Summary
Этот подробный протокол описывает транскраниальной стимуляции электрода размещение на височной кости для того, чтобы исследовать кратко - и долгосрочные эффекты транскраниальной электростимуляции в свободно перемещающихся крыс.
Abstract
Транскраниальной электростимуляции (ТЭС) является мощным и относительно простой подход к диффузно влияние активность мозга, случайно или событийные образом замкнутого цикла. Хотя многие исследования сосредоточены на возможные преимущества и побочные эффекты ТЭС в здоровых и патологического мозги, есть еще много основных нерешенных вопросов, касающихся механизма действия стимуляции. Таким образом, существует явная необходимость надежных и воспроизводимых метод для тестирования острые и хронические эффекты TES грызунов. TES может сочетаться с регулярные поведенческих, электрофизиологических и тепловизионные методы расследовать нейрональных сетей в vivo. Имплантация электродов транскраниальной стимуляции не налагают дополнительные ограничения на экспериментальный дизайн хотя он предлагает универсальный и гибкий инструмент для манипулирования активность мозга. Здесь мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол в изготовлении и имплантировать электроды транскраниальной стимуляции влиять активность мозга в духе височно ограниченных для месяцев.
Introduction
Транскраниальной электростимуляции (ТЭС) является ценным методологический подход к влияние активность мозга в височно ограниченных образом. В зависимости от размера и размещения электродов стимуляции, пес может повлиять на объемы большого мозга и увлекают нейрональных популяций диффузно1,2,3. Постоянного тока транскраниальной стимуляции уже медицински одобрен для лечения большого депрессивного расстройства4,5, и многие исследования фокус на показ когнитивных эффектов транскраниальной стимуляции в людей6 , 7. Кроме того, обещая результатах сообщалось о возможностях TES в контроле эпилептические припадки8,9.
Несмотря на интенсивные исследования есть еще много нерешенных вопросов, касающихся детальный механизм действий, возможных побочных эффектов и долгосрочный результат применения этого метода10,,1112. Таким образом критически важно иметь надежный, воспроизводимые протокол к исследовать эффекты ТЭС в животных моделях. Учитывая, что многие расстройства (например, депрессии, эпилепсии и шизофрении) могут быть широко исследованы в просыпаются животные и природа этих медицинских условий обычно требуют длительного лечения, мы предоставляем протокол для хронических Имплантация электродов транскраниальной крыс. Представленные здесь метод может использоваться для исследования поведенческих или могут быть объединены с имплантация электродов записи (то есть, провода, силиконовые зонды, juxtacellular электроды) или с хроническими черепной windows для электрофизиологических экспериментов и изображений исследования, соответственно. В зависимости от экспериментальный дизайн сроки стимулов может быть случайных или событиями для конкретных поведенческих подсказки или электрофизиологических клейма в частности мозга государств (припадки, тета колебания)8, 11 , 13.
Важно отметить, что в отличие от используемых в настоящее время человека подход, который использует воплощение электродов, расположенных на коже, здесь мы показываем метод, который использует подкожной имплантации права над поверхностью височной кости, с крысы едва терпеть что-нибудь на их кожи, которые легко доступны, используя их лапы.
В соответствии с принципами замены, сокращение и утонченности, вследствие хронического характера имплантации этот метод помогает уменьшить количество животных, поскольку каждое животное могут быть набраны в различных экспериментальных условиях для месяцев, что позволяет использовать меньшее количество животных для тестирования различных гипотез.
В настоящем исследовании мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол транскраниальной стимуляции электрода производства (Рисунок 1A-B) и продемонстрировать хронического вживления эти электроды над височной кости 6 месячного мужчина долго-Эванс крыса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, в соответствии с директивами Совета европейских сообществ (86/609 ECC) и были утверждены Этический Комитет для исследования животных на Альберт Szent-Дьерди медицинский и фармацевтический центр университета Сегед (XIV/218/2016).
1. Изготовление электродов стимуляции
- Чтобы сделать одну стимуляция электрода, вырезать шесть 10 см длинные куски миниатюрные подключение проводов, удалите 2 см обшивки на одном конце и 1 см на другом конце.
- Поверните два кабели вместе и паять их на стороне короче очищенный.
- Приобрести полосы три упаковки ленты любого интегральной схемы с корпус SOT-353.
- Стежка скрученные провода через три отверстия пакета. В полостях пакета должно быть больше очищенные сегмент провода. Расположите кабели так, чтобы конец изоляции соответствует краю отверстия.
- Положите стоматологического цемента на отверстия, чтобы исправить провода.
Предупреждение: Стоматологического цемента должны быть достаточно плотным для того, чтобы избежать утечки в полость пакета. - Как только цемент затвердевших (минимум 10 мин), флип пакет и положить тонкий слой суперклея в отверстие в форме водонепроницаемые уплотнения к пористой цемента. Избегайте клея очищенные провода.
- Перекручивайте кабели вместе на стороне короче очищенные и паять их (рис. 1A).
- Захватить больше очищенные сегмент провода с кончик тонкой пинцет, раскатать их вокруг и обернуть их в полости (рис. 1B). Отрежьте излишки кабеля, при необходимости.
2. Изготовление электродов записи
- Чтобы сделать одну запись триплет электрода (Рисунок 1 c-D), вырезать один см длинный кусок трубки из нержавеющей стали с использованием высокоскоростной роторный видел. Удалить ребра из концов трубки с резким игольчатые и убедитесь, что трубка очистить от мусора и полностью проницаемые.
Примечание: Не используйте плоскогубцы, как они будут исказить трубка. - Согните распорку pin-позолоченные платы с минимальной длиной 3 см для формирования J-образный держатель. Вырезать больше нога «J» формы и паять его вместе, чтобы получить обратно первоначальную форму сделать съемный стык между давно линейной части, которая будет проводиться стереотаксического устройством, и форме «U», которые проведет электрода и служить в качестве точки привязки . Склейте трубки и короткие ноги «J» держателя. Клей некоторые дополнительные 1 см длинные полосы, при необходимости, для обеспечения стабильности.
- Вырежьте 3 куски провода 2,5 см длиной электрода с нержавеющей стали, ультрадисперсных ножницы. Убедитесь, что это четкое и резкое сокращение, и изоляция повреждена на поверхности круговой электродной проволоки. Кроме того, убедитесь, что вырезать кончик не согнута благодаря усилие. Изгиб 1 или 2 мм на одном конце каждого из проводов под разными углами (например, один левый прямой, один 45 ° и один прямой угол) чтобы сделать их отличить.
- Заполнить трубу с проводами, выберите соответствующий интервал электродов для эксперимента (например, корковых местах потенциал (LFP) и текущий источник плотности (КУР) регистрации, рекомендованные выступ наконечников проводов от Открытие трубки: 4,5 мм, 4,1 мм и 3,7 мм, соответственно). Обратите внимание, какие провода соответствует какой глубины для поддержания правильного канала порядка.
- Провода по правому рядом друг с другом и параллельно трубе, чтобы исправить электродных проволок, место одной капли жидкого суперклея на обоих концах трубки с острые иглы. Убедитесь, что клей поступает в трубу за счет капиллярного эффекта, но не к записи сайтов на выступающих концах.
- Подготовьте электрода интерфейсная плата с надлежащей microconnector совместим с системой записи для использования.
- Внедрение-запись, изогнутые концы проводов в отверстия электрода интерфейсная плата соответствует требуемой записи канала. Когда все провода находятся в положении, вставьте золотой булавки в отверстия с помощью пинцета.
Примечание: Золотой булавки могут устанавливаться в месте, с использованием стоматологического цемента, но в большинстве случаев, это достаточно стабильным даже без этого шага безопасности.
3. анестезия
- Поместите животное в камере индукции запечатанном анестезии и заполнить его с 4-5% изофлюрановая медицинского воздуха 2 Л/мин.
- Когда крыса лежачие, удалите животное из камеры и поместите его в Стереотаксическая рама с соответствующей вентиляции носа кусок.
- Установите уровень изофлюрановая 2%, хотя скорость воздушного потока должен оставаться одинаковым. Проверьте уровень анестезии. Если есть отсутствие рефлекс вывод лапы в ответ на щипать, продолжить, в противном случае увеличение глубины анестезии.
- Контролировать и поддерживать температуру тела крыс на 37 ± 0,5 ° C с гомойотермных системой мониторинга. Примените капли парафина мазь на глаза, чтобы предотвратить истощение роговицы. Повторите эту процедуру во время операции несколько раз, если это необходимо.
- Подкожно вводить атропина 0,3 мг/кг, чтобы избежать образования слизи в дыхательных путях. Повторите эту процедуру каждые четыре часа в случае больше кабинетов. Контролировать дыхание и настроить испарителя, при необходимости.
4. Имплантация стимуляции и записи электродов
Примечание: Автоклав все необходимые хирургические инструменты и тщательно соблюдать общие правила асептики и антисептики в течение всей процедуры. Не прикасайтесь нестерильной районы за пределами области хирургического. Погружайте электродов в этиловый спирт (70%), за 30 мин до имплантации.
- Удалите большую часть волос из головы с клипер волос. Применить депиляционный крем на кожу головы, равномерно на поверхности и подождите несколько минут. Лопаточкой аккуратно удалить крем и оставшиеся волосы. Промывайте кожу водой, затем с дезинфицирующим средством.
- Придать 1-2% лидокаин (не превышает общую дозу 7 мг/кг) подкожно, чтобы ошеломить кожи. Применение одной капли ветеринар мазь для глаз (например, парафин).
- Сделайте тщательный и длинные (~ 2 см) Сагиттальный разрез в срединной линии с помощью скальпеля, от лба к шее. Вскрыть тканей, включая надкостницы от черепа, а затем с помощью стамески или зуб пинцета очистить район между макул двух височных костей. Держите черепа, предоставляемые втягивания расчлененных кожи, используя четыре бульдогов.
- Аккуратно место тонкой пинцет между крутыми края височной кости и мышцы и разделить их. Сделайте отсадки движений, чтобы разоблачить столько большой поверхности височной кости как можно скорее, предпочтительно от края затылочной кости к плоскости корональный швов, без повреждения мышц.
- Место bitemporally ретракторы сохранить височной кости подвергаются.
- Промойте поверхность черепа с 1-2 мл 3% H2O2, затем промойте его с 1-2 мл воды.
- Очень тщательно просушите поверхности височных костей, вытирать влагу с глазные палочки. Тест, если электроды стимуляции помещается на поверхности очищаемой вертикальных черепа (верхний край электрод стимуляции должны соответствовать края Криста височной кости). Подрегулировать бульдоги и втягивающие или фигуру электроды стимуляции с помощью ножниц, при необходимости.
- Заполнение полости стимуляция электродов с электропроводящих гель и нанесите тонкий слой клея на обод электродов.
- Поместите электрод стимуляции на сухой поверхности височной кости с одним точным движением и держите его твердо в месте в течение одной минуты штрафа пинцетом. Убедитесь, что нет влаги находится в контакте с клеем. Швабра с глазные палочки, в случае необходимости.
Предупреждение: В случае, если любая нестабильность электрода опытные, удалите его. После очистки костей, повторите этот шаг с новым электрод стимуляции. - Положите стоматологического цемента за края электродов стимуляции, в то время как течь влага тканей постоянно иссяк с глазные палочки. Покрывают весь стимуляции электрод с цементом.
- После того, как полностью затвердевшего цемента, повторите эти действия на контралатеральную сторону.
- Некоторые отверстия по всему черепа для крепления винтов. Драйв миниатюрных винты в отверстия и положить стоматологического цемента над ними. Использование меньшего диаметра ~ 10% сверлить головы, по сравнению с диаметр винта.
- В зависимости от цели экспериментов либо припой соединителя на концы кабелей, поместите его на поверхность и крышка с цементом, или продолжить вживления электродов записи и оптических волокон или подготовить черепной окно над черепа. В этом последнем случае паять разъемы и привязать их к конструкции только в конце. В случае необходимости долгосрочной одновременных записей TES и LFP имплантат вышеупомянутых электрода тройни вместо одиночных проводов.
Примечание: Эта настройка позволяет для удаления общего режима стимуляции артефакты8. Для записи электрода имплантации детали см. предыдущий протоколы14,15. - Вымойте подвергаются ткани обильно с дезинфицирующим средством. Придать 1-2% лидокаин (не превышает общую дозу 7 мг/кг) подкожно.
- Предотвращать края раны и закрыть их с простыми швами Прерванный вокруг имплантата соединителя. Лечить рану повидон йод.
- Придать carprofene 5 мг/кг подкожно. При необходимости, повторите это.
Примечание: Любые другие болеутоляющие средства могут использоваться соответствия требованиям, установленным Советом местных этические разрешение. - Приостановить анестезии, выпуск earbars и Стволы пожарные и положить животное в клетке послеоперационного восстановления, чтобы восстановить сознание.
- Убедитесь, что животное находится под тщательным наблюдением во время первых послеоперационных часов. Продолжать периодически контролировать области имплантата.
Примечание: Животное не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Дом животное индивидуально до полного восстановления от процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Имплантация электродов хронической стимуляции (рис. 1B) могут быть объединены с дополнительным имплантации записи электродов (Рисунок 1 c-D). Такие параметры подходят для формирования систем стимуляции мешать деятельности конкретных мозга и записи по требованию. Здесь мы представляем представитель результаты вмешательства системы, применяется на Лонг-Эванс крыс, выражая спонтанные судороги (рисунок 2A)9и эпилепсии замкнутого цикла обнаружения. Известно, что этот штамм Показать электрографические и поведенческие симптомы эпилепсии отсутствие (petit mal) (рис. 2B). В случае эпилептический припадок, как записанные intracortical сигналов анализируются в режиме реального времени, триггер отправляется в изолированной стимул генератор в соответствующий момент вмешиваться Спайк волна активности головного мозга. В свою очередь стимул генератор обеспечивает заряд сбалансированный, трехфазных стимул через электроды стимуляции Битемпоральная, чтобы прервать действие изъятия.
Рисунок 2 c-D показывает количество височно целевые стимулы для прерывания текущей изъятий от 1 недели до недели 16, продемонстрировав устойчивость и надежность электродов имплантированных стимуляции. Чтобы поместить эти результаты в контексте, Рисунок 2E отображает записи прерывания эксперимента, где среднее ткани проникли между височной кости и поверхности электрода из-за неправильного запечатывания и вяжущие электродов (показывает вскрытие животное подтвердил вторжения ткани). Помимо увеличения импеданс электродов стимуляции, рост ткани может обеспечить электрические шунта. Этот эксперимент свидетельствует полное важность тщательной изоляции добиться надежных и воспроизводимых результатов во время стимуляции экспериментов.
Рисунок 1: шаги стимуляции и записи Изготовление электродов. (A) витой провода сшитые через отверстия и фиксируется на упаковке перед оборачивать очищенные провода в полости. (B) окончательная форма электродов стимуляции. Вставка: завернутый провода внутри упаковки; (C) вид записи электродов; Вид сверху (D) записи электродов. Вставка: Кончик записи сайтов, 400 мкм интервал. (E) интраоперационной картина размещения электрода транскраниальной стимуляции. Уже вживляются электроды стимуляции, вместе с некоторыми из анкерные болты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель результаты замкнутой захват вмешательства с помощью электродов стимуляции этого протокола. (A) Обзор системы закрытого цикла. Триплет записи электродов имплантирован в теменной коре и электроды стимуляции помещаются bitemporally на черепе. Крыса оснащен усилитель на голову и подключены к системе обнаружения в реальном времени захвата. (B) LFP след непрерывный захват Спайк волна (C и D) пример LFP следы вмешательства захват на 1-й и 16-й недели стимуляции. (E) пример отказа захват прерывания в случае ткани между электроды стимуляции и височной кости (подтверждено результатами вскрытия) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важным этапом этого протокола является приклеивание пакет электродов на поверхности кости. В случае ненадлежащего уплотнения, образуется зазор между электродами и кости, и вторичного рубцовой ткани может вырасти в этот разрыв, который уменьшает качество стимуляции. Кость поверхность должна быть абсолютно сухой во время шагов прилипания на упаковке, а в случае наблюдается нестабильность электродов, он должен быть удалены и заменены с нового пакета, чтобы получить наилучшие результаты.
Ограничение этого метода является, как кожа полностью не закрыта после операции, это относительно высокий риск инфекции. Послеоперационный уход в первые 4-5 дней при восстановлении с дезинфицирующим раствором, а затем с порошком, помогает предотвратить инфекции. По нашему опыту это лечение облегчает формирование рубцовой ткани, который можно полностью закрыть рану к внешнему миру.
Здесь мы представили один из дешевых, самых доступных методов изготовления электрода, но в зависимости от особых потребностей конкретных экспериментов, модификация проводящего материала могут быть необходимы, например, покрытие поверхности Кабели с-поляризационные электрода интерфейс материалы, например, PEDOT:PSS. Электрод пакет может быть на заказ, 3D-печати и измененной экспериментаторов, в случае наши рекомендации не соответствуют требованиям конкретного исследования. В нашем опыте размер транскраниальной электродов, изготовленный в этом исследовании позволяют имплантаций в мужских и женских крысы выше 300 г веса, но размер электродов стимуляции легко может быть уменьшен путем разрезания небольшие полоски в протокол шаг 1.3. Кроме того все клеи и стоматологических цементов, дано в протоколе могут быть заменены с заменителями, учитывая, что наружный слой находится в прямом контакте с ткани, поэтому они должны быть био совместимого.
В настоящем исследовании мы предоставили протокол для изготовления электродов стимуляции Битемпоральная и имплантации, который является технически простой для выполнения, экономически эффективной и надежной в долгосрочной перспективе, позволяя электрической стимуляции эксперименты на свободно Перемещение крысы9. Как электроды стимуляции размещаются на височной кости, черепа всей горизонтальной поверхности сохраняется для других имплантации. Этот метод может сочетаться с регулярной электрофизиологических15,16, optogenetic17и18 методы, обеспечивая возможность универсальный сочетание экспериментальных протоколов визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Антал Берений является владельцем и основателем компании Amplipex Ltd, компания, производящая крупномасштабных мультиплексирования biosignal усилителей. Габор Козак и Тамаш Фолди имеют ничего не разглашать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом ЕС-FP7-ERC-2013-Начиная (No.337075), «Импульс» программа Венгерской академии наук (LP2013-62) и GINOP-2.3.2-15-2016-00018 Грант. Мы благодарим Мате Козак за документирование стимуляции и записи электродов и Михай Vöröslakos для плодотворных дискуссий в ходе разработки протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate liquid | Henkel | Loctite 401 | |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 454 | |
| Wire for stimulation electrodes | Phoenix Wire Inc. | 36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire | |
| Board spacer | E-tec Interconnect | SP1-020-S378/01-55 | |
| Connector | E-tec Interconnect | P2510I-02 | |
| Tape packaging for stimulation electrodes | Nexperia | 74HC1G00GW | Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used |
| Grip Cement Industrial Grade | Caulk Dentsply | 675571 (powder) 675572 (solvent) | |
| Electroconductive gel | Rextra | ECG Gel | |
| Recording electrode wire | California Fine Wire Co. | .002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire | |
| Ultrafine scissors | Hammacher Instrumente | Stainless HSB 544-09 | |
| Stainless steel tube | Vita Needle Company | 29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug | |
| High speed rotary saw | Dremel | Model # 395 | |
| Rotary saw holder | Dremel | Model # 220 | |
| Rotary saw cut-off wheel | Dremel | Model # 409 | |
| Ocular sticks | Lohmann-Rauscher | Pro-ophta Ocular Sticks | |
| Wet disinfectant | Egis | Betadine | |
| Dry disinfectant | Wagner Pharma | Reseptyl-urea | |
| Drilling machine | NSK-Nakanishi United Kingdom | Vmax35RV Pack | |
| Anchoring screws | Antrin Miniature Specialties, Inc. | 000-120x1/16 SL BIND MS SS |
References
- Ozen, S., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (34), 11476-11485 (2010).
- Ali, M. M., Sellers, K. K., Frohlich, F. Transcranial alternating current stimulation modulates large-scale cortical network activity by network resonance. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (27), 11262-11275 (2013).
- Helfrich, R. F., et al. Entrainment of brain oscillations by transcranial alternating current stimulation. Current biology : CB. 24 (3), 333-339 (2014).
- Bikson, M., et al. Transcranial direct current stimulation for major depression: a general system for quantifying transcranial electrotherapy dosage. Current treatment options in neurology. 10 (5), 377-385 (2008).
- Lefaucheur, J. P., et al. Evidence-based guidelines on the therapeutic use of transcranial direct current stimulation (tDCS). Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 128 (1), 56-92 (2017).
- Kuo, M. F., Nitsche, M. A. Effects of transcranial electrical stimulation on cognition. Clinical EEG and neuroscience. 43 (3), 192-199 (2012).
- Sandrini, M., Fertonani, A., Cohen, L. G., Miniussi, C. Double dissociation of working memory load effects induced by bilateral parietal modulation. Neuropsychologia. 50 (3), 396-402 (2012).
- Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation. Science. 337 (6095), New York, N.Y. 735-737 (2012).
- Kozak, G., Berenyi, A. Sustained efficacy of closed loop electrical stimulation for long-term treatment of absence epilepsy in rats. Scientific reports. 7 (1), 6300 (2017).
- Fertonani, A., Ferrari, C., Miniussi, C. What do you feel if I apply transcranial electric stimulation? Safety, sensations and secondary induced effects. Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 126 (11), 2181-2188 (2015).
- Marshall, L., Binder, S. Contribution of transcranial oscillatory stimulation to research on neural networks: an emphasis on hippocampo-neocortical rhythms. Frontiers in human neuroscience. 7, 614 (2013).
- Reato, D., Rahman, A., Bikson, M., Parra, L. C. Effects of weak transcranial alternating current stimulation on brain activity-a review of known mechanisms from animal studies. Frontiers in human neuroscience. 7, 687 (2013).
- Thut, G., Miniussi, C. New insights into rhythmic brain activity from TMS-EEG studies. Trends in cognitive sciences. 13 (4), 182-189 (2009).
- Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of visualized experiments : JoVE. (60), (2012).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (61), e3568 (2012).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52554 (2015).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e50004 (2012).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (12), (2008).
