Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación no invasiva de competencia desarrollo de oocito durante su maduración en vitro de la vesícula germinal a la etapa de metafase II. Este método combina la proyección de imagen de Time-lapse con partículas imagen velocimetry (PIV) y análisis de redes neuronales.
Abstract
Clínicas de infertilidad se beneficiarían de la capacidad para seleccionar al desarrollo competente vs incompetente ovocitos utilizando procedimientos no invasivos, mejorando así el resultado general del embarazo. Recientemente se desarrolló un método de clasificación basado en observaciones energizados microscopio de ovocitos de ratón durante su maduración en vitro de la vesícula germinal (VG) a la etapa de metafase II, seguida por el análisis de los movimientos citoplasmáticos que ocurre durante este período de lapso de tiempo. Aquí, presentamos protocolos detallados de este procedimiento. Ovocitos son aislados folículos antrales adulto y cultivados durante 15 h dentro de un microscopio equipado para Time-lapse análisis a 37 ° C y 5% CO2. Los cuadros son tomados a intervalos de 8 minutos. Las imágenes son analizadas utilizando el método de imagen de partícula Velocimetry (PIV) que calcula, para cada ovocito, el perfil de velocidades de movimiento citoplásmico (CMVs) que ocurren durante el período de la cultura. Por último, CMVs de cada ovocito solo son alimentados a través de una herramienta de clasificación matemática (red neuronal Artificial de Feed-forward, FANN), que predice la probabilidad de que un gameto al desarrollo competente o incompetente con una precisión de 91.03%. Este protocolo, configurar el ratón, ahora podría ser probado en ovocitos de otras especies, incluyendo a seres humanos.
Introduction
Infertilidad femenina es una patología que afecta a un número creciente de mujeres. Según la Organización Mundial de la salud, 20% de las parejas son infértil, con un 40% debido a la infertilidad femenina. Además, un tercio de las mujeres sometidas a tratamientos contra el cáncer (300.000/año y 30.000 al año en Estados Unidos o Italia, respectivamente) desarrollar falla ovárica prematura.
Una estrategia para prevenir la infertilidad en pacientes con cáncer es el aislamiento y criopreservación de los folículos ováricos antes del tratamiento oncológico, seguido de maduración en vitro (MIV) de ovocitos GV a la etapa MII (transición de GV a MII). La disponibilidad de marcadores no invasivos de competencia desarrollo de ovocitos mejoraría a la fertilización y procesos de desarrollo y el éxito embarazo general1,2.
En función de su configuración de cromatina observada después de la tinción con el fluorocromo supravital Hoechst 33342, mamíferos adulto ovocitos se clasifican ya sea como un nucleolo rodeado (SN) o un nucleolo no rodeado (NSN)3. Además de su organización de la cromatina diferentes, estos dos tipos de ovocitos Mostrar muchas diferencias morfológicas y funcionales3,4,5,6,7,8 ,9, incluyendo su competencia meiótica y de desarrollo. Cuando aislado el ovario y madurado en vitro, tipo de ovocitos alcance la etapa MII y después de la inseminación de esperma, desarrollar a la fase de 2 células, pero sólo aquellos con una organización de la cromatina de SN pueden desarrollar a plazo9. Aunque bueno como un método de clasificación de selección competente vs incompetente ovocitos, el principal inconveniente es el efecto mutagénico que el fluorocromo sí mismo y, sobre todo, la luz UV utilizada para su detección podrían tener en las células.
Por todas estas razones, hemos buscado otros marcadores no invasivos asociados a la conformación de la cromatina SN o NSN que podría sustituir el uso de Hoechst manteniendo la misma precisión de clasificación alta. La observación de Time-lapse de las velocidades de movimiento citoplásmico (CMVs) está emergiendo como una característica distintiva del estado de la célula. Por ejemplo, estudios recientes demostraron que la asociación entre CMVs grabado en el momento de la fecundación y la capacidad del ratón y cigotos humanos preimplantacional completo y termino desarrollo10,11.
Basado en estos estudios anteriores, Describimos aquí una plataforma para el reconocimiento de desarrollo competente o incompetente ratón adulto ovocitos5,6,7,8. La plataforma se basa en tres pasos principales: 1) ovocitos de folículos antrales en primer lugar se clasifican en función de su configuración de cromatina ya sea como un nucleolo rodeado (SN) o un nucleolo rodeado no (NSN); 2) imágenes Time-lapse de CMVs que ocurren durante la transición de la GV a MII de cada ovocito solo se toman y analizan con partículas imagen velocimetry (PIV); y 3) se analizaron los datos obtenidos con PIV con un Feed-forward Artificial Neural Network (FANN) clasificación ciega12,13. Nos dan detalles de los pasos más críticos del procedimiento diseñado para que el ratón que esté listo para ser probado y utilizado por otras especies de mamíferos (p. ej., bovinos, monos y seres humanos).
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el institucional Animal cuidado uso y comités de ética en la Universidad de Pavía. Animales fueron mantenidos bajo condiciones de 22 ° C, 60% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h.
1 aislamiento de ovario
- Inyectar por vía intraperitoneal 2 cuatro a once semanas de edad CD1 ratones femeninos con 10 U de hormona folículo estimulante con una jeringa de insulina de 1 mL estériles.
- Espere 46-48 h.
- Peso del ratón y anestesiar con una inyección intramuscular de 50 mg/kg de Zoletil (Tiletamina y clorhidrato de cloridrate). Eutanasia por dislocación cervical.
- Sujete la piel que cubre la pared abdominal usando un par de pinzas de disección. Cortar la piel y la pared del cuerpo con un par de tijeras y abra la incisión con unas pinzas.
- Usando un par de pinzas, mueva las tripas a un lado, ubicar los cuernos uterinos y localización los ovarios en su extremidad.
- Suavemente Sujete el ovario con unas pinzas de relojero y utilice tijeras para cortar su ligamento del útero. Repita con el otro ovario.
- Transferir los ovarios recogidos en una célula de 35 mm cultura de Petri que contenga 1 mL de medio de aislamiento M2 pre-calentado a 37 ° C, 5% CO2 en aire.
- Retire la grasa y el oviducto con unas tijeras finas bajo un estereomicroscopio.
2. aislamiento de Cumulus ovocito complejos
- Perfore la superficie ovárica con pinza estéril y una aguja de insulina estéril de 1G hasta que pasivamente se liberan complejos de ovocito cumulus antral (AOC).
- Recoger los AOC con más de tres capas de células del cúmulo utilizando una controlado de boca tiró mano Pasteur micropipeta (200 μm de diámetro) y transferirlos en una caída de 300 μL de medio fresco M2.
- Eliminar las células del cúmulo que rodean los ovocitos utilizando una micropipeta Pasteur estirados a mano (a 80 μm de diámetro) transfiriendo suavemente hacia adentro y hacia afuera durante unos segundos,
- Repetidamente transferencia de ovocitos de una gota de 20 μl de medio de M2 a otro, hasta que las células del cúmulo se eliminan totalmente.
3. cromatina ovocitaria basado en la organización clasificación
- Preparar la solución de tinción de Hoechst 33342 a una concentración final de 0.05 μg/mL en M2 medio a partir de una solución madre de 5 mg/mL diluido en PBS 1 x.
- Ponga 3,5 μl micro gotas de solución en la parte inferior de una tapa de caja Petri de 35 mm de la tinción de Hoechst.
- Transferir cada ovocito solo en una gota de tinción de Hoechst, coloque el plato en un plato de calentamiento precalentado (37 ° C) y cubrirla con una tapa oscura para evitar la exposición de luz.
- Después de 10 min de incubación a temperatura ambiente, observar los ovocitos con un microscopio de fluorescencia con 10 aumentos bajo luz UV (330-385 nm), para no más de 1-2 s.
- Clasifican los ovocitos como un nucleolo rodeado (SN) (figura 1A), si presentan un anillo de cromatina de Hoechst-positivo que rodea al nucleolo.
- Clasifican los ovocitos como un nucleolo no rodeado (NSN), si su nucleolo no está rodeado de cromatina de Hoechst-positivo y muestra la dispersión heterochromatic puntos dentro del núcleo (figura 1B).
4. clasificación de ovocitos neuronal basado en la red
- Preparar cuatro gotas de medio de α-MEM suplementado con 5% suero bovino fetal inactivado con calor, 2 mM L-glutamina, taurina de 5 mM, 100 U/mL penicilina, estreptomicina μg/mL 75 y piruvato de sodio μg/μl 23.5 en un vaso de 35 mm de 2 μl inferior placa de Petri y cúbralos con precalentado (37 ° C) y pre equilibrado aceite mineral para evitar la evaporación media.
Nota: Si utiliza un sistema de detección de células vivo, mantener las gotas en una distancia específica utilizando una cuadrícula dibujada de 7 mm x 7 mm como guía. - Transferencia de 3 - 4 ovocitos a cada gota.
- Coloque la parte inferior de cristal plato de Petri en un sistema vivo de la célula de proyección, equipado con software de grabación Time-lapse (véase Tabla de materiales), que permite la observación de la maduración de ovocitos en un ambiente con temperatura estable (37 º C) y CO2 concentración (5%).
- Abra el software de grabación Time-lapse. En la pantalla aparece una ventana con un tiro directo de los ovocitos en el lado izquierdo y todos los botones de configuración en el lado derecho.
- Seleccione el centro de los ovocitos para colocar en el centro de la pantalla. Ajustar el foco si es necesario.
- Seleccione el botón de Ph y ajustar el Diámetro de la lámpara a 192; el tiempo de exposición a 1/125 s; la ganancia a 1.99; y la resolución de 1600 x 1200.
- Seleccione FL2 y ajuste el Diámetro de la lámpara a 5; el tiempo de exposición a 3 s; la ganancia a 2,37; y la resolución de 1600 x 1200.
- Seleccione el botón nuevo punto para grabar la posición del ovocito en la caída de la cultura. Repita la misma rutina para cada ovocito en la caída de la cultura.
- Seleccionar el tiempo y establezca el ciclo de adquisición 8 min y el Tiempo Total de 15 h.
- Seleccione Start Time-lapse para iniciar el ciclo de grabación.
- Abra el software MATLAB y escribir >>cell_piv; y luego seleccione la Herramienta de PIV.
- Elija la carpeta que contiene la película grabada y seleccionar cualquiera de los archivos .jpeg para cargar la secuencia de toda la imagen. Para cada ovocito, seleccione la región de interés (ROI) haciendo clic en el desplegable Seleccione la herramienta área.
- Seleccione Proceso PIV en el menú archivo. Seleccione el botón de la Herramienta Visor .
Nota: El programa calcula los vectores de velocidad en el retorno de la inversión y produce automáticamente un archivo de datos, guardado como un archivo MAT. - Seleccione el archivo .MTL para abrir. Seleccione el botón herramienta seleccionar ROI y dibuje un círculo alrededor del contorno de los ovocitos. En el menú Archivo, haga clic en guardar.
Nota: Ahora se muestran los vectores de esta región y los datos de magnitud media en la ventana de gráfico actualizan para este nuevo retorno de la inversión. - Abierto los datos de magnitud media recogidos de los cuadros todo Time-lapse graban en una hoja de cálculo, con, en las filas, la secuencia de Marcos y, en las columnas, cada ovocito solo analizado.
- Organizar los datos de ovocitos NSN y SN en 10 subgrupos.
- Utilizar 9 subgrupos para entrenar la red neuronal artificial de feed-forward iterativamente (FANN) y 1 subgrupo para la prueba ciega.
- Otro repita 9 veces, cambiar la muestra de prueba ciega (validación cruzada 10 veces).
- Abrir MATLAB, ejecutar el script a medida principal y, bajo pedido, introduzca el nombre del archivo con los datos del entrenamiento (train.txt), el número de ovocitos NSN y SN utilizado para que la formación y el lapso de tiempo intervalo a analizar (por lo general, de marco # 1-2 a # 112-113).
- Presione entrar para realizar el entrenamiento.
- Introduzca el nombre del archivo con los datos de prueba (test.txt).
- Abra el test_outputs_cyt del vector en espacio de trabajo MATLAB.
Nota: Aparecerá una ventana en la pantalla que muestra, en la primera fila, la probabilidad de obtener verdaderos positivos (TP o verdadero NSN) y falsos positivos (FP o NSN falsos) de ovocitos NSN y SN, respectivamente; en cambio, en la segunda fila, la probabilidad de obtener falsos negativos (FN o SN falsas) y verdaderos negativos (TN o SN verdadero) de ovocitos NSN y SN, respectivamente. - Utilice la fórmula: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), para calcular la exactitud FANN, expresada como un porcentaje.
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Representative Results
La figura 2 muestra una representativa ovocitos desarrollo competentes e incompetentes, respectivamente al principio (GV) y al final (MII) del procedimiento IVM. MIV de ovocitos de ratón adulto ocurre en el cultivo de 15 h. La observación de Time-lapse registra la progresión de la meiosis y detecta grandes acontecimientos meiotic, incluyendo la GVBD y la extrusión del primer cuerpo polar.
El análisis y la comparación de más de doscientos desarrollo competente vs incompetente ovocitos mostraron diferencias de tiempo en la progresión de la meiosis. Específicamente, en ovocitos NSN, GVBD es significativamente retrasado de 1-2 marcos de Time-lapse, mientras que la extrusión PB1 se produce con un retraso de 15 fotogramas. A pesar de estas diferencias, la variabilidad es demasiado alta para permitir la clasificación de ovocitos solo. Por esta razón, el procedimiento se implementó con una herramienta de clasificación matemáticas.
La figura 3 muestra un esquema de la herramienta de clasificación matemático utilizado, llamado Feed-forward Artificial Neural Network (FANN). Para cada ovocito a través de, FANN simultáneamente da la probabilidad de que el gameto es un desarrollo competente y la probabilidad de que sea un incompetente ovocito. En nuestros experimentos, el FANN clasificados ovocitos de ratón con una precisión media de 91.03%.
Figura 1 . Representativas ovocitos SN y NSN teñidos con Hoechst 33342. Aislamiento y tinción con el fluorocromo Hoechst 33342, ovocitos adulto se clasifican ya sea como rodeado de nucleolo (SN) (A) o no rodeado de nucleolo (NSN) (B), dependiendo de la presencia (flecha) o ausencia, respectivamente, de un anillo de Heterocromatina de Hoechst-positivo que rodea al nucleolo. Barra de escala: 5 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Análisis de velocimetría de imagen de partículas de Time-lapse imágenes. Los resultados del análisis PIV se muestran debajo de la imagen de campo claro para cada uno de los 113 Marcos lapso de tiempo analizados. La figura muestra el principio (GV) y el final (MII) del proceso de grabación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Representación esquemática de la red neuronal Artificial de Feed-forward. FANN es la herramienta matemática utilizada para clasificar los oocitos como desarrollo competente o incompetente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay varios pasos críticos uno debe cuidar al realizar este protocolo con ovocitos de ratón, así como con los de otras especies. Una vez aisladas de sus folículos, ovocitos deben ser transferidos inmediatamente en las gotas de la grabación, como la separación de la cumulus compañero células activa el inicio de la transición de la GV para MII. Una posible modificación en el presente Protocolo podría ser la adición de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) M2 medio utilizado para el aislamiento de los AOC. IBMX evita la activación inmediata de la transición de la GV a MII y permite una sincronización del conjunto experimental grupo de ovocitos.
El sistema de detección celular vivo en nuestros experimentos (véase Tabla de materiales) limita el número de gotas de maduración a 4 con 4 ovocitos por gota, así a un total de 16 ovocitos por experimento. Esta limitación podría superarse utilizando otros sistemas celulares-proyección energizados Time-lapse, comercialmente disponibles y están equipadas con varios compartimientos de la cultura.
Basándonos en nuestra experiencia, el intervalo de registro entre un fotograma y el siguiente es un punto crítico. Después de una serie de experimentos preliminares, tomamos imágenes cada 8 minutos porque ésta era la ventana de tiempo mínimo que permitía la observación clara de los acontecimientos principales que ocurren durante la transición de la GV a MII, como la ruptura de vescicle germinal y la extrusión del primer cuerpo polar. Esta ventana del tiempo que tenga que ser revaluados al observar ovocitos de otras especies.
Un inconveniente de este método es la cultura de los ovocitos en la ausencia de sus células del cúmulo circundante, como el último se sabe para mejorar aún más la transición de la GV para MII. A este respecto, nuestro laboratorio ahora prueba una ligera modificación al protocolo reportado mediante la inclusión de la cultura de libre de cumulus ovocitos sobre una capa de alimentador de las células de cumulus.
Por su naturaleza, la FANN tiene un número fijo de entrada (el número de módulos de CMV analizados) y las neuronas de salida (ya sea un desarrollo competente o incompetente ovocito), pero el número de neuronas ocultas es elegido por el investigador a través de un juicio y corrección enfoque para obtener el mejor rendimiento de la predicción. En nuestro caso, experimentó con diferentes números de neuronas ocultas y encontró que tres dieron los mejores resultados. Además, análisis FANN requieren una gran cantidad de datos de entrada (en nuestros módulos de CMV 112 experimentos) para obtener una estadística robusta. Una posible mejora que podría reducir el número de datos de entrada necesarios es el uso de herramientas de clasificación alternativos, tales como máquinas de Vector soporte, bolso del árbol, o clasificadores KNN. Cuando el análisis FANN demuestra su robustez, paso 1 podría ser eliminado del procedimiento.
Este protocolo, configurar el ratón, podría probarse en ovocitos de otras especies incluyendo a los seres humanos. Además, la combinación de Time-lapse de grabación con PIV y red neuronal de análisis podrían ser aprovechados para la observación de CMVs en cigotos10,11 y en embriones de preimplantación para la evaluación de sus más potencial de desarrollo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue hecho posible gracias al apoyo de: Universidad de Pavia RFA 2016; Universidad de Parma FIL 2014, 2016; y Kinesis para el suministro de los recipientes de plástico necesario para llevar a cabo este estudio. Agradecemos al Dr. Shane Windsor (Facultad de ingeniería, Universidad de Bristol, Reino Unido) para proporcionar el software de Cell_PIV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
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