Summary
이 상세한 프로토콜 transcranial 전기 자극 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 단기 및 장기 효과 조사 하기 위하여 측 뼈에 transcranial 자극 전극 배치를 설명 합니다.
Abstract
Transcranial 전기 자극 (TES)은 무작위로 또는 폐쇄 루프 이벤트 트리거 방식으로 만들어진다 두뇌 활동에 영향을 강력 하 고 비교적 간단한 방법입니다. 많은 연구는 가능한 혜택 및 건강 하 고 pathologic 두뇌에서 TES의 부작용에 초점을 맞추고 있습니다, 하지만 여전히 자극의 행동의 메커니즘에 관한 많은 근본적인 오픈 질문이 있습니다. 따라서, 거기는 분명 강력 하 고 재현할 수 메서드는 급성 테스트 및 설치류에서 TES의 만성 효과 대 한 필요. TES는 신경 네트워크 비보조사 일반 행동, electrophysiological 및 이미징 기술을 결합할 수 있습니다. 뇌 활동을 조작 하는 다양 하 고 유연한 도구를 제공 하는 동안 transcranial 자극 전극 이식 실험 설계에 추가 제약을 부과 하지 않습니다. 여기 우리가 조작 하 고 몇 달 동안 일시적으로 제한 된 방식으로 두뇌 활동에 영향을 transcranial 자극 전극 이식 상세한, 단계별로 프로토콜을 제공 합니다.
Introduction
Transcranial 전기 자극 (TES)은 일시적으로 제한 된 방식으로 두뇌 활동에 영향을 가치 있는 방법론 접근 이다. 크기와 자극 전극의 배치에 따라 TES 큰 두뇌 볼륨에 영향을 미칠 수 있고 신경 인구를 끌고가 다 만들어진다1,2,3. Transcranial 직류 자극은 이미 의학적으로 주요 우울증 장애4,5, 그리고 인간6 transcranial 자극의 인지 효과 보여주는에 많은 연구 초점의 치료에 대 한 승인 , 7. 또한, 유망한 결과 간 질 발작8,9제어 TES의 잠재력에 관한 보도 했다.
집중적인 연구에도 불구 하 고 여전히 많은 관련 작업, 잠재적인 부작용 및 적용이 방법을10,,1112의 장기 결과의 상세한 메커니즘에 관한 질문 있습니다. 따라서, 그것은 동물 모델에서 TES의 효과 조사 하기 위해 강력 하 고 재현 가능한 프로토콜을 매우 중요 하다입니다. 우리에 대 한 프로토콜을 제공 하는 많은 장애 (예, 우울증, 간 질, 및 정신 분열 증)을 깨어 동물에 광범위 하 게 조사 될만 하 고 이러한 의료 조건의 본질 일반적으로 장기 치료를 필요로, 만성 transcranial 전극 쥐에 이식 여기에 제시 된 방법 행동 연구에 사용할 수 있습니다 또는 기록 전극 (즉, 전선, 실리콘 프로브, juxtacellular 전극)의 주입 또는 만성 두개골 윈도우 electrophysiological 실험에 대 한 결합 될 수 있다 그리고 이미징 연구, 각각입니다. 실험 설계에 따라 자극의 타이밍 일 수 있다 무작위 이벤트 트리거 특정 행동 신호, 또는 특정 한 두뇌 상태 (발작, 세타 진동)8, 의 electrophysiological 특징 11 , 13.
그 피부에 전극의 구체화를 사용 하 여, 현재 사용 된 인간의 접근 달리 여기 우리가 표시 메서드를 사용 하 여 피하 주입 오른쪽 측 뼈의 표면에 쥐부터 거의 언급 하는 것이 중요 하다 그들의 발을 사용 하 여 쉽게 접근할 수 있는 그들의 피부에 아무것도 용납.
이식의 만성 특성상 교체, 감소, 및 교양의 원칙에 따라이 방법은 이후 각 동물 사용할 수 달, 동안에 다른 실험 조건에 채용 될 수 있는 동물의 수를 줄일 수 다양 한 가설을 테스트 하는 적은 동물.
현재 연구에서 우리는 transcranial 자극 전극 제조 (그림 1A-B)의 상세한, 단계별로 프로토콜을 제공 하 고 이러한 전극의 만성 이식 6 개월의 측 뼈 통해 입증 남성 긴 에반스 쥐입니다.
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Protocol
여기서 설명 하는 모든 메서드는 유럽 공동체 위원회의 지침에 따라 (86/609 ECC) 앨버트 Szent-Györgyi 의료 및 제약 센터의 대학에서 동물 연구에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 세게 드 (14 세/218/2016)입니다.
1입니다. 자극 전극의 제조
- 한 자극을 전극, 미니어처 훅 업 와이어의 6 10 cm 긴 조각을 잘라 한쪽 끝에 피복 및 다른 쪽 끝에 1 cm의 2 cm를 제거 합니다.
- 2 개의 케이블을 함께 트위스트과 짧은 벗 겨 옆에 그들을 솔더.
- SOT-353 케이스 어떤 집적 회로의 세 가지 테이프 포장의 스트립을 획득 합니다.
- 패키지의 3 개의 구멍을 통해 트위스트 와이어 바느질. 전선의 이상 벗 겨 세그먼트 패키지 구멍에 있어야 합니다. 단열재의 끝 구멍의 가장자리에 맞춰 되도록 케이블을 배치 합니다.
- 전선을 해결 하기 위해 구멍에 치과 시멘트를 넣어.
주의: 치과 시멘트 패키지의 캐비티에 누출 되지 않도록 충분히 조밀 되어야 합니다. - 시멘트는 응고 (최소 10 분), 일단 패키지를 플립 하 고 superglue의 얇은 층으로 다공성 시멘트 방수 물개를 형성 하기 위하여 구멍에 넣어. 벗 겨 와이어 접착 하지 마십시오.
- 짧은 벗 겨 쪽에 케이블을 함께 트위스트과 솔더 그들 (그림 1A).
- 고급 핀셋 끝으로 철사의 더 이상 벗 겨 세그먼트, 롤 주위에, 그들을 충 치 (그림 1B)에 그들을 포장. 필요한 경우 초과 케이블을 잘라.
2입니다. 기록 전극의 제조
- 한 녹음을 triplet 전극 (그림 1C-D), 스테인레스 스틸 튜브를 사용 하 여 고속 회전에의 한 cm 긴 조각 잘라 보았다. 튜브의 끝에서 날카로운 바늘으로는 지 느 러 미를 제거 하 고 튜브 파편의 깨끗 하 고 완전히 투과 확인 하십시오.
참고: 튜브를 왜곡 하는 것으로, 플라이어를 사용 하지 마십시오. - J 자형 홀더를 3cm의 최소 길이와 골드 도금 보드 스페이서 핀을 벤드. 'J' 모양의 긴 다리를 잘라 그리고 함께 돌아가 긴 선형, stereotaxic 장치에 의해 개최 됩니다 부분과 사이 'U' 모양, 전극, 개최 하 고 앵커 포인트 역할 분리 가능한 합동을 원래 모양 그것을 납땜합니다 . 튜브와 'J' 보유자의 짧은 다리를 함께 접착제. 필요한 경우, 안정성에 대 한 몇 가지 추가 1 cm 긴 막대를 붙입니다.
- 스테인레스 스틸, ultrafine가 위 2.5 cm 긴 전극 와이어의 3 조각 잘라. 그것은 명확 하 고 날카로운 컷, 그리고 단 열 전극 와이어의 원형 표면에 그대로 있는지 확인 합니다. 또한 컷된 팁 적용 되는 힘으로 인해 구부러지거나 되지 있는지 확인 합니다. 벤드 1 또는 2 m m (예를 들어, 한 왼쪽된 직선, 한 45 °, 및 한 직각) 그들을 구별할 수 있도록 다른 각도에서 전선의 각각의 1 개의 끝에.
- 전선 관, 실험에 대 한 전극의 적절 한 간격을 선택 (예를 들면, 대뇌 피 질의 로컬 필드 가능성 (LFP)와 현재 소스 밀도 (CSD) 등록, 전선에서의 팁 권장된 돌출은 튜브의 열: 4.5 m m, 4.1 m m 및 3.7 m m, 각각). 참고 적절 한 채널 순서를 유지 하는 깊이에 해당 하는 와이어.
- 일단 전선이 서로 오른쪽 정렬 되며 튜브와 함께 병렬, 전극 와이어를 해결 하기 위해 장소 액체 superglue 한 방울 튜브의 양쪽 끝에 날카로운 바늘으로. 접착제는 모 세관 효과 튀어나온 끝에 녹음 사이트를 향해 하지 튜브에 흐르는 지 다는 것을 확인 하십시오.
- 적절 한 microconnector 녹음 시스템을 사용할 수와 호환 되는 전극 인터페이스 보드를 준비 합니다.
- 원하는 녹음 채널에 해당 하는 전극 인터페이스 보드의 구멍에 전선의 비 녹음, 구부러진 끝을 소개 합니다. 모든 와이어 위치에 있을 때, 핀셋으로 구멍에 골드 핀을 밀어.
참고: 골드 핀 치과 시멘트를 사용 하 여 장소에 고정 될 수 있습니다 하지만 대부분의 경우, 그것은 충분히 안정적이 안전 단계 없이.
3입니다. 마 취
- 봉인 된 마 취 유도 실에서 동물을 놓고 2 L/min 의료 공기에서 isoflurane의 4-5%로 그것을 채우십시오.
- 쥐 휴식 때 상공에서 동물을 제거 하 고 적절 한 환기 코 조각으로 stereotaxic 프레임에 배치.
- 공기의 속도 동일 하 게 유지 해야 하지만 2 %isoflurane 수준을 설정 합니다. 마 취의 수준을 확인 합니다. 곤란에 발 철수 반사의 결핍이 있는 경우에, 계속, 그렇지 않으면 마 취의 깊이 증가.
- 모니터링 하 고 37 ± 0.5 ° C homeothermic 모니터링 시스템에서 쥐의 체온을 유지 한다. 각 막의 건조를 방지 하기 위해 눈에 파라핀 연 고의 방울을 적용 합니다. 반복이 절차는 수술 하는 동안 여러 번, 필요한 경우.
- 기도에 점액 형성을 피하기 위해 0.3 mg/kg 아트로핀 주사 피하. 이 더 이상 수술의 경우 4 시간 마다 반복 합니다. 호흡을 모니터링 하 고 필요한 경우 기화 기, 조정.
4. 자극 및 기록 전극의 주입
참고: 압력솥 수술 필요한 모든 계기 및 전체 절차 동안 무 균 상태와 antisepsis의 일반 규칙에 따라 신중 하 게. 외과 영역 외부 nonsterile 영역을 만지지 마십시오. 주입 하기 전에 30 분 동안 에틸 알콜 (70%)에 전극을 담가.
- 머리 깎기로 두 피에서 머리의 대부분을 제거 합니다. 두 피에 depilatory 크림을 적용, 표면에 균일 하 게 확산 하 고 몇 분. 부드럽게 크림 및 나머지 머리를 제거 하는 주걱을 사용 합니다. 다음 살 균 제와 물으로 피부를 씻어.
- 1-2 %lidocaine 주사 (7 mg/kg의 총계 복용량을 초과 하지 않도록) 피부 감각을 피하. (예를 들어, 파라핀) 눈에 대 한 연 고 수 의사의 한 방울을 적용 합니다.
- 목에이 마에서 메스와 함께 중간에는 철저 하 고 긴 (~ 2 cm) 화살 절 개를 확인 합니다. 다음 두 개의 측 뼈의 cristae 사이의 영역을 청소 끌 또는 치아 핀셋을 사용 하 여 두개골에서 포함 하 여 조직 해 부. 4 롯데를 사용 하 여 해 부 피부를 제거 하 여 노출 하는 두개골을 유지.
- 부드럽게 측 뼈의 가파른 가장자리와 근육 사이의 정밀한 핀셋 놓고 그들을 분리 합니다. 근육 손상 없이 가능한 코로나 봉합의 평면에 후 두 뼈의 가장자리에서 선호 측 뼈의 큰 표면에 많이 노출 하 지 그 춤을 추는 움직임을 확인 합니다.
- 견인 기 bitemporally 노출 측 뼈를 유지 장소.
- 린스와 함께 1-2 mL 3% H2O2, 두개골의 표면 다음 1-2 mL 물으로 그것을 씻어.
- 매우 신중 하 게 측 뼈의 표면을 건조, 눈 막대기와 습기를 청소. 테스트 경우 자극 전극 (자극 전극의 위쪽 가장자리 측 뼈의 crista의 가장자리 라인에 있어야 함) 청소 수직 두개골 표면에 적합 합니다. 다시 롯데와는 브래킷으로 조정 하거나 필요한 경우가 위, 자극 전극 모양.
- Electroconductive와 전극 젤과 전극의 가장자리에 접착제의 얇은 층을 넣어 자극의 구멍을 채우십시오.
- 한 정확한 운동, 측 뼈의 건조 표면에 자극 전극을 놓고 단단히 제자리에 고정 1 분 고급 핀셋으로 합니다. 아무 습기는 접착제와 접촉 하 여 있는지 확인 합니다. 청소 하십시오 눈 막대기, 필요한 경우.
주의: 전극의 어떤 불안정성을 경험 하는 경우에 그것을 제거 합니다. 뼈를 청소 후 새로운 자극 전극으로이 단계를 반복 합니다. - 조직의 새 수 분은 지속적으로 눈 막대기로 건조 하는 동안 자극 전극의 가장자리 위에 치과 시멘트를 넣어. 시멘트로 전체 자극 전극 커버.
- 시멘트 완전히 경화 된 후, contralateral 측면에서이 단계를 반복 합니다.
- 고정 나사에 대 한 두개골 전체 일부 구멍을 드릴 합니다. 미니어처 나사 구멍에 운전 하 고 그들을 통해 치과 시멘트를 넣어. ~ 10% 더 작은 직경 드릴 나사 직경에 비해 머리에 사용 합니다.
- 실험의 목적에 따라 솔더 커넥터는 케이블의 끝에, 표면, 및 시멘트, 커버에 배치 또는 계속 기록 전극 및 광학 섬유, 이식 하거나 두개골에 두개골 창 준비 합니다. 이 후자의 경우 커넥터를 납땜 하 고 끝에만 구조에 앵커. 장기 동시 TES와 LFP 녹음의 필요한 경우 단일 와이어 대신 상기 전극 쌍 둥 이식.
참고:이 설치는 일반적인 모드 자극 유물8의 제거에 대 한 수 있습니다. 전극 이식 기록의 세부 사항에 대 한 이전 프로토콜14,15를 참조 하십시오. - 워시 살 균 제와 풍부 하 게 노출 된 조직. 1-2 %lidocaine 주사 (7 mg/kg의 총계 복용량을 초과 하지 않는) 피하.
- 상처 가장자리를 debride 하 고 간단한 중단된 봉합 커넥터/임 플 란 트 주위와 그들을 닫습니다. Povidone-요오드와 상처를 소독.
- 5 mg/kg carprofene 피하 주사. 필요한 경우이 반복 합니다.
참고: 다른 진통제 사용할 수 있습니다 일치 하는 로컬 윤리적 권한 위원회에 의해 설정 요구 사항. - 마 취를 중단 하 고 earbars 및 nosepiece, 의식 회복 수술 후 회복에에서는 동물을 넣어.
- 첫 수술 후 시간 동안 가까운 감독 하에 동물 인지 확인 합니다. 임 플 란 트 영역을 정기적으로 모니터링을 계속 합니다.
참고: 동물 하지 맡겨야 한다 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 집 전체 복구 절차에서까지 개별적으로 동물.
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Representative Results
만성 자극 전극 (그림 1B)의 주입 전극 (그림 1C-D) 기록의 추가 주입 결합 될 수 있다. 이러한 설정은 요청 시 녹음 및 특정 뇌 활동 방해 자극 시스템에 적합 합니다. 여기는 폐쇄 루프 간 질 탐지 및 긴-에반스 쥐 표현 자발적인 발작 (그림 2A)9에 적용 된 개입 시스템의 대표적인 결과 선물이. 이 긴장 표시 부재 (petit mal) 간 질 (그림 2B)의 electrographic 및 행동 증상으로 알려져 있다. 기록으로 간 질 발작의 경우 intracortical 신호 실시간으로 분석, 트리거 두뇌의 스파이크 파 활동을 방해 하는 적절 한 순간에는 격리 된 자극 발생기에 보내집니다. 차례 차례로, 자극 발생기 충전 균형 triphasic 자극 bitemporal 자극 전극을 통해 발작 활동을 방해 하기 위해 제공 합니다.
그림 2C-D 는 견고성과 이식된 자극 전극의 안정성을 보여주는 주 16, 지속적인 발작 주 1에서에서 인터럽트를 일시적으로 타겟된 자극의 용량을 표시 합니다. 맥락에서 이러한 결과 넣어 그림 2E 표시 중단된 실험, 보조 조직 측 뼈와 부적 절 한 씰링 및 전극의 접합 전극 표면 사이 관통의 녹음 (부검의 동물 조직 침입 확인). 자극 전극의 임피던스 증가, 게다가 성장 조직 전기 션트를 제공 가능성이 높습니다. 이 실험은 자극 실험 동안 안정적이 고 재현 가능한 결과 달성 하기 위해 주의 격리의 완전 한 중요성을 강조 한다.
그림 1: 자극 및 기록 전극 제조 단계. (A) 트위스트 와이어 구멍을 통해 물 렸 다 고 벗 겨 와이어 구멍에 배치 하기 전에 포장에 고정. (B) 자극 전극의 최종 형태. 삽입: 포장 포장; 내부 전선 (C) 측 기록 전극;의 보기 (D) 기록 전극의 최고 볼 수 있습니다. 인세트: 녹음 사이트의 팁 400 µ m 간격. Transcranial 자극 전극 배치 (E) 자가 그림. 자극 전극은 고정 나사 중 일부와 함께 이미 이식 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:이 프로토콜의 자극 전극을 사용 하 여 폐쇄 루프 발작 개입의 대표적인 결과. (A) 폐쇄 루프 시스템 개요. Triplet 기록 전극 정수 리 피 질에 이식 되 고 자극 전극은 bitemporally 두개골에 됩니다. 쥐 머리에 증폭기를 갖추고 이며 실시간 발작 감지 시스템에 연결 된. (B) LFP 추적 1세인트 에 발작 개입 중단된 스파이크 파 발작 (C 및 D) 예제 LFP 트레이스와 자극의 16번째 주입니다. 자극 전극과 (부검에 의해 확인) 측 뼈 사이 성장 하는 조직의 경우 발작 중단의 실패의 (E) 예 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 뼈 표면에 전극 패키지의 접착제로. 부적 절 한 씰링, 경우 전극과 뼈 사이 간격이 형성 되 고 보조 흉터 조직 자극의 품질을 줄이는이 간격으로 성장할 수 있다. 뼈 표면, 패키지에의 단계 동안 완전히 건조 해야 하며 전극의 불안정을 발생 하는 경우 그것은 제거 되어야 하며 최상의 결과 얻기 위해 새로운 패키지와 함께 대체.
이 방법의 제한으로 피부 수술 후 완전히 폐쇄 되지 않습니다, 거기는 감염의 위험이 상대적으로 높은입니다. 살 균 제 솔루션, 그리고 분말, 나중에 복구 하는 동안 첫 번째 4-5 일에 수술 치료는 감염을 방지할 수 있습니다. 우리의 경험에이 치료는 완전히 외부 세계를 향해 상처를 닫을 수 있습니다 흉터 조직 형성을 촉진 한다.
여기 우리가 제시 전극 제조, 하지만 따라 특정 실험의 특별 한 요구에 전도성 물질의 수정 할 수 있습니다, 예를 들어, 가장, 가장 접근 방법 중 하나는 케이블의 표면 코팅 와 비 편광 전극 인터페이스 재료, 예를 들어, PEDOT:PSS. 전극 패키지 주문 품, 3D 인쇄와 경험에 의해 수정 될 수 있습니다, 그리고 경우에 우리의 권고는 특정 연구의 요구 사항을 일치 하지 않습니다. 우리의 경험에서는,이 연구에서 조작 transcranial 전극의 크기 300 g bodyweight의 위에 둘 다 남성과 여성 쥐에 있는 implantations를 허용 하지만 프로토콜 단계에서 작은 스트립을 절단 하 여 쉽게 자극 전극의 크기를 줄일 있습니다. 1.3. 또한, 모든 접착제 및 프로토콜에 치과 시멘트 대체, 외부 레이어는 조직, 직접 접촉에 따라서 그들은 바이오 호환 되어야 고려 교체할 수 있습니다.
현재 연구에서 우리가 제공 프로토콜 bitemporal 자극 전극 제조 및 기술적으로, 비용 효과적인 수행을 간단 하 고 신뢰할 수 있는 이상 되는 장기, 이식에 전기 자극 실험을 자유롭게 허용 움직이는 쥐9. 자극 전극 측 뼈에 배치 됩니다, 다른 implantations에 대 한 전체 가로 두개골 표면 유지 됩니다. 이 메서드는 일반 electrophysiological15,16,17, optogenetic 결합 될 수 있다 영상18 기법, 실험 프로토콜의 다양 한 결합의 가능성을 제공 하 고.
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Disclosures
내 Berényi 소유자와 Amplipex 주식 회사, 대규모 멀티플렉싱 biosignal 앰프 제조 회사의 설립자입니다. Gábor Kozák 및 Tamás Földi 없다 공개.
Acknowledgments
이 작품은 지원 EU FP7-ERC-2013-시작 권한을 부여 하 여 (No.337075), 과학의 헝가리 아카데미 (LP2013-62), 그리고 GINOP-2.3.2-15-2016-00018 그랜트의 '기세' 프로그램. 우리 감사 Máté Kozák 자극을 문서화 및 기록 전극 Mihály Vöröslakos 유익한 토론에 대 한 프로토콜 디자인.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cyanoacrylate liquid | Henkel | Loctite 401 | |
Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 454 | |
Wire for stimulation electrodes | Phoenix Wire Inc. | 36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire | |
Board spacer | E-tec Interconnect | SP1-020-S378/01-55 | |
Connector | E-tec Interconnect | P2510I-02 | |
Tape packaging for stimulation electrodes | Nexperia | 74HC1G00GW | Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used |
Grip Cement Industrial Grade | Caulk Dentsply | 675571 (powder) 675572 (solvent) | |
Electroconductive gel | Rextra | ECG Gel | |
Recording electrode wire | California Fine Wire Co. | .002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire | |
Ultrafine scissors | Hammacher Instrumente | Stainless HSB 544-09 | |
Stainless steel tube | Vita Needle Company | 29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug | |
High speed rotary saw | Dremel | Model # 395 | |
Rotary saw holder | Dremel | Model # 220 | |
Rotary saw cut-off wheel | Dremel | Model # 409 | |
Ocular sticks | Lohmann-Rauscher | Pro-ophta Ocular Sticks | |
Wet disinfectant | Egis | Betadine | |
Dry disinfectant | Wagner Pharma | Reseptyl-urea | |
Drilling machine | NSK-Nakanishi United Kingdom | Vmax35RV Pack | |
Anchoring screws | Antrin Miniature Specialties, Inc. | 000-120x1/16 SL BIND MS SS |
References
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