Summary
El actual artículo describe la generación y caracterización metabólica de ratones alimentados con dieta alta en grasas como un modelo de resistencia a la insulina inducida por la dieta y la obesidad. Además cuenta con protocolos detallados para realizar la prueba de tolerancia oral a la glucosa y la prueba de tolerancia a insulina, monitoreo de todo el cuerpo alteraciones del metabolismo de la glucosa en vivo.
Abstract
La obesidad representa el más importante factor de riesgo en la patogenia de la diabetes tipo 2, una enfermedad que se caracteriza por una resistencia a la captación de glucosa estimulada por insulina y una descompensación grave del metabolismo de la glucosa sistémica. A pesar de progresos considerables en la comprensión del metabolismo de la glucosa, los mecanismos moleculares de la regulación en salud y la enfermedad siguen bajo investigación, mientras que se necesitan urgentemente nuevos enfoques para prevenir y tratar la diabetes. Dieta derivada de la glucosa estimula la secreción pancreática de insulina, que sirve como el principal regulador de los procesos anabólicos celulares durante el estado de alimentación y así equilibra la glucosa en la sangre los niveles para mantener la condición de energía sistémica. Sobrealimentación disparadores meta-inflamación crónica, que conduce a alteraciones en la insulina periférica asociado a receptor de señalización y por lo tanto reduce la sensibilidad a la disposición de glucosa mediada por insulina. Estos eventos resultan en elevados de glucosa en ayunas y los niveles de insulina así como una reducción en la tolerancia a la glucosa, que a su vez sirven como indicadores importantes de resistencia a la insulina. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y caracterización metabólica de la dieta alta en grasas (HFD)-alimentó ratones como modelo frecuente de resistencia a la insulina inducida por la dieta. Ilustramos detalladamente la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT), que supervisa la disposición periférica de una secreción de insulina y carga de glucosa por vía oral con el tiempo. Además, presentamos un protocolo para la prueba de tolerancia a insulina (ITT) supervisar la acción de la insulina de todo el cuerpo. Estos métodos y sus aplicaciones posteriores constituyen herramientas poderosas para caracterizar el fenotipo metabólico general de ratones, así como para evaluar específicamente alteraciones en el metabolismo de la glucosa. Pueden ser especialmente útiles en el campo de investigación amplio de resistencia a la insulina, diabetes y obesidad para proporcionar una mejor comprensión de la patogenia, así como para probar los efectos de las intervenciones terapéuticas.
Introduction
En los países desarrollados, la obesidad y la diabetes alcanzaron dimensiones epidémicas debido a la inactividad física y el consumo excesivo de alimentos procesados, efectos que son conducidos por la rápida urbanización, industrialización y globalización. Aunque investigación en resistencia a la insulina y sus comorbilidades, tales como hiperlipidemia y aterosclerosis, ha ganado importancia en las últimas décadas, los complejos mecanismos biológicos que regulan el metabolismo en la salud y la enfermedad siguen siendo incompleto entendido y todavía hay una necesidad urgente de nuevas modalidades de tratamiento prevenir y tratar estas enfermedades1.
Insulina y sus hormonas contador-reguladoras glucagón sirven como los principales reguladores del equilibrio oferta y macronutrientes energía celular, manteniendo así también sangre sistémica adecuada glucosa concentraciones2. Glucosa sí mismo actúa como uno de los principales estimuladores de la secreción de insulina por células β pancreáticas, mientras que otros macronutrientes, factores humorales como entrada neural más modificar esta respuesta. Insulina, en consecuencia, desencadena los procesos anabólicos del estado fed facilitando la difusión de glucosa en la sangre de exceso en la músculo y células gordas y además activando la glucólisis así como proteínas o síntesis de ácidos grasos, respectivamente. Además, insulina suprime la salida de glucosa hepática inhibiendo la gluconeogénesis. Consumo de energía de exceso crónico y meta-inflamación conducen a hiperinsulinemia y resistencia a la insulina periférica debido a la abajo-regulación de la expresión del receptor de insulina, así como alteraciones en las vías de señalización aguas abajo, lo que resulta en deterioro sensibilidad a la disposición de glucosa mediada por insulina, así como inhibición insuficiente de la glucosa hepática producción3,4,5,6.
Una amplia gama de modelos animales con inducción genética, nutricional o experimental de la enfermedad han demostrado para ser excelentes herramientas para el estudio de los mecanismos moleculares de resistencia a la insulina y varias formas de diabetes, así como sus enfermedades acompañantes7 . Un ejemplo es el modelo de ratón inducido por HFD ampliamente utilizado y bien establecida, que se caracteriza por el rápido aumento de peso debido al aumento de la ingesta dietético en combinación con la menor eficiencia metabólica, resultando en resistencia de insulina8, 9. tanto en modelos animales y humanos, una elevación en sangre glucosa y la insulina niveles en ayunas, así como una tolerancia deteriorada a la administración de glucosa son utilizados indicadores de resistencia a la insulina y otras alteraciones sistémicas de la glucosa metabolismo. Monitoreo glucosa e insulina niveles de sangre en el estado basal o tras estímulo son lecturas de fácil acceso.
El presente Protocolo describe la generación de ratones alimentados con HFD como dos métodos utilizados, la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) y la prueba de resistencia de insulina (ITT), que son útiles para caracterizar el fenotipo metabólico e investigar alteraciones en el metabolismo de la glucosa. Describimos la OGTT detalladamente, que evalúa la eliminación de una secreción de insulina y carga de glucosa por vía oral con el tiempo. Además, ofrecemos instrucciones sobre cómo llevar a cabo la ITT para investigar la acción de la insulina corporal total mediante el control de la concentración de la glucosa de la sangre en respuesta a un bolo de insulina. Los protocolos descritos en este artículo están bien establecidos y se han utilizado en múltiples estudios10,11,12. Además de ligeras modificaciones que pueden ayudar a incrementar el éxito, les da las pautas para el diseño experimental y análisis de datos, así como consejos útiles evitar peligros potenciales. Los protocolos descritos pueden ser herramientas muy poderosas para investigar la influencia de la genéticas, farmacológicos, dieta y otros factores ambientales sobre el metabolismo de la glucosa de todo el cuerpo y sus enfermedades asociadas como resistencia a la insulina. Además de la estimulación con glucosa o insulina, puede utilizarse una variedad de otros compuestos para la estimulación según el propósito de la investigación individual. Aunque fuera del alcance de este manuscrito, muchas otras aplicaciones posteriores pueden realizarse en las muestras de sangre dibujada, como el análisis de sangre valores distintos de la glucosa y la insulina (p. ej., lípidos y lipoproteínas perfiles) así como toda Análisis de marcadores metabólicos (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real, análisis de Western blot y análisis genitals del Immunosorbent (ELISA)). Citometría de flujo más y fluorescencia activada célula clasificación (FACS) puede aplicarse para investigar los efectos en las poblaciones de la célula distinta, mientras que transcriptómicos, proteómicos y metabolómicos enfoques también pueden ser utilizados para el análisis no focalizados.
En general, proporcionamos un protocolo simple para generar un modelo de ratón inducido por HFD, mientras más describir dos enfoques de gran alcance para estudiar alteraciones metabólicas de todo el cuerpo, la usa y la ITT, que puede ser herramientas útiles para el estudio de la patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias, especialmente en el campo de enfermedades asociadas por el metabolismo como la resistencia a la insulina y diabetes.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso de la Universidad médica de Viena y llevó a cabo según la Federación de europeo laboratorio animales ciencia asociaciones (personal). Tenga en cuenta que todos los procedimientos descritos en este protocolo sólo deben realizarse después de la aprobación institucional y gubernamental, así como por el personal que es técnicamente competente.
1. HFD-alimentó ratones
Nota: Mantenga todos los ratones C57BL/6J en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con libre acceso a alimentos y agua.
- En 6 semanas de edad, lugar de ratones para 8-12 semanas en un HFD (40-60% calorías de grasa) para inducir a la obesidad, mientras se alimenta el magro grupo de control una dieta baja en grasa (LFD) (10% calorías de grasa).
- Determinar el peso corporal de los ratones sobre una base semanal. Las curvas de peso deben muestran patrones similares en ambos grupos, con una pendiente mayor en el grupo HFD-alimentó.
2. USA
Nota: Si los puntos de tiempo de muestreo de sangre son elegidos durante OGTT cada 15 min, el experimento debe realizarse con un máximo de 15 ratones en paralelo, para tener al menos 1 minuto de tiempo de manipulación por ratón.
- Preparativos en la víspera OGTT
- Transferir a los ratones en una jaula con ropa de cama fresca y rápida que durante la noche antes de la prueba (14 h), asegurando que los ratones tengan acceso a agua potable (por ejemplo, retirar los alimentos en 18:00 para un tiempo de inicio en la mañana siguiente a las 8:00).
Nota: Ratones de ayuno durante la noche es el acercamiento estándar, sin embargo un ayuno corto (5-6 h) es más fisiológico para los ratones (véase la discusión para más detalles).
- Transferir a los ratones en una jaula con ropa de cama fresca y rápida que durante la noche antes de la prueba (14 h), asegurando que los ratones tengan acceso a agua potable (por ejemplo, retirar los alimentos en 18:00 para un tiempo de inicio en la mañana siguiente a las 8:00).
- Preparaciones en el día del experimento (pero antes del experimento)
- Preparar 10 mL de solución glucosa al 20% (disolver D-(+)-glucosa en agua destilada).
Nota: Todos los reactivos que se administran a los animales deben ser grado farmacológico y estéril. - Preparar una placa de 96 pocillos para colección de plasma, llenando un pozo para cada punto del tiempo de muestreo y cada ratón con 5 μl NaEDTA (0,5 M de EDTA, pH 8.0 en 0.9% NaCl, almacenamiento a temperatura ambiente). Durante el experimento, guarde esta placa de hielo.
Nota: Ver complementarios figura 1 para una lista detallada.
- Preparar 10 mL de solución glucosa al 20% (disolver D-(+)-glucosa en agua destilada).
- Medir el peso corporal de todos los ratones y su cola la marca con un rotulador permanente para hacer los ratones fácilmente reconocibles (por ejemplo, dash de ratón 1 = 1, guiones de ratón 2 = 2, etc.).
- Medición de glucosa y tomar muestras de sangre (figura 2)
- Cuidadosamente corte 1-2 mm de la punta de la cola con unas tijeras afiladas ("variante A" en la figura 2). Siempre limpie la primera gota de sangre para evitar la hemólisis o contaminación con fluido de tejido antes de tomar muestras de sangre para determinación de glucosa de la sangre. Extraer una pequeña muestra de sangre (aproximadamente 3 μL) para medir el nivel de glucosa en sangre basal (= momento 0) con el glucómetro.
PRECAUCIÓN: Compruebe y ajuste la cantidad de carga de las tiras reactivas en un glucómetro.
Nota: Como un método de muestreo alternativo sangre, nick la vena lateral de la cola de un ratón con una hoja de bisturí afilado ("variante B" en la figura 2). La vena lateral de la cola se accede generalmente a aproximadamente un tercio a lo largo de la longitud de la cola de la punta de la cola, moviéndose hacia la base de la cola para muestras múltiples. Se recomienda el uso de una crema de anestesia local. Detener el flujo de sangre aplicando presión con el dedo sobre el tejido blando de al menos 30 s antes de regresa el animal a su jaula. - Recoger una muestra de sangre (alrededor de 30 μL) mediante un tubo capilar fresco (mantener la horizontal del tubo capilar). Vacíe el tubo capilar mediante una pipeta poniendo la punta de la pipeta en la parte superior del extremo del tubo capilar y con cuidado empujar la sangre recogida en un pocillo de la placa de 96 pocillos, evitando burbujas de aire. Repita este procedimiento para todos los ratones - uno a la vez.
Nota: Como alternativa para recolección de sangre a través de un tubo capilar, utilice una pipeta ajustada al volumen correcto (por ejemplo, 30 μL) para recoger la sangre, o recoger una gota de sangre de la cola en la película de parafina y pipeta lo en la solución de EDTA. Estrictamente evitar el contacto de la jalea de petróleo con sangre o glucómetro Optium, como pueden influir en las mediciones sucesivas de glucosa e insulina.
PRECAUCIÓN: La OGTT es muy estresante para los ratones: ratones magras pueden perder alrededor de 15% de su peso corporal durante un ayuno nocturno. Además, la muestra de sangre en diferentes puntos temporales conduce a una pérdida considerable de sangre. Para el muestreo de sangre más fácil, es posible Masajear cuidadosamente la mouse-tail con vaselina.
Nota: Las directrices pueden limitar la cantidad permisible de sangre recogido dentro de un período determinado. Los volúmenes de muestreo y puntos de tiempo deben ajustarse para no exceder los máximos permitidos. El peso corporal de los ratones pueden usarse para calcular el total retiro permitido de la sangre.
- Cuidadosamente corte 1-2 mm de la punta de la cola con unas tijeras afiladas ("variante A" en la figura 2). Siempre limpie la primera gota de sangre para evitar la hemólisis o contaminación con fluido de tejido antes de tomar muestras de sangre para determinación de glucosa de la sangre. Extraer una pequeña muestra de sangre (aproximadamente 3 μL) para medir el nivel de glucosa en sangre basal (= momento 0) con el glucómetro.
- Calcular el volumen requerido de solución de glucosa basada en peso corporal (1 g glucosa/kg de peso corporal, esta puede incrementarse hasta 3 g/kg) al ser administrado por sonda oral para cada ratón. Por ejemplo, un ratón con un peso de 30 g tendría 150 μL de una solución de glucosa 20% administrar 30 mg de glucosa.
Nota: A la base de la dosis de glucosa en el peso del ratón es el procedimiento estándar. Si se dispone de datos de la composición corporal, la dosis de glucosa OGTT debe ser calculado basado en la magra masa corporal (ver la discusión para más detalles). - Administración de glucosa
- Preparación de everythingthat es necesario durante el experimento entero por adelantado (temporizador, hoja de registro del experimento, glucosa monitor y tiras, tubos capilares, jeringas, solución de glucosa, placa de 96 pocillos, bisturí, calculadora, balanza, marcador permanente, papeles de banco, una pipeta con una punta y guantes).
- Para el uso de glucosa, refrena el ratón agarrando firmemente por el pescuezo. Aplique suficiente firmeza a la piel alrededor del cuello para evitar que el ratón de una torsión de la refrena y correctamente incline su cabeza hacia atrás. También asegúrese de que el ratón pueda respirar correctamente.
Nota: Una vez iniciada la administración de glucosa, administración del tiempo es muy importante. - Administrar con cuidado la solución de glucosa (basada en paso 2.5) directamente en el estómago con una aguja de alimentación. Directo con cuidado la aguja de alimentación a través de la boca hacia el esófago. Permitir que el ratón para tragar la aguja: la aguja se hunde totalmente en la parte inferior del esófago/estómago del ratón. Luego inyectar la solución de glucosa (figura 3a).
- Si encuentra alguna resistencia, o si el animal lucha inmediatamente, retire la aguja y vuelva a colocarlo. Iniciar el temporizador inmediatamente después de la primera sonda nasogástrica y administrar glucosa a otros ratones en intervalos de 1 minuto.
Nota: Puede ser útil aplicar una gota de solución de glucosa directamente de la alimentación de la aguja a la boca del ratón, que estimulará la lamer y tragar, facilitando así el facilitar la inserción de la aguja de alimentación. No aplique presión al insertar la aguja de alimentación como esto puede dañar seriamente el animal.
- Si encuentra alguna resistencia, o si el animal lucha inmediatamente, retire la aguja y vuelva a colocarlo. Iniciar el temporizador inmediatamente después de la primera sonda nasogástrica y administrar glucosa a otros ratones en intervalos de 1 minuto.
- Después de 15 minutos, medir niveles de glucosa en sangre con el glucómetro y además tomar muestras de sangre (30 μL) (como se describe en detalle en el paso 2.4) de cada ratón en el mismo orden como fueron inyectados.
Nota: La gestión del tiempo es muy importante; seguir tan de cerca como sea posible utilizando los mismos intervalos de tiempo en cuanto a la sonda nasogástrica. Que los ratones mover tan libremente como sea posible y el límite de restricción al mínimo durante todo el procedimiento para reducir el estrés, que puede modificar los resultados. Leche la cola con una mano y recoger la sangre con la otra. - Repita el paso 2.7 en momentos seleccionados dependiendo de los resultados esperados (p. ej., a 30, 45, 60, 90, 120, 150 y 180 min después de la administración de glucosa). Si los puntos de tiempo son más de 120 min, asegúrese de que los ratones tengan acceso a agua potable. Asegúrese de que los ratones tengan siempre acceso a agua potable. Cuando haya terminado el experimento, retomar los ratones sus jaulas hogar equipados con alimentos y agua.
PRECAUCIÓN: La OGTT es muy agotador para los ratones. Por lo tanto, esperar al menos 1 semana antes de realizar la siguiente prueba metabólica, como un ITT. - Después del experimento, centrifugar las muestras de sangre a 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Transferir el sobrenadante (plasma) para vaciar los pozos de la placa y almacenarlo a-20 ° C hasta su análisis.
- Grabar la hemólisis de las muestras si está presente (ver sección 3).
- Determinar los niveles de la insulina del plasma utilizando un ELISA disponible comercialmente kit (véase la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante del kit.
Nota: Dependiendo del estado de ayuno, así como en el metabolismo de los ratones investigados, pueden surgir dificultades durante este análisis: los niveles de insulina de ayuno durante la noche (momento 0) son muy bajos y por lo tanto cerca del límite de detección. Para evitar este problema, doblar la cantidad de volumen plasmático recomendada y por consiguiente reducir el resultado de la prueba de ELISA. Por otro lado, si ratones alcanzan el pico de insulina durante OGTT, especialmente en los ratones alimentados de HFD, los niveles de insulina pueden exceder el límite de detección: diluir la muestra (por ejemplo, 10 veces con 0.9% NaCl) y repetir el ensayo de ELISA. Hemólisis en muestras de plasma puede conducir a la degradación de la insulina, resultando en una disminución de los valores de lectura. La degradación depende de tiempo, la temperatura y la concentración de hemoglobina en la muestra. Siempre mantenga las muestras hemolizadas fría o con hielo para reducir la degradación de insulina.
3. ITT
Nota: Las mismas precauciones descritas para OGTT (manejo de ratones, sangre, glucómetro y uso de la jalea de petróleo) también deban aplicarse cuando se realiza la ITT. Por ejemplo, todas las inyecciones deben llevarse a cabo dentro de 15 min en intervalos de 1 minuto si 15 ratones son probados en paralelo. Para la ITT, la posterior recogida de muestras de sangre con tubos capilares es opcional.
- Preparativos antes del experimento
- Ayunar a ratones durante al menos 2 h antes de la inyección de insulina, asegurando que los ratones tengan acceso a agua potable (por ejemplo, eliminar alimentos en 8:00, ratones de prueba 2-5 h más tarde).
- Diluir 1:1,000 de insulina en 0.9% NaCl (Stock: 100 insulina U/mL; trabajo concentración 0.1 U/mL) y preparar 20% glucosa (D-(+)-solución de glucosa disuelta en agua destilada) administrará si los ratones llegan a ser hipoglucémicos.
Nota: La ITT se realiza generalmente después de un corto ayuno para evitar la hipoglucemia que puede ocurrir lo contrario en la noche los animales en ayunas. Todos los reactivos que se administran a los animales deben ser grado farmacológico y estéril.
- Medir el peso corporal de los ratones, marcar la cola, cortar la punta de la cola con unas tijeras afiladas y medir niveles de glucosa en sangre basal como se describe anteriormente para el SOG en el paso 2.4.
- Inyección de insulina
- Para inyectar insulina intraperitoneal (0,75 U insulina/kg de peso corporal, calculada previamente), refrenar el ratón por el método de pescuezo.
- Utilizar un estilo fresco, estéril 27 o 30 calibre aguja para cada animal evitar la incomodidad y el riesgo de infección de cualquier sitio de la inyección.
Nota: La esterilización de la piel puede prolongar la duración de la administración de insulina y así puede causar disturbios adicionales al animal. Por lo tanto, no se recomienda. - Incline la cabeza de ratón hacia abajo en un ángulo ligero para exponer el lado ventral del animal. Coloque la aguja con el bisel hacia arriba y un ángulo de 30 ° en el cuadrante inferior derecho del abdomen del animal (figura 3b). Iniciar el temporizador inmediatamente después de inyecta el primer ratón.
Nota: Servicio de dosis bajas (0.1 U/kg) puede realizarse para evaluar específicamente la sensibilidad a la insulina hepática. En cuanto a la OGTT, calcular el volumen de inyección basado en el peso corporal es el procedimiento estándar, basándose en la dosis en corporal magra masa es preferible si se dispone de datos de la composición corporal.
- Los niveles de glucosa en la sangre medida en puntos de tiempo seleccionado (por ejemplo, después de 15, 30, 45, 60 y 90 min).
Nota: Como la insulina tiene un corto tiempo de ~ 10 min en ratones13, diferencias finales después de la administración de insulina (p. ej., después de 2 h) no pueden reflejar un efecto directo de la acción de la insulina. Administrar solución glucosa al 20% en caso de un ratón hipoglicémico (niveles por debajo de 35 mg/dL de glucosa en la sangre) y está en riesgo de morir. - Después de la última vez puntos, coloque los ratones en sus jaulas hogar preparados con un montón de comida y agua.
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Representative Results
La figura 1 muestra un esquema horario para fenotipado metabólico de ratones con una dieta. En una edad de aproximadamente 6 semanas, los ratones deben colocarse en un HFD, mientras que un grupo de LFD puede servir como el grupo de control. Lo importante, peso corporal deberá determinarse semanalmente para observar si hay un aumento esperado en el peso corporal. Cualquier tipo de estrés (p. ej., ruido o comportamiento agresivo del macho) puede interferir con la ganancia de peso corporal y debe ser eliminado inmediatamente. Cada cohorte de ratones para los experimentos de la dieta debe consistir de al menos 10 ratones porque estos experimentos de dieta son lentos, y afloramientos son frecuentes (por ejemplo, ratones no ganando peso o ratones con niveles de insulina o glucosa anormal). Después del período seleccionado de tiempo (dependiendo de la hipótesis del estudio y el momento de los cambios esperados), pueden realizarse para la evaluación de la acción de insulina y la tolerancia de la glucosa OGTT y ITT. En este trabajo, se eligieron momentos finales para la prueba metabólica.
Importante, debe haber un tiempo de recuperación de al menos 1 semana entre la OGTT y ITT como estos experimentos conducen a la pérdida sustancial de sangre y por lo tanto son muy estresantes para los ratones. Si los volúmenes de la colección de sangre están disminuida (por ejemplo, si se realiza primero un ITT sin recolección de sangre adicional), este período de recuperación también puede ser acortado o se omite, en consonancia con las directrices para varios sorteos de sangre en animales14, 15,16,17.
En este estudio grande con 60 ratones C57BL/6J en total, la mitad de los ratones fueron fijada en HFD o LFD en una edad de 6 semanas (n = 30 grupo) y ganancia de peso corporal se controló durante 16 semanas en dieta. El consumo de HFD dio lugar a un aumento significativo en el peso corporal como se muestra en la figura 4. A las 6 semanas de edad, el peso del cuerpo fue 20,2 g en ambos grupos. Mientras que los ratones en LFD mostraron un constante, aumentando ligeramente el peso corporal (31,2 g ± 2.7) durante el período observado, ratones en HFD aumentaron su peso corporal rápidamente, especialmente durante las primeras semanas y alcanzaron su máximo de peso corporal después de 16 semanas en la dieta. Aunque las curvas de peso mostraron un patrón similar durante el experimento, los ratones del grupo de HFD alcanzada un 1,5 a 2 veces mayor de peso corporal (g 44,4 ± 4.0) en comparación con los ratones alimentados con LFD.
Para investigar el fenotipo metabólico de las dos cohortes, realizaron un OGTT (figura 5) y ITT (figura 6). Como el volumen de sangre es limitado en pequeños roedores, un ensayo de point-of-care (POC) para los seres humanos diabéticos (glucómetro) fue utilizado para monitorear niveles de glucosa en sangre durante los experimentos de fenotipado metabólico. Como se muestra en la figura 2, los monitores de glucosa en sangre son fáciles de usar, necesita sólo una pequeña gota de sangre y mostrar niveles de glucosa en sangre dentro de los segundos para la documentación. Figura 5 presenta el curso temporal de insulina absoluta y absoluta glucosa (figura 5a–b) (figura 5 c) niveles durante la OGTT. Generalmente, un ratón sano con tolerancia a la glucosa normal muestra una característica subida rápida en sangre de glucosa, alcanzando su pico de 15-30 min después de la glucosa.
La captación de glucosa posterior, llevada a cabo principalmente por músculo, tejido de grasa y tejido de hígado conduce a una disminución gradual de la concentración de glucosa de la sangre. En todos los experimentos, los ratones alimentados con LFD sirvió como grupo control tolerante de glucosa y por lo tanto, cumplen el perfil metabólico esperado: el pico de los niveles de glucosa de sangre de ~ 240 mg/dL se llegó aproximadamente 15 minutos después de la administración de glucosa, inmediatamente seguido por una disminución llegando a niveles basales aproximadamente 60 min después de la glucosa, lo que indica eliminación de glucosa adecuado. En contraste, HFD-ratones alcanzó aproximadamente ~ 320 mg/dL de glucosa y no mostraron casi ninguna disposición de la glucosa, lo que indica resistencia a la glucosa. Cuando los niveles de glucosa en sangre entre los dos grupos ya difieren en el estado de ayuno (como en este ejemplo), se debe realizar un cálculo del área bajo la curva (AUC) sobre la glucosa basal para validar los resultados (figura 5a– b).
Además, se determinaron los niveles de insulina circulantes de sangre utilizando una prueba ELISA de insulina (figura 5 c) con el fin de proporcionar más información sobre la fisiopatología subyacente en este modelo. Mientras que los niveles de insulina estaban casi sin cambios en el grupo control, los ratones alimentados un HFD demostraron 16-fold elevados en comparación con el grupo de control, así como una respuesta grandemente creciente de la insulina, indicando HFD-inducida de la hiperinsulinemia compensatoria como el ayuno un intento de contrarrestar la capacidad de eliminación disminuida de la glucosa, que puede ser causada por resistencia a la insulina. Sin embargo, tenga en cuenta no a sobre-interpretar los resultados de OGTT, esta prueba no evalúa directamente la acción de la insulina y no debe utilizarse para concluir las declaraciones sobre la resistencia a la insulina.
Para medir la sensibilidad a la insulina en los ratones alimentados de HFD, una ITT realizó 1 semana después de OGTT (Figura 6a). En este ensayo, el grado a que la sangre las concentraciones de glucosa caen después de la administración de insulina representa la eficacia de la acción de la insulina de todo el cuerpo. Los ratones alimentados de HFD mostraron una reducción deterioro de niveles de glucosa en sangre en comparación con el grupo de control alimentado por la LFD, en todos los puntos de tiempo en el ITT, por lo tanto, lo que sugiere resistencia a la insulina. Generalmente se presentan los resultados ITT como el curso temporal de los niveles de glucosa, pero además también la inversa que AUC debajo de glucosa basal puede ser mostrada como se muestra en la figura 6b. Si los grupos que se comparan tienen similar ayuno niveles de glucosa en sangre (que no es el caso de este experimento), los niveles de glucosa durante ITT pueden presentarse como el porcentaje de glucosa basal. Como en ratones, se activa una respuesta contador-reguladoras a la insulina si los niveles de glucosa en sangre caen por debajo de ~ 80 mg/dL18: defectos en esta respuesta contador-reguladoras en un modelo de ratón particular puedan ser mal interpretadas como un aumento en la sensibilidad a la insulina. Durante HFDs y posterior metabólicos experimentos fenotípicos, afloramientos pueden ocurrir con frecuencia. Ratones que no ganan peso en HFD, o aquellos con glucosa anormal en ayunas o los niveles de insulina deben ser excluidos del análisis. Para los dos últimos, una prueba de aislados puede realizarse para cada grupo experimental por separado (p. ej., prueba de Grubbs)
En este estudio, como ejemplo nos demostró interpretar datos de metabólicas experimentos en vivo, había realizado en ratones con obesidad inducida por dieta, intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina y compararon con un grupo control con peso corporal normal. Como se esperaba, hubo tolerancia deteriorada de la glucosa y la hiperinsulinemia en ratones obesos constantes con resistencia a la insulina en comparación con los ratones de edad comparable del control; Esto fue descubierto usando métodos bien establecido y confiable, a tiempo y presupuesto amigable, que son relativamente fáciles de realizar. Diferencias en tolerancia a la glucosa, los niveles de insulina, así como en la sensibilidad a la insulina, que son todos los obtenidos por los métodos actuales de OGTT y ITT, a menudo pueden ayudar a planificar los próximos pasos de un estudio, que pueden incluir experimentos más sofisticados, tales como hiperglucémico o abrazaderas de hyperinsulinemic, así como experimentos con islotes pancreáticos aislados.
Figura 1. Esquema horario para un régimen de dieta sugerida y metabólicas experimentos en vivo. Para investigar los efectos metabólicos de HFD en ratones, los animales del grupo experimental se colocan en HFD en aproximadamente 6 semanas de edad, mientras que el grupo de control recibe un LFD. El peso corporal de los ratones debe determinarse sobre una base semanal para evaluar ganancia de peso adecuada. Después de aproximadamente 12 semanas de dieta (o un punto de tiempo seleccionado dependiendo de la hipótesis de investigación), el fenotipo metabólico de los ratones es evaluado por un OGTT seguido de 1 semana de tiempo de recuperación y posteriormente un ITT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Métodos para el muestreo de sangre durante los experimentos metabólicos. Para la usa, así como por la ITT, donde se requiere tomar muestras de sangre repetidas, se recomienda extraer sangre mediante corte con cuidado un pedazo de 1-2 mm de la punta de la cola con unas tijeras afiladas (variante A), seguido por la determinación de niveles de glucosa en sangre con un glucómetro y mayor colección de la sangre con un capilar para determinar los niveles de insulina y otros valores relevantes de la sangre. Alternativamente, sangre también podría ser muestreada a través de la vena de la cola (variante B) o por cateterización arterial (no mostrado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Sonda oral de glucosa (a) y la inyección de insulina intraperitoneal (b). Imágenes representativas de la administración de glucosa oral, utilizando una aguja de alimentación durante OGTT (una) y la inyección intraperitoneal de insulina durante la ITT (b). Ver protocolo para una descripción detallada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Ganancia de peso de ratones C57BL/6J alimentados HFD y LFD-alimentó el cuerpo. Ratones C57BL/6J tratara bien en 60% HFD, o 10% LFD para servir como un control, por un período de 20 semanas. Mientras que los ratones en HFD mostraron un aumento esperado en el peso corporal, especialmente en las primeras semanas de dieta, LFD-alimentó los ratones mostraron peso corporal casi constante durante el período observado. Los resultados son la media ± SEM. *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. n = 30 por grupo. ANOVA y prueba post hoc de Tukey se utilizaron para probar para las diferencias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. OGTT realizada en HFD-alimentó y LFD-alimentó animales C57BL/6J. (a) glucosa niveles durante OGTT. Después de un ayuno nocturno, se midieron los niveles de glucosa (mg/dL) en estado de ayuno, 15, 30, 45 y 60 min después de administrar la solución de glucosa por vía oral mediante sonda nasogástrica (1 g glucosa/kg). Los niveles de glucosa en el grupo de HFD fueron elevados en el estado de ayuno, así como después de glucosa. El aumento alcanzó su pico después de 15 minutos seguido por una retrasada y lenta disminución. Los resultados son la media ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. n = 30 por grupo. Análisis estadístico se realizó utilizando la prueba ANOVA y de Tukey post hoc . (b) área de glucosa bajo la curva (AUC) durante OGTT. Para calcular la línea base corregido AUC, los niveles de glucosa basal (momento 0) se resta de todo más adelante obtiene niveles de glucosa en sangre de cada ratón individualmente, seguido por el cálculo de la AUC individual. Las AUC sobre la glucosa basal ilustra la resistencia de la glucosa en los ratones alimentados de HFD. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA y de Tukey post hoc la prueba (niveles de glucosa) o dos colas del estudiante t-pruebas (AUC). (c) Niveles de insulina durante OGTT. Se midieron los niveles de insulina (ng/mL) después de un período ayuno de 4 h y 15, 30 y 60 min después de administrar la solución de glucosa por vía oral mediante sonda nasogástrica (1 g glucosa/kg). HFD-alimentó ratones no sólo compensadas la inyección de glucosa con un mayor incremento en los niveles de insulina de la sangre, también inició y terminó la OGTT con niveles de insulina elevados en comparación con el grupo de control. Los resultados son la media ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. n = 30 por grupo. Análisis estadístico se realizó utilizando la prueba ANOVA y de Tukey post hoc . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Servicio realizado en HFD-alimentó y LFD-alimentó animales C57BL/6J. (a) glucosa niveles en ITT. Los niveles de glucosa (mg/dL) se midieron en estado de ayuno, 15, 30, 45 y 60 min después de la inyección de la insulina intraperitoneal (0,75 U insulina/kg). En ITT, HFD-alimentó los ratones mostraron niveles de glucosa elevados. Los niveles de glucosa en sangre no fueron bajados adecuadamente en los ratones alimentados de HFD después de la inyección de insulina. Los resultados son la media ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. n = 30 por grupo. Análisis estadístico se realizó utilizando la prueba ANOVA y de Tukey post hoc . (b) área de glucosa bajo la curva (AUC) en ITT. Para calcular la base corregida inversa AUC, los niveles de glucosa basal (momento 0) se resta de todos después de obtenidos los niveles de glucemia para cada ratón individualmente. Los valores fueron invertido (multiplicación con -1), seguido por el cálculo de la AUC individual. Como consecuencia del mayor nivel de glucosa en ratones alimentados con HFD durante OGTT, la línea de base corregido inversa que AUC fue menor en los ratones alimentados de HFD en comparación con ratones control, que sugirieron la sensibilidad de insulina disminuida. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA y de Tukey post hoc la prueba (niveles de glucosa) o dos colas del estudiante t-pruebas (inverso AUC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1. Lista de verificación para la preparación del experimento de. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Suplementario Figura 2. Los niveles de insulina durante servicio. Los niveles de insulina del plasma durante la ITT en la LFD-fed versus los grupos alimentados con HFD mostró dinámica similar en los niveles de insulina plasmáticos después de la inyección de la insulina en ambos grupos. Como se esperaba, los ratones HFD exhibieron niveles fuertemente creciente de la insulina basal en comparación con el grupo de control. Además, el aumento de los niveles de insulina en los ratones alimentados de HFD era más fuerte, que puede ser parcialmente causado por la sobreestimación de la masa corporal magra si la cantidad de insulina inyectada se calcula basándose en la masa de cuerpo entero (el enfoque convencional de la normalización) como realizar en este experimento. Sin embargo, la respuesta de la insulina fue deteriorada en el grupo HFD-alimentó (insuficiente reducción de niveles de glucosa en plasma), así más lejos haciendo hincapié en el estado de resistencia a la insulina en estos animales. Los resultados son la media ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Análisis estadístico se realizó utilizando la prueba ANOVA y de Tukey post hoc . Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Con la alta prevalencia de diabetes y enfermedades asociadas en la población mundial, hay una necesidad para la investigación abordando el mecanismo molecular, prevención y tratamiento de la enfermedad19. El protocolo presentado describe métodos bien establecidos para la generación de ratones HFD, un robusto modelo animal utilizado para la investigación metabólica, así como la conducción de la OGTT y ITT, que son potentes herramientas para la evaluación de las alteraciones metabólicas de todo el cuerpo como resistencia a la insulina. Los métodos presentados en este documento pueden ser útiles para estudiar el papel de genes sospechosos, factores ambientales, así como terapias farmacológicas, dietéticas, físicas o genéticas en el metabolismo de la glucosa de todo el cuerpo9,10. Mientras que la glucosa sirve como el principal estímulo para la secreción de insulina en un OGTT, el protocolo presentado puede ser modificado por (co-) aplicar otras sustancias como otros macronutrientes y las hormonas que se saben que modificar la respuesta de insulina2. Del mismo modo, el protocolo ITT puede modificarse por la aplicación (co-) de otras sustancias (p. ej., glucagón o catecolaminas) según la pregunta de investigación individual. Las principales lecturas de los protocolos descritos de OGTT y ITT son concentraciones de la glucosa y la insulina de la sangre; sin embargo, la medición de otros parámetros de la sangre tales como glucagón, ácidos grasos y los niveles de lipoproteínas, así como de diversos marcadores metabólicos en el nivel de mRNA y proteína también puede ser útil dependiendo de la finalidad del estudio.
Los investigadores deben ser conscientes que las respuestas neuroendocrinas a hipoglucemia, la secreción de insulina, acción de la insulina así como el fenotipo metabólico general dependen fuertemente del fondo genético de los ratones10. Aquí, utilizamos ratones dentro del fondo genético de C57BL/6J como modelo HFD-inducida de la diabetes, que tienen una deficiencia parcial en la secreción de insulina mediada por glucosa debido a una canceladura que ocurre naturalmente en el gene de transhidrogenasa del nucleótido de nicotinamida 20, haciendo que un modelo adecuado para estudiar la obesidad asociadas a insulina resistencia8,9. Los protocolos describen aquí mayo sin embargo también utilizarse para caracterizar metabólicamente modelos de ratón alternativo de resistencia a la insulina y la diabetes, que se basan generalmente en enfermedades monogénicas o en la destrucción química de las β-células21, 22 , 23. Precauciones durante el diseño experimental incluyen pruebas de ratones de edad comparable, como disminución de la sensibilidad de insulina con edad de24y llevar a cabo los experimentos en ratones del mismo sexo. Como tratamientos y las mutaciones genéticas pueden provocar diversos fenotipos dependiendo de sexo25,26, también puede ser aconsejable investigar ambos sexos por separado uno del otro.
El método de muestreo de sangre descrito en el presente Protocolo no requiere anestesia, que puede influir en la frecuencia cardíaca, flujo sanguíneo y metabolismo de la glucosa, produciendo resultados no fisiológico10. Alternativamente, puede ser necesario implantar un catéter arterial, que permite el muestreo vascular sin manejar el estrés durante el experimento, pero también agrega esfuerzo, costes así como el riesgo de pérdida de animales para el experimento. Para el SOG, ratones son típicamente ayunó durante la noche (14-18 h), que provoca un estado catabólico en los ratones, fuertemente que agotan el glucógeno hepático. Aunque esto reduce la variabilidad en los niveles de glucosa basal en sangre, el ayuno prolongado disminuye la tasa metabólica y aumenta la utilización de la glucosa en ratones, que está en contraste con la situación de los seres humanos10,27. Como los patrones de alimentación en ratones también no mímico comportamiento humano, puede ser así más fisiológica para realizar un SOG después de un corto ayuno. Como los ritmos circadianos tiene un fuerte efecto sobre el metabolismo de glucosa sistémica28, es importante considerar en qué momento del día se llevan a cabo los experimentos descritos aquí. Para investigar el metabolismo de ratones durante su período activo (la fase oscura), un ciclo de luz-oscuridad invertido puede ser valioso para generar más resultados fisiológicos.
La ruta descrita de administración también puede variar dependiendo de la hipótesis específica siendo probada. La administración oral de glucosa durante una prueba de tolerancia de glucosa conduce a la secreción de insulina más variable, como vaciamiento gástrico, motilidad gastrointestinal, hormonas (incretinas) y entrada neural modificarán y prolongan la respuesta de insulina2, 10. durante el pozo describió el "efecto de la incretina", la absorción de glucosa desde el intestino conduce a la liberación de hormonas gastrointestinales como GLP1, que potencializa la insulina oral glucosa entregado comunicado29. Para evitar estos efectos, un bolo de glucosa puede también administrarse por vía intravenosa (IVGTT) o intraperitoneal (IPGTT). Excursiones de glucosa e insulina significativamente diferencian dependiendo de la ruta de entrega solicitadas. En comparación con lo usa, la administración intraperitoneal de glucosa conduce a un pico mayor y prolongado en los niveles de glucosa en plasma, mientras que plasma insulina incrementa en un retraso, pero más de manera sostenida de30. Asimismo, la administración de glucosa intravenosa se caracteriza por una respuesta de insulina retrasada31. Los fuertes aumentos en los niveles de insulina así como los datos de AUC insulina más robustos obtenidos durante la OGTT sugieren que entrega oral de la glucosa puede ser más sensible para detectar alteraciones en el metabolismo de la glucosa en chow-fed versus ratones alimentados de HFD30, 31. entrega de balon e intraperitoneal son similares en cuanto a la gravedad de la dificultad técnica y animal, mientras que la administración intravenosa es generalmente más difícil como más estresante para los ratones32. La administración oral más elimina la tasa de 10-20% de error durante las inyecciones intraperitoneales en el lumen intestinal o del estómago, que puede afectar la tasa de glucosa entrega y redistribución de33,34.
Aunque es la ruta más fisiológica de la entrega de glucosa, la OGTT es limitado en cuenta sólo la absorción de glucosa, mientras que una comida completa, también contiene proteínas, hidratos de carbono complejos, grasas, fibras y micronutrientes. El enfoque estándar durante OGTT es basar la dosis de glucosa en el peso del cuerpo del ratón, mientras que 1-3 g de glucosa/kg de peso corporal son generalmente administrados35,36. En algunos casos, puede necesitarse una mayor carga de glucosa de 1g/kg para revelar una intolerancia a la glucosa tolerancia30. Muchos modelos de ratón de la obesidad y la diabetes se caracterizan por alteraciones en la composición del cuerpo, especialmente un enorme aumento en la masa de grasa, mientras que la masa corporal magra (músculo, cerebro y el hígado), que es el principal sitio de eliminación de glucosa no cambia proporcionalmente. El enfoque convencional normalización de peso corporal por lo tanto resultará en una dosis desproporcionadamente mayor de glucosa a la que está expuesto el tejido magro en un ratón obeso en comparación con el ratón no obesos. Este sesgo se incrementa con una glucosa más alta dosis30. Por lo tanto, óptimamente la dosis de glucosa (OGTT), así como insulina (ITT) se calculará basándose en la masa corporal magra, si los datos de composición corporal son disponible37. Si la evaluación de la composición corporal no es posible debido a limitaciones técnicas, la dosificación debe efectuarse según el peso del cuerpo (suplementario Figura 2), mientras que la aplicación de una dosis fija, como en un OGTT humana debe ser el último recurso si realizar estas pruebas en ratones10,35,36. En el protocolo presentado, una mano sangre entera se utiliza para medir niveles de glucosa en sangre, que es una ventaja en pruebas como el OGTT y ITT que requieren múltiples muestras de volúmenes pequeños de sangre. Sin embargo, estos dispositivos se diseñan para la sangre humana, teniendo un rango dinámico reducido. Por otra parte, la glucosa los niveles se pueden medir en las muestras del plasma recogidas, por ejemplo, por totalmente automatizado analizadores de química en los laboratorios rutinarios. Además de insulina, péptido C se puede medir en los protocolos descritos como un indicador más directo de la función secretor β-celular, que no es extraída por el hígado en contraste con insulina38,39. Si gluconeogénesis necesita ser evaluado, puede aplicarse la prueba de tolerancia a piruvato (PTT), que es otra variante de los protocolos descritos aquí, monitoreo glucémico excursiones después de la administración de un bolo de piruvato40.
Los enfoques descritos aquí de la OGTT y ITT pueden a menudo explicar las diferencias observadas en la tolerancia a la glucosa y además pueden servir para sugerir que experimentos posteriores, más sofisticados se efectuará de la siguiente (p. ej., hyperglycemic abrazaderas o estudios en islotes aislados). En Resumen, presentamos un protocolo simple para la generación de un modelo de ratón inducido por HFD y describir más lejos la OGTT y ITT, que son herramientas poderosas para evaluar alteraciones del fenotipo metabólico en vivo y puede ser útil para el estudio de mecanismos de la enfermedad asociada a metabolismo así como nuevos enfoques terapéuticos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el fondo científico médico del alcalde de la ciudad de Viena y la Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa - Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa - Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid - Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline - creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
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