Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

Summary

Liquefação do sêmen é necessária para que o esperma ser libertado do gel seminal. Este estudo fornece os procedimentos para a recolha de sémen de coito de pós o trato reprodutivo feminino e medir o tempo de liquefação do sêmen.

Abstract

Em camundongos, ejaculou esperma é depositada no útero. Após a ejaculação, o sémen altera a consistência de gel-like para aguado, um processo chamado de liquefação. Neste estudo, mostramos como coletar o sêmen pós-ejaculou do tracto reprodutivo feminino em um modelo do rato. Primeiros, adultos ratos fêmeas na fase de estro foram alojados em jaula de um macho durante a noite. Na manhã seguinte, cópula foi confirmada pela presença de imperatividade plug na abertura vaginal. Camundongos fêmeas com plugues copulativo foram sacrificados, e cada trato reprodutivo foi coletado como um todo (vagina, útero, ovidutos, ovários), assegurando um sistema fechado para conter o sêmen. O trato reprodutivo foi colocado em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, e a vagina foi cortada para liberar o sêmen para dentro do tubo. Para garantir o volume de sêmen máxima para análise, pinças desdentadas foram usadas para espremer os cornos uterinos de extremidade ovariana vaginal fim expelir sémen restante. Tracto reprodutivo então foi Descartado. O tubo contendo sêmen brevemente foi girado para baixo. Uma pipeta capilar 25 μL foi colocada dentro do tubo em um ângulo de 180° (paralela à parede do tubo). A quantidade de tempo usado para encher o tubo capilar à linha 25 μL foi gravada. Sêmen de um reprodutor masculino comprovado normalmente leva cerca de 60-180 s para encher um tubo capilar de 25 μL. Esta técnica de coleta de sêmen também pode ser usada em outras aplicações a jusante, tais como análise de imagens e motilidade do esperma.

Introduction

Aparelho reprodutor feminino é composto pelo trato superior e inferior. O trato reprodutivo superior inclui trompas de Falópio, o útero e o endocérvice. O trato reprodutivo inferior inclui o ectocérvice e a vagina. Em humanos, ejaculou sêmen é depositado na parede anterior da vagina, adjacente à ectocérvice¹. Em camundongos, entretanto, o sémen é arrastado para o útero dentro de minutos após o acasalamento de².

Sêmen contém gel seminal que é solidificado em segundos da ejaculação, fazendo com que o esperma a ser aprisionado e imobilizada³. Liquefação libera o esperma imobilizado, alterando o sêmen de um gel-like para uma consistência aquosa. Este processo é essencial para a mobilidade do esperma e a reprodução dos mamíferos. Conhecimento de liquefação do sêmen baseia-se principalmente em vitro estudos onde o sêmen torna-se liquefeito em um prato de cultura. Em humanos, a atividade enzimática de antígeno prostático específico ou PSA (também conhecido como calicreína-relacionados peptidase 3 ou KLK3) é o principal contribuinte para liquefação por hidrólise de semenogelins (formação de gel de proteínas presentes no sêmen)^{4 ,5,6}. Degradação de semenogelins libera o esperma da hemostase seminal, aumentando a mobilidade do esperma. Libertou o esperma nadar em direção de Falópio para fecundar o óvulo. Liquefação (ou viscosidade do sêmen) testes são uma das sessões iniciais padrão para análise de sêmen em clínicas de fertilidade para avaliar a fertilidade masculina⁷.

Um artigo recentemente publicado mostra que a análise do fluido seminal coletado do rato fêmea trato reprodutivo pós acasalamento pode ser usada para ilustrar uma deficiência na liquefação que posteriormente pode causar defeitos de fertilidade⁸. Liquefação defeituosa como sémen hiperviscosidade contribui para 11,8-32,3% dos casos inférteis em homens⁹, sugerindo que a liquefação normal é indispensável para a reprodução dos mamíferos. No entanto, estudos e tratamento de defeitos de liquefação têm-se centrado exclusivamente no masculino⁷. Não tem sido explorada a possibilidade de que o trato reprodutivo feminino desempenha um papel na liquefação do sêmen. Portanto, os métodos de colheita de sémen e medir o tempo de liquefação fornecerá pesquisadores uma nova ferramenta de diagnóstica para determinar se a liquefação pode ser uma das causas de infertilidade no organismo modelo de interesse.

Protocol

Todos os animais e os procedimentos utilizados neste estudo foram tratados de acordo com orientações do Comité de uso e cuidado do Animal de Washington State University (WSU) de acordo com protocolos animais aprovados WSU 4702 # e #4735.

1. ratos

1. Use padrão C57BL/6J ratos machos adultos ou outras cepas de interesse. Manter os animais sob um ambiente de temperatura e umidade controlada, com acesso ad libitum de água e comida.
   1. Use reprodutores machos variando de 8 semanas de idade de 10 meses de idade. Use apenas os criadores comprovados nos experimentos.
2. Usar ratos fêmeas adultos com uma exclusão seletiva de tecido do trato reprodutivo estrogênio receptor α (codificada pelo gene Esr1 ) no¹⁰ células epiteliais (Wnt7a^{Cre / +}; Esr1^f/f, chamado nocaute ou "KO") e controlar littermates (Esr1^f/f, chamado "CTRL") neste estudo.
   1. Use 8 semanas de fêmeas. As idades das fêmeas variaram dependendo do experimento de interesse.
3. Determine as fases do ciclo estral às 08:00 h da manhã. Use somente as fêmeas na fase de estro do ciclo. Para métodos detalhados de mancha vaginal e análise citológica, consulte os procedimentos publicados anteriormente¹¹.

2. acasalamento e avaliar copuladores plugues

1. O dia do estro (16:00 h), na casa a fêmea na gaiola de um macho.
2. Na manhã seguinte (08:00 h), separe a fêmea do rato masculino.
3. Use uma adaptação de um método previamente publicado¹² para acessar a presença ou ausência de um plug vaginal ou imperatividade como uma indicação de acasalamento.
4. Segure o mouse feminino da base da cauda para brevemente levantar as patas.
5. Encontre a ficha copulador pela presença de um coágulo seminal off-White na abertura vaginal usando um palito de dente. Se o plugue imperatividade está presente, o palito não será capaz de ser inserido no canal vaginal.

3. preparação antes da coleta de tecido

1. Prepare-se 10 mL de mídia de L-15 do Leibovitz, suplementada com 1% de soro fetal bovino (chamado L15 media + 1% FBS) em um tubo de 15 mL. Incube a mídia a 37 ° C por 15 min em banho-maria.
2. A fim de preservar a viabilidade do tecido e esperma para aplicações a jusante, alíquota 2 mL de pré-aquecido L15 media + 1% FBS numa microcentrifuga 2 mL tubo para coleta de tecido.
3. Aquecer a fase do microscópio estereoscópico para 37 ° C. Definir o calor-bloco 37 ° c e colocar um tubo de microcentrifugadora de vazio 1,5 mL no bloco.
4. Se as aplicações a jusante requerem imagiologia da motilidade espermática, aquecer a lâmina de vidro para 37 ° C.

4. tecido coleção

1. Trazer pré-aquecido L15 mídia + alíquota de 1% FBS para a área de coleção de tecidos.
2. Abater a fêmea (~ 08: 30h) usar o dióxido de carbono asfixia seguido por deslocamento cervical.
   Nota: Este é aproximadamente 8 h após o acasalamento, supondo que o acasalamento ocorre à meia-noite.
3. Coloque o animal em posição supina para expor a área abdominal.
4. Borrife o álcool a 70% no abdômen perto membros posteriores.
5. Use a tesoura de dissecação para fazer um pequeno corte (~ 1 cm) na pele do abdômen inferior.
6. Use a mão dominante para puxar o rabo (e membros posteriores se necessário) enquanto a mão não dominante puxa a pele na direção oposta (em direção a cabeça) para expor os músculos abdominais. Este método é usado para minimizar a quantidade de contaminação de cabelo para os órgãos viscerais.
7. Corte o músculo abdominal em uma forma de V na base do abdômen, adjacente à vagina, para expor os órgãos viscerais.
8. Mova os intestinos e gordura abdominal para o lado para expor o trato reprodutivo.
9. Retire a bexiga e outros tecidos acima a área vaginal.
10. Cortadas sínfise púbica para obter acesso ao tecido vaginal.
11. Levante o tecido vaginal na abertura vaginal e usando tesouras para separar o canal vaginal do tecido retal.
12. Cuidadosamente retire a gordura mesentérica de ambos os lados do útero usando uma tesoura de mola.
    Atenção: O útero é muito frágil com o sêmen para dentro. Tenha cuidado para não perfurar o útero, ou então o sêmen será perdido.
13. Levante o trato reprodutivo mais baixo e cortar do tecido ovariano fora de ambos os lados.
14. Tracto reprodutivo de transferência para o tubo do Leibovitz previamente aquecido media L-15 + 1% FBS.

5. medição de liquefação do sêmen (viscosidade) de coleção de conteúdo uterina

1. Na fase aquecida do microscópio estereoscópico, os tecidos em um prato de cultura de tecido estéril de 35mm preenchidos com 3,5 mL de transferência pré aquecido L-15 media + 1% FBS para limpar tecidos do sangue e outros contaminantes.
   Atenção: Durante a lavagem, pegue os tecidos pela gordura, não o útero. Neste ponto, o sémen é esperado estar intacto dentro do útero.
2. Borre os tecidos do excesso mídia usando toalhetes de laboratório.
3. Mantenha o tecido na extremidade vaginal enquanto colocando as extremidades dos ovários no tubo microcentrifuga pré-aquecido. Mantendo o fim vaginal, corte os cornos uterinos na base do útero, permitindo que os cornos uterinos a cair dentro do tubo de microcentrifugadora.
4. Deixe o sémen fluxo fora os cornos uterinos no tubo. Use fórceps desdentado para apertar suavemente os cornos uterinos da extremidade ovariana à extremidade vaginal, expulsar o sêmen de sobra.
5. Descarte os tecidos em saco de risco biológico e incinerar.
6. Brevemente spin para baixo o sêmen em uma minicentrifuge (~ 1-2 s).
7. Colocar o tubo, paralelo à fase aquecida - sémen não vai derramar para fora.
8. Tem o temporizador pronto e definido para 'contar'.
9. Inserir um tubo capilar de 25 µ l da amostra de sêmen em um ângulo de 180° (paralela à parede do tubo). Isto é para minimizar a variabilidade entre cada investigador de segurando o tubo capilar em ângulos diferentes.
10. Pressione o cronômetro assim que o tubo capilar faz contato com o sêmen.
11. Registro do (s) de tempo que leva para o sémen alcançar a linha de 25 µ l.
12. Quando a medição estiver concluída, coloque imediatamente o tubo contendo o sêmen volta no bloco de calor seco para posterior análise funcional, tais como a imagem latente de motilidade espermática.
13. Desinfectar o tubo capilar contendo sêmen imergindo o tubo em solução 10% por 20 min e descartar o tubo capilar no recipiente de objectos cortantes.

6. a imagem da motilidade espermática

1. Liga o microscópio e o software de imagem de vídeo.
2. Pipete 20 µ l de sêmen restante a lâmina de vidro previamente aquecido, enquanto a lâmina de vidro é colocada no palco aquecido.
3. Cobrir com uma lamela de vidro.
4. Coloque o lado de lamela de slide para baixo no microscópio.
5. Use 20 X objectiva para encontrar a área de interesse.
6. Alterar para 100 lente objetiva de X para a imagem latente.
7. Gravar o vídeo em 12 quadros/s (fps) para 30 s.
8. Aleatoriamente, grave os vídeos em pelo menos 3 diferentes áreas por animal.
9. Executar a imagem rapidamente e minimizar a exposição à luz para o slide a fim de preservar a viabilidade e motilidade espermática.
   Nota: Este procedimento de imagens deve ser feito dentro de 2-3 min.
10. Realizar a análise de dados utilizando o software ImageJ como descrito anteriormente⁸.

Representative Results

Sêmen foi colhido em CTRL e KO fêmeas aproximadamente 8 h após o acasalamento com machos férteis do CTRL. Liquefação (ou viscosidade do sêmen) é quantificada pelo tempo necessário para encher o tubo capilar de 25 μL com sêmen. Sêmen coletado do útero CTRL levou 2,06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) para encher o tubo capilar (Figura 1). No entanto, o sêmen coletado do útero KO demorou mais de 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) do tempo experimental. Estes dados sugerem que o sêmen é significativamente mais gás liquefeito ou menos viscoso no CTRL em comparação com KO do útero.

Para ilustrar uma das aplicações a jusante de coleta de sêmen do tracto reprodutivo feminino, a motilidade espermática foi avaliada utilizando imagens de vídeo. O sêmen coletado o útero CTRL mostrou esperma nadar livremente dentro do campo microscópico, representado no instantâneo na Figura 2A. O sêmen coletado o útero KO mostrou que a maioria dos espermatozoides foram agrupada juntamente com mobilidade mínima (Figura 2B). Estes resultados indicam que o sêmen coletado do tracto reprodutivo feminino 8 h após acasalamento pode ser usado para uma análise mais aprofundada esperma.

Figura 1 : Tempo de liquefação (viscosidade do sêmen) do sêmen coletado do útero rato. Representação gráfica do tempo liquefação (min) do sêmen coletados de úteros CTRL e KO aproximadamente 8 h após o acasalamento. Dados representam mean±S.E.M., n = 5 fêmeas/genótipo. p < 0,001, pareado, teste t -Student. Adaptado de resultados publicados anteriormente⁸ com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Imagens representativas de esperma dentro do sêmen coletado do útero rato. Instantâneos representativos do vídeo imagem tirada em 1000 X ampliação de espermatozoides no sêmen coletado CTRL (A) e (B) KO do útero. Adaptado de resultados publicados anteriormente⁸ com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Coleta de sêmen de úteros de rato pode fornecer vantagens sobre sêmen análise em vitro , como o antigo pode ilustrar as interações fisiológicas entre o esperma e as secreções do tracto reprodutivo feminino. As técnicas apresentadas neste estudo permitem aos investigadores determinar a qualidade do sêmen, bem como a viabilidade do esperma e a mobilidade em condições fisiológicas ideais. Além disso, existem várias análises a jusante que podem ser executadas usando o sêmen coletado o útero, por exemplo, o esperma pode ser contado determinar o número real de esperma entrando o útero e os espermatozoides também pode ser fotografado para os ensaios de motilidade. O ponto de tempo ideal para coletar o sêmen para a capacidade de fertilização deve ser dentro de 1 a 2 h após o acasalamento¹.

Além da mencionado anteriormente aplicações a jusante, os investigadores também podem avaliar os efeitos dos inibidores/compostos de interesse no transporte de esperma processos, tais como a liquefação do sêmen (ou viscosidade do sêmen), número de espermatozoides no trato, esperma motilidade, ou migração de esperma para diferentes áreas do trato reprodutivo feminino. Os compostos podem ser aplicados no trato reprodutivo feminino antes da⁸de acasalamento. Então, o impacto desses inibidores/compostos pode ser avaliado a amostra de sêmen pós-acasalamento. Estes métodos podem ser úteis para testar a praticidade do contraceptivas drogas que inibem o transporte de espermatozoides.

Pontos cruciais da consideração para medições de coleção e liquefação/viscosidade do sêmen são a sensibilidade do esperma e o ângulo do tubo capilar. Espermatozoides são sensíveis às mudanças de temperatura. Se a jusante análise da função do esperma e a mobilidade é essencial para os resultados experimentais, o tecido e sêmen precisam ser mantidas a 37 ° C em todos os vezes, com a mínima exposição à luz. Se existirem várias amostras para coletar várias fêmeas, a eutanásia dos animais um de cada vez para minimizar a espera. Para a medição de liquefação, diferentes ângulos do tubo capilar geram inconsistências no tempo de liquefação. Portanto, os investigadores tem que segurar o tubo capilar paralela à parede do tubo (em um ângulo de 180°) para minimizar a variabilidade criada por cada investigador. Amostra de sêmen não deve ser cobrada de 09:00 h, o mais tardar, isto é devido a reabsorção de fluido no útero. O investigador não pode obter suficiente material fluido para a medição de liquefação.

Ficou estabelecido que a liquefação do sêmen é principalmente mediada pela atividade enzimática da PSA secretada do próstata¹³. No entanto, existem estudos limitados para determinar as funções do aparelho reprodutor feminino durante na vivo liquefação processo⁸. Portanto, a coleta do sêmen do tracto reprodutivo feminino fornece uma vantagem crucial para estudar a liquefação processa na vivo, depois o sêmen foi exposto a secreções do trato reprodutivo feminino¹⁴. Em conclusão, pós ejaculou esperma liquefação/viscosidade medida permite que os pesquisadores a decifrar a interação entre o sémen e o trato reprodutivo feminino.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Toothpick	Diamond	750-Flat	Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Spring scissors	Roboz	RS-5600
Fine forceps	Roboz	RS-5045
25-μL glass capillary tube	VWR	53432-761
Leibovitz’s L-15 media	Life Technologies	11415064	Supplement with 1% FBS
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
1.5-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
2-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-A
Digital dry block heater	VWR	13259-052	For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection
Minicentrifuge	Corning	LSE 6765
35-mm culture dish	VWR	10861-656
15-mL polypropylene centrifuge tube	VWR	10025-686
Waterbath	Precision	TSGP05
Heated stage stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ10F	To keep the tissue warm prior to semen collection
Brightfield microscope	Leica Microsystems	DMi8	Optional. For video imaging of the sperm motility
Camera	Leica Microsystems	DMC2900	Optional. For video imaging of the sperm motility
Glass slides	Fisher	12-552-3	Optional. For video imaging of the sperm motility
Coverslip	VWR	48393-059	Optional. For video imaging of the sperm motility
Bleach			Dilute in dH2O to 10% concentration