Summary
Liquefazione dello sperma è richiesto per gli spermatozoi di essere liberato dal gel seminale. Questo studio fornisce le procedure per la raccolta dello sperma dal post-coito tratto riproduttivo femminile e misurazione del tempo di liquefazione dello sperma.
Abstract
In topi, sperma eiaculato è depositato nell'utero. Dopo l'eiaculazione, lo sperma cambia consistenza da gel-like a acquoso, un processo chiamato liquefazione. In questo studio, mostriamo come raccogliere il post-eiaculato sperma dal tratto riproduttivo femminile in un modello murino. In primo luogo, adulti topi femminili in fase di estro sono stati alloggiati nella gabbia del maschio durante la notte. La mattina successiva, copulazione è stata confermata dalla presenza di copulatoria spina all'apertura vaginale. I topi femminili con spine copulatore sono stati eutanasizzati e ogni tratto riproduttivo è stato raccolto nel suo complesso (vagina, utero, ovidotti, ovaie), garantendo un sistema chiuso per contenere lo sperma. Il tratto riproduttivo è stato disposto in una microcentrifuga da 1,5 mL, e la vagina è stata tagliata fuori per liberare il suo sperma nel tubo. Per garantire il volume di sperma massimo per l'analisi, senza denti forcipe sono stato utilizzato per spremere i corni uterini da ovarico fine a fine vaginale espellendo lo sperma restante. Il tratto intero riproduttivo è stato poi scartato. Il tubo che contiene lo sperma era filato brevemente verso il basso. Una pipetta capillare 25 μL è stato disposto nel tubo ad un angolo di 180° (parallela alla parete del tubo). La quantità di tempo utilizzato per riempire il tubo capillare alla riga 25 μL è stata registrata. Sperma da un allevatore provato maschio di solito prende circa 60-180 s per riempire un tubo capillare di 25 μL. Questa tecnica di raccolta dello sperma è utilizzabile anche in altre applicazioni a valle quali analisi di imaging e la motilità dello sperma.
Introduction
Il tratto riproduttivo femminile comprende i tratti superiori e inferiori. Il tratto riproduttivo superiore include Tube di Falloppio, l'utero e l'endocervice. Il tratto riproduttivo inferiore comprende l'esocervice e vagina. In esseri umani, lo sperma eiaculato è depositato presso la parete anteriore della vagina, adiacente al ectocervix1. In topi, tuttavia, lo sperma è spazzato in utero pochi minuti dopo l'accoppiamento di2.
Lo sperma contiene gel seminale che si solidifica in pochi secondi di eiaculazione, causando lo sperma per essere intrappolati e immobilizzato3. Liquefazione rilascia lo sperma immobilizzato modificando lo sperma da un simil-gel ad una consistenza acquosa. Questo processo è essenziale per la motilità spermatica e la riproduzione dei mammiferi. Conoscenza della liquefazione dello sperma è principalmente basato su studi in vitro dove lo sperma diventa liquefatto in una piastra di coltura. In esseri umani, l'attività enzimatica di antigene prostatico specifico o PSA (noto anche come callicreina-correlati peptidasi 3 o KLK3) è il maggiore contributo per liquefazione attraverso idrolisi del semenogelins (gelificanti proteine presenti nel liquido seminale)4 ,5,6. Degradazione di semenogelins libera lo sperma dal coagulo seminale, aumento della mobilità degli spermatozoi. Liberate lo sperma nuotare verso le tube di Falloppio per fertilizzare l'uovo. Liquefazione (o viscosità del liquido seminale) test sono uno delle proiezioni standard iniziale per analisi del liquido seminale in cliniche di fertilità per valutare la fertilità maschile7.
Un articolo pubblicato di recente mostra che l'analisi del liquido seminale raccolto da mouse femminile tratto riproduttivo post-corrispondersi può essere utilizzato per illustrare una carenza nella liquefazione che successivamente può causare difetti di fertilità8. Liquefazione difettoso come sperma iperviscosità contribuisce a 11,8-32,3% dei casi infertili in uomini9, suggerendo che normale liquefazione è indispensabile per la riproduzione dei mammiferi. Tuttavia, studi e trattamento dei difetti di liquefazione si sono concentrati esclusivamente sul maschio7. La possibilità che il tratto riproduttivo femminile svolge un ruolo nella liquefazione dello sperma non è stata esplorata. Di conseguenza, i metodi per la raccolta dello sperma e la misurazione del tempo di liquefazione fornire ai ricercatori un nuovo strumento diagnostico per determinare se la liquefazione potrebbe essere una delle cause della sterilità nell'organismo modello di interesse.
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Protocol
Tutti gli animali e le procedure utilizzate in questo studio sono state gestite secondo orientamenti Comitato di uso e cura degli animali di Washington State University (WSU) e in conformità a protocolli animale WSU-approvato 4702 # e #4735.
1. topi
-
Utilizzare standard topi del maschio adulto C57BL/6J o altri ceppi di interesse. Mantenere gli animali in un ambiente di temperatura e umidità controllata, con accesso ad libitum di acqua e cibo.
- Utilizzare riproduttori maschi che vanno da 8 settimane a 10 mesi di età. Utilizzare solo gli allevatori provati negli esperimenti.
-
Utilizzare topi adulti femminili con un'omissione selettiva dei tessuti del tratto riproduttivo dell'estrogeno recettore α (codificata dal gene Esr1 ) in cellule epiteliali10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, chiamato KO o "KO") e controllare littermates (Esr1f/f, chiamato "CTRL") in questo studio.
- Utilizzare 8 settimana-vecchio femmine. Età delle femmine varia a seconda dell'esperimento di interesse.
- Determinare le fasi del ciclo estrale la mattina alle 08:00 h. Usare solo le femmine allo stadio del ciclo di estro. Per metodi dettagliati di sbavature vaginali e analisi citologica, consultare le procedure pubblicate in precedenza11.
2. accoppiamento e valutare copulatore spine
- Al giorno di estro (16:00 h), casa la femmina nella gabbia del maschio.
- La mattina successiva (08:00 h), separare la femmina dal maschio mouse.
- Utilizzare un adattamento di un metodo precedentemente pubblicato12 per accedere la presenza o l'assenza di un plug vaginale o copulatoria come un'indicazione dell'accoppiamento.
- Tenere premuto il mouse femmina dalla base della coda per sollevare brevemente gli arti posteriori.
- Trovare la spina copulatoria dalla presenza di un coagulo seminale biancastro all'apertura vaginale utilizzando uno stuzzicadenti. Se la spina copulatoria è presente, lo stuzzicadenti non sarà in grado di essere inserito nel canale vaginale.
3. preparazione prima dell'accumulazione del tessuto
- Preparare 10 mL di mezzi di L-15 di Leibovitz, completati con 1% di siero fetale bovino (chiamato L15 media + 1% FBS) in una provetta da 15 mL. Incubare i media a 37 ° C per 15 min a bagnomaria.
- Al fine di preservare la vitalità del tessuto e dello sperma per applicazioni a valle, aliquotare 2 mL di pre-riscaldato L15 media + 1% FBS in una microcentrifuga 2 mL tubo per la raccolta del tessuto.
- Scaldare la fase dello stereomicroscopio a 37 ° C. Impostare il calore-blocco a 37 ° C e inserire un tubo del microcentrifuge vuoto 1,5 mL nel blocco.
- Se le applicazioni a valle richiedono imaging di motilità dello sperma, calda il vetrino a 37 ° C.
4. tessuto collezione
- Portare preriscaldata L15 media + 1% aliquota FBS alla zona di raccolta del tessuto.
- La femmina di eutanasia (~ 08: 30h) utilizzando anidride carbonica asfissia seguita da dislocazione cervicale.
Nota: Questo è circa 8 h dopo l'accoppiamento, supponendo che l'accoppiamento avviene a mezzanotte. - Metti l'animale in posizione supina per esporre la zona addominale.
- Spruzzare alcool al 70% sull'addome vicino arti posteriori.
- Utilizzare le forbici per dissezione per fare un piccolo taglio (~ 1 cm) sulla pelle dell'addome più basso.
- Utilizzare la mano dominante per tirare la coda (e arti posteriori se necessario) mentre la mano non dominante tira la pelle in direzione opposta (verso la testa) per esporre il muscolo addominale. Questo metodo viene utilizzato per ridurre al minimo la contaminazione di capelli agli organi viscerali.
- Tagliare il muscolo addominale in una forma di V alla base dell'addome, adiacente alla vagina, per esporre gli organi viscerali.
- Spostare gli intestini e grasso addominale verso il lato per esporre il tratto riproduttivo.
- Tagliare dalla vescica e altri tessuti sopra la zona vaginale.
- Tagliate la sinfisi pubica per ottenere l'accesso al tessuto vaginale.
- Sollevare il tessuto vaginale all'apertura vaginale e utilizzando forbici per separare il canale vaginale dal tessuto rettale.
- Tagliate accuratamente il grasso mesenterico da entrambi i lati dell'utero utilizzando forbici di primavera.
Attenzione: L'utero è molto fragile con lo sperma all'interno. Fare attenzione a non perforare l'utero, altrimenti lo sperma sarà perso. - Sollevare il basso tratto riproduttivo e tagliare il cuscinetto di grasso ovarico fuori entrambi i lati.
- Trasferire il tratto intero riproduttivo nel tubo di pre-riscaldato Leibovitz L-15 media + 1% FBS.
5. misurazione della liquefazione dello sperma (viscosità) dalla raccolta contenuto uterino
- Sul piatto riscaldato dello stereomicroscopio, trasferire i tessuti in un piatto di coltura di tessuto sterile 35 mm riempiti con 3,5 mL pre-riscaldati L-15 media + 1% FBS per pulire i tessuti di sangue e di altri contaminanti.
Attenzione: Durante il lavaggio, afferrare i tessuti per il grasso, non l'utero. A questo punto, lo sperma dovrebbe essere intatto all'interno dell'utero. - Asciugare i tessuti del terreno in eccesso utilizzando salviette di laboratorio.
- Tenere il tessuto all'estremità vaginale mentre inserendo l'estremità ovarica nel tubo del microcentrifuge pre-riscaldata. Tenendo l'estremità vaginale, tagliata i corni uterini alla base dell'utero, permettendo i corni uterini cadere nel tubo del microcentrifuge.
- Lasciate che lo sperma fuoriuscire i corni uterini nella provetta. Utilizzare pinze senza denti per spremere delicatamente i corni uterini dall'estremità ovarica fino alla fine vaginale, espellendo fuori lo sperma rimasto.
- Scartare i tessuti in sacchetto biohazard e incenerire.
- Si sono fermati brevemente lo sperma in un minicentrifuge (~ 1-2 s).
- Disporre il tubo, parallelo al piatto riscaldato - sperma non versare fuori.
- Hanno il timer pronto e impostare a 'contare'.
- Inserire un tubo capillare di 25 µ l del campione di sperma con un angolo di 180° (parallelo alla parete del tubo). Questo è per ridurre al minimo la variabilità tra ciascun investigatore da che tiene il tubo capillare in diverse angolazioni.
- Premere il timer, non appena il tubo capillare fa contatto con lo sperma.
- Registrare il tempo (s) necessario per lo sperma a raggiungere la linea di 25 µ l.
- Quando la misurazione è terminata, immediatamente messo il tubo contenente sperma indietro nel blocco a calore secco per ulteriori analisi funzionale, come l'imaging dei video di motilità dello sperma.
- Disinfettare il tubo capillare contenente sperma immergendo il tubo nella soluzione di candeggina al 10% per 20 min e scartare il tubo capillare nell'apposito contenitore.
6. video Imaging di motilità dello sperma
- Accendere il microscopio e video software di imaging.
- Pipettare 20 µ l di sperma restante nella diapositiva di vetro pre-riscaldato, mentre il vetrino viene collocato sul piatto riscaldato.
- Coprire con un vetrino coprioggetti.
- Posizionare il lato del vetrino coprioggetto diapositiva sul microscopio.
- Utilizzare 20 X Diametro obiettivo per trovare l'area di interesse.
- Cambiare a 100 X Diametro obiettivo per l'imaging dei video.
- Registrare il video a 12 fotogrammi/s (fps) per 30 s.
- Casualmente è possibile registrare i video in almeno 3 diverse aree per animale.
- Eseguire l'imaging rapidamente e minimizzare l'esposizione alla luce alla diapositiva al fine di preservare la motilità e vitalità.
Nota: Questa procedura di imaging deve essere eseguita entro 2-3 min. - Eseguire l'analisi di dati utilizzando software ImageJ come descritto in precedenza8.
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Representative Results
Lo sperma è stato raccolto da CTRL e KO femmine circa 8 h dopo l'accoppiamento con i maschi fertili di CTRL. Liquefazione (o viscosità del liquido seminale) è quantificata mediante il tempo impiegato per riempire il tubo capillare di 25 μL di sperma. Lo sperma raccolto da uteri di CTRL preso 2,06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) per riempire il tubo capillare (Figura 1). Tuttavia, lo sperma raccolto da uteri di KO ha avuto più di 60 min (60,0 ' di ± 0.0, mean±S.E.M, n = 5) di tempo sperimentale. Questi dati suggeriscono che lo sperma è significativamente più liquefatto o meno viscoso in CTRL rispetto agli uteri di KO.
Per illustrare una delle applicazioni a valle della raccolta di sperma dal tratto riproduttivo femminile, motilità dello sperma è stata valutata usando la formazione immagine video. Lo sperma raccolto da uteri del CTRL ha mostrati liberamente-nuoto sperma all'interno del campo microscopico, rappresentato nell'istantanea nella Figura 2A. Lo sperma raccolto da uteri del KO ha mostrato che la maggior parte dello sperma sono stata ragruppata insieme minimo mobilità (Figura 2B). Questi risultati indicano che il suo sperma raccolto dal tratto riproduttivo femminile 8 h dopo l'accoppiamento può essere utilizzato per un'ulteriore analisi dello sperma.
Figura 1 : Tempo di liquefazione (viscosità del liquido seminale) dallo sperma raccolto da uteri di mouse. Rappresentazione grafica del tempo (min) liquefazione dello sperma raccolto da uteri di CTRL e KO circa 8 h dopo l'accoppiamento. I dati rappresentano mean±S.E.M., n = 5 femmine/genotipo. p < 0,001, spaiati Student t -test. Adattato da risultati precedentemente pubblicati8 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Immagini rappresentative di sperma all'interno lo sperma raccolto da uteri di mouse. Rappresentante istantanee dall'imaging dei video presi a 1000 X ingrandimento degli spermatozoi nello sperma raccolto da uteri di KO CTRL (A) e (B) . Adattato da risultati precedentemente pubblicati8 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Raccolta di sperma da uteri del mouse possa fornire vantaggi rispetto sperma analisi in vitro come l'ex può illustrare le interazioni fisiologiche tra lo sperma e le secrezioni dal tratto riproduttivo femminile. Le tecniche presentate in questo studio permettono ai ricercatori di determinare la qualità dello sperma nonché la vitalità degli spermatozoi e la motilità in condizioni fisiologiche ideali. Inoltre, ci sono varie analisi a valle che possono essere eseguite utilizzando lo sperma raccolto dalla uterina, ad esempio, lo sperma può essere contato per determinare il numero effettivo di sperma entrare l'utero e lo sperma può essere ripresa anche per i saggi di motilità. Il punto di tempo ideale per raccogliere lo sperma per la capacità di fertilizzazione dovrebbe essere all'interno di 1 o 2 h dopo l'accoppiamento1.
Oltre alle applicazioni a valle menzionate in precedenza, gli investigatori possono anche valutare gli effetti di inibitori/composti di interesse il trasporto dello sperma processi, ad esempio liquefazione dello sperma (o viscosità del liquido seminale), numero di spermatozoi nel tratto, sperma motilità, o migrazione dello sperma a diverse aree del tratto riproduttivo femminile. I composti possono essere applicati nel tratto riproduttivo della femmina prima dell'accoppiamento8. Quindi, può essere valutato l'impatto di tali inibitori/composti dal campione di sperma post-accoppiamento. Questi metodi possono essere utili per testare la praticità del contraccettivi farmaci che inibiscono il trasporto dello sperma.
Punti cruciali di considerazione per le misure di collezione e liquefazione/viscosità dello sperma sono la sensibilità dello sperma e l'angolo del tubo capillare. Gli spermatozoi sono sensibili alle variazioni di temperatura. Se analisi a valle delle funzionalità degli spermatozoi e la motilità sono essenziale per i risultati sperimentali, il tessuto e lo sperma devono essere tenuti a 37 ° C in ogni momento, con la minima esposizione alla luce. Se ci sono diversi esempi di raccogliere da più femmine, eutanasia gli animali uno alla volta per minimizzare l'attesa. Per la misura di liquefazione, diverse angolazioni del tubo capillare generano incoerenze in tempo di liquefazione. Di conseguenza, gli investigatori hanno tenere il tubo capillare parallelo alla parete del tubo (ad un angolo di 180°) per ridurre al minimo la variabilità creata da ogni investigatore. Campione di seme non deve essere raccolti entro le 09:00 h, questo è dovuto il riassorbimento fluido nell'utero. Il ricercatore non può ottenere sufficiente materiale fluido per la misurazione di liquefazione.
È stabilito che la liquefazione dello sperma è mediata principalmente dall'attività enzimatica dello PSA secernuta dalla ghiandola di prostata13. Tuttavia, ci sono studi limitati per determinare i ruoli del tratto riproduttivo femminile durante in vivo processo di liquefazione,8. Di conseguenza, la raccolta dello sperma dal tratto riproduttivo femminile fornisce un vantaggio cruciale per studiare la liquefazione elabora in vivo, dopo che lo sperma è stato esposto alle secrezioni del tratto riproduttivo femminile14. In conclusione, post-eiaculato sperma liquefazione/viscosità misura permette ai ricercatori di decifrare l'interazione tra lo sperma e il tratto riproduttivo femminile.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto dal fondo di Start-up di College di medicina veterinaria (WSU) a WW. Gli autori ringraziano Sierra Olsen (WSU) per la lettura critica di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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