Summary
המאמר הנוכחי מתאר את הדור ואת מטבולית איפיון של עכברים-fed דיאטה עתירת שומן כמודל של עמידות לאינסולין הנוצרות על-ידי תזונה והשמנה. עוד כולל פרוטוקולים מפורט לביצוע הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה ואת הבדיקה עמידות אינסולין, מעקב אחר שינויים לכל הגוף של גלוקוז חילוף החומרים ויוו.
Abstract
השמנת יתר מייצג את גורם הסיכון יחיד הכי חשוב בפתוגנזה של סוכרת מסוג 2, מחלה המתאפיינת התנגדות ספיגת הגלוקוז האינסולין, על ההחרפה ברוטו של מטבוליזם הגלוקוז מערכתית. למרות התקדמות ניכרת בהבנת מטבוליזם הגלוקוז, המנגנון המולקולרי של רגולציה שלה על בריאות ומחלה נשארים תחת-חקר, ואילו רומן גישות כדי למנוע ולטפל סוכרת נחוצים בדחיפות. דיאטה גלוקוז נגזר מעוררת הפרשת אינסולין, אשר משמש הרגולטור הראשי של התהליכים האנאבוליים הסלולר במהלך המדינה האכילו ובכך מאזן את רמת הסוכר בדם הלבלב רמות כדי לשמור על מצב האנרגיה מערכתית. האכלת מפעילים מטא-דלקת כרונית, מה שמוביל שינויים בהיקפי אינסולין. הקשורים קולטן איתות, ובכך מפחיתה את הרגישות וחיסול בתיווך אינסולין הגלוקוז. אירועים אלה בסופו של דבר לגרום גלוקוז בצום גבוהות, רמות האינסולין, כמו גם הפחתה גלוקוזה, אשר בתורו לשמש האינדיקטורים החשובים של תנגודת לאינסולין. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להפוך את הדור מטבולית איפיון תזונה עתירת שומן (HFD)-נמאס עכברים כמודל בשימוש תכוף של דיאטה-induced תנגודת לאינסולין. אנו מדגימים בפירוט את המבחן סובלנות גלוקוז דרך הפה (OGTT), אשר עוקב אחר לרשות היקפיים של הפרשת עומס, אינסולין גלוקוז אוראלית לאורך זמן. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבדיקה עמידות אינסולין (ITT) לעקוב אחר פעילות לכל הגוף לאינסולין. יחד, שיטות אלה ושימושיהם במורד הזרם מייצגים כלים רבי-עוצמה כדי לאפיין את פנוטיפ מטבולי כללי של עכברים גם לגבי במיוחד להעריך שינויים בחילוף החומרים של גלוקוז. הם עשויים להיות שימושית במיוחד בתחום מחקרית רחבה של תנגודת לאינסולין, סוכרת והשמנה לספק הבנה טובה יותר של פתוגנזה גם כדי לבחון את ההשפעה של התערבויות טיפוליות.
Introduction
בעולם המפותח, השמנת יתר, סוכרת הגיעו ממדי מגפה עקב חוסר פעילות גופנית, צריכת עודף של מזון מעובד, תופעות אשר מונעים על ידי עיור מהיר, תיעוש, כמו גם הגלובליזציה. למרות מחקר על עמידות לאינסולין ועל זה morbidities משותף, כגון היפרליפידמיה, טרשת עורקים, צברה לגדולה במהלך העשורים האחרונים, המנגנונים הביולוגיים מורכבים אשר לווסת את חילוף החומרים על בריאות ומחלה נשארים שהיישום מובן עדיין קיים צורך דחוף הקדמה חדשה למנוע ולטפל במחלות אלה1.
אינסולין, גלוקגון הורמון counter-regulatory זה לשמש הרגולטורים העיקריים של האנרגיה התאית אספקת חומר מזין ואיזון, וכך גם שמירה על ריכוזי גלוקוז נאותה דם מערכתית2. גלוקוז עצמה פועלת כאחת תכשירים הראשי הפרשת האינסולין על ידי תאי β בלבלב, בעוד אחרים macronutrients, גורמים ההורמונאלית וכן לקלט העצבי עוד יותר לשנות תגובה זו. אינסולין וכתוצאה מכך מפעיל את התהליכים האנאבוליים של המדינה מוזן על ידי הקלת פעפוע של עודפי הסוכר לתוך שריר, תאי שומן נוסף מפעיל גליקוליזה וכן חלבון או חומצות סינתזה, בהתאמה. בנוסף, אינסולין הסתרת פלט גלוקוז בכבד על ידי עיכוב גלוקונאוגנזה. צריכת אנרגיה עודף כרוני ודלקת meta להוביל hyperinsulinemia ו היקפית לאינסולין בשל למטה-ויסות לביטוי קולטן לאינסולין, כמו גם שינויים איתות המסלולים במורד הזרם, ובעקבותיה לקוי רגישות גלוקוז בתיווך האינסולין לרשותו וכן עיכוב לא מספיקות של גלוקוז בכבד ייצור3,4,5,6.
מגוון רחב של מודלים עם אינדוקציה גנטי, תזונתי או ניסיוני של מחלת הוכחו להיות כלי מצוין כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תנגודת לאינסולין ואת צורות שונות של סוכרת, כמו גם מחלות הנלוות שלה7 . דוגמה הוא הדגם בשימוש נרחב וותיקה HFD-induced העכבר, אשר מאופיין על ידי עלייה מהירה במשקל עקב תזונה מוגברת בשילוב עם מופחתת יעילות מטבולית, וכתוצאה מכך אינסולין התנגדות8, 9. הן בבעלי חיים ובבני אדם, ובחרמון צום גלוקוז, אינסולין ברמות בדם, כמו גם סובלנות לקוי גלוקוז למינהל הם אינדיקטורים בשימוש תכוף של תנגודת לאינסולין והשינויים מערכתית אחרים של גלוקוז חילוף החומרים. ניטור גלוקוז, אינסולין רמות בדם המדינה הבזליים או לאחר גירוי ולכן הם המפרט נגיש בקלות.
בפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של עכברים HFD-fed, כמו גם שתי שיטות נפוצות, הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה (OGTT) ואת הבדיקה עמידות לאינסולין (ITT), אשר שימושיים כדי לאפיין את פנוטיפ מטבולית וכדי לחקור שינויים בחילוף החומרים של גלוקוז. אנו מתארים את OGTT בפירוט, הבודק לרשות הפרשת עומס, אינסולין גלוקוז אוראלית לאורך זמן. יתר על כן, אנו מספקים ההוראות כיצד לנהל את ITT לחקור לכל הגוף לאינסולין-פעולה על-ידי ניטור ריכוז הגלוקוז בדם בתגובה סיילין של אינסולין. הפרוטוקולים המתוארות במאמר זה ומבוססת, נעשה שימוש במספר מחקרים10,11,12. בנוסף שינויים קלים אשר עשוי לסייע להגביר הצלחה, אנו מספקים הנחיות תכנון ניסויים, ניתוח נתונים, כמו גם עצות שימושיות להימנע ממלכודות הפוטנציאל. הפרוטוקולים המפורטים להלן יכולים להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור את ההשפעה של גורמים סביבתיים גנטי תרופתי, תזונתיים, אחרים על חילוף החומרים של הגלוקוז בגוף כל ועל הפרעות המשויכת שלו כמו תנגודת לאינסולין. בנוסף גירוי עם גלוקוז או אינסולין, מגוון רחב של תרכובות אחרות עשוי לשמש לגירוי בהתאם למטרת מחקר אישיים. למרות מחוץ הטווח של כתב יד זה, יישומים רבים אחרים במורד הזרם ניתן לבצע את דגימות הדם נמשך, כגון הניתוח של דם ערכים שאינם גלוקוז, אינסולין (למשל, שומנים בדם, כולסטרול # ליפופרוטאינים פרופילי) כמו גם נתונים היסטוריים ניתוח של סמנים מטבוליים (למשל, על ידי בזמן אמת כמותיים פולימראז תגובת שרשרת (PCR), ניתוח תספיג Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (אליסה)). בהמשך flow cytometry, קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) ניתן להחיל לחקור את ההשפעות אוכלוסיות נפרדות תא בודד, בעוד transcriptomic פרוטיאומיה מבנית, גישות metabolomic עשוי גם להיות מנוצל עבור ניתוח untargeted.
בסך הכל, אנו מספקים פרוטוקול פשוט כדי ליצור מודל HFD-induced העכבר, בעוד נוסף המתאר שתי גישות עוצמה ללמוד שינויים מטבוליים לכל הגוף, את OGTT, ITT, אשר יכול להיות כלים שימושיים ללימוד בפתוגנזה של המחלה, פיתוח טיפולים חדשים, בעיקר בתחום של חילוף החומרים-הקשורים למחלות כמו תנגודת לאינסולין & סוכרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן מאושר על ידי חיה אכפת ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת וינה רפואי, שנערכו לפי הפדרציה של אירופה מעבדה חיה המדע שיוכי (FELASA). אנא שימו לב כי כל ההליכים המתוארים פרוטוקול זה רק לבצע לאחר אישור מוסדי וממשלתיים, כמו גם על ידי צוות כי הם בקיאים טכנית.
1. HFD-fed עכברים
הערה: לשמור על כל C57BL/6J עכברים על מחזור/כהה 12 שעות ביממה עם גישה חופשית מזון ומים.
- בגיל 6 שבועות, במקום עכברים במשך 8-12 שבועות על HFD (40-60% שומן קלוריות) כדי לגרום להשמנה, בזמן האכלה קבוצת הביקורת רזה דיאטה דלת שומן (LFD) (10% שומן קלוריות).
- לקבוע את משקל הגוף של העכברים על בסיס שבועי. עקומות משקל צריך להראות דפוסים דומים בשתי הקבוצות, עם מדרון גבוהה יותר בקבוצה הניזונה HFD.
2. OGTT
הערה: אם נקודות זמן דגימה דם נבחרו במהלך OGTT כל 15 דקות, הניסוי צריכה להתבצע עם מקסימום של 15 עכברים במקביל, על מנת לקבל לפחות 1 דקות טיפול-זמן לכל העכבר.
- ההכנות ביום שלפני OGTT
- להעביר את העכברים לתוך כלוב עם מצעים טרי ומהר אותם לילה לפני בדיקות (14 h), תוך הבטחת כי העכברים יש גישה למי שתייה (למשללהסיר את האוכל בשעה 6 בערב במשך זמן התחלה למחרת בבוקר בשעה 8 בבוקר).
הערה: צום עכברים הוא הגישה רגיל, בין לילה אולם מהיר יותר קצר (5-6 h) הוא יותר פיזיולוגית עבור עכברים (לפרטים, ראה דיון ).
- להעביר את העכברים לתוך כלוב עם מצעים טרי ומהר אותם לילה לפני בדיקות (14 h), תוך הבטחת כי העכברים יש גישה למי שתייה (למשללהסיר את האוכל בשעה 6 בערב במשך זמן התחלה למחרת בבוקר בשעה 8 בבוקר).
- ההכנות ביום של הניסוי (אך לפני הניסוי)
- הכינו 10 מ"ל של תמיסת גלוקוז 20% (להמיס D-(+)-גלוקוז במים מזוקקים).
הערה: כל ריאגנטים המנוהלים החיות חייב להיות תרופתי כיתה וסטרילי. - להכין צלחת 96-ובכן האוסף פלזמה, על ידי מילוי טוב אחד על כל נקודת זמן הדגימה ועכבר כל, עם 5 µL NaEDTA (0.5 M EDTA, pH 8.0 ב- 0.9% NaCl, אחסון ב- RT). במהלך הניסוי, לאחסן את הצלחת הזו על קרח.
הערה: ראה איור 1 משלים עבור רשימה מפורטת.
- הכינו 10 מ"ל של תמיסת גלוקוז 20% (להמיס D-(+)-גלוקוז במים מזוקקים).
- למדוד את משקל הגוף של עכברים כל ולסמן הזנבות שלהם עם סמן קבוע על מנת להפוך עכברים בקלות ניתן להבחנה (למשל, העכבר 1 = 1 מקף, מקפים העכבר 2 = 2, וכו ').
- גלוקוז מדידה ודגימה הדם (איור 2)
- בזהירות לחתוך 1-2 מ מ של קצה הזנב באמצעות מספריים חדות ("חלופה א' באיור2). תמיד לנגב את טיפת הדם כדי למנוע המוליזה או זיהום בנוזל רקמות לפני לקיחת דגימות דם חדש עבור קביעת גלוקוז הדם הראשונה. להוציא דגימת דם קטנים (µL ~ 3) לשקילת הבזליים רמת הסוכר בדם (= נקודת זמן 0) עם סוכר.
התראה: לבדוק ולהתאים מספר תשלום לבדוק רצועות על סוכר.
הערה: כמו שיטת דגימה דם אלטרנטיביים, ניק את וריד הזנב לרוחב של עכבר עם להב סכין חדה (Variant B" באיור2). תקחי את הזנב לרוחב מתבצעת בדרך כלל כשליש לאורכו של הזנב מקצה הזנב, נע לכיוון הבסיס של הזנב לדוגמאות מרובים. השימוש בקרם הרדמה מקומית מומלצת. לעצור את זרימת הדם על ידי הפעלת לחץ אצבע על הרקמות הרכות לפחות 30 s לפני החיה מוחזר לכלוב שלו. - לאסוף דגימת דם (כ-30 µL) באמצעות צינור קפילרי טריים (שמור את הציר האופקי צינור קפילרי). רוקן את צינור קפילרי באמצעות פיפטה על ידי לשים את הטיפ פיפטה בחלק העליון של צינור קפילרי הסוף על בקפידה דוחפים את הדם שנאספו לבאר של צלחת 96-ובכן, תוך הימנעות בועות אוויר. חזור על הליך זה עבור כל העכברים - אחד בכל פעם.
הערה: חלופה עבור איסוף דם דרך צינור קפילרי, להשתמש פיפטה התרגלו האחסון הנכון (למשל, 30 µL) לאיסוף דם, או לאסוף את טיפת דם לכיוון הזנב על הסרט פרפין, ו pipet זה לתוך הפתרון-EDTA. אך ורק למנוע המגע של וזלין עם רצועות בדיקת דם או סוכר, כמו זה עשוי להשפיע עוקבות מדדים גלוקוז, אינסולין.
התראה: OGTT זה מלחיץ מאוד עבור עכברים: עכברים רזה יכול לאבד כ 15% ממשקל גופם במהלך מהיר לילה. בנוסף, לקיחת דמים בנקודות זמן שונות מוביל לאובדן משמעותי של דם. עבור דגימה דם קל יותר, זה אפשרי לעסות היטב את mouse-tail עם וזלין.
הערה: המוסדיים הנחיות עשוי להגביל את כמות הדם שנאספו בתוך תקופת מוגדרת המותר. הדגימה ואמצעי timepoints צריך להיות מותאם לא תעלה על ערכים מרביים מותרים. משקל הגוף של העכברים יש להשתמש כדי לחשב את הסכום הכולל דם נסיגה מותרת.
- בזהירות לחתוך 1-2 מ מ של קצה הזנב באמצעות מספריים חדות ("חלופה א' באיור2). תמיד לנגב את טיפת הדם כדי למנוע המוליזה או זיהום בנוזל רקמות לפני לקיחת דגימות דם חדש עבור קביעת גלוקוז הדם הראשונה. להוציא דגימת דם קטנים (µL ~ 3) לשקילת הבזליים רמת הסוכר בדם (= נקודת זמן 0) עם סוכר.
- חישוב נפח תמיסת גלוקוז מבוסס על משקל הגוף (1 גרם גלוקוז/ק"ג משקל גוף; הזה יכול להיות מוגברת עד 3 g/kg) נדרש להיות מנוהל על ידי אוראלי gavage עבור כל עכבר. לדוגמה, עם משקל הגוף של 30 g העכבר צריך 150 µL של גלוקוז 20% פתרון לניהול 30 מ"ג של גלוקוז.
הערה: כדי לבסס את המינון של גלוקוז על המשקל של העכבר זה הליך רגיל. אם גוף הרכב נתונים זמינים, המינון של גלוקוז עבור OGTT יש לחשב על בסיס לין מסת הגוף (לפרטים, ראה דיון ). - ניהול גלוקוז
- להכין כל מה נדרש במהלך הניסוי כולו מראש (טיימר, גיליון הרשומה ניסוי, מזרקים צג, רצועות, נימים, גלוקוז, תמיסת גלוקוז, צלחת 96-ובכן, אזמל, מחשבון, איזון, בטוש, ספסל ניירות, פיפטה עם טיפ, כפפות).
- ליישום גלוקוז, לרסן את העכבר על-ידי בחוזקה אוחז אותו יתלה. חלות מספיק מוצקות העור סביב הצוואר כדי למנוע פיתול מגבילות העכבר וכדי כראוי הטה את ראשו לאחור. גם להבטיח כי העכבר יכול לנשום כמו שצריך.
הערה: לאחר ניהול גלוקוז מופעל, ניהול זמן טוב חשוב מאוד. - בזהירות לנהל את תמיסת גלוקוז (מבוסס על שלב 2.5) ישירות לתוך הקיבה באמצעות מחט האכלה. בזהירות לכוון את המחט האכלה דרך הפה לכיוון הוושט. לאפשר את העכבר כדי לבלוע את המחט: המחט לחלוטין שוקעת לתוך הוושט התחתון/הקיבה של העכבר. להזריק את תמיסת גלוקוז (איור 3 א).
- אם התנגדות כלשהי, או אם החיה נאבק באופן מיידי, לשלוף את המחט ולמקם אותו מחדש. להתחיל את הטיימר מיד לאחר gavage הראשונה ולפקח גלוקוז כל לעכברים אחרים במרווחים 1 דקות.
הערה: זה עשוי להיות שימושי להחיל טיפת תמיסת גלוקוז ישירות מן המחט האכלה על הפה של העכבר, אשר יגרה מלקקת, בבליעה, ובכך להקל על החדרת המחט האכלה קל יותר. אל תחיל לחץ בעת החדרת המחט האכלה כמו זה עלול לפצוע את החיה.
- אם התנגדות כלשהי, או אם החיה נאבק באופן מיידי, לשלוף את המחט ולמקם אותו מחדש. להתחיל את הטיימר מיד לאחר gavage הראשונה ולפקח גלוקוז כל לעכברים אחרים במרווחים 1 דקות.
- לאחר 15 דקות, למדוד את רמות הגלוקוז בדם עם סוכר, בנוסף לקחת דגימות דם (µL ~ 30) (כפי שמתואר פרט בשלב 2.4) של העכבר בכל באותו סדר כפי שהם היו מזריקים.
הערה: ניהול זמן הוא מאוד חשוב; בצע כמו צמוד ככל האפשר באמצעות ממרווחי הזמן אותו באשר gavage. תן העכברים לנוע באופן חופשי ככל האפשר, מגבלת הרחקה למינימום במהלך כל התהליך כדי להפחית את הלחץ, אשר עשויים לשנות את התוצאות. חלב הזנב עם יד אחת ולאסוף את הדם עם האחר. - חזור על שלב 2.7 בנקודות זמן נבחר בהתאם התוצאות הצפויות (למשל, ב 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 דקות לאחר ניהול גלוקוז). אם נקודות זמן נבחר הן יותר מ 120 דקות, ודא כי העכברים יש גישה למי שתייה. ודא כי העכברים יש תמיד גישה למי שתייה. לאחר סיום הניסוי, להחזיר את העכברים לכלובים הביתה מצוידים עם מים ואוכל.
התראה: OGTT זה מתיש מאוד עבור העכברים לכן לחכות לפחות שבוע אחד לפני ביצוע המבדק מטבולית הבאה, כגון ITT - לאחר הניסוי, צנטריפוגה דגימות דם-2,500 x g, 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס. להעביר את תגובת שיקוע (פלזמה) לרוקן בארות של הצלחת ולאחסן אותו ב-20 ° C עד הניתוח.
- להקליט המוליזה של דגימות אם קיים (ראה סעיף 3).
- לקבוע רמות אינסולין פלזמה באמצעות אליסה זמינים מסחרית של קיט (ראה את הטבלה של חומרים) בעקבות הוראות היצרן של הערכה.
הערה: בהתאם למצב צום וגם על חילוף החומרים של העכברים ובדוקים, קשיים במהלך assay זו עלולה להתרחש: רמות של אינסולין בצום לילה (נקודת זמן 0) קרובים מאוד נמוך, ולכן מגבלת זיהוי. כדי להימנע מבעיה זו, להכפיל את הכמות של נפח פלזמה מומלצת, בהתאם צונחים בחצי התוצאה של אליסה וזמינותו. מצד שני, אם עכברים להגיע לפסגה אינסולין במהלך OGTT, בעיקר בעכברים HFD-fed, רמות האינסולין עלול חורגת מהמגבלה של זיהוי: לדלל את הדגימה (למשל, 10-fold עם 0.9% NaCl) וחזור וזמינותו אליסה. המוליזה בדגימות הפלסמה עלול להוביל ההשפלה של אינסולין, וכתוצאה מכך ירידה של ערכי הבדיקה. ההשפלה תלוי זמן, טמפרטורה, ריכוז המוגלובין במדגם. תמיד לשמור דגימות hemolyzed קר או על קרח כדי להפחית אינסולין השפלה.
3. ITT
הערה: אמצעי הזהירות אותם תיאר עבור OGTT (טיפול של עכברים, דם, סוכר ושימוש וזלין) יש גם להחיל בעת ביצוע של ITT. לדוגמה, זריקות כל צריכה להתבצע בתוך 15 דקות במרווחים 1 דקות אם עכברים 15 נבדקים במקביל. עבור ITT, אוסף עוקבות של דגימות דם עם צינורות קפילר הוא אופציונלי.
- ההכנות לפני הניסוי
- מהר עכברים כבר לפחות שעתיים לפני הזרקת אינסולין, תוך הבטחת כי העכברים יש גישה למי שתייה (למשללהסיר מזון ב־8: 00, מבחן עכברים 2-5 שעות מאוחר יותר).
- לדלל אינסולין 1:1,000 ב- 0.9% NaCl (מניות: אינסולין U/mL 100; ריכוז בעבודה 0.1 U/mL) ולהכין 20% גלוקוז (D-(+)-תמיסת גלוקוז מומס מים מזוקקים) ינוהלו אם והעכברים הופכים מתת.
הערה: ITT מבוצעת בדרך כלל לאחר מהיר קצר כדי למנוע היפוגליקמיה אשר ייתכן אחרת מתרחשים בין לילה התענה חיות. ריאגנטים כל המנוהלים החיות חייב להיות תרופתי כיתה וסטרילי.
- מודדים את משקל גוף של עכברים, לסמן את הזנב, חותכים קצה הזנב באמצעות מספריים חדות, למדוד את רמות הגלוקוז בדם הבזליים כמתואר קודם לכן OGTT בשלב 2.4.
- הזרקת אינסולין
- כדי להזריק אינסולין intraperitoneally (0.75 U אינסולין/ק"ג משקל גוף, מחושב מראש), לרסן את העכבר בשיטת עורפה.
- השתמש רעננה, סטרילי 27 או 30 מד מחט עבור כל חיה למנוע אי נוחות, את הסיכון של זיהום כלשהו-ההזרקה.
הערה: עיקור של העור יכולים להאריך את משך הזמן של אינסולין המינהל, ובכך עלול לגרום הפרעות נוספות לחיה. לכן, לא מומלץ. - להטות את הראש העכבר מטה בזווית קלה כדי לחשוף את הצד הבטני של החיה. הצב מחט סטרילית עם שפוע, בזווית של 30 מעלות הרביע הימני. התחתון של הבטן של החיה (איור 3b). התחל את הטיימר מיד לאחר מוזרק העכבר הראשון.
הערה: במינון נמוך ITTs (0.1 U/kg) ניתן לבצע כדי להעריך באופן ספציפי את הרגישות לאינסולין בכבד. באשר OGTT, חישוב הנפח הזרקת מבוסס על משקל הגוף הוא הליך רגיל, בעוד מבסס את המינון על גוף רזה מסה היא עדיפה אם נתוני הרכב גוף הינם זמינים.
- למדוד את רמות הגלוקוז בדם בנקודות זמן נבחר (למשל, לאחר 15, 30, 45, 60, 90 דקות).
הערה: כמו אינסולין יש חצי-זמן קצר של ~ 10 דקות עכברים13, ההבדלים מאוחר לאחר ניהול אינסולין (למשל, לאחר 2 h) אינן משקפות בהכרח השפעה ישירה של פעילות האינסולין. להזריק תמיסת גלוקוז 20% למקרה עכבר הופך hypoglycemic (את רמות הגלוקוז בדם מתחת 35 מ"ג/ד"ל) נמצא בסיכון למות. - אחרי הפעם האחרונה נקודות, מקום העכברים בחזרה לתוך הכלובים הביתה מוכן עם שפע של מזון ומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מדגימה על לוח זמנים סכמטית phenotyping מטבולית של עכברים על דיאטות. בגיל כ- 6 שבועות, עכברים להניחה על HFD, בעוד קבוצת-LFD עשוי לשמש קבוצת הביקורת. חשוב, משקל הגוף צריך להיות נחוש מדי שבוע כדי לבחון אם יש עלייה במשקל הגוף הצפוי. כל סוג של לחץ (למשל, רעש או התנהגות תוקפנית זכר) יכולה להפריע עלייה במשקל הגוף, צריך לחסל מיד. כל קוהורטה של עכברים לניסויים דיאטה צריכה להכיל לפחות 10 עכברים כי הדיאטה-ניסויים אלו זמן רב, והם ליניאריים בתדירות גבוהה (למשל, עכברים לא צובר משקל או עכברים עם גלוקוז לא נורמלי או רמות האינסולין). לאחר תקופת זמן (בהתאם את השערת המחקר, נקודת זמן של שינויים צפויים) שנבחר, OGTT, ITT יכול להתבצע על ההערכה של פעולה סובלנות, אינסולין הגלוקוז. בנייר זה, נבחרו נקודות זמן מאוחר עבור הבדיקה מטבולית.
חשוב, צריך להיות זמן התאוששות לפחות שבוע אחד בין OGTT ITT כמו הניסויים להוביל דם ניכר-הפסד ובכך הם מלחיץ מאוד עבור עכברים. אם אמצעי האחסון איסוף הדם ירד (למשל, אם ביצוע של ITT ללא איסוף דם נוספים קודם), תקופת ההחלמה זו ייתכן גם מקוצר או מושמט, בקנה אחד עם הנחיות לקחת דם מרובים בעלי חיים14, 15,16,17.
במחקר גדול עם עכברים C57BL/6J 60 סה כ, מחצית העכברים היו להגדיר HFD או LFD בגיל של 6 שבועות (n = 30/קבוצה), עלייה במשקל הגוף היה במעקב במשך 16 שבועות בדיאטה. צריכת HFD הביאה לעלייה משמעותית במשקל הגוף כפי שמוצג באיור4. בגיל 6 שבועות, משקל הגוף היה g 20.2 בשתי הקבוצות. ואילו עכברים-LFD הראה עקבית, מעט הגדלת משקל הגוף (± 31.2 g 2.7) במהלך התקופה נצפתה, עכברים על HFD גדל ממשקל גופם במהירות, במיוחד במהלך השבועות הראשונים, להגיע מקסימום משקל הגוף שלהם לאחר 16 שבועות בדיאטה. למרות עקומות משקל הראו דפוס דומה במהלך הניסוי, העכברים של קבוצת HFD הגיעו של 1.5 - ל שתיים פי גבוה יותר משקל הגוף (44.4 g ± 4.0) לעומת העכברים LFD-fed.
כדי לחקור את ותפקיד מטבולית של שני גדודים, בוצעו OGTT (איור 5), ו ITT (איור 6). כמו נפח הדם מוגבל מכרסמים קטנים, assay (POC) בשלב של טיפול לבני סוכרתית (סוכר) נעשה שימוש כדי לנטר את רמות הגלוקוז בדם במהלך הניסויים phenotyping מטבולית. כפי שמתואר באיור2, המוניטורים הגלוקוז הדם קל לשימוש, צריך רק קטן טיפת דם, להציג את רמות הגלוקוז בדם תוך שניות לתיעוד. איור 5 מציג מהלך הזמן המוחלט גלוקוז (איור 5a–b), אינסולין מוחלטת (איור 5 c) רמות במהלך OGTT. באופן כללי, עכבר בריא עם גלוקוזה רגילה מראה לעליה מהירה האופיינית דם גלוקוז, שהגיע לשיאו 15-30 דקות לאחר האתגר גלוקוז.
ספיגת הגלוקוז עוקבות, בעיקר בניצוחו של שריר, שומן, רקמת הכבד מוביל ירידה הדרגתית של ריכוז הגלוקוז בדם. בניסויים כל, העכברים LFD-fed מוגש כחלק מקבוצת הביקורת סובלנית גלוקוז, לכן מילא את פרופיל מטבולי הצפוי: הפסגה של רמות הגלוקוז בדם ~ 240 מ"ג/ד"ל הגיעה כ 15 דקות לאחר ניהול גלוקוז, מיד ואחריו ירידה לכת רמות הבסיס כ 60 דקות לאחר האתגר גלוקוז, המציינת את חיסול גלוקוז נאותה. בניגוד חריף, HFD-עכברים לשיאה בכ ~ 320 מ"ג/ד"ל גלוקוז, הראה כמעט אין סילוק של גלוקוז, המציינת את ההתנגדות גלוקוז. כאשר רמות הגלוקוז בדם בין שתי הקבוצות כבר שונים במצב צום (כמו זה לדוגמא נציג), יש לבצע חישוב של השטח מתחת העקומה (AUC) מעל בסיס גלוקוז כדי לאמת את התוצאות (איור 5a– b).
בנוסף, רמות האינסולין במחזור הדם היו נחושים באמצעות בדיקת אינסולין-אליסה (איור 5 c) על מנת לספק מידע נוסף אודות פתופיזיולוגיה כבסיס במודל זה. ואילו רמות האינסולין היו כמעט ללא שינוי בקבוצת הביקורת, עכברים שקיבלו HFD הראה הקיפול מוגברות צום רמות לעומת קבוצת הביקורת, וכן תגובת אינסולין מוגבר מאוד, המציין HFD-induced היפראינסולינמיה הבולמוס כמו ניסיון לאזן את הסוכר ירד חיסול קיבולת, אשר עלולה להיגרם על ידי תנגודת לאינסולין. עם זאת, להיות מודע אל יתר לפרש את התוצאות של OGTT, בדיקה זו לא ישירות אינסולין פעולה והערכה צריך לשמש כדי להסיק הצהרות על עמידות לאינסולין.
כדי למדוד את הרגישות לאינסולין בעכברים HFD-fed, ITT בוצעה 1 שבוע לאחר OGTT (איור 6a). ב הזה assay, מידת כדי דם ריכוזי גלוקוז ליפול בעקבות אינסולין המינהל מייצגים את היעילות של הפעולה לכל הגוף לאינסולין. העכברים HFD-fed הראו הפחתת לקוי של רמות הגלוקוז בדם לעומת קבוצת הביקורת LFD-fed, בנקודות זמן כל במהלך ITT, שהציעה תנגודת לאינסולין. התוצאות ITT מוצגים בדרך כלל כמו מסלול הזמן של רמות הגלוקוז, אך בנוסף גם ההופכי שייתכן שיוצגו חאן אל מתחת הגלוקוז הבסיסית כפי שמתואר ב איור 6b. אם הקבוצות אשר משווים רמות הגלוקוז דומה בצום בדם שנקרא (וזה לא המקרה בניסוי זה), ניתן להציג את רמות הגלוקוז במהלך ITT גם כאחוז של גלוקוז הבזליים. כמו עכברים, תגובה counter-regulatory לאינסולין מופעל אם רמות הגלוקוז בדם יורדת מתחת ~ 80 מ"ג/ד"ל18: פגמים בתגובה counter-regulatory הזה במודל עכבר מסוים עלול להתפרש בטעות כשייך עלייה ברגישות לאינסולין. במהלך HFDs הבאים ניסויים פנוטיפי מטבולית, ליניאריים עלולה להתרחש בתדירות גבוהה. לא להיות כלולים עכברים אשר לא לקבל את המשקל על HFD, או אלה מציג גלוקוז בצום נורמלי ו/או רמות האינסולין הניתוח. עבור השניים האחרונים, מבחן חריג חשוד טעות ניתן לבצע עבור כל קבוצה ניסיונית בנפרד (למשל, מבחן גרובס)
במחקר זה, כדוגמה אנחנו הראה לפרש נתונים של ניסויים מטבולית ויוו, בוצעו על עכברים עם דיאטה-induced השמנת יתר, חוסר סובלנות גלוקוז לאינסולין ו אותם לעומת קבוצת הבקרה עם משקל גוף נורמלי. כצפוי, היה לקוי גלוקוזה היפראינסולינמיה בעכברים שמנים בקנה אחד עם תנגודת לאינסולין בהשוואה העכברים שליטה מתאימים לגיל; זו נחשפה באמצעות שיטות ומבוססת, אמין, זמן, תקציב-ידידותי, אשר קל יחסית לביצוע. הבדלים גלוקוזה, רמות האינסולין באותה מידה כמו הרגישות לאינסולין, אשר כולם מתקבלים על ידי שיטות הציג OGTT, ITT, יכול לעיתים קרובות לעזור לתכנן את הצעדים הבאים של מחקר, אשר עשויים לכלול ניסויים מתוחכמים יותר כגון hyperglycemic או hyperinsulinemic מלחציים, כמו גם ניסויים עם איים מבודדים הלבלב.
איור 1. לוח זמנים סכמטי של משטר דיאטה המוצע וחילוף ניסויים ויוו. על מנת לחקור את השפעות HFD. מטבולית בעכברים, החיות של קבוצת הניסוי ממוקמות על HFD כ- 6 שבועות של גיל, בעוד קבוצת הביקורת מקבל LFD של. משקל הגוף של העכברים צריכים להיקבע על בסיס שבועי כדי להעריך את במשקל תקין. לאחר כ-12 שבועות בדיאטה (או נקודת זמן נבחר בהתאם השערת המחקר), פנוטיפ מטבולית של העכברים מוערך על-ידי OGTT ואחריו 1 בשבוע של זמן ההחלמה ובעקבות כך של ITT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. שיטות דגימה דם במהלך הניסויים מטבולית. עבור OGTT גם לגבי ITT, שבו נדרשת לקיחת דמים חוזרים ונשנים, אנו ממליצים על ציור דם דרך בזהירות לחתוך חתיכה 1-2 מ מ של קצה הזנב עם מספריים חדות (Variant א), ואחריו הקביעה של רמות הגלוקוז בדם עם סוכר ו עוד אוסף של דם עם נימי כדי לקבוע רמות האינסולין וערכי דם רלוונטיים אחרים. לחלופין, ייתכן גם לטעום דם דרך הווריד של הזנב (Variant B) או על ידי צנתור עורקי (לא מוצג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. Gavage שבעל-פה של גלוקוז (א) והזרקת אינסולין בקרום הבטן (ב). תמונות נציג מינהל גלוקוז דרך הפה באמצעות מחט האכלה במהלך OGTT () ובקרום הבטן הזרקה של אינסולין במהלך ITT (b). ראה פרוטוקול לתיאור מפורט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. גוף במשקל של עכברים C57BL/6J HFD-fed, הניזונה LFD. C57BL/6J עכברים היו אחת מהערכות 60% HFD, או 10% LFD לשמש פקד, במשך תקופה של 20 שבועות. ואילו עכברים על HFD הראה גידול צפוי במשקל הגוף, במיוחד בשבועות הראשונים בדיאטה, הניזונה LFD עכברים הראו משקל הגוף כמעט קבוע במהלך התקופה נצפתה. התוצאות הן זאת אומרת ± ב- SEM *p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. n = 30 לכל קבוצה. אנובה ובדיקה של Tukey פוסט הוק שימשו כדי לבדוק את ההבדלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. OGTT שבוצעו בבעלי C57BL/6J HFD-fed, הניזונה LFD. () גלוקוז רמות במהלך OGTT. לאחר מהיר לילה, נמדדו רמות הגלוקוז (מ"ג/ד"ל) בתוך המדינה צום, 15, 30, 45 ו- 60 דקות לאחר מתן תמיסת גלוקוז בבליעה דרך gavage (גלוקוז 1 g/ק ג). רמות הגלוקוז HFD-קבוצה היו גבוהות במדינה בצום וגם לאחר אתגר גלוקוז. העלייה הגיעה לשיא אחרי 15 דקות אחרי על ידי עיכוב של ואיטי ירידה. התוצאות הן זאת אומרת ± ב- SEM *p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. n = 30 לכל קבוצה. ניתוח סטטיסטי בוצעה באמצעות פוסט הוק מבחן ANOVA, של Tukey. (b) גלוקוז השטח מתחת לעקומה (AUC) במהלך OGTT. כדי לחשב הבסיס מתוקן חאן אל, רמות הגלוקוז הבזליים (נקודת זמן 0) היו המופחת מאוחר השיג את רמות הגלוקוז בדם עבור כל עכבר בנפרד, ואחריו את החישוב של AUCs בודדים. חאן אל מעל הגלוקוז הבסיסית ממחיש את ההתנגדות גלוקוז בעכברים HFD-fed. ניתוח סטטיסטי התבצע בעזרת ANOVA, של Tukey פוסט הוק המבחן (רמות גלוקוז) או של תלמיד שני זנב t-test (AUC). (ג) רמות אינסולין במהלך OGTT. רמות האינסולין (ng/mL) נמדדו לאחר תקופת צום של 4 שעות ו- 15, 30 ו- 60 דקות לאחר מתן תמיסת גלוקוז בבליעה דרך gavage (גלוקוז 1 g/ק ג). HFD-fed עכברים לא רק פיצוי כספי בעבור הזריקה גלוקוז עם עלייה גבוהה יותר ברמות האינסולין בדם, הם גם התחיל והסתיים OGTT את רמות האינסולין גבוהות לעומת קבוצת הביקורת. התוצאות הן זאת אומרת ± ב- SEM *p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. n = 30 לכל קבוצה. ניתוח סטטיסטי בוצעה באמצעות פוסט הוק מבחן ANOVA, של Tukey. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. ITTs שבוצעו בבעלי C57BL/6J HFD-fed, הניזונה LFD. () גלוקוז רמות במהלך ITT. רמות הגלוקוז (מ"ג/ד"ל) נמדדו ב מדינת צום, 15, 30, 45 ו- 60 דקות לאחר הזרקה של אינסולין intraperitoneally (0.75 U אינסולין/ק ג). במהלך ITT, הניזונה HFD עכברים הראו רמות גלוקוז גבוהות. רמות הגלוקוז בדם היו לא מספקת הנמיך בעכברים HFD-fed לאחר הזרקת אינסולין. התוצאות הן זאת אומרת ± ב- SEM *p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. n = 30 לכל קבוצה. ניתוח סטטיסטי בוצעה באמצעות פוסט הוק מבחן ANOVA, של Tukey. (b) גלוקוז השטח מתחת לעקומה (AUC) במהלך ITT. כדי לחשב את ההופכי המתוקן בסיסית חאן אל, רמות הגלוקוז הבזליים (נקודת זמן 0) היו המופחת כל רמות הגלוקוז בדם שהושג מאוחר יותר עבור כל עכבר בנפרד. הערכים היו הפוכות (כפל עם-1) ואחריו את החישוב של AUCs בודדים. כתוצאה מכך רמת הסוכר גבוה בעכברים HFD-fed במהלך OGTT, הבסיס תיקן את ההופכי שחאן היה נמוך בעכברים HFD-fed לעומת בקרת עכברים, אשר הציע הרגישות לאינסולין ירד עוד יותר. ניתוח סטטיסטי התבצע בעזרת ANOVA, של Tukey פוסט הוק המבחן (רמות גלוקוז) או של תלמיד שני זנב t-test (ההופכי חאן אל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1. רשימת פעולות לביצוע עבור ניסוי הכנה- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלים באיור 2. רמות האינסולין במהלך ITTs. רמות של פלזמה אינסולין במשך ITT ב- LFD-fed נגד הקבוצות HFD-fed הראו דינמיקה דומה פלזמה רמות האינסולין לאחר הזרקת אינסולין בשתי הקבוצות. כצפוי, העכברים HFD הפגינו רמות האינסולין הבזליים חריפה מוגבר לעומת קבוצת הביקורת. יתר על כן, עליית רמות האינסולין בעכברים HFD-fed היה חזק יותר, אשר ייתכן חלקית נגרם את מופרזת של מסת גוף רזה אם כמות האינסולין מוזרק מחושב בהתבסס על המסה לכל הגוף (הגישה המקובלת נורמליזציה) כפי שבוצע בניסוי זה. אולם, תגובת האינסולין היה לקוי בקבוצה הניזונה HFD (לא מספיקות הפחתה של רמות הגלוקוז פלזמה), ובכך נוספת תוך הדגשת המדינה עמידות לאינסולין בבעלי חיים אלה. התוצאות הן זאת אומרת ± ב- SEM *p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. ניתוח סטטיסטי בוצעה באמצעות פוסט הוק מבחן ANOVA, של Tukey. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם שכיחות גבוהה של סוכרת ומחלות המשויך באוכלוסיית העולם, יש דרישה חזקה למחקר פונה את המנגנון המולקולרי, מניעה וטיפול של מחלות19. פרוטוקול הציג מתאר שיטות ומבוססת על הדור של עכברים HFD, מודל בעלי חיים חזקים בשימוש עבור מחקר מטבולית, כמו גם את הולכה של OGTT, ITT, אשר הם כלי חזק ההערכה של שינויים מטבוליים לכל הגוף כגון עמידות לאינסולין. השיטות הציג נייר זה עשוי להיות שימושי ללמוד את התפקיד של גנים חשודים, גורמים סביבתיים, כמו גם טיפולי תרופתי, תזונתיים, פיזי או גנטיות על כל הגוף גלוקוז-מטבוליזם9,10. בעוד הגלוקוז משמש הגירוי העיקריות על הפרשת האינסולין ב- OGTT, פרוטוקול שהוצגו ניתן לשנות על ידי (co-) החלת חומרים אחרים כגון macronutrients והורמונים אחרים אשר ידועים כדי לשנות את התגובה של אינסולין2. באופן דומה, ניתן לשנות את פרוטוקול ITT על ידי היישום (co-) של חומרים אחרים (למשל, גלוקגון או catecholamines) לפי שאלת המחקר בודדים. הקריאות הראשי של הפרוטוקולים OGTT ו- ITT המתוארים הם ריכוזי גלוקוז, אינסולין בדם; עם זאת, מדידת פרמטרים דם אחרים כגון גלוקגון, חומצת שומן רמות ליפופרוטאין, כמו גם סמנים מטבוליים שונים על רמת ה-mRNA, חלבון יכול להיות שימושי גם בהתאם מטרת המחקר.
החוקרים צריכים להיות מודעים כי התגובות נוירואנדוקריניים היפוגליקמיה, הפרשת אינסולין, אינסולין פעולה, כמו גם על פנוטיפ הכולל מטבולית בחוזקה תלוי הרקע הגנטי של עכברים10. כאן, אנחנו מנוצל עכברים בתוך הרקע הגנטי של C57BL/6J כמודל HFD-induced של סוכרת, אשר יש ליקוי חלקי של הפרשת האינסולין בתיווך גלוקוז עקב מחיקה המתרחשים באופן טבעי בגן nicotinamide נוקלאוטיד transhydrogenase 20, הפיכתם מודל מתאים ללמוד השמנה קשורה אינסולין התנגדות8,9. הפרוטוקולים המתוארים כאן במאי אולם גם להיות מנוצל לאפיין סמויה העכבר חלופי מודלים של תנגודת לאינסולין וסוכרת, אשר בדרך כלל מבוססים על הפרעות monogenic או על ההרס כימי של תאי β-21, 22 , 23. אמצעי זהירות במהלך תכנון ניסויים כוללים בדיקות תואם גיל עכברים, כמו ירידות של רגישות האינסולין עם בן24, בנוסף לבצע הניסויים בעכברים של אותו המין. כמו מוטציות גנטיות וטיפולים עלול לגרום מתבטא בצורות שונות בהתאם סקס25,26, גם ייתכן רצוי לחקור לשני המינים בנפרד אחד מהשני.
שיטת דגימה דם שמתואר פרוטוקול זה אינו דורש הרדמה, העלולים להשפיע על קצב הלב, זרימת הדם, מטבוליזם הגלוקוז, מניב תוצאות-פיזיולוגיים10. לחלופין, צנתר עורקי עשוי להיות מושתלים, אשר מאפשר דגימה דם ללא טיפול מתח במהלך הניסוי, אך גם מוסיף מאמץ, עלויות, כמו גם את הסיכון של אובדן חיים הניסוי. עבור OGTT, עכברים הם בדרך כלל התענה לילה (14-18 h), אשר מעורר מצב קטבולי בעכברים, חריפה depleting מאגרי הגליקוגן בכבד. למרות זה מפחית את מידת ההשתנות ברמות הגלוקוז בדם בסיסית, הצום הממושך מקטין את קצב חילוף החומרים ומגבירה את ניצול הגלוקוז בעכברים, אשר בניגוד למצב בני10,27. כפי הדפוסים האכלה בעכברים גם מחקה התנהגות אנושית, ייתכן וכך יותר פיזיולוגית לביצוע של OGTT לאחר מהיר קצר. כמו השעון הביולוגי יש השפעה חזקה על מטבוליזם של גלוקוז מערכתית28, חשוב לשקול ובו בזמן של היום נערכים הניסויים המתוארים כאן. על מנת לחקור את חילוף החומרים של עכברים בתקופת פעיל (השלב כהה), מחזור בהירה-כהה הפוכה עשוי להיות יקר כדי להפיק תוצאות פיזיולוגיות רבות.
המסלול המתואר של הממשל יכול גם להיות מגוונים בהתאם ההשערה מסוים נבדק. ניהול אוראלי של גלוקוז במהלך בדיקת פינוי גלוקוזה מוביל הפרשת אינסולין יותר משתנה, כמו ריקון הקיבה, תנועתיות מערכת העיכול, הורמונים (incretins) ו לקלט העצבי לשנות ולהאריך את האינסולין בתגובה2, 10. במהלך הבאר תיאר "incretin הגדלת אפקט", ספיגת הגלוקוז מהפניות במעי שחרור של הורמונים במערכת העיכול כגון GLP1, אשר potentiates שחרור אינסולין גלוקוז המועבר דרך הפה29. כדי לעקוף את ההשפעות הללו, מנת גלוקוז יכול גם ניתן בהזרקה לווריד (IVGTT) או intraperitoneally (IPGTT). טיולים גלוקוז. והן אינסולין שונים באופן משמעותי בהתאם למסלול שבחרת משלוח. בהשוואה OGTT המינהל בקרום הבטן של גלוקוז מוביל לפסגת מוגבר וממושך ברמות הגלוקוז פלזמה, בעוד רמות האינסולין פלזמה עלייה מתעכב, אבל אופנה מתמשכת יותר30. באופן דומה, גלוקוז תוך ורידי הניהול מאופיין של תגובת אינסולין מושהית31. העליות החדות רמות האינסולין, כמו גם נתונים חאן אל-אינסולין עמידים יותר שהושגו במהלך OGTT מראים כי משלוח אוראלי של גלוקוז עשוי להיות רגיש יותר כדי לזהות שינויים בחילוף החומרים של גלוקוז בצ'או-fed נגד עכברים HFD-fed30, 31. משלוח הן intragastric והן בקרום הבטן דומים מבחינת חומרה עבור הקושי בעלי חיים וטכני, ואילו עירוי לוריד הוא בדרך כלל קשה יותר, כמו גם ונושא העכברים32. ניהול אוראלי נוסף מבטלת 10-20% אחוזי שגיאה במהלך בקרום הבטן זריקות לתוך לומן מעיים או הבטן, אשר עשויים להשפיע על שיעור של גלוקוז משלוח חלוקה מחדש33,34.
למרות התוואי ביותר פיזיולוגיים של אספקת גלוקוז, OGTT מוגבל בחשבונאות לקליטה רק גלוקוז, בזמן ארוחה מלאה מכילה גם חלבונים, פחמימות מורכבות, שומנים, סיבים, יסודות קורט. הגישה רגיל במהלך OGTT היא לבסס את המינון גלוקוז על משקל הגוף של העכבר, אמנם בדרך כלל 1-3 גר' גלוקוז/kg של משקל גוף מנוהל35,36. במקרים מסוימים, טעינה גלוקוז גבוה יותר מאשר 1g/kg עשוי להיות נחוץ כדי לחשוף את הסובלנות של גלוקוז לקוי30. דגמים רבים העכבר של השמנת יתר, סוכרת מאופיינת שינויים בהרכב הגוף, במיוחד עלייה מסיבית מסת השומן, בעוד מסת גוף רזה (השרירים, המוח, הכבד), אשר הוא האתר המרכזי של גלוקוז סילוק אינו משתנה באופן פרופורציונלי. הגישה המקובלת נורמליזציה משקל הגוף ובכך יגרום מינון גבוה יותר באופן לא פרופורציונלי של גלוקוז שאליהם חשוף הרקמה רזה עכבר שמנים בהשוואה העכבר ולא שמנים. הנטיה הזו מגבירה את מנה גלוקוז גבוה30. לכן, באופן מיטבי המינון של גלוקוז (OGTT), כמו גם אינסולין (ITT) צריך להיות מחושב בהתבסס על מסת גוף רזה, אם נתוני הרכב גוף הינם זמינים37. אם ההערכה של הרכב הגוף אינו אפשרי עקב מגבלות טכניות, מינון צריכה להתבצע על פי משקל הגוף (משלימה איור 2), בעת החלת מנה קבוע, כגון ב- OGTT האנושית צריך להיות המוצא האחרון אם ביצוע בדיקות אלה בעכברים-10,-35,-36. פרוטוקול שהוצגו, צג דם ידניים שימשה כדי למדוד את רמות הגלוקוז בדם, אשר יש יתרון בבדיקות כגון OGTT ITT המחייבים דגימה מרובות נפח הדם קטן. עם זאת, התקנים אלה מיועדים דם אנושי, בעל טווח דינמי מופחת. לחלופין, הגלוקוז ניתן למדוד רמות הדגימות שנאספו פלזמה, למשלעל ידי מלא אוטומטית מנתחי בכימיה במעבדות שגרתית. בנוסף אינסולין, C-פפטיד עשויה למדוד את הפרוטוקולים שתואר כסמן ישירה יותר של תאי β הפונקציה הפרשה, אשר לא מופק על ידי הכבד לעומת אינסולין38,39. אם גלוקונאוגנזה צריך להיות מוערך, הבדיקה סובלנות פירובט (סניף הדואר) ניתן להחיל, אשר היא עוד גרסה של הפרוטוקולים שתואר כאן, ניטור גליקמי טיולים לאחר הממשל של פירובט בולוס40.
הגישות שתואר כאן של הפח OGTT, ITT לעיתים קרובות להסביר הבדלים שנצפה גלוקוזה, עשוי לשרת נוסף להציע אילו ניסויים עוקבות, מתוחכמים יותר תיעשה הבא (לדוגמה, מלחציים hyperglycemic או מחקרים על איים מבודדים). לסיכום, אנו להציג פרוטוקול פשוט לדור של מודל HFD-induced העכבר, עוד יותר לתאר את OGTT ואת ITT, אשר עשוי להיות שימושי ללמוד הינם כלים רבי-עוצמה כדי להעריך שינויים של ה פנוטיפ מטבולית ויוו מנגנוני מחלות הקשורות חילוף החומרים, כמו גם רומן גישות טיפוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי קרן מדעי רפואי של ראש העיר של העיר וינה, את und Laboratoriumsmedizin לדנציג Österreichische בווריה Chemie פסיכולוג קליני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa - Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa - Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid - Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline - creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
References
- Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
- Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
- Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
- Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
- Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
- Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
- Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, Suppl 3. S215-S219 (2004).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
- Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
- Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
- First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
- McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- NIH. National Institute of Health - Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. , Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf (2017).
- Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
- Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
- Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Jr Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
- Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
- Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
- Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
- Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
- Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
- Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
- Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
- Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
- Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , Chapter 29 Unit 29B 23 (2007).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
- Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
- Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
- Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).
