Summary
Här presenterar vi ett protokoll för icke-invasiv bedömning av äggcell utvecklingsmässiga kompetens under deras i vitro mognad från den germinal vesikler till metafas II scenen. Denna metod kombinerar time-lapse imaging med particle image velocimetry (PIV) och neurala nätverk analys.
Abstract
Infertilitet kliniker skulle dra nytta av möjligheten att välja utvecklingsmässigt behöriga vs. inkompetenta oocyter med icke-invasiva ingrepp, vilket förbättrar det totala resultatet för graviditet. Vi har nyligen utvecklat en klassificeringsmetod baserat på mikroskopiska live observationer av mus oocyter under deras i vitro mognad från germinal vesikler (GV) till metafas II scenen, följt av analysen av de cytoplasmiska rörelserna som inträffar under denna time-lapse period. Här presenterar vi detaljerade protokoll av proceduren. Oocyter är isolerade från fullvuxen antral folliklar och odlade för 15 h inne Mikroskop utrustat för time-lapse analys vid 37 ° C och 5% CO2. Bilderna är tagna med 8 minuters mellanrum. Bilderna analyseras med metoden Particle Image Velocimetry (PIV) som beräknar, för varje äggcell, cytoplasmiska rörelse hastigheter (CMVs) som inträffar under hela kultur profil. Slutligen matas CMVs av varje enda äggcell genom en matematisk klassificeringen verktyg (Feed-forward artificiella neurala nätverk, FANN), som förutsäger sannolikheten för en könscell utvecklingsmässigt behöriga eller inkompetent med en noggrannhet på 91.03%. Detta protokoll, ställa in för musen, kunde nu testas på oocyter från andra arter, inklusive människor.
Introduction
Kvinnlig infertilitet är en patologi som påverkar ett ökande antal kvinnor. Enligt Världshälsoorganisationen är omkring 20% av alla par infertila, med 40% på grund av kvinnlig infertilitet. I tillägg, en tredjedel av kvinnor som genomgår cancerbehandlingar (300.000 per år och 30 000 per år i USA eller Italien, respektive) utveckla prematur ovarialsvikt.
En strategi för att förebygga infertilitet hos cancerpatienter är isolering och Frysförvaring av äggstockscancer folliklar innan onkologisk behandling, följt av in vitro- mognad (IVM) GV oocyter till MII scenen (GV-till-MII övergång). Tillgängligheten av icke-invasiva markörer för äggcell utvecklingsmässiga kompetens skulle förbättra befruktningen och utvecklingsprocesser och övergripande graviditet framgång1,2.
Baserat på deras kromatin-konfiguration som observerats efter färgning med den supravital fluorokrom Hoechst 33342, däggdjur fullvuxen oocyter klassificeras antingen som en omges Nucleolus (SN) eller en inte omgiven Nucleolus (NSN)3. Förutom deras olika kromatin organisation Visa dessa två typer av oocyter många morfologiska och funktionella skillnader3,4,5,6,7,8 ,9, inklusive deras meiotiska och utvecklingsmässiga kompetens. När isolerade från äggstocken och mognat i vitro, både typ av oocyter reach MII scenen, och efter sperm insemination, utvecklas till ett 2-cells Stadium, men endast de med en SN kromatin organisation kan utvecklas till termen9. Även bra som en klassificeringsmetod för att välja behöriga vs. inkompetenta oocyter, är den största nackdelen mutagen effekt som fluorokrom själv och, framför allt UV-ljus används för dess upptäckt kanske på cellerna.
Av alla dessa skäl sökte vi andra icke-invasiva markörer associerade med SN eller NSN kromatin konformation som kunde ersätta användningen av Hoechst samtidigt bibehålla samma höga klassificering noggrannhet. Time-lapse observationen av cytoplasmisk rörelse hastigheter (CMVs) framstår som en funktion särskiljande av cell status. Till exempel visat nyligen genomförda studier sambandet mellan CMVs registreras vid tiden för befruktning och mus och mänskliga zygoter kapacitet till komplett preimplantatorisk och fullgångna utveckling10,11.
Baserat på dessa tidigare studier, beskriver vi här en plattform för erkännande av utvecklingsmässigt behöriga eller inkompetent mus fullvuxen oocyter5,6,7,8. Plattformen bygger på tre huvudsakliga steg: 1) oocyter som isolerats från antral folliklar klassificeras först utifrån deras kromatin konfiguration antingen som en omgiven nucleolus (SN) eller en inte-omgiven nucleolus (NSN); (2) time-Lapse bilder av CMVs som inträffar under GV-till-MII övergången av varje enda äggcell tas och analyseras med particle image velocimetry (PIV); och 3) data som erhållits med PIV analyseras med en Feed-forward artificiella neurala nätverk (FANN) för blinda klassificering12,13. Vi redogör för de viktigaste stegen i förfarandet för musen för att göra det redo att testas och används för andra däggdjursarter (t.ex. nötkreatur, apa och människa).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur godkändes av institutionella djur vård och användning och etiska kommittéer på universitetet i Pavia. Djur upprätthölls under 22 ° C, 60% luftfuktighet och en ljus/mörk cykel av 12:12 h.
1. äggstock isolering
- Injiceras intraperitonealt 2 fyra-till-elva veckor gamla CD1 honmöss med 10 U follikelstimulerande hormon med en steril 1 mL insulinspruta.
- Vänta 46-48 h.
- Väga musen och söva med en intramuskulär injektion 50 mg/kg av Zoletil (Tiletamina och Zolazepan cloridrate). Eutanasi av cervikal dislokation.
- Ta tag i huden som täcker den buk-väggen med ett par dissektion pincett. Klipp huden och kroppen väggen med en sax och dra öppna snittet med pincett.
- Använder ett par pincett, flytta modet undan, precisera uterin hornen och lokalisera äggstockarna på deras extremiteter.
- Försiktigt hålla äggstocken med urmakare pincett och använd sax för att klippa dess ligament till livmodern. Upprepa med den andra äggstocken.
- Överföra insamlade äggstockarna i en 35 mm cell kultur petriskål innehållande 1 mL M2 isolering medium pre värmas vid 37 ° C, 5% CO2 i luften.
- Ta bort fettet och det äggledaren med fina sax under ett stereomikroskop.
2. isolering av Cumulus äggcell komplex
- Punktera cystor ytan med steril pincett och en 1G steril insulin nål tills antral cumulus äggcell komplex (COC) släpps passivt.
- Samla COC med mer än tre lager av cumulus celler med en mun-kontrollerade hand dras Pasteur mikropipett (200 µm i diameter) och överföra dem till en 300 µL droppe färska M2 medium.
- Ta bort cumulus cellerna kring oocyterna använder en hand dras Pasteur mikropipett (80 µm i diameter) genom att försiktigt in och ut för några sekunder, med
- Upprepade gånger överföra oocyter från en 20 µL droppe M2 medium till en annan, tills cumulus celler är helt elimineras.
3. kromatin organisation-baserade äggcellen klassificering
- Förbereda Hoechst 33342 färglösningen med en slutlig koncentration på 0,05 µg/mL i M2 medium start från en mor lösning 5 mg/ml späds med 1 x PBS.
- Placera 3,5 µL mikro droppar av Hoechst färgning lösning på botten av en 35 mm petriskål locket.
- Överför varje enda äggcell till en Hoechst färgning droppe, placera skålen på förhand värmde (37 ° C) värme plåt och täcka det med en mörk lock för att undvika ljus exposition.
- Efter 10 min inkubering vid rumstemperatur, Observera oocyterna med fluorescens Mikroskop vid 10 X förstoring i UV-belysning (330-385 nm), för mer än 1-2 s.
- Klassificera oocyter som en omgiven nucleolus (SN) (figur 1A), om de presenterar en ring av Hoechst-positiv kromatin kring nucleolus.
- Klassificera oocyter som en inte omgiven nucleolus (NSN), om deras nucleolus omges inte av Hoechst-positiv kromatin och visar skingra heterochromatic ställen inom kärnan (figur 1B).
4. neurala nätverksbaserade äggcellen klassificering
- Förbereda fyra 2 µL droppar av α-MEM medium kompletteras med 5% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 5 mM taurin, 100 U/mL penicillin, 75 µg/mL streptomycin och 23,5 µg/µL natrium pyruvat i en 35 mm glas botten petriskål och täck dem med Pre värmde (37 ° C) och pre skakad mineralolja att undvika medium avdunstning.
Obs: Om du använder en levande cell-screening hålla dropparna vid en viss distans med hjälp av ett ritade rutnät av 7 x 7 mm som en riktlinje. - Överföring 3 - 4 ägg till varje droppe.
- Placera glas botten petriskål i en levande cell-screening system, utrustad med time-lapse inspelningsprogramvara (se Tabell för material), som tillåter observation av oocytmognaden i en miljö med stabil temperatur (37 ° C) och CO2 koncentration (5%).
- Öppna programvaran time-lapse recording. På skärmen visas ett fönster med ett levande skott av äggcellen på vänster sida och alla inställningen knapparna på höger sida.
- Välj centrera av äggcellen att placera det på skärmens mitt. Justera fokus vid behov.
- Välj knappen Ph och ställa DIA lampa till 192; exponeringstid att 1/125 s; de få till 1,99; och upplösning på 1600 x 1200.
- Välj FL2 och ange DIA lampa till 5. exponeringstid att 3 s; de få till 2,37; och upplösning på 1600 x 1200.
- Välj knappen New peka för att spela in äggcellen positionen inom kultur drop. Upprepa samma rutin för varje äggcell inom kultur drop.
- Välj tid och ange de förvärv cykel till 8 min och Total tid till 15 h.
- Välj Starta time-lapse att starta inspelning cykeln.
- Öppna programvaran MATLAB och skriva >>cell_piv; och välj sedan PIV verktyg.
- Välj den mapp som innehåller den inspelade filmen och välj någon av .jpeg-filer att ladda hela bilden sekvensen. För varje äggcell, Välj region av intresse (ROI) genom att klicka på den Markera området verktyg.
- Välj Process PIV i Arkiv-menyn. Välj knappen Viewer-verktyget .
Obs: Programmet kommer att beräkna hastighet vektorerna inom ROI och producerar automatiskt en datafil, sparas som en .mat fil. - Välj den .mat fil att öppna. Välj knappen Välj ROI-verktyg och rita en cirkel runt konturerna av en äggcell. Klicka på Spara på Arkiv-menyn.
Obs: Vektorer i denna region visas nu och genomsnittlig magnitud data i fönstret diagram uppdateras för denna nya ROI. - Öppna insamlade genomsnittlig magnitud data helt tidsförlopp bildrutor registreras i ett kalkylblad, med raderna, bildrutesekvensen och på kolumner, varje enda äggcell som analyseras.
- Organisera data både NSN och SN oocyter i 10 undergrupper.
- Använd 9 undergrupper för att träna feed-forward artificiella neurala nätverk iterativt (FANN) och 1 undergruppen för blinda testning.
- Upprepa en annan 9 gånger, ändra blind test provet (10-faldig cross-validering).
- Öppna MATLAB, kör den skräddarsydda skript huvudsakligen och, på begäran, Infoga namnet på filen med utbildning data (train.txt), antalet NSN och SN oocyter som används för utbildning och time-lapse intervallet ska analyseras (vanligtvis från Frame # 1-2 Rama # 112-113).
- Tryck på Ange att utföra träningen.
- Infoga namnet på filen med testdata (test.txt).
- Öppna den vektor test_outputs_cyt i MATLAB arbetsyta.
Obs: Ett fönster visas på skärmen som visar, på den första raden, sannolikheten att erhålla sant positiva (TP eller sann NSN) och falskt positiva (FP eller falska NSN) för NSN och SN oocyter, respektive; istället, i den andra raden, sannolikheten att få falska negativa (FN eller falska SN) och sant negativa (TN eller sann SN) för NSN och SN oocyter, respektive. - Använd formeln: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), att beräkna FANN riktighet, uttryckt i procent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar en representativ utvecklingsmässigt kompetenta och inkompetenta äggcell, respektive i början (GV) och i slutet (MII) IVM förfarandet. IVM fullvuxen mus oocyter inträffar under 15 h kultur. Time-Lapse observationen registrerar förloppet av meios och upptäcker stora meiotiska evenemang, inklusive GVBD och extrudering av första polar kroppen.
Analys och jämförelse av mer än två - hundra utvecklingsmässigt behöriga vs. inkompetenta oocyter visade tidsskillnader i förloppet av meios. Specifikt, i NSN oocyter, är GVBD avsevärt försenat av 1-2 time-lapse ramar, medan PB1 extrudering uppstår med 15 bildrutor fördröjning. Trots dessa skillnader är variabiliteten för hög så att single-äggcellen klassificering. Av denna anledning genomfördes förfarandet med en matematisk klassificeringen verktyg.
Figur 3 visar en ordning av den matematiska klassificering verktyget används, namngivna Feed-forward artificiella neurala nätverk (FANN). För varje donerad matas genom, ger FANN samtidigt sannolikheten att könsceller är ett utvecklingsmässigt behöriga och sannolikheten att det är en inkompetent äggcell. I vårt experiment klassificeras FANN mus oocyter med en genomsnittlig noggrannhet på 91.03%.
Figur 1 . Representativa SN och NSN oocyter färgas med Hoechst 33342. Efter isolering och färgning med en fluorokrom Hoechst 33342, fullvuxen oocyter klassificeras antingen som omges nucleolus (SN) (A) eller inte omgiven nucleolus (NSN) (B), beroende på förekomst (pil) eller frånvaro, respektive av en ring av Hoechst-positiv Heterokromatin kring nucleolus. Skalstapeln: 5 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 . Particle Image Velocimetry analys av Time-Lapse bilder. Resultaten av PIV analysen nedan bildens ljusa fält för de 113 time-lapse ramarna som analyseras. Figuren visar början (GV) och slutet (MII) av inspelningsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Schematisk framställning av Feed-forward artificiella neurala nätverk. FANN är det matematiska verktyg som används för att klassificera oocyter som utvecklingsmässigt behöriga eller inkompetent. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I området i närheten finns det flera kritiska steg man bör ta hand om medan du utför detta protokoll med musen oocyter samt med de av andra arter. När isolerade från sin folliklar, oocyter omedelbart bör överföras till inspelning dropparna som avskiljandet från de följeslagare cumulus celler utlösare i början av GV-till-MII övergången. En möjlig ändring i detta protokoll kan vara tillsats av 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) till M2 medium används för COC isolering. IBMX förhindrar omedelbar utlösning av GV-till-MII övergången och tillåter en synkronisering av hela experimentgruppen oocyter.
Det levande cell-screening system som används i våra experiment (se Tabell för material) begränsar antalet mognad sjunker till 4 med 4 oocyter per droppe, således till totalt 16 oocyter per experiment. Denna begränsning kan övervinnas med hjälp av andra time-lapse levande cell-screening system, kommersiellt tillgängliga och utrustade med flera kultur kammare.
Registreringsintervall mellan en ram och följande baserat på vår erfarenhet, och är en kritisk punkt. Efter ett antal preliminära experiment tog vi bilder varje 8 min eftersom detta var fönstret minimitid som tillät tydlig observation av de stora händelserna som inträffade under GV-till-MII övergången, såsom germinal vescicle fördelningen och extrudering av första polar kroppen. Detta tidsfönster behöva vara Varianskvantiteten när observerar oocyter från andra arter.
En nackdel med denna metod är en kultur av oocyter i avsaknad av deras omgivande cumulus celler, som den senare är kända för att ytterligare förbättra GV-till-MII övergången. Till detta avseende testar vårt laboratorium nu en smärre ändring av rapporterade protokollet av inklusive kulturen av cumulus-fri oocyter på en cumulus celler feeder lager.
Genom sin natur, FANN har ett fast antal både input (antalet analyserade CMV moduler) och output (antingen ett utvecklingsmässigt behöriga eller inkompetent äggcell) nervceller, men antalet dolda neuroner är valt av prövaren genom en rättegång och korrigering strategi för att få bästa prognos prestanda. I vårt fall, vi experimenterade med olika antal dolda nervceller och fann att tre gav bäst resultat. Dessutom kräver FANN analyser ett stort antal indata (i våra experiment 112 CMV moduler) för att få en robust statistik. En möjlig förbättring som skulle kunna minska antalet nödvändiga indata är användningen av alternativa klassificeringen verktyg, såsom stöd vektor maskin, träd-påse, eller KNN klassificerare. När FANN analysen visar dess robusthet, kunde steg 1 avlägsnas från förfarandet.
Detta protokoll, ställa in för musen, kunde testas på oocyter från andra arter, inklusive människor. Dessutom inspelning kombinationen av time-lapse med PIV och neurala nätverk analys kan utnyttjas för observationen av CMVs i zygoter10,11 och preimplantatorisk embryon för utvärdering av deras ytterligare utvecklingspotentialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete gjordes möjligt tack vare stöd av: universitetet i Pavia FRG 2016. Universitetet i Parma FIL 2014 2016. och Kinesis för att tillhandahålla plasticware som är nödvändiga för att genomföra denna studie. Vi tackar Dr Shane Windsor (tekniska fakulteten, universitetet i Bristol, UK) för att tillhandahålla Cell_PIV programvara.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
