Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliação não invasiva de competência no desenvolvimento de oócito realizada durante sua em vitro maturação da vesícula germinal à fase de metáfase II. Este método combina imagens de lapso de tempo com análises de rede neural e Velocimetria por imagem (PIV).
Abstract
Clínicas de infertilidade beneficiaria a habilidade de selecionar mentalmente competente vs incompetente oócitos usando procedimentos invasivos, melhorando assim o resultado global da gravidez. Recentemente desenvolvemos um método de classificação baseado em observações ao vivo microscópicas de ovócitos de rato durante sua em vitro maturação da vesícula germinal (GV) à fase metáfase II, seguido da análise dos movimentos citoplasmáticos ocorrem durante este período de lapso de tempo. Aqui, apresentamos protocolos detalhados deste procedimento. Oócitos são isolados de folículos antrais já crescidos e cultivados para 15 h no interior de um microscópio equipado para a análise de lapso de tempo a 37 ° C e 5% de CO2. Fotos são tiradas em intervalos de 8 min. As imagens são analisadas usando o método Particle Image Velocimetry (PIV) que calcula, para cada oócito, o perfil de velocidades de movimento citoplasmático (CMVs) ocorrendo durante todo o período de cultura. Finalmente, os CMVs de cada único oócito são alimentados através de uma ferramenta de classificação matemática (Feed-forward de Rede Neural Artificial, FANN), que prevê a probabilidade de um gameta ser mentalmente competente ou incompetente com uma precisão de 91.03%. Este protocolo, configurar para o mouse, agora poderia ser testado em oócitos de outras espécies, incluindo seres humanos.
Introduction
Infertilidade feminina é uma patologia que afecta um número crescente de mulheres. De acordo com a Organização Mundial de saúde, cerca de 20% dos casais são inférteis, com um 40% devido à infertilidade feminina. Além disso, um terço das mulheres passando por tratamentos contra o cancro (300.000 por ano e 30.000/ano nos EUA e Itália, respectivamente) desenvolver falência ovariana prematura.
Uma estratégia para impedir a infertilidade em pacientes com câncer é o isolamento e criopreservação de folículos nos ovários antes do tratamento oncológico, seguido em vitro maturação (IVM) de ovócitos GV à fase MII (transição de GV-para-MII). A disponibilidade de marcadores não-invasivo de competência no desenvolvimento de oócito melhoraria a fertilização e processos de desenvolvimento e o global gravidez sucesso1,2.
Com base na sua configuração de cromatina observada após coloração com o fluorocromo supravital Hoechst 33342, oócitos já crescidos mamíferos classificam-se como um nucléolo rodeado (SN) ou um não cercado nucléolo (NSN)3. Além de sua organização da cromatina diferentes, estes dois tipos de oócitos exibir muitas diferenças morfológicas e funcionais3,4,5,6,7,8 ,9, incluindo sua competência meiótica e do desenvolvimento. Quando isolado do ovário e amadurecido em vitro, ambos tipo de oócitos alcance o estágio MII e após a inseminação de espermatozoides, desenvolvem-se para a fase 2-célula, mas apenas aqueles com uma organização da cromatina SN podem desenvolver a termo9. Embora bom como um método de classificação para selecionar competente vs incompetente oócitos, a principal desvantagem é o efeito mutagénico que o fluorocromo em si e, acima de tudo, a luz UV usado para sua detecção podem ter sobre as células.
Por todas estas razões, nós procuramos por outros marcadores não invasivos associados a conformação da cromatina SN ou NSN que poderia substituir o uso de Hoechst, mantendo a mesma precisão de alta classificação. A observação do tempo-lapso de velocidades de movimento citoplasmático (CMVs) está emergindo como uma característica distintiva do status do celular. Por exemplo, estudos recentes demonstraram que a associação entre CMVs gravado no momento da fertilização e da capacidade de zigotos humanos e rato pré-implantacional completa e desenvolvimento termo10,11.
Baseado nestes estudos anteriores, descrevemos aqui uma plataforma para o reconhecimento de rato mentalmente competente ou incompetente oócitos já crescido5,6,7,8. A plataforma é baseada em três etapas principais: 1) oócitos isolados de folículos antrais primeiro são classificados com base na sua configuração de cromatina ou como um nucléolo rodeado (SN) ou um nucléolo não-cercado (NSN); 2) Time-Lapse imagens de CMVs ocorrendo durante a transição de GV-para-MII de cada único oócito são tomadas e analisadas com Velocimetria por imagem (PIV); e 3) os dados obtidos com PIV são analisados com um Feed-forward Artificial Neural Network (FANN) para classificação cego12,13. Nós dar detalhes das etapas mais críticas do processo projetado para o mouse para torná-lo pronto para ser testado e usado para outras espécies de mamíferos (por exemplo, bovinos, macacos e humanos).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso e comitês de ética na Universidade de Pavia. Os animais foram mantidos em condições de 22 ° C, umidade do ar de 60% e um ciclo claro/escuro de 12:12 h.
1. ovário isolamento
- Injete intraperitonealmente 2-para-quatro as onze semanas CD1 ratos fêmeas com 10 U de hormônio folículo estimulante com uma seringa de insulina de 1ml estéril.
- Espere 46-48 h.
- Pesar o mouse e anestesiar com uma injeção intramuscular de 50 mg/kg de Zoletil (zolazepan Tiletamina e cloridrato). Eutanásia por deslocamento cervical.
- Segure a pele que cobre a parede abdominal, usando um par de pinças de dissecação. Cortar a pele e a parede do corpo com uma tesoura e abra a incisão com fórceps.
- Usando um par de pinças, mova a coragem à parte, identificar os cornos uterinos e localizar os ovários em sua extremidade.
- Delicadamente segurar o ovário usando pinça de relojoeiro e use tesouras para cortar seu ligamento para o útero. Repita com o outro ovário.
- Transferi os ovários coletados em um prato de Petri de cultura 35mm célula contendo 1 mL de meio de isolamento M2 pré aquecido a 37 ° C, 5% de CO2 no ar.
- Remova a gordura e o oviduto usando tesouras bem sob um estereomicroscópio.
2. isolamento de Cumulus oócito complexos
- Perfure a superfície ovariana, usando uma pinça estéril e uma agulha de insulina estéril de 1G até complexos de antral cumulus oócito (COCs) são liberados passivamente.
- Coletar COCs com mais de três camadas de células do cumulus usando uma boca-controlada mão-puxado Pasteur micropipeta (200 µm de diâmetro) e transferi-los para uma gota de 300 µ l de meio fresco M2.
- Remover as células do cumulus envolvendo oócitos usando uma micropipeta de Pasteur puxados à mão (80 µm de diâmetro) pipetando suavemente dentro e para fora por alguns segundos,
- Repetidamente transferi oócitos de uma gota de 20 µ l de meio M2 para a outra, até que as células do cumulus são completamente eliminadas.
3. classificação de ovócito baseada na organização da cromatina
- Prepare a solução de coloração de Hoechst 33342 em uma concentração final de 0,05 µ g/mL em M2 médio a partir de uma solução mãe de 5 mg/mL, diluído em PBS 1x.
- Coloca 3,5 gotículas de micro µ l de Hoechst solução no fundo de uma tampa de caixa de Petri de 35 mm de coloração.
- Transferir cada único oócito para uma coloração gota a Hoechst, coloque o prato em uma placa de aquecimento previamente aquecido (37 ° C) e cubra com uma tampa escura para evitar a exposição de luz.
- Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, observe os oócitos com um microscópio de fluorescência na ampliação de 10x sob luz UV (330-385 nm), para não mais do que 1-2 s.
- Classifica oócitos como um nucléolo rodeado (SN) (figura 1A), se eles apresentam um anel da cromatina Hoechst-positivo em torno do nucléolo.
- Classifica oócitos como um nucléolo não cercado (NSN), se o nucléolo não é rodeado por cromatina Hoechst-positivo e mostra dispersar heterocromático pontos dentro do núcleo (figura 1B).
4. neural Network-Based oócito classificação
- Prepare quatro 2 gotas µ l de meio de α-MEM suplementado com 5% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 2 mM L-glutamina, taurina de 5 mM, 100 U/mL penicilina, 75 µ g/mL Estreptomicina e piruvato 23,5 µ g / µ l de sódio em um vidro de 35 mm inferior a placa de Petri e cubra-os com pré-aquecido (37 ° C) e pre-equilibrado óleo mineral para evitar a evaporação média.
Nota: Se utilizar um sistema de célula-seleção ao vivo, manter as gotas a uma distância específica, usando uma grade desenhada de 7 x 7 mm como uma diretriz. - Oócitos de transferência 3 - 4 para cada gota.
- Colocar o fundo de vidro, placa de Petri em um sistema de célula-seleção ao vivo, equipado com software de gravação de lapso de tempo (veja a Tabela de materiais), que permite a observação de maturação do ovócito em um ambiente com temperatura estável (37 ° C) e CO2 concentração (5%).
- Abra o software de gravação de lapso de tempo. Na tela aparece uma janela com uma imagem ao oócito no lado esquerdo e todos os botões de ajuste no lado direito.
- Selecione o centro do oócito para posicioná-la no centro da tela. Se necessário, ajuste o foco.
- Selecione o botão de Ph e definir o Diâmetro da lâmpada para 192; o tempo de exposição de de 1/125 s; o ganho de 1,99; e a resolução de 1600 x1200.
- Selecione FL2 e defina o Diâmetro da lâmpada para 5; o tempo de exposição para 3 s; o ganho de 2,37; e a resolução de 1600 x1200.
- Selecione o botão New aponte para gravar a posição do oócito dentro da gota de cultura. Repita a mesma rotina para cada oócito dentro da gota de cultura.
- Selecione o tempo e definir o ciclo de aquisição de 8 min e o tempo Total de 15 h.
- Selecione iniciar o lapso de tempo para iniciar o ciclo de gravação.
- Abra o software MATLAB e escrever >>cell_piv; e, em seguida, selecione a Ferramenta PIV.
- Escolha a pasta que contém o filme gravado e selecione qualquer um dos arquivos. jpeg para carregar a sequência de toda a imagem. Para cada oócito, selecione a região de interesse (ROI) clicando o Selecione a ferramenta de área.
- Selecione o Processo PIV no menu arquivo. Selecione o botão de Ferramenta de visualizador .
Nota: O programa irá calcular os vetores de velocidade dentro o ROI e produz automaticamente um arquivo de dados, salvo como um arquivo de Mat. - Selecione o arquivo de Mat para abrir. Selecione o botão selecionar ROI tool e desenhe um círculo ao redor do contorno do oócito. No menu arquivo, clique em salvar.
Nota: Os vetores nesta região são exibidos e os dados de amplitude média na janela do gráfico atualizado para este novo ROI. - Aberto os dados coletados de magnitude média dos quadros todo lapso de tempo registrado em uma planilha, com as linhas, a sequência de quadros e, nas colunas, cada único oócito analisado.
- Organize os dados de ovócitos tanto NSN e SN em 10 subgrupos.
- Use 9 subgrupos para treinar a rede neural artificial de feed-forward iterativamente (FANN) e 1 subgrupo para teste cego.
- Repita outra 9 vezes, mudando a amostra de teste cega (10 vezes a validação cruzada).
- Abrir o MATLAB, execute o script feito por principal e, quando solicitado, insira o nome do arquivo com os dados de treinamento (train.txt), o número de oócitos NSN e SN usado para treinamento e o intervalo de lapso de tempo para ser analisado (normalmente, a partir de quadro # 1-2 para enquadrar # 112-113).
- Pressione enter para realizar o treinamento.
- Insira o nome do arquivo com os dados de teste (Test. txt).
- Abra o vetor test_outputs_cyt no espaço de trabalho do MATLAB.
Nota: Uma janela aparece na tela mostrando, na primeira linha, a probabilidade de obter verdadeiros positivos (TP ou verdadeiro NSN) e falsos positivos (FP ou False NSN) para oócitos NSN e SN, respectivamente; em vez disso, na segunda linha, a probabilidade de obter falsos negativos (FN ou False SN) e verdadeiro negativos (TN ou SN True) para oócitos NSN e SN, respectivamente. - Use a fórmula: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), para calcular a precisão FANN, expressada em percentagem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 2 mostra um representante oócito mentalmente competente e incompetente, respectivamente no início (GV) e no final do procedimento de IVM (MII). IVM de ovócitos de rato já crescido ocorre durante a cultura de 15 h. A observação de lapso de tempo grava a progressão da meiose e detecta grandes eventos meióticos, incluindo a GVBD e a extrusão do primeiro corpo polar.
Análise e comparação de mais de duzentos mentalmente competente vs ovócitos incompetente mostraram diferenças de tempo na progressão da meiose. Especificamente, em oócitos NSN, GVBD é significativamente atrasado de 1-2 quadros de lapso de tempo, Considerando que a extrusão de PB1 ocorre com um atraso de 15 quadros. Apesar dessas diferenças, a variabilidade é muito alta para permitir a classificação de single-oócito. Por este motivo, o procedimento foi implementado com uma ferramenta de classificação de matemática.
A Figura 3 mostra um esquema da ferramenta matemática de classificação usado, chamado Feed-forward Artificial Neural Network (FANN). Para cada oócito alimentado através de, FANN simultaneamente dá a probabilidade que o gameta é um mentalmente competente e a probabilidade é um oócito incompetente. Em nossos experimentos, o FANN classificados oocytes do rato com uma precisão média de 91.03%.
Figura 1 . Representante oócitos SN e NSN manchado com Hoechst 33342. Após o isolamento e a coloração com o fluorocromo Hoechst 33342, já crescidos oócitos são classificados como cercado nucléolo (SN) (A) ou não cercados nucléolo (NSN) (B), dependendo da presença (seta) ou ausência, respectivamente, de um anel de Hoechst-positivo heterocromatina em torno do nucléolo. Barra de escala: 5 µm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Análise de imagem de partícula de lapso de tempo imagens. Os resultados da análise PIV são mostrados abaixo da imagem de campo claro para cada um dos 113 quadros lapso de tempo analisados. A figura mostra o início (GV) e final (MII) o processo de gravação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Representação esquemática da Rede Neural Artificial Feed-forward. FANN é a ferramenta matemática utilizada para classificar os oócitos como mentalmente competente ou incompetente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Existem várias etapas críticas um deve cuidar da durante a execução do presente protocolo com oócitos de rato, bem como com os de outras espécies. Uma vez isolados de seus folículos, oócitos devem ser imediatamente transferidos para as gotas de gravação, como a separação do cumulus companheiro células disparadores o início da transição GV-para-MII. Uma eventual modificação do presente protocolo pode ser a adição de 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) para o meio de M2 utilizado para isolamento de COCs. IBMX impede o desencadeamento imediato do processo de transição de GV-para-MII e permite uma sincronização do grupo todo experimental de ovócitos.
O sistema de célula-seleção ao vivo usado em nossos experimentos (ver Tabela de materiais) limita o número de gotas de maturação de 4 com 4 oócitos por gota, assim, para um total de 16 ovócitos por experiência. Esta limitação pode ser superada utilizando outros sistemas celulares-rastreio ao vivo lapso de tempo, comercialmente disponíveis e estão equipados com várias câmaras de cultura.
Baseado em nossa experiência, o intervalo de gravação entre um frame e a seguir é um ponto crítico. Após uma série de experimentos preliminares, levamos imagens cada 8 min porque esta era a janela de tempo mínimo que permitiu a observação clara dos principais eventos ocorridos durante a transição de GV-para-MII, tais como a repartição vescicle germinal e a extrusão do primeiro corpo polar. Esta janela de tempo talvez precise ser reavaliados quando observando oócitos de outras espécies.
Uma desvantagem deste método é a cultura de ovócitos na ausência de suas células cumulus circundantes, como o último é conhecido para melhorar ainda mais a transição de GV-para-MII. A este respeito, nosso laboratório está agora testando uma ligeira modificação do protocolo relatados, incluindo a cultura de ovócitos cumulus-livre em cima de uma camada de alimentador de células cumulus.
Pela sua natureza, o FANN tem um número fixo de entrada (o número de módulos de CMV analisados) e neurônios de saída (ou um oócito mentalmente competente ou incompetente), mas o número de neurônios ocultos é escolhido pelo investigador através de um julgamento e correção abordagem para obter o melhor desempenho de previsão. No nosso caso, nós experimentou com diferentes números de neurônios ocultos e descobriu que três deram os melhores resultados. Além disso, análises FANN exigem um grande número de dados de entrada (em nossos módulos de CMV 112 experimentos) para obter uma estatística robusta. Uma possível melhoria que poderia reduzir o número de dados de entrada necessários é a utilização de ferramentas de classificação alternativa, tais como a máquina do vetor da sustentação, árvore-saco, ou KNN classificadores. Quando a análise FANN demonstra sua robustez, etapa 1 poderia ser eliminada do procedimento.
Este protocolo, configurar para o mouse, poderia ser testado em oócitos de outras espécies, incluindo seres humanos. Além disso, a combinação de lapso de tempo gravando com PIV e rede neural análises podem ser exploradas para a observação de CMVs em zigotos10,11 e em embriões pré-implantação para a avaliação dos seus mais potencial do desenvolvimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho tornou-se possível graças ao apoio por: Universidade de Pavia FRG 2016; Universidade de Parma FIL 2014, 2016; e Kinesis para fornecer o plasticware necessária para realizar este estudo. Agradecemos o Dr. Shane Windsor (Faculdade de engenharia, Universidade de Bristol, Reino Unido) para fornecer o software Cell_PIV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
