di altre specie.
Uno svantaggio di questo metodo è la cultura di ovociti in assenza di loro circostanti cellule del cumulo, come quest'ultimo è conosciuto per migliorare ulteriormente la transizione di GV-a-MII. A questo proposito, il nostro laboratorio sta ora testando una leggera modifica al protocollo segnalato includendo la cultura degli ovociti cumulus-libero su uno strato dell'alimentatore di cellule cumulus.
Per sua natura, la FANN ha un numero fisso di input (il numero di moduli di CMV analizzati) sia i neuroni di output (sia un ovocita inerente allo sviluppo competente o incompetente), ma il numero di neuroni nascosti è scelto dallo sperimentatore attraverso un processo e correzione approccio per ottenere le migliori prestazioni di stima. Nel nostro caso, abbiamo sperimentato con un diverso numero di neuroni nascosti e abbiamo trovato che tre ha dato i migliori risultati. Inoltre, FANN analisi richiede un gran numero di dati di input (nei nostri moduli di CMV 112 esperimenti) per ottenere una statistica robusta. Un eventuale miglioramento che potrebbe ridurre il numero di dati di input necessari è l'uso di strumenti alternativi di classificazione, ad esempio Support Vector Machine, albero-borsa o classificatori KNN. Quando l'analisi FANN dimostra la sua robustezza, passaggio 1 potrebbe essere eliminato dalla procedura.
Questo protocollo, impostare per il mouse, potrebbe essere testato su ovociti di altre specie, compreso gli esseri umani. Inoltre, la combinazione di time-lapse registrazione con PIV e rete neurale analisi potrebbero essere sfruttate per l'osservazione di CMVs zigoti10,11 e in embrioni preimpianto per la valutazione della loro ulteriore potenziale di sviluppo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato reso possibile grazie al sostegno di: Università di Pavia RFG 2016; Università di Parma FIL 2014, 2016; e Kinesis per fornire il plasticware necessarie per svolgere questo studio. Ringraziamo il Dr. Shane Windsor (facoltà di ingegneria, Università di Bristol, UK) per la fornitura del software di Cell_PIV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
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