Summary
Sperma vloeibaar is vereist voor sperma worden bevrijd van de rudimentaire gel. Deze studie bevat de procedures voor het verzamelen van sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem na coïtus en sperma vloeibaar tijdmeting.
Abstract
Bij muizen, wordt ejaculated sperma gestort in de baarmoeder. Na ejaculatie, verandert het sperma consistentie van gel-achtige te waterig, een proces dat vloeibaar. In deze studie, we laten zien hoe het na ejaculated sperma van het vrouwelijke voortplantingssysteem in een muismodel verzamelen. Eerste, volwassen vrouwelijke muizen in de estrus fase werden gehuisvest in een man de kooi 's nachts. De volgende ochtend, werd copulatie bevestigd door de aanwezigheid van copulatory stekker aan de vaginale opening. Vrouwelijke muizen met copulatory stekkers waren euthanized, en elke voortplantingssysteem verzameld als geheel (vagina, baarmoeder, oviducts, eierstokken), zorgen voor een gesloten systeem om te bevatten het sperma. Het voortplantingskanaal werd geplaatst in een tube van 1,5 mL microcentrifuge, en de vagina werd afgesneden vrij te geven van het sperma in de buis. Om ervoor te zorgen maximale sperma volume voor analyse, tandeloze pincet dienden te knijpen de baarmoeder horens van ovariële einde vaginale daartoe resterende sperma verdrijven. Het hele voortplantingskanaal werd vervolgens weggegooid. De sperma-bevattende buis was kort gesponnen beneden. Capillaire Pipetteer 25 μL werd geplaatst in de buis onder een hoek van 180° (parallel aan de buiswand). De hoeveelheid tijd gebruikt voor het vullen van het capillair aan de 25 μL lijn werd opgenomen. Sperma van een bewezen mannelijke Fokker duurt meestal ongeveer 60-180 s tot een capillaire buis van 25 μL. Dit sperma collectie techniek kan ook worden gebruikt in andere downstream toepassingen zoals sperma beeldvorming en motiliteit analyse.
Introduction
Het vrouwelijke voortplantingssysteem bestaat uit de bovenste en onderste traktaten. Het bovenste voortplantingskanaal omvat de eileiders, de baarmoeder en de endocervix. Het lagere voortplantingskanaal omvat de ectocervix en de vagina. Bij de mens, wordt het ejaculated sperma gestort op de voorste wand van de vagina, grenzend aan de ectocervix1. Bij muizen, echter is het sperma veegde in de baarmoeder binnen minuten na de paring2.
Sperma bevat baanbrekende gel die is verhard binnen seconden na de ejaculatie, waardoor het sperma te worden in de val gelokt en3geïmmobiliseerd. Vloeibaar brengt het geïmmobiliseerdet sperma door sperma van een gel-achtige omzetten in een waterige consistentie. Dit proces is essentieel voor de beweeglijkheid van de zaadcellen en zoogdieren reproductie. Kennis van sperma vloeibaar is meestal gebaseerd op in vitro studies waar sperma wordt vloeibaar in een cultuur schotel. Bij de mens is de enzymatische activiteit van prostaat specifiek antigeen of PSA (ook bekend als kallikrein-gerelateerde peptidase 3 of KLK3) de grootste bijdrage voor vloeibaar maken door middel van hydrolyse van semenogelins (gel-vormende aanwezige eiwitten in het sperma)4 ,5,6. Afbraak van semenogelins bevrijdt het sperma van de baanbrekende coagulum, mobiliteit van sperma. Bevrijd zaadcellen zwemmen naar de eileider te bevruchten het ei. Vloeibaar (of sperma viscositeit) tests zijn een van de standaard eerste screenings voor semenanalyse in vruchtbaarheid klinieken te beoordelen van de mannelijke vruchtbaarheid7.
Een onlangs gepubliceerde artikel toont aan dat de analyse van zaadvocht vloeistof verzameld uit de vrouwelijke muis voortplantingssysteem na de paring kan worden gebruikt ter illustratie van een tekort aan vloeibaar dat vervolgens leiden vruchtbaarheid gebreken8 tot kan. Defecte vloeibaar zoals sperma hyperviscosity draagt bij aan 11,8-32.3% van onvruchtbaar gevallen in mannen9, suggereert dat de normale vloeibaar onmisbaar voor de voortplanting van de zoogdieren is. Echter, studies en de behandeling van vloeibaar gebreken hebben uitsluitend gericht op de mannelijke7. De mogelijkheid dat het vrouwelijke voortplantingssysteem een rol in het sperma vloeibaar speelt is niet onderzocht. Daarom zal de methoden voor sperma en vloeibaar meettijd bieden onderzoekers een nieuwe diagnostische tool om te bepalen of vloeibaar maken één van de oorzaken van onvruchtbaarheid bij de modelorganisme van belang zou kunnen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren en procedures die gebruikt worden in deze studie werden behandeld volgens de Washington State University (WSU) Animal Care en gebruik Comité richtsnoeren en met inachtneming van de WSU-goedgekeurde dierlijke protocollen #4702 en #4735.
1. muizen
-
Gebruik standaard C57BL/6J volwassen mannelijke muizen of andere stammen van belang. Het houden van dieren onder een temperatuur - en vocht-gecontroleerde omgeving, met ad libitum toegang van water en voedsel.
- Gebruik mannelijke fokkers variërend van 8 weken oud tot 10 maanden oud. Gebruik alleen bewezen kwekers in de experimenten.
-
Volwassen vrouwelijke muizen met een selectieve schrapping van weefsel van voortplantingssysteem oestrogeen receptor α (gecodeerd door Esr1 gen) gebruiken in de epitheliale cellen10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, knock-out of "KO" genoemd) en controle van nestgenoten (Esr1f/f, genaamd "CTRL") in deze studie.
- Gebruik 8 weken oude vrouwtjes. Leeftijden van vrouwtjes gevarieerd afhankelijk van het experiment van belang.
- Het bepalen van de stadia van de oestrische cyclus in de ochtend om 08:00 uur. Gebruik alleen vrouwtjes in de estrus fase van de cyclus. Voor gedetailleerde methoden van vaginale smeren en cytologische analyse, verwijzen naar de eerder gepubliceerde procedures11.
2. voortplanting en beoordelen van Copulatory stekkers
- Op de dag van estrus (16:00 h), het huis van de vrouwelijke in een man in de kooi.
- De volgende ochtend (08:00 h), scheiden de vrouwtjes van de mannelijke muis.
- Gebruik een aanpassing van een eerder gepubliceerde methode12 om de aanwezigheid of afwezigheid van een vaginale of copulatory stekker als indicatie van de paring.
- Houd de vrouwelijke muis uit de basis van de staart te kort heffen de achterste ledematen.
- Zoek de copulatory stekker van de aanwezigheid van een gebroken witte baanbrekende coagulum bij de vaginale opening met een tandenstoker. Als de stekker van de copulatory aanwezig is, zal de tandenstoker niet zitten kundig voor het vaginale kanaal worden ingevoegd.
3. voorbereiding voor weefsel collectie
- Bereiden van 10 mL Leibovitz van L-15 media, aangevuld met 1% foetale runderserum (genaamd L15 media + 1% FBS) in een tube van 15 mL. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. in waterbaden media.
- Oog op het behoud van de levensvatbaarheid van het weefsel en sperma voor downstream toepassingen, aliquoot 2 mL voorverwarmde L15 media + 1% FBS in een microcentrifuge van 2 mL tube voor weefsel collectie.
- Warm de fase van de stereomicroscoop tot 37 ° C. De warmte-blok ingesteld op 37 ° C en plaats een lege 1,5 mL microcentrifuge buis in het blok.
- Indien de downstream toepassingen beeldvorming van de beweeglijkheid van de zaadcellen vereisen, warm het glasplaatje tot 37 ° C.
4. de weefsels collectie
- Voorverwarmde L15 media + 1% FBS aliquot brengen door het weefsel collectie gebied.
- Het vrouwtje euthanaseren (~ 08: 30h) met behulp van kooldioxide verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.
Opmerking: Dit is ongeveer 8 h na de paring, ervan uitgaande dat paring om middernacht plaatsvindt. - Plaats het dier in een liggende positie voor het blootstellen van de buikstreek.
- Spray 70% alcohol op de buik in de buurt van hind ledematen.
- Gebruik de ontleden schaar te maken een kleine snede (~ 1 cm) op de huid van de onderbuik.
- Gebruik van de dominante hand te trekken van de staart (en hind ledematen indien nodig) terwijl niet-dominante hand de huid in de tegenovergestelde richting (richting het hoofd trekt) om de buikspier bloot te stellen. Deze methode wordt gebruikt om te minimaliseren van de hoeveelheid haar besmetting van de viscerale organen.
- Snijd de buikspier in een V-vorm aan de voet van de buik, grenzend aan de vagina, de viscerale organen bloot te stellen.
- Darmen en buikvet verplaatsen naar de kant het voortplantingskanaal bloot te stellen.
- Trim uit blaas en andere weefsels boven het vaginale gebied.
- Snijd de symphysis pubica apart toegang te krijgen tot het vaginale weefsel.
- Til het vaginale weefsel bij de vaginale opening, en met behulp van schaar te scheiden van het vaginale kanaal van het rectale weefsel.
- Trim zorgvuldig uit de mesenterische vet aan weerszijden van de baarmoeder met behulp van voorjaar schaar.
Let op: De baarmoeder is erg kwetsbaar met het sperma binnen. Wees voorzichtig niet te doorprikken van de baarmoeder, of anders het sperma zal worden verloren. - Til het lagere voortplantingskanaal en snijd de ovariële vet pad off van beide zijden.
- Breng het geheel voortplantingskanaal in de buis van de voorverwarmde Leibovitz L-15 media + 1% FBS.
5. meting van de sperma vloeibaar (viscositeit) uit uteriene inhoud collectie
- Het verwarmde werkgebied van de stereomicroscoop, overdracht van de weefsels in een 35 mm steriele weefselkweek schotel gevuld met 3,5 mL pre opgewarmd L-15 media + 1% FBS te reinigen van de weefsels van bloed en andere verontreinigingen.
Let op: Tijdens het wassen, grijpen de weefsels door het vet, niet de baarmoeder. Op dit punt het sperma wordt verwacht worden binnen de baarmoeder intact. - DEP de weefsels van overtollige media gebruikend laboratorium afveegt.
- Houd het weefsel vaginale eind terwijl de plaatsing van de ovariële uiteinden in de voorverwarmde microcentrifuge buis. Houd het vaginale einde en snijd de baarmoeder horens aan de voet van de baarmoeder, waardoor de baarmoeder horens te vallen in de buis microcentrifuge.
- Laat de sperma in de buis stromen uit de baarmoeder horens. Gebruik tandeloze pincet te zachtjes knijpen de baarmoeder horens ovariële na daartoe de vaginale uitzetting uit overgebleven sperma.
- Negeren van de weefsels in biohazard zak en verbranden.
- Kort spin down het sperma in een minicentrifuge (~ 1-2 s).
- Leg de buis, parallel aan de verwarmde fase - sperma zal niet morsen uit.
- De timer klaar hebben en ingesteld op 'tellen'.
- Een 25 µL capillair in het sperma monster bij een hoek van 180° (parallel aan de buiswand) invoegen. Dit is om te minimaliseren van de variabiliteit tussen elke onderzoeker uit het bezit van het capillair onder verschillende hoeken.
- Druk op de timer zodra het capillair maakt contact met het sperma.
- Het opnemen van de tijd (s) die nodig is voor het sperma tot de 25 µL-lijn.
- Wanneer de meting is voltooid, onmiddellijk zet de buis met sperma terug in de droge hitte blok voor verdere functionele analyse, zoals video beeldvorming van de beweeglijkheid van de zaadcellen.
- Ontsmetten van het capillair met sperma door de buis in 10% bleekwater oplossing gedurende 20 minuten onder te dompelen en gooi het capillair in de container slijpsel.
6. video beeldvorming van de beweeglijkheid van de zaadcellen
- Zet de Microscoop en video imagingsoftware.
- Pipetteer 20 µL van het resterende sperma op de voorverwarmde glasplaatje, terwijl het glasplaatje in het verwarmde werkgebied is geplaatst.
- Dek af met een dekglaasje glas aan.
- Leg de dia dekglaasje aan kant naar beneden in de Microscoop.
- Gebruik 20 X objectief te vinden interessegebied.
- 100 X objectief voor video imaging omzetten.
- Vastleggen van de video op 12 frames/s (fps) voor 30 s.
- Willekeurig het opnemen van de video's in ten minste 3 verschillende gebieden per dier.
- Uitvoeren van de beeldvorming snel en blootstelling aan licht naar de dia te minimaliseren om de beweeglijkheid van de zaadcellen en levensvatbaarheid te behouden.
Opmerking: Deze beeldvormende procedure moet gebeuren binnen 2-3 min. - Het uitvoeren van de gegevensanalyse met behulp van ImageJ software als eerder beschreven8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sperma werd bijeengezocht uit CTRL en KO vrouwtjes ongeveer 8 h na de paring met vruchtbare CTRL mannetjes. Vloeibaar (of sperma viscositeit) wordt gekwantificeerd door de tijd genomen om de 25 μL capillair vullen met sperma. Sperma van CTRL baarmoeders nam 2.06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) naar de capillaire buis (Figuur 1). Echter het sperma van KO baarmoeders duurde langer dan 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) experimentele tijd. Deze gegevens duiden erop dat het sperma is aanzienlijk meer vloeibaar of minder viskeuze in de CTRL ten opzichte van KO baarmoeders.
Ter illustratie een van de downstream toepassingen van het verzamelen van sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem evalueerden de beweeglijkheid van de zaadcellen met behulp van video imaging. Het sperma van de CTRL baarmoeders bleek vrij zwemmen sperma binnen de microscopische veld, vertegenwoordigd in de momentopname in het figuur 2A. De sperma uit de KO baarmoeders toonde aan dat de meerderheid van de zaadcellen werden geclusterd samen met minimale mobiliteit (figuur 2B). Deze bevindingen wijzen erop dat het sperma van het vrouwelijke voortplantingssysteem 8 h na de paring kan worden gebruikt voor verdere analyse van sperma.
Figuur 1 : Vloeibaar tijd (sperma viscositeit) van het sperma is verkregen van muis baarmoeders. Grafische weergave van de tijd (min) van de vloeibaar maken van sperma bijeengezocht uit CTRL en KO baarmoeders ongeveer 8 h na de paring. Gegevens vertegenwoordigen mean±S.E.M., n = 5 vrouwtjes/genotype. p < 0.001, ongepaarde Student t -test. Aangepast van eerder gepubliceerde resultaten8 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief beelden van zaadcellen in het sperma is verkregen van muis baarmoeders. Representatieve snapshots uit de video beeldvorming genomen bij 1000 X vergroting van zaadcellen in het sperma is verkregen van CTRL (A) en (B) KO baarmoeders. Aangepast van eerder gepubliceerde resultaten8 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voordelen ten opzichte van sperma analyse in vitro kan verzamelen van sperma van muis baarmoeders geven, zoals de voormalige de fysiologische interacties tussen het sperma en de afscheidingen van de vrouwelijke voortplantingssysteem. illustreren kunt De technieken gepresenteerd in deze studie laten onderzoekers om sperma kwaliteit evenals sperma levensvatbaarheid en beweeglijkheid in ideale fysiologische omstandigheden te bepalen. Bovendien zijn er diverse downstream analyses die kunnen worden uitgevoerd met behulp van de sperma uit de baarmoeders, bijvoorbeeld, het sperma kan worden geteld en controleer of het nummer van de werkelijke sperma invoeren van de baarmoeder en het sperma kan ook worden beeld voor de beweeglijkheid testen. De ideale tijd voor het verzamelen van sperma voor de bevruchting vermogen moet worden binnen 1 tot 2 uur na de paring1.
Naast de eerder genoemde downstream toepassingen, onderzoekers ook de effecten van remmers/verbindingen van belang op sperma vervoer kunnen evalueren verwerkt, zoals sperma vloeibaar (of sperma viscositeit), sperma nummer in het darmstelsel, sperma beweeglijkheid, of sperma migratie naar verschillende gebieden van het vrouwelijke voortplantingssysteem. De verbindingen kunnen worden toegepast in de vrouwelijke voortplantingssysteem voorafgaand aan paring8. Vervolgens, de impact van deze remmers/verbindingen kan worden beoordeeld van het sperma monster na paring. Deze methoden kunnen bruikbaar zijn voor het testen van de uitvoerbaarheid van contraceptieve drugs die een remmende werking van sperma vervoer.
Cruciale punten van overweging voor sperma collectie en vloeibaar/viscositeit metingen zijn de gevoeligheid van het sperma en de hoek van het capillair. Sperma zijn gevoelig voor temperatuurveranderingen. Als downstream analyse van sperma functie en motiliteit is essentieel voor de experimentele resultaten, het weefsel en sperma moet worden bewaard bij 37 ° C te allen tijde, met de minimale blootstelling aan licht. Als er verschillende monsters te verzamelen van meerdere vrouwtjes, euthanaseren van de dieren een op een moment om te minimaliseren van wachten. Voor de meting van vloeibaar genereren verschillende kanten van het capillair inconsistenties in vloeibaar tijd. Daarom moeten de onderzoekers houden het capillair parallel aan de buiswand (onder een hoek van 180°) tot een minimum beperken van de variabiliteit gemaakt door elke onderzoeker. Sperma moet niet uiterlijk 09:00 uur worden verzameld, dit is te wijten aan de vloeistof reabsorptie in de baarmoeder. De onderzoeker kunnen niet voldoende vloeistof materiaal voor de meting van vloeibaar.
Vaststaat dat het sperma vloeibaar voornamelijk wordt gemedieerd door de enzymatische activiteit van PSA afgescheiden van de prostaat klier13. Echter, er zijn beperkte studies voor het vaststellen van de rollen van vrouwelijke voortplantingssysteem tijdens in vivo vloeibaar proces8. Collectie van het sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem biedt daarom een cruciaal voordeel om te studeren het vloeibaar verwerkt in vivo, nadat het sperma is blootgesteld aan afscheidingen van de vrouwelijke voortplantingssysteem14. Kortom, kan post ejaculated sperma vloeibaar/viscositeit meting de onderzoekers te ontcijferen van de wisselwerking tussen het sperma en de vrouwelijke voortplantingssysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door College voor diergeneeskunde (WSU) startfonds, gevormd op WW. De auteurs bedanken Sierra Olsen (WSU) voor de kritische lezing van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
