Summary
Este protocolo detalhado descreve a colocação de eletrodos de estimulação transcraniana no osso temporal a fim de investigar os efeitos a curto e longo prazo da estimulação elétrica transcraniana em ratos movimentando-se livremente.
Abstract
Estimulação elétrica transcraniana (TES) é uma abordagem relativamente simples e poderosa para influenciar difusamente atividade cerebral aleatoriamente ou de forma acionados por eventos de ciclo fechado. Embora muitos estudos concentram-se os possíveis benefícios e efeitos colaterais de TES em cérebros saudáveis e patológicos, há ainda muitas questões fundamentais sobre o mecanismo de ação da estimulação. Portanto, há uma clara necessidade de um método robusto e reprodutível para testar o aguda e os efeitos crônicos de TES em roedores. TES podem ser combinados com regulares técnicas comportamentais, eletrofisiológicas e de imagem para investigar as redes neuronais em vivo. O implante de eletrodos de estimulação transcraniana não impõe restrições extras sobre o delineamento experimental enquanto oferece uma ferramenta versátil, flexível para manipular a atividade cerebral. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado, passo a passo para fabricar e implante de eletrodos de estimulação transcraniana para influenciar a atividade cerebral de forma temporalmente restrita por meses.
Introduction
Estimulação elétrica transcraniana (TES) é uma abordagem metodológica valiosa para influenciar a atividade cerebral de forma temporalmente restrita. Dependendo do tamanho e posicionamento dos eléctrodos de estimulação, TES podem afetar volumes de cérebro grande e arrastar populações neuronais difusamente1,2,3. Transcraniana por corrente contínua estimulação já medicamente é aprovada para o tratamento do transtorno depressivo maior4,5e muitos estudos enfocam mostrando os efeitos cognitivos de estimulação transcraniana em seres humanos6 , 7. Além disso, prometendo resultados foram relatados sobre o potencial de TES no controle de crises epilépticas8,9.
Apesar da intensa pesquisa, ainda há muitas questões abertas sobre o mecanismo detalhado de ação, efeitos colaterais e o resultado a longo prazo da aplicação deste método10,11,12. Portanto, é criticamente importante ter um protocolo robusto, reprodutível para investigar os efeitos de SMT em modelos animais. Dado que muitas doenças (por exemplo, depressão, epilepsia e esquizofrenia) só podem ser investigadas extensivamente em animais acordados, e a natureza dessas condições médicas geralmente requerem tratamento a longo prazo, nós fornecemos um protocolo para crônica implante de eletrodos de transcraniana em ratos. O método apresentado aqui pode ser usado para estudos comportamentais ou pode ser combinado com implante de eletrodos de gravação (ou seja,fios, sondas de silicone, eletrodos de juxtacellular) ou com windows cranianas crônicas para experimentos eletrofisiológicos e imagem estudos, respectivamente. Dependendo do design experimental, o sincronismo dos estímulos pode ser aleatórios ou acionados por eventos para pistas comportamentais específicas, ou para as características eletrofisiológicas do cérebro particular Estados (convulsões, oscilações de theta)8, 11 , 13.
É importante mencionar que, em contraste com a abordagem humana atualmente usada, que usa uma encarnação de eletrodos colocados na pele, aqui nós mostramos um método que emprega mal o direito de implantação subcutânea sobre a superfície do osso temporal, desde ratos tolera qualquer coisa colocada na sua pele que é facilmente acessível usando suas patas.
Em consonância com os princípios de substituição, redução e refinamento, devido à natureza crônica de implantação, este método ajuda a reduzir o número de animais, desde que cada animal pode ser recrutado em diferentes condições experimentais por meses, permitindo o uso de menos animais para testar várias hipóteses.
No presente estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado, passo a passo do eletrodo de estimulação transcraniana fabricação (figura 1A-B) e demonstrar a implantação crônica desses eletrodos sobre os ossos temporais de um six-month-old rato de Long-Evans masculino.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos estão em conformidade com as directivas do Conselho das Comunidades Europeias (86/609 ECC) e foram aprovados pelo Comitê de ética para a investigação do Animal no centro farmacêutico da Universidade de Albert Szent-Györgyi Medical e Szeged (XIV/218/2016).
1. fabricação de eletrodos de estimulação
- Para fazer uma estimulação eletrodo, corte seis pedaços de 10 cm longo dos fios de ligação em miniatura, remover de 2 cm de revestimento em uma extremidade e 1 cm na outra extremidade.
- Torça os dois cabos juntos e solda-los no lado mais curto pelado.
- Adquira uma tira de três embalagens de fita de qualquer circuito integrado com caso de SOT-353.
- Costure os fios torcidos através de três orifícios do pacote. O segmento mais descascado dos fios deve ser nas cavidades do pacote. Posicione os cabos para que o fim do isolamento está alinhado com a borda dos furos.
- Coloque o cimento dental dos furos para fixar os fios.
Atenção: O cimento dental deve ser denso o bastante para evitar vazamento na cavidade do pacote. - Uma vez que o cimento é solidificado (mínimo 10 min), virar o pacote e coloque uma camada fina de cola no buraco para formar um selo à prova d'água para o cimento poroso. Evite a colagem dos fios descascados.
- Torcer os cabos juntos no lado mais curto pelado e solda-los (figura 1A).
- Pegar mais pelado segmento dos fios com a ponta da pinça fina, rolá-los ao redor e envolvê-los em cavidades (figura 1B). Corte o cabo em excesso, se necessário.
2. fabricação de eletrodos gravação
- Para fazer a gravação de um eletrodo de triplet (Figura 1-D), cortar uma parte longa de um cm de tubo de aço inoxidável usando rotativo de alta velocidade vi. Retire as extremidades do tubo com uma agulha afiada a barbatana e certifique-se de que o tubo está limpa de detritos e completamente permeável.
Nota: Não use alicate, como eles vão distorcer o tubo. - Dobre um pino de espaçador placa banhado a ouro com um comprimento mínimo de 3 cm, para formar um suporte J-forma. Cortar a perna mais comprida da forma 'J' e solda-lo juntos para voltar a forma original para fazer uma destacável junção entre a parte do tempo linear, que será realizada pelo dispositivo estereotáxica, e a forma de 'U', que vai segurar o eletrodo e servir como um ponto de ancoragem . Cola o tubo e a perna mais curta do titular 'J' juntos. Cole algumas barras de tempo adicional de 1 cm, se necessário, para a estabilidade.
- Corte 3 pedaços de fios de eletrodo longa 2,5 cm com aço inoxidável, tesoura ultrafinas. Certifique-se que é um corte de claro e nítido, e o isolamento está intacto na superfície circular do arame eletrodo. Também certifique-se de que a ponta de corte não está dobrada devido a força aplicada. Dobre 1 ou 2 milímetros em uma extremidade de cada um dos fios em ângulos diferentes (por exemplo, um direto de esquerda, um 45 ° e um ângulo reto) para torná-los distinguishable.
- Encha o tubo com os fios, escolha um espaçamento adequado dos eletrodos para o experimento (por exemplo, para o potencial cortical local campo (LFP) e registro atual de fonte densidade (CSD), o recomendado protrusão das pontas dos fios da abertura do tubo: 4,5 mm, 4,1 mm e 3,7 mm, respectivamente). Nota que fio corresponde a qual profundidade para a manutenção de uma ordem de canal adequado.
- Uma vez que os fios alinham ao lado do outro e são paralelos com o tubo, para consertar os fios do eléctrodo, coloque uma gota de cola líquida em ambas as extremidades do tubo com uma agulha afiada. Certifique-se de que a cola está fluindo para dentro do tubo devido ao efeito capilar, mas não no sentido dos locais de gravação nas extremidades salientes.
- Prepare uma placa de interface de eletrodo com uma adequada microconnector compatível com o sistema de gravação para ser usado.
- Introduza as extremidades não-gravação, dobradas dos fios nos furos da placa de interface de eletrodo correspondente ao canal de gravação desejado. Quando todos os fios estão em posição, empurre os pinos ouro nos orifícios com uma pinça.
Nota: Os pinos de ouro podem ser fixados no lugar usando cimento dental, mas na maioria dos casos, é bastante estável mesmo sem esta etapa de segurança.
3. anestesia
- Coloque o animal em uma câmara de indução de anestesia selado e preenchê-lo com 4-5% de isoflurano em 2 L/min de ar médico.
- Quando o rato está reclinado, remover o animal da câmara e colocá-lo em uma armação estereotáxica com um pedaço do nariz de ventilação adequada.
- Defina o nível de isoflurano para 2%, embora a taxa de fluxo de ar deve permanecer o mesmo. Verifique o nível de anestesia. Se há uma ausência de reflexo de retirada da pata em resposta a beliscar, continuar, caso contrário, aumentar a profundidade da anestesia.
- Monitorar e manter a temperatura do corpo do rato a 37 ± 0,5 ° C, com um sistema de monitoramento homeotérmicos. Aplique uma gota de pomada de parafina sobre os olhos para evitar a dessecação da córnea. Repita este procedimento durante a cirurgia várias vezes, se necessário.
- Injecte por via subcutânea atropina 0,3 mg/kg para evitar a formação de muco nas vias aéreas. Repita isto a cada 4 horas em caso de cirurgias mais tempo. Monitorar a respiração e ajustar o vaporizador, se necessário.
4. a implantação da estimulação e eletrodos de gravação
Nota: Autoclave cirúrgico todo necessário instrumentos e siga atentamente as regras gerais de assepsia e anti-sepsia durante todo o processo. Evite tocar não estéreis áreas fora da área cirúrgica. Mergulhe os eléctrodos em álcool etílico (70%) por 30 min antes da implantação.
- Remova a maioria dos cabelos do couro cabeludo com um aparador de cabelo. Aplicar o creme depilatório no couro cabeludo, espalhe uniformemente sobre a superfície e aguarde alguns minutos. Use uma espátula para remover suavemente o creme e o restante do cabelo. Enxague a pele com água, em seguida, com desinfetante.
- Injetar lidocaína a 1-2% (não exceder uma dose total de 7 mg/kg) por via subcutânea para anestesiar a pele. Aplique uma gota de pomada de veterinário para os olhos (por exemplo, parafina).
- Fazer uma incisão sagital long (~ 2 cm) e uma completa na linha média com um bisturi, da testa ao pescoço. Dissecar os tecidos incluindo o periósteo do crânio e, em seguida, usando um formão ou dente uma pinça limpa a área entre as cristas dos dois ossos temporal. Manter o crânio exposto pelo retraindo a pele dissecada usando quatro os bulldogs.
- Delicadamente, coloque a pinça fina entre a borda íngreme do osso temporal e os músculos e separá-los. Faça movimentos de agitação para expor tanto da grande superfície do osso temporal, quanto possível, de preferência da borda do osso occipital ao plano das suturas coronal, sem danificar os músculos.
- Coloque afastadores bitemporally para manter os ossos temporais expostos.
- Enxaguar a superfície do crânio com 1-2 mL 3% H2O2, depois lave-o com 1-2 mL de água.
- Secar a superfície dos ossos temporal muito cuidadosamente, enxugar a umidade com varas oculares. Teste se os eletrodos de estimulação se encaixa sobre a superfície do crânio vertical limpo (a borda superior do eletrodo estimulação deve ser alinhado com a borda da crista do osso temporal). Reajuste os bulldogs e os retractores ou moldar os eletrodos de estimulação com tesoura, se necessário.
- Encha as cavidades da estimulação eletrodos com electroconductive gel e colocar uma camada fina de cola para a borda dos eletrodos.
- Coloque o eletrodo de estimulação sobre a superfície seca do osso temporal com um movimento de precisão e segure-o firmemente no lugar por um minuto com pinça fina. Certifique-se de que nenhuma umidade está em contato com a cola. Esfregar com varas oculares, se necessário.
Atenção: no caso de qualquer instabilidade do eléctrodo é experiente, removê-lo. Após a limpeza do osso, repita essa etapa com um novo eletrodo de estimulação. - Colocar cimento dental sobre as bordas do eletrodo estimulação, enquanto a umidade está vaza dos tecidos é continuamente secou com varas oculares. Cobrir o eletrodo de estimulação todo com cimento.
- Depois que o cimento é completamente endurecido, repita essas etapas no lado contralateral.
- Faça alguns furos por todo o crânio para parafusos de ancoragem. Dirija os parafusos em miniatura nos furos e colocar cimento dental sobre eles. Uso um diâmetro menor de ~ 10% broca em relação ao diâmetro do parafuso.
- Dependendo da finalidade dos experimentos, um conector para as extremidades dos cabos de solda, coloque-o sobre a superfície e cobrir com cimento, ou continuar a implantar a gravação eletrodos e fibras ópticas ou preparar uma janela craniana sobre o crânio. Neste último caso, os conectores de solda e ancorá-los para a construção de apenas no final. Em caso de necessidade de longo prazo gravações simultâneas de TES e LFP, implante os trigêmeos eletrodo acima mencionadas, em vez de fios simples.
Nota: Esta configuração permite a remoção de de artefatos de estimulação de modo comum8. Para os detalhes da implantação do eletrodo de gravação, consulte anteriores protocolos14,15. - Lave os tecidos expostos abundantemente com desinfetante. Injetar lidocaína a 1-2% (não exceder uma dose total de 7 mg/kg) por via subcutânea.
- Debride bordas da ferida e fechá-los com suturas interrompidas simples ao redor do implante/conector. Desinfecte a ferida com iodo-povidona.
- Injete carprofene 5 mg/kg por via subcutânea. Repeti se necessário.
Nota: Quaisquer outros analgésicos podem ser usados correspondência aos requisitos definidos pelo Conselho local permissão ético. - Suspender a anestesia, liberar o earbars e o inalador nasal e colocar o animal em uma gaiola de recuperação pós-operatória para recuperar a consciência.
- Certifique-se de que o animal está sob vigilância durante as primeiras horas de pós-operatório. Continue a monitorar a área de implante periodicamente.
Nota: O animal não deve ser deixado sem supervisão até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Casa do animal individualmente até a recuperação completa do procedimento.
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Representative Results
O implante de eletrodos de estimulação crônica (figura 1B) pode ser combinado com implantação adicional de gravação de eletrodos (Figura 1-D). Essas configurações são adequadas para formar a gravação por demanda e sistemas de estimulação para interferir com as atividades específicas do cérebro. Aqui nós apresentamos resultados representativos de uma epilepsia de loop fechado sistema de detecção e intervenção, aplicado em ratos Long-Evans expressando convulsões espontâneas (Figura 2A)9. Esta variedade é conhecida por mostrar os sintomas comportamentais e electrographic da epilepsia ausência (petit mal) (Figura 2B). No caso de um ataque epiléptico, como gravado intracortical sinais são analisados em tempo real, um gatilho é enviado para um gerador de estímulo isolado no momento apropriado para interferir com a atividade de pico-e-onda do cérebro. Por sua vez, o gerador de estímulo proporciona um estímulo de trifásico balanceamento de carga, através de eletrodos de estimulação a bitemporal para interromper a atividade de apreensão.
Figura 2-D mostra a capacidade dos estímulos temporalmente alvo interromper convulsões em curso da semana 1 a semana 16, demonstrando a robustez e confiabilidade dos eléctrodos de estimulação implantado. Para colocar esses resultados no contexto, Figura 2E exibe as gravações de um experimento abortado, onde o tecido secundário penetrou entre o osso temporal e a superfície do eletrodo devido a selagem inadequada e cimentação dos eletrodos (autópsia do animal confirmou a invasão de tecido). Além de aumentar a impedância dos eléctrodos de estimulação, o crescimento do tecido é susceptível de fornecer uma derivação elétrica. Esta experiência destaca a importância total de isolamento cuidadoso para alcançar resultados confiáveis e reprodutíveis durante as experiências de estimulação.
Figura 1: etapas de estimulação e gravação de fabricação de eletrodos. (A) Twisted fios costurados através dos orifícios e fixado na embalagem antes de embrulhar os fios descascados em cavidades. (B) a forma Final dos eléctrodos de estimulação. Baixo-relevo: enrolado de fios dentro da embalagem; (C) lado Ver os dos eléctrodos de gravação; (D) vista superior dos eléctrodos de gravação. Baixo-relevo: Dica de sites de gravação, 400 µm de espaçamento. Foto intra-operatória (E) a colocação de eletrodos de estimulação transcraniana. Os eletrodos de estimulação são já implantados, juntamente com alguns dos parafusos de ancoragem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resultados representativos da intervenção de apreensão de loop fechado usando os eletrodos de estimulação do presente protocolo. (A) visão geral do sistema de circuito fechado. Eletrodos de gravação Triplet são implantados no córtex parietal e eletrodos de estimulação são colocados bitemporally no crânio. O rato é equipado com um amplificador na cabeça e conectado a um sistema de detecção de ataque em tempo real. (B) LFP vestígio de um vestígios de exemplo LFP ininterrupto apreensão do ponto-e-onda (C e D) de intervenção de apreensão sobre a 1st e 16th semana de estimulação. (E) exemplo de falha de interrupção de apreensão no caso de tecido crescendo entre os eletrodos de estimulação e o osso temporal (confirmado pela autópsia) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A etapa mais crítica do presente protocolo é a colagem do pacote de eletrodos na superfície do osso. No caso de selagem inadequada, uma lacuna é formada entre os eléctrodos e o osso e tecido de cicatrização secundário pode crescer a esta lacuna, o que diminui a qualidade da estimulação. A superfície do osso deve ser completamente seca durante as etapas de colagem sobre o pacote, e no caso de experimentando instabilidade dos eletrodos, deve ser removido e substituído com um novo pacote para obter os melhores resultados.
Uma limitação deste método é que, como a pele não está completamente fechada após a cirurgia, há um risco relativamente maior de infecção. Cuidados pós-operatórios nos primeiros 4-5 dias durante a recuperação com solução desinfetante e mais tarde com o pó, ajuda a prevenir a infecção. Em nossa experiência, esse tratamento facilita a formação de tecido cicatricial, que pode fechar completamente a ferida para com o mundo externo.
Aqui apresentamos um dos métodos de fabricação de eletrodos, mas depende as necessidades especiais das experiências particulares, modificação do material condutor pode ser necessária, por exemplo, mais baratos, mais acessíveis do revestimento da superfície dos cabos com não-polarização eletrodo interface materiais, por exemplo, PEDOT:PSS. O pacote de eletrodo pode ser feitos por medida, 3D-impresso e modificado pelos experimentadores, caso as nossas recomendações não corresponde aos requisitos de um estudo particular. Em nossa experiência, o tamanho dos eléctrodos transcraniana fabricado neste estudo permitir implantações em ratos machos e fêmeas acima de 300 g de peso corporal, mas o tamanho dos eléctrodos de estimulação facilmente pode ser reduzido por um corte tiras menores na etapa de protocolo 1.3. Além disso, todas as colas e cimentos dentais dados no protocolo podem ser substituídos com substitutos, Considerando que a camada externa é em contato direto com os tecidos, portanto devem ser biocompatível.
No presente estudo, nós fornecemos um protocolo para fabricação de eletrodos de estimulação bitemporal e implantação, que é tecnicamente simples para executar, custo-eficaz e confiável no longo prazo, permitindo que as experiências de estimulação elétrica em livremente de ratos em movimento9. Como os eletrodos de estimulação são colocados no osso temporal, a superfície do crânio todo horizontal é preservada para outras implantações. Esse método pode ser combinado com regular eletrofisiológicos15,16, optogenetic17e18 técnicas, oferecendo a possibilidade de uma versátil combinação de protocolos experimentais de imagem.
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Disclosures
Antal Berényi é o proprietário e fundador da Amplipex Ltd, uma empresa de fabricação em grande escala amplificadores multiplexação de sinais. Gábor Kozák e Tamás Földi não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo EU-FP7-ERC-2013-começando grant (No.337075), o programa 'Momentum' da Academia húngara de Ciências (LP2013-62) e o grant GINOP-2.3.2-15-2016-00018. Agradecemos a Máté Kozák para documentar a estimulação e gravação eletrodos e Mihály Vöröslakos o debate frutífero durante o projeto de protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate liquid | Henkel | Loctite 401 | |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 454 | |
| Wire for stimulation electrodes | Phoenix Wire Inc. | 36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire | |
| Board spacer | E-tec Interconnect | SP1-020-S378/01-55 | |
| Connector | E-tec Interconnect | P2510I-02 | |
| Tape packaging for stimulation electrodes | Nexperia | 74HC1G00GW | Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used |
| Grip Cement Industrial Grade | Caulk Dentsply | 675571 (powder) 675572 (solvent) | |
| Electroconductive gel | Rextra | ECG Gel | |
| Recording electrode wire | California Fine Wire Co. | .002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire | |
| Ultrafine scissors | Hammacher Instrumente | Stainless HSB 544-09 | |
| Stainless steel tube | Vita Needle Company | 29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug | |
| High speed rotary saw | Dremel | Model # 395 | |
| Rotary saw holder | Dremel | Model # 220 | |
| Rotary saw cut-off wheel | Dremel | Model # 409 | |
| Ocular sticks | Lohmann-Rauscher | Pro-ophta Ocular Sticks | |
| Wet disinfectant | Egis | Betadine | |
| Dry disinfectant | Wagner Pharma | Reseptyl-urea | |
| Drilling machine | NSK-Nakanishi United Kingdom | Vmax35RV Pack | |
| Anchoring screws | Antrin Miniature Specialties, Inc. | 000-120x1/16 SL BIND MS SS |
References
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