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Étude In Vivo du métabolisme du Glucose à haute teneur en graisses régime chez les souris nourries avec épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) et Test de tolérance à l’insuline (ITT)

Published: January 7, 2018 doi: 10.3791/56672
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, Medical University of Vienna

Summary

L’article décrit la génération et la caractérisation métabolique de chez les souris nourries à la diète riche en gras comme un modèle de résistance à l’insuline induite par le régime alimentaire et l’obésité. Il dispose également des protocoles détaillés pour effectuer l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale et le test de tolérance de l’insuline, suivi des altérations du corps entier de glucose métabolisme in vivo.

Abstract

L’obésité représente le seul facteur de risque plus important dans la pathogenèse du diabète de type 2, une maladie qui se caractérise par une résistance à l’absorption du glucose stimulée par l’insuline et une décompensation brute du métabolisme du glucose systémique. Malgré des progrès considérables dans la compréhension du métabolisme du glucose, les mécanismes moléculaires de sa réglementation en santé et la maladie demeurent sous visé par l’enquête, alors qu’il existe un besoin urgent de nouvelles approches pour prévenir et traiter le diabète. Alimentation dérivée de glucose stimule la sécrétion pancréatique d’insuline, qui sert à l’organisme de réglementation principal de processus anaboliques cellulaires pendant l’État nourri et soldes ainsi la glycémie niveaux pour maintenir le statut énergétique systémique. Suralimentation déclencheurs meta-inflammation chronique, qui entraîne des modifications en insuline périphérique associés aux récepteurs de signalisation et réduit ainsi la sensibilité à la disposition de la glycémie induite par l’insuline. Ces événements aboutirait à glycémie élevée à jeun et de taux d’insuline, mais aussi une réduction de la tolérance au glucose, qui à son tour servir d’indicateurs importants de résistance à l’insuline. Nous présentons ici un protocole pour la production et la caractérisation métabolique d’alimentation riche en graisses (HFD)-nourri des souris comme un modèle souvent utilisé de résistance à l’insuline induite par l’alimentation. Nous illustrons en détail l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO), qui surveille l’élimination périphérique d’une sécrétion glucose administré par voie orale de charge et de l’insuline au fil du temps. En outre, nous présentons un protocole pour l’épreuve d’hyperglycémie provoquée insuline (ITT) de surveiller l’action de l’insuline de l’organisme entier. Ensemble, ces méthodes et leurs applications en aval, représentent des outils puissants pour caractériser le phénotype métabolique général de souris aussi bien quant à évaluer plus précisément les altérations du métabolisme du glucose. Ils peuvent être particulièrement utiles dans le domaine de la recherche large de résistance à l’insuline, le diabète et l’obésité pour fournir une meilleure compréhension de la pathogenèse, aussi bien quant à tester les effets des interventions thérapeutiques.

Introduction

Dans les pays développés, l’obésité et le diabète atteint des dimensions épidémies due à la sédentarité et la consommation excessive d’aliments transformés, les effets qui résultent de l’urbanisation, industrialisation, mais aussi la mondialisation. Bien que les recherches sur la résistance à l’insuline et ses co-morbidités, tels que les hyperlipidémies et l’athérosclérose, a gagné la proéminence pendant les dernières décennies, les mécanismes biologiques complexes qui régulent le métabolisme de la santé et la maladie restent incomplètement compris et il n’y a toujours un besoin urgent de nouvelles modalités de traitement prévenir et traiter ces maladies1.

L’insuline et du glucagon d’hormone hyperglycémiante c' est servent les principaux régulateurs cellulaires d’alimentation et macronutriments du bilan d’énergie, donc maintenant bon sang systémique glucose concentration2. Glucose lui-même agit comme parmi les principaux stimulateurs de sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas, tandis que les autres macronutriments, facteurs humoraux comme entrée neuronale plus modifier cette réponse. L’insuline déclenche par conséquent des processus anaboliques de jeun en facilitant la diffusion des excès de glycémie dans le muscle et les cellules adipeuses et en outre activant la glycolyse comme protéine - ou synthèse des acides gras, respectivement. En outre, l’insuline supprime la production hépatique de glucose en inhibant la néoglucogenèse. Consommation d’énergie excessive chronique et meta-inflammation mènent à une hyperinsulinémie et insulinorésistance périphérique due à la régulation de l’expression des récepteurs de l’insuline ainsi que les modifications dans les voies de signalisation en aval, ce qui a entraîné une déficience sensibilité à la disposition de la glycémie induite par l’insuline ainsi qu’insuffisante inhibition de la production de glucose hépatique3,4,5,6.

Une large gamme de modèles animaux avec induction génétique, nutritionnelle ou expérimentale de la maladie s’est avéré pour être d’excellents outils pour étudier les mécanismes moléculaires de la résistance à l’insuline et les diverses formes de diabète ainsi que son accompagnement des maladies7 . Un exemple typique est le modèle largement utilisé et bien établie de souris induite par le SIH, qui se caractérise par la prise de poids rapide en raison de l’apport alimentaire accrue en combinaison avec l’efficacité métabolique réduite, ce qui entraîne l’insuline résistance8, 9. tant chez des modèles animaux et les humains, une élévation à jeun niveaux de glucose et d’insuline sanguins, ainsi qu’une intolérance à l’administration de glucose sont fréquemment utilisés indicateurs de résistance à l’insuline et d’autres modifications systémiques du glucose métabolisme. Surveillance insuline et glucose sanguin à l’état basal ou après stimulation est donc facilement accessibles lectures.

Le présent protocole décrit la génération de souris nourries HFD ainsi que deux méthodes fréquemment utilisées, l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) et l’essai de résistance d’insuline (ITT), qui sont utiles pour caractériser le phénotype métabolique et d’enquêter sur altérations du métabolisme du glucose. Nous décrivons l’HGPO en détail, ce qui permet d’évaluer la disposition d’une sécrétion glucose administré par voie orale de charge et de l’insuline au fil du temps. En outre, nous fournissent des instructions sur la façon de mener l’invitation à soumissionner pour enquêter sur tout le corps-action de l’insuline en surveillant la concentration de glucose en réponse à un bolus d’insuline. Les protocoles décrits dans cet article sont bien établis et ont été utilisées dans plusieurs études10,11,12. En plus de légères modifications qui peuvent contribuer à accroître le succès, nous fournissons des lignes directrices pour la conception expérimentale et analyse des données, ainsi que des conseils utiles éviter les pièges potentiels. Les protocoles décrits dans les présentes peuvent être des outils très puissants pour étudier l’influence de facteurs génétiques, pharmacologiques, alimentaires et autres sur le métabolisme du glucose tout le corps et sur ses troubles associés comme la résistance à l’insuline. Outre la stimulation avec le glucose ou l’insuline, une variété d’autres composés peut être utilisée pour la stimulation selon le but d’une recherche individuelle. Bien qu’en dehors de la portée de ce manuscrit, de nombreuses autres applications en aval peuvent être effectuées sur les échantillons de sang dessinés, comme l’analyse des valeurs de sang autres que le glucose et d’insuline (par ex., lipides et lipoprotéines profils) ainsi que détaillées analyse des marqueurs métaboliques (par exemple, en temps réel quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR), analyse par Western blot et enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)). Outre cytométrie en flux et tri cellulaire activé par Fluorescence (FACS) peut être appliquée afin d’étudier les effets chez les populations de cellules simples distinctes, tandis que la transcriptomique, protéomique et métabolomique approches peuvent également être utilisés pour l’analyse non ciblée.

Dans l’ensemble, nous fournissons un protocole simple pour générer un modèle de souris induite par le SIH, tout en décrivant plus deux approches puissants pour étudier les modifications métaboliques dans tout l’organisme, l’HGPO et l’invitation à soumissionner, qui peut être des outils utiles pour étudier la pathogenèse de la maladie et développement de nouvelles thérapies, notamment dans le domaine des maladies associées au métabolisme tels que la résistance à l’insuline et le diabète.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université médicale de Vienne et animalier et réalisées selon la Fédération des européen Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Veuillez noter que toutes les procédures décrites dans le présent protocole doivent être effectuées uniquement après approbation institutionnelle et gouvernementale, ainsi que par le personnel qui est techniquement compétent.

1. HFD-nourris de souris

Remarque : Maintenir toutes les souris C57BL/6J sur un cycle lumière/obscurité de 12 h avec accès gratuit à la nourriture et l’eau.

  1. À l’âge de 6 semaines, placez la souris pendant 8 à 12 semaines sur un HFD (40-60 % graisse calories) pour provoquer l’obésité, tout en alimentant le groupe témoin maigre une diète faible en gras (écoute) (10 % graisse calories).
  2. Déterminer le poids du corps des souris sur une base hebdomadaire. Les courbes de poids devraient montrer des tendances similaires dans les deux groupes, avec une pente plus élevée dans le groupe nourri HFD.

2. HGPO

Remarque : Si les points de temps pour le prélèvement sanguin sont choisis au cours de l’HGPO à toutes les 15 min, l’expérience devrait être effectuée avec un maximum de 15 souris en parallèle, afin d’avoir au moins 1 min manutention-temps par souris.

  1. Préparation la veille de l’HGPO
    1. Transférer les souris dans une cage avec literie douce et rapide durant la nuit avant l’essai (14 h), tout en s’assurant que les souris aient accès à l’eau potable (par exemple, supprimer les aliments à 18:00 pour une heure de début sur le lendemain matin à 08:00).
      NOTE : Jeûne souris pendant la nuit est l’approche standard, cependant un jeûne plus court (5-6 h) est plus physiologique pour la souris (voir pour plus de détails) .
  2. Préparations, le jour de l’expérience (mais avant l’expérience)
    1. Préparer 10 mL d’une solution de glucose 20 % (dissoudre D-(+)-Glucose dans de l’eau distillée).
      Remarque : Tous les réactifs qui sont administrés aux animaux doivent être de classe pharmacologique et stérile.
    2. Préparer une plaque à 96 puits pour la collecte de plasma, en remplissant un puits pour chaque point de prélèvement temps et chaque souris, 5 µl NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8.0 à 0,9 % NaCl, stockage à ta). Pendant l’expérience, stocker cette plaque sur la glace.
      Remarque : Voir supplémentaire Figure 1 pour une liste détaillée.
  3. Mesurer le poids des souris et marquer leurs queues avec un marqueur permanent afin de rendre les souris faciles à distinguer (p. ex., souris 1 = 1 dash, tirets souris 2 = 2, etc.).
  4. Mesure de la glycémie et des prélèvements sanguins (Figure 2)
    1. Découpez soigneusement 1-2 mm de l’extrémité de la queue à l’aide de ciseaux pointus (« variante A » dans la Figure 2). Toujours essuyer la première goutte de sang pour éviter l’hémolyse ou une contamination par tissu liquide avant de prendre des échantillons de sang neuf pour le dosage du glucose sanguin. Obtenir un échantillon de sang petit (~ 3 µL) pour mesurer le niveau de glucose sanguin basal (= point de temps 0) avec le glucomètre.
      ATTENTION : Vérifier et ajuster le nombre de charge de bandelettes de test sur un glucomètre.
      Remarque : Comme une méthode d’échantillonnage de sang alternative, entailler la veine latérale queue d’une souris avec une lame de scalpel tranchant (« variante B » à la Figure 2). La veine caudale latéral est généralement accessible environ un tiers sur toute la longueur de la queue de l’extrémité de la queue, se déplaçant vers la base de la queue pour des échantillons multiples. L’utilisation d’une crème d’anesthésique local est recommandée. Arrêter la circulation sanguine en appliquant une pression du doigt sur les tissus mous au moins 30 s avant que l’animal est renvoyé à sa cage.
    2. Prélever un échantillon de sang (environ 30 µL) à l’aide d’un tube capillaire frais (Gardez le tube capillaire horizontale). Vider le tube capillaire à l’aide d’une pipette en plaçant l’embout de la pipette en haut de l’extrémité du tube capillaire et soigneusement en poussant le sang recueilli dans un puits de la plaque à 96 puits, tout en évitant les bulles d’air. Répétez cette procédure pour toutes les souris - un à la fois.
      Remarque : Comme une alternative pour la collecte de sang par un tube capillaire, utiliser une pipette réglée sur le volume correct (par exemple, 30 µL) pour recueillir le sang, ou de collecter une goutte de sang de la queue sur le film de paraffine et pipette il dans la solution d’EDTA. Strictement éviter le contact de la gelée de pétrole avec des bandelettes de test sanguin ou glucomètre, puisqu’il peut influencer les mesures ultérieures de glucose et d’insuline.
      ATTENTION : L’HGPO est très stressant pour les souris : souris maigres peuvent perdre environ 15 % de leur poids corporel au cours du jeûne d’une nuit. En outre, les prélèvements sanguins à différents moments conduit à une perte considérable de sang. Pour les prélèvements sanguins plus facile, il est possible de masser soigneusement la mouse-tail de vaseline.
      Remarque : Les directives institutionnelles peuvent limiter le montant admissible du sang prélevé dans un délai déterminé. Les volumes de prélèvement d’échantillons et on doit être redressé pour ne pas dépasser les taux maximaux autorisés. Le poids du corps des souris doit être utilisé pour calculer le total retrait autorisé de sang.
  5. Calculer le volume nécessaire de solution de glucose selon le poids corporel (1 g de glucose/kg poids corporel, ce qui peut être augmentée jusqu'à 3 g/kg) qui serait administré par gavage pour chaque souris. Par exemple, une souris avec un poids de 30 g faudrait 150 µL d’une solution de glucose 20 % pour l’administration de 30 mg de glucose.
    Remarque : À la base de la dose de glucose sur le poids de la souris est la procédure standard. S’il existent des données de composition de corps, la dose de glucose pour HGPO devrait être calculé basé sur le maigre de la masse corporelle (voir pour plus de détails) .
  6. Administration de glucose
    1. Préparer everythingthat est nécessaire pendant l’expérience entière à l’avance (minuterie, fiche d’expérience, glucose moniteur et bandes, capillaires, seringues, solution de glucose, plaque à 96 puits, bistouri, calculatrice, équilibre, marqueur permanent, papiers de banc, un pipette avec une pointe et gants).
    2. Pour l’application de glucose, restreindre la souris en le saisissant fermement par la peau du cou. Appliquer suffisamment de fermeté à la peau autour du cou pour empêcher la torsion de la retenue de la souris et de bien pencher sa tête en arrière. Également de veiller à ce que la souris peut respirer correctement.
      Remarque : Une fois que l’administration de glucose est démarrée, gestion du temps est très importante.
    3. Soigneusement administrer la solution de glucose (basée sur l’étape 2.5) directement dans l’estomac à l’aide d’une aiguille d’alimentation. Prudemment, diriger l’aiguille alimentation par la bouche vers le œsophage. Laissez la souris à avaler l’aiguille : l’aiguille s’enfonce entièrement dans le bas oesophage/estomac de la souris. Puis injecter la solution de glucose (Figure 3 a).
      1. Si une résistance est remplie ou si l’animal se débat immédiatement, retirer l’aiguille et le repositionner. Démarrer la minuterie immédiatement après le premier gavage et administrer glucose à toutes les autres souris à intervalles de 1 min.
        Remarque : Il peut être utile d’appliquer une goutte de solution de glucose directement à partir de l’alimentation de l’aiguille jusqu'à l’embouchure de la souris, ce qui stimulera les lécher et avaler, facilitant ainsi faciliter l’introduction de l’aiguille d’alimentation. N’appliquez pas de pression lors de l’insertion de l’aiguille alimentation car cela peut blesser gravement l’animal.
  7. Après 15 min, mesurer le taux de glucose sanguin avec le glucomètre et en outre prendre des échantillons (~ 30 µL) de sang (comme décrit en détail à l’étape 2.4) de chaque souris dans le même ordre qu’ils ont reçu une injection.
    NOTE : La gestion du temps est très importante ; suivre d’aussi près que possible en utilisant les mêmes intervalles de temps en ce qui concerne le gavage. Laissez les souris déplacer aussi librement que possible et à endiguer les limite au minimum pendant toute la procédure pour réduire le stress, qui peut modifier les résultats. Queue d’une main de lait et de recueillir le sang avec l’autre.
  8. Répétez l’étape 2.7 aux moments choisis en fonction des résultats escomptés (par exemple, au 30, 45, 60, 90, 120, 150 et 180 min après l’administration de glucose). Si les points de l’heure sélectionnée sont plus de 120 min, veiller à ce que les souris aient accès à l’eau potable. Veiller à ce que les souris ont toujours accès à l’eau potable. Lorsque vous avez terminé avec l’expérience, retourner les souris à leurs domicile cages équipées de nourriture et d’eau.
    ATTENTION : L’HGPO est très épuisant pour les souris. Donc attendre au moins 1 semaine avant d’effectuer le prochain test métabolique, comme une ITT.
  9. Après l’expérience, centrifuger les échantillons de sang à 2 500 x g, 30 min, 4 ° C. Transférer le surnageant (plasma) pour vider les puits de la plaque et la stocker à-20 ° C jusqu'à l’analyse.
    1. Enregistrer une hémolyse des échantillons s’il est présent (voir Section 3).
  10. Déterminer le taux d’insuline plasmatique à l’aide d’un ELISA commercial nécessaire (voir la Table des matières) suivant les instructions du fabricant de la trousse.
    Remarque : Selon l’état de jeûne, ainsi que sur le métabolisme des souris étudiées, des difficultés au cours de cet essai peuvent survenir : insuline jeûne pendant la nuit les niveaux (instant 0) sont très bas et donc à proximité de la limite de détection. Pour éviter ce problème, doubler la quantité de volume plasmatique recommandée et par conséquent réduire de moitié le résultat du test ELISA. En revanche, si la souris a atteindre le sommet de l’insuline au cours de l’HGPO, surtout chez les souris nourries HFD, le taux d’insuline peut dépasser la limite de détection : diluer l’échantillon (par exemple, 10 fois avec 0,9 % NaCl) et répétez le test ELISA. Hémolyse dans des échantillons de plasma peut conduire à la dégradation de l’insuline, ce qui entraîne une diminution des valeurs d’affichage. La dégradation dépend de la durée, la température et la concentration d’hémoglobine dans l’échantillon. Gardez toujours les échantillons hémolysés froid ou sur la glace pour réduire la dégradation de l’insuline.

3. ITT

NOTE : Les mêmes précautions pour le HGPO (manipulation de la souris, du sang, glucomètre et utilisation de la gelée de pétrole) devraient également s’appliquer lors de l’exécution de l’ITT. Par exemple, toutes les injections doivent être effectuées dans les 15 min à intervalles de 1 min si 15 souris sont testés en parallèle. Pour l’invitation à soumissionner, la collecte ultérieure des échantillons de sang avec tubes capillaires est facultative.

  1. Préparatifs avant l’expérience
    1. Rapide des souris pendant au moins 2 h avant l’injection d’insuline, tout en s’assurant que les souris aient accès à l’eau potable (p. ex., retirez les aliments à 08:00, test souris 2-5 h plus tard).
    2. Diluer l’insuline 1 : 1 000 à 0,9 % NaCl (Stock : 100 U/mL d’insuline ; travail concentration 0,1 U/mL) et de préparer les 20 % de glucose (D-(+)-solution de Glucose dissoute dans l’eau distillée) à administrer si les souris deviennent hypoglycémiques.
      NOTE : L’invitation à soumissionner est généralement effectuée après qu’un jeûne court pour éviter l’hypoglycémie qui peut survenir dans le cas contraire dans toute la nuit à jeun animaux. Tous les réactifs qui sont administrés aux animaux doivent être de classe pharmacologique et stérile.
  2. Mesurer le poids corporel des souris, marquer la queue, couper l’extrémité de la queue à l’aide de ciseaux pointus et mesurer la glycémie basale comme décrit plus haut pour l’HGPO à l’étape 2.4.
  3. Injection d’insuline
    1. Pour injecter de l’insuline par voie intrapéritonéale (0.75 U d’insuline/kg de poids corporel, calculé au préalable), restreindre la souris par la méthode de la peau du cou.
    2. Utiliser une nouvelle, 27 ou 30 stérile aiguille pour chaque animal afin d’éviter l’inconfort et le risque d’une infection du site d’injection de calibre.
      NOTE : Stérilisation de la peau peut prolonger la durée de l’administration d’insuline et donc peut provoquer des perturbations supplémentaires à l’animal. Par conséquent, il n’est pas recommandé.
    3. Inclinez la tête de la souris vers le bas avec un léger angle d’exposer la face ventrale de l’animal. Placer l’aiguille stérile avec le biseau vers le haut et un angle de 30 ° dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen de l’animal (Figure 3 b). Démarrer la minuterie immédiatement après que la première souris est injectée.
      NOTE : Faible dose ITTs (0,1 U/kg) peut être effectuée afin d’évaluer plus précisément la sensibilité d’insuline hépatique. En ce qui concerne l’HGPO, calculer le volume d’injection selon le poids corporel est la procédure standard, tout en fondant la dose sur maigre masse est préférable si les données de composition de corps sont disponibles.
  4. Mesurer la glycémie aux moments choisis (par exemple, après 15, 30, 45, 60 et 90 min).
    Remarque : Comme l’insuline a une courte demi-vie de ~ 10 min dans la souris13, différences fin après l’administration d’insuline (par exemple, après 2 h) ne reflètent pas un effet direct de l’action de l’insuline. Administrer une solution de glucose 20 % dans le cas où une souris devient hypoglycémie (glycémie inférieure à 35 mg/dL de sang) et est à risque de mourir.
  5. Après que le temps final points, replacez les souris dans leur cage maison préparé avec beaucoup de nourriture et d’eau.

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Representative Results

La figure 1 illustre un calendrier schématique pour Phénotypage métabolique de la souris sur le régime alimentaire. À un âge d’environ 6 semaines, les souris doivent être placés sur un HFD, alors qu’un groupe d’écoute peut servir le groupe témoin. Ce qui est important, poids corporel doit être déterminé chaque semaine pour observer si il y a une augmentation du poids corporel. Tout type de stress (p. ex., bruit ou le comportement agressif des hommes) peut interférer avec la prise de poids de corps et doit être éliminée immédiatement. Chaque cohorte des souris pour des expériences d’alimentation doit se composer d’au moins 10 souris parce que ces expériences de régime sont coûteuses en temps et valeurs aberrantes sont fréquents (p. ex., souris ne pas gagne du poids ou la souris avec le glucose anormale ou taux d’insuline). Après la période de temps (en fonction de l’hypothèse de l’étude et le point dans le temps des changements attendus), HGPO et ITT sont possibles pour l’évaluation des actions de tolérance et de l’insuline glucose. Dans cet article, fin points dans le temps pour le test métabolique ont été choisis.

Ce qui est important, il devrait y avoir une indisponibilité d’au moins 1 semaine entre le HGPO et ITT car ces expériences conduisent à la perte de sang importante et sont donc très stressantes pour les souris. Si les volumes de collecte de sang sont une diminution (par exemple, si vous effectuez un ITT sans prélèvement de sang supplémentaire d’abord), cette période de récupération peut également être raccourcie ou omise, conformément aux orientations pour plusieurs tirages de sang en animaux14, 15,16,17.

Dans cette importante étude avec des souris C57BL/6J 60 au total, la moitié des souris ont été définie sur HFD ou écoute à l’âge de 6 semaines (n = 30/Groupe) et le gain de poids corporel a été suivi pendant 16 semaines sur l’alimentation. La consommation de HFD a entraîné une augmentation significative du poids corporel tel qu’illustré à la Figure 4. À l’âge de 6 semaines, le poids du corps était de 20,2 g dans les deux groupes. Alors que les souris sur écoute ont montré un uniforme, en augmentant légèrement le poids corporel (31,2 g ± 2,7) au cours de la période observée, souris sur HFD augmentent leur poids corporel rapidement, surtout pendant les premières semaines et ont atteint leur maximum de poids de corps après 16 semaines sur l’alimentation. Bien que les courbes de poids ont montré une tendance semblable pendant l’expérience, les souris du groupe HFD atteint un 1,5 à 2 fois plus élevé de poids corporel (44,4 g ± 4,0) par rapport aux souris nourries LFD.

Pour étudier le phénotype métabolique des deux cohortes, une HGPO (Figure 5) et l’ITT (Figure 6) ont été effectuées. De petits rongeurs, le volume sanguin est limitée, un point-of-care (POC) de dosage pour les humains diabétiques (glucomètre) a été utilisé pour surveiller la glycémie au cours de ces expériences de Phénotypage métabolique. Comme le montre la Figure 2, les glucomètres sont faciles à utiliser, besoin seulement une petite goutte de sang et affichent des taux de glucose sanguin quelques secondes pour obtenir la documentation. La figure 5 présente l’évolution temporelle de l’absolu insuline et de glucose absolue (Figure 5 a–b) (Figure 5C) niveaux au cours de l’HGPO. Généralement, une souris en bonne santé avec la tolérance au glucose normale montre une augmentation rapide caractéristique de sang glucose, atteignant son apogée 15-30 min après le défi de glucose.

Captation du glucose ultérieure, principalement menée par muscle, graisse des tissus et tissus foie conduit à une diminution progressive de la concentration de glucose de sang. Dans toutes les expériences, les souris nourries LFD servi comme le groupe de contrôle tolérant du glucose et du profil métabolique attendu a donc été respectée : le pic de la glycémie de ~ 240 mg/dL a été atteint environ 15 min après l’administration de glucose, immédiatement suivie d’une diminution atteignant des concentrations basales environ 60 min après le défi de glucose, indiquant l’élimination appropriée de glucose. Contraste, HFD-souris atteint approximativement de glucose ~ 320 mg/dL et a montré presque aucune élimination du glucose, ce qui indique la résistance de glucose. Lorsque les niveaux de glucose de sang entre les deux groupes déjà diffèrent dans l’état de jeûne (comme dans cet exemple représentatif), un calcul de l’aire sous la courbe (AUC) au-dessus de glucose de base devrait être effectué pour valider les résultats (Figure 5 a– ( b).

En outre, les taux d’insuline sanguins circulants ont été déterminées à l’aide d’un test de l’insuline-ELISA (Figure 5C) afin de fournir plus d’informations sur la physiopathologie sous-jacente dans ce modèle. Alors que le taux d’insuline est pratiquement inchangées dans le groupe témoin, souris nourries avec un SIH a montré 16 fois élevés comparativement au groupe de contrôle, ainsi qu’une réponse insuline grandement accrue, indiquant l’hyperinsulinémie compensatoire HFD-induced comme le jeûne pour tenter de contrebalancer la capacité d’élimination diminuée de glucose, qui peut être causée par la résistance à l’insuline. Sachez toutefois ne pas à sur-interpréter les résultats de l’HGPO, comme ce test n’évalue pas directement l’action de l’insuline et ne doit pas être utilisé pour conclure les déclarations sur la résistance à l’insuline.

Pour mesurer la sensibilité à l’insuline chez les souris nourries HFD, une ITT a été effectué 1 semaine après HGPO (Figure 6 a). Dans cet essai, le degré de sang glycémies tombent suite à l’administration d’insuline représentent l’efficacité de l’action de l’insuline de l’organisme entier. Les souris nourries HFD a montré une réduction altérée de glucose sanguin comparée au groupe témoin nourri LFD, à tous moments au cours de l’ITT, suggérant ainsi la résistance à l’insuline. Les résultats de l’ITT sont généralement présentés comme l’évolution temporelle des niveaux de glucose, mais en outre aussi l’inverse QU'AUC au-dessous de glucose de départ peut être montré comme illustré dans la Figure 6 b. Si les groupes qui sont contre ont même jeûne de glucose sanguin (ce qui n’est pas le cas dans cette expérience), le taux de glucose au cours de l’ITT peut aussi être présentée sous forme de pourcentage de glucose basale. Comme les souris, une contre-régulation réponse à l’insuline est activée si le taux de glucose sanguin en dessous de ~ 80 mg/dL18: défauts dans cette réponse hyperglycémiante dans un modèle murin particulière peuvent être mal interprétés comme une augmentation de la sensibilité à l’insuline. Pendant HFDs et expériences subséquentes de phénotypiques métaboliques, valeurs aberrantes peuvent se produire fréquemment. Souris qui n’obtiennent pas de poids sur HFD, ou celles qui se montrent la glycémie à jeun anormale et/ou taux d’insuline devraient être exclues de l’analyse. Pour les deux derniers, un test d’aberration peut être effectué séparément pour chaque groupe expérimental (p. ex., test de Grubbs)

Dans cette étude, à titre d’exemple nous a montré et interprété les données des expériences métabolique in vivo, réalisée sur des souris avec l’obésité induite par l’alimentation, l’intolérance au glucose et résistance à l’insuline et comparés à un groupe témoin de poids normal. Comme prévu, il y avait une intolérance au glucose et l’hyperinsulinémie chez des souris obèses compatibles avec résistance à l’insuline par rapport aux souris témoins du même âge ; Cela a été découvert par des méthodes bien établie et fiable, temps - et abordable, qui sont relativement faciles à exécuter. Différences de tolérance au glucose, taux d’insuline ainsi que la sensibilité à l’insuline, qui sont tous obtenus par les méthodes présentées d’HGPO et ITT, peuvent souvent aider à planifier les prochaines étapes d’une étude, qui peuvent comprendre des expériences plus sophistiqués tels que hyperglycémiques ou pinces hyperinsulinémique, ainsi que des expériences avec les îlots pancréatiques isolés.

Figure 1
Figure 1. Calendrier schématique d’un régime de diète suggérée et métaboliques des expériences in vivo. Afin d’étudier les effets métaboliques de HFD chez les souris, les animaux du groupe expérimental sont placés sur HFD à environ 6 semaines d’âge, tandis que le groupe témoin reçoit une écoute. Le poids du corps des souris doit être déterminé sur une base hebdomadaire afin d’évaluer le gain de poids. Après environ 12 semaines sur l’alimentation (ou un point de temps choisi selon l’hypothèse de recherche), le phénotype métabolique des souris est évalué par une HGPO suivie de 1 semaine de temps de récupération, puis une ITT. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Méthodes pour les prélèvements sanguins au cours d’expériences métaboliques. Pour l’HGPO aussi bien en ce qui concerne l’invitation à soumissionner, où les prélèvements sanguins répétés est nécessaire, il est recommandé de prélever le sang via soigneusement couper un morceau de 1 à 2 mm de l’extrémité de la queue avec des ciseaux pointus (variante A), suivi par la détermination de la glycémie avec un glucomètre et autre collecte de sang avec un capillaire afin de déterminer les niveaux d’insuline et d’autres valeurs de sang pertinentes. Alternativement, sang pourrait également être dégustée via la veine caudale (variante B) ou par cathétérisme artériel (non illustré). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Gavage par voie orale de glucose (a) et injection d’insuline intrapéritonéale (b). Images représentatives de l’administration orale de glucose à l’aide d’une aiguille d’alimentation au cours de l’HGPO (un) et l’injection intrapéritonéale de l’insuline au cours de l’ITT (b). Voir le protocole pour une description détaillée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Gain de poids des souris C57BL/6J HFD-nourris et nourris LFD corporel. A à des souris C57BL/6J définie sur 60 % HFD, soit 10 % LFD pour servir un contrôle, pour une période de 20 semaines. Tandis que la souris sur HFD provoquerait une augmentation du poids corporel, en particulier dans les premières semaines de régime, chez les souris nourries LFD a montré poids corporel presque constante au cours de la période observée. Les résultats sont moyenne ± SEM. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. n = 30 par groupe. Analyse de la variance et test post hoc de Tukey ont servi à vérifier les différences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. HGPO réalisées chez l’animal de C57BL/6J HFD-nourris et nourris LFD. (un) Glucose niveaux au cours de l’HGPO. Après un jeûne d’un nuit, glycémie (mg/dL) ont été mesurés en état de jeûne et de 15, 30, 45 et 60 min après l’administration de la solution de glucose par voie orale par gavage (1 g de glucose/kg). Taux de glucose dans le SIH-groupe était élevées dans l’état de jeûne, ainsi qu’après le défi de glucose. L’augmentation a atteinte son apogée après que 15 min suivi d’une tardive et lente diminution. Les résultats sont moyenne ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 par groupe. L’analyse statistique a effectué un test post hoc de variance et de Tukey. (b) aire de Glucose sous la courbe (AUC) au cours de l’HGPO. Pour calculer le niveau de référence corrigé des AUC, glycémie basale niveaux (instant 0) ont été soustraits tous plus tard obtenu le taux de glucose sanguin pour chaque souris individuellement, suivi par le calcul des AUCs individuels. L’AUC au-dessus du glucose base illustre la résistance de glucose chez les souris nourries HFD. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du test d’analyse de la variance et de Tukey post hoc (taux de glucose) ou de la queue deux de Student t-test (AUC). (c) Taux d’insuline au cours de l’HGPO. Taux d’insuline (ng/mL) ont été mesurées après une période de 4 h et de 15, 30 et 60 min après l’administration de la solution de glucose par voie orale par gavage (1 g de glucose/kg). HFD-chez les souris nourries compensées non seulement pour l’injection de glucose avec une augmentation plus élevée dans les niveaux d’insuline de sang, ils ont aussi commencé et s’est terminée l’HGPO avec des niveaux d’insuline élevé comparées au groupe témoin. Les résultats sont moyenne ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 par groupe. L’analyse statistique a effectué un test post hoc de variance et de Tukey. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6. ITTs réalisées chez l’animal de C57BL/6J HFD-nourris et nourris LFD. (un) Glucose niveaux au cours de l’ITT. Le taux de glucose (mg/dL) ont été mesurés en état de jeûne et de 15, 30, 45 et 60 min après l’injection d’insuline par voie intrapéritonéale (0.75 U d’insuline/kg). Au cours de l’ITT, chez les souris nourries HFD a montré une glycémie élevée. Le taux de glucose sanguin ne était pas suffisamment abaissé chez les souris nourries HFD après injection d’insuline. Les résultats sont moyenne ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 par groupe. L’analyse statistique a effectué un test post hoc de variance et de Tukey. (b) Glucose zone sous la courbe (AUC) au cours de l’ITT. Pour calculer l’inverse corrigé base AUC, glycémie basale niveaux (instant 0) ont été soustraits tous plus tard obtenu de glucose sanguin pour chaque souris individuellement. Les valeurs sont inversée (multiplication par -1), suivi par le calcul des AUCs individuels. Par suite de la concentration de glucose plus élevée chez les souris nourries HFD au cours de l’HGPO, la ligne de base corrigée inverse QU'AUC était plus faible chez les souris nourries HFD par rapport aux souris témoins, qui a proposé la sensibilité d’insuline diminuée. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du test d’analyse de la variance et de Tukey post hoc (taux de glucose) ou de la queue deux de Student t-test (inverse AUC). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1. Liste de vérification pour la préparation de l’expérimentation. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaires Figure 2. Taux d’insuline pendant ITTs. Insulinémie niveaux au cours de l’AO dans le LFD-nourri contre les groupes HFD-fed a montré dynamique similaire à l’insuline plasmatique après injection d’insuline chez les deux groupes. Comme prévu, les souris HFD présentaient des niveaux d’insuline basale fortement accrue par rapport au groupe témoin. En outre, l’augmentation du taux d’insuline chez les souris nourries HFD était plus forte, qui peut être partiellement causée par la surestimation de la masse corporelle maigre si la quantité d’insuline injectée est calculée en fonction de la masse du corps entier (l’approche conventionnelle de normalisation) interprété dans cette expérience. Cependant, la réponse de l’insuline a été altérée chez le groupe nourri HFD (insuffisante réduction du taux de glucose plasmatique), donc de nouvelles mettant l’accent sur l’état de résistants à l’insuline chez ces animaux. Les résultats sont moyenne ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. L’analyse statistique a effectué un test post hoc de variance et de Tukey. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Avec la forte prévalence du diabète et des maladies associées à la population mondiale, il y a une exigence forte pour une recherche portant sur le mécanisme moléculaire, prévention et traitement de la maladie,19. Le protocole présenté décrit des méthodes bien établies pour la génération de souris HFD, un modèle animal robuste utilisé pour les recherches métaboliques, ainsi que la conduction de l’HGPO et ITT, qui sont des outils puissants pour l’évaluation des modifications métaboliques confiné comme la résistance à l’insuline. Les méthodes présentées dans cet article peuvent être utiles d’étudier le rôle des gènes présumés, les facteurs environnementaux ainsi que des thérapies pharmacologiques, alimentaires, physiques ou génétiques sur tout le corps-le métabolisme du glucose9,10. Alors que le glucose est le principal stimulus pour la sécrétion d’insuline dans une HGPO, le protocole présenté peut être modifié par (co-) application d’autres substances comme les autres macronutriments et les hormones qui sont connus pour modifier la réponse de l’insuline2. De même, le protocole d’ITT peut-être être modifié par l’application (co-) d’autres substances (par exemple, glucagon ou catécholamines) selon la question de recherche individuelles. Les principaux afficheurs des protocoles décrits HGPO et ITT sont des concentrations de glucose et d’insuline de sang ; Toutefois, la mesure d’autres paramètres sanguins tels que le glucagon, acides gras et des niveaux de lipoprotéines, ainsi que de différents marqueurs métaboliques au niveau de l’ARNm et protéines peut être également utile en fonction de l’objectif de l’étude.

Les enquêteurs doivent être conscients que les réponses neuro-endocrines à l’hypoglycémie, la sécrétion d’insuline, action de l’insuline ainsi que le phénotype métabolique général dépendent fortement du bagage génétique de la souris10. Ici, nous avons utilisé des souris dans le bagage génétique de C57BL/6J comme un modèle HFD-induite de diabète, de qui ont une déficience partielle dans la sécrétion d’insuline induite par le glucose en raison d’une naturellement délétion du gène de la nicotinamide nucléotides transhydrogénase 20, ce qui les rend un modèle approprié pour l’étude de l’obésité lié l’insuline résistance8,9. Les protocoles décrits ici mai cependant aussi être utilisé pour caractériser métaboliquement modèles souris alternative de l’insulinorésistance et le diabète, qui s’appuient généralement sur des maladies monogéniques ou sur la destruction chimique des cellules β21, 22 , 23. précautions lors de la conception expérimentale comprennent les tests souris appariés selon l’âge, comme l’insuline sensibilité diminue avec l’âge24et à la suite d’effectuer des expériences chez des souris de même sexe. Comme les traitements et les mutations génétiques peuvent causer des phénotypes différents selon le sexe25,26, il peut également être conseillé pour enquêter sur les deux sexes séparément les uns des autres.

La méthode de prélèvement de sang décrite dans le présent protocole ne nécessite pas d’anesthésie, qui peut-être influer sur la fréquence cardiaque, la circulation sanguine et le métabolisme du glucose, ce qui donne des résultats non physiologiques10. Sinon, un cathéter artériel peut être implanté, qui permet un échantillonnage vasculaire sans le stress de manipulation pendant l’expérience, mais ajoute également les efforts, les coûts ainsi que le risque de perte de l’animal à l’expérience. Pour l’HGPO, souris sont généralement soumis à un jeûne pendant la nuit (14-18 h), qui provoque un état catabolique chez la souris, appauvrissant fortement les réserves de glycogène hépatique. Bien que cela réduit la variabilité des taux de glucose sanguin de base, le jeûne prolongé diminue le taux de métabolisme et améliore l’utilisation du glucose chez les souris, qui contraste avec la situation dans les humains10,27. Comme les modes d’alimentation chez la souris imiter aussi pas de comportement humain, il peut être ainsi plus physiologique pour effectuer une HGPO après un jeûne court. Comme les rythmes circadiens ont un fort effet sur le métabolisme de glucose systémique28, il est important d’examiner à quel moment de la journée les expériences décrites ici sont effectuées. Afin d’étudier le métabolisme des souris au cours de leur période active (la phase obscure), un cycle lumière-obscurité inversé peut être utile pour générer plus de résultats physiologiques.

La voie décrite d’administration peut également varier selon l’hypothèse spécifique mis à l’essai. L’administration orale de glucose pendant un test de tolérance au glucose conduit à la sécrétion d’insuline plus variable, comme la vidange gastrique, motilité gastro-intestinale, hormones (incrétines) et entrée neurale modifier et prolongent la réponse de l’insuline2, 10. au cours du puits décrit « effet incrétine », l’absorption du glucose dans l’intestin conduit à la libération des hormones gastro-intestinales comme le GLP1, qui potentialise l’insuline orale de glucose sous format sortie29. Pour contourner ces effets, un bolus de glucose peut également être administré par voie intraveineuse (IVGTT) ou par voie intrapéritonéale (HPI). Excursions de glucose et d’insuline diffèrent significativement selon l’itinéraire de livraison choisi. Par rapport à l’HGPO, une injection intrapéritonéale de glucose conduit à un pic accru et prolongé de la glycémie à jeun, alors que l’insuline plasmatique augmente dans un retard, mais de façon soutenue plus30. De même, l’administration intraveineuse de glucose se caractérise par une réponse de l’insuline retard31. Les fortes hausses dans les taux d’insuline ainsi que des données plus robustes de AUC-insuline obtenues au cours de l’HGPO suggèrent que l’administration orale de glucose peut être plus sensible pour détecter les modifications du métabolisme du glucose en nourris par rapport aux souris nourries HFD30, 31. livraison fois intragastrique et intrapéritonéale sont similaires en termes de gravité pour la difficulté technique et animale, tandis que l’administration intraveineuse est généralement plus difficile mais aussi plus stressante pour les souris32. Administration orale plus élimine le taux de 10 à 20 % d’erreur lors des injections intrapéritonéales dans la lumière intestinale ou de l’estomac, ce qui peut affecter le taux de glucose livraison et redistribution33,34.

Bien qu’il soit l’itinéraire plus physiologique de la livraison de glucose, l’HGPO est limitée en comptabilité pour seulement absorption de glucose, alors qu’un repas complet contient également des protéines, glucides, graisses, fibres et micronutriments. Au cours de l’HGPO, la norme consiste à baser la dose de glucose sur le poids du corps de la souris, tandis que généralement 1 à 3 g de glucose/kg de poids corporel sont administrés35,36. Dans certains cas, un chargement de glucose supérieur à 1g/kg peut être nécessaire de révéler une intolérance au glucose tolérance30. De nombreux modèles de souris de l’obésité et le diabète sont caractérisés par des modifications de la composition corporelle, notamment une augmentation massive de la masse grasse, tandis que la masse maigre (muscles, cerveau et le foie), qui est le principal site d’élimination de glucose ne change pas proportionnellement. L’approche conventionnelle de normalisation du poids corporel entraîne donc une dose proportionnellement plus élevée de glucose auquel est exposée la masse maigre chez une souris obèse par rapport à la souris non-obèses. Ce biais augmente avec un dose de glucose supérieur30. Donc, optimale la dose de glucose (HGPO) ainsi que l’insuline (ITT) devrait être calculée en fonction sur la masse maigre, si les données de composition de corps sont disponibles37. Si l’évaluation de la composition corporelle n’est pas possible en raison de limitations techniques, le dosage doit être effectué selon le poids du corps (la Figure 2), tout en appliquant une dose fixe, comme dans une HGPO humaine doit être le dernier recours, si effectuer ces tests dans la souris10,35,36. Dans le protocole présenté, un moniteur portatif de sang a été utilisé pour mesurer la glycémie, qui est avantageux dans des épreuves comme une HGPO et ITT qui nécessitent plusieurs prélèvements des volumes sanguins petit. Toutefois, ces appareils sont conçus pour le sang humain, ayant une portée dynamique réduite. Alternativement, le glucose des niveaux peuvent être mesurées dans les échantillons de plasma collectée, par exemple, par entièrement automatisé analyseurs dans les laboratoires de routine. En plus de l’insuline, peptide C peut être mesurée dans les protocoles décrits comme un indicateur plus direct de la fonction sécrétrice de cellules β, qui n’est pas extrait par le foie, contrairement à l’insuline38,,39. Si gluconéogenèse doit être évaluée, l’épreuve d’hyperglycémie provoquée pyruvate (PTT) peut être appliquée, qui est une autre variante des protocoles décrits ICIS, surveillance glycémique excursions après l’administration d’un bolus de pyruvate40.

Souvent, les approches décrites ICIS de l’HGPO et ITT peuvent expliquer les différences observées dans la tolérance au glucose et peut servir davantage à penser Quelles expériences ultérieures, plus sophistiquées se dérouleront ensuite (p. ex., pinces hyperglycémiques ou études sur les îlots isolés). En résumé, nous présentons un protocole simple pour la génération d’un modèle de souris induite par le SIH et décrire plus l’HGPO et ITT, qui sont de puissants outils pour évaluer les modifications du phénotype métabolique in vivo et peut être utile d’étudier mécanismes de maladies associées au métabolisme ainsi que de nouvelles approches thérapeutiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par le Fonds scientifique médicale du maire de la ville de Vienne et de la Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse strain: C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer Roche 6870228 OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips Roche 6454038 OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769 OGTT
Actrapid - Insulin Novo Nordisk 417642 ITT
Reusable Feeding Needles Fine Science Tools #18061-22 OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes Braun 9161406V OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) Braun 304000 ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)   Braun 4657705 ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible Braintree Scientific, Inc. SP0016 OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit Crystam Chem 90080 OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat Research Diets Inc D12492 mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat. Research Diets Inc D12450B mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary Sigma-Aldrich BR749321 OGTT/ITT
Vaseline - creme Riviera P1768677 OGTT/ITT

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Étude <em>In Vivo</em> du métabolisme du Glucose à haute teneur en graisses régime chez les souris nourries avec épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) et Test de tolérance à l’insuline (ITT)
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Nagy, C., Einwallner, E. Study of… More

Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). J. Vis. Exp. (131), e56672, doi:10.3791/56672 (2018).

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