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Medicine

उच्च वसा वाले आहार में Vivo ग्लूकोज चयापचय में का अध्ययन-खिलाया चूहों मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (OGTT) और इंसुलिन सहिष्णुता परीक्षण (ITT) का उपयोग

Published: January 7, 2018 doi: 10.3791/56672
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, Medical University of Vienna

Summary

वर्तमान लेख उत्पादन और उच्च वसा वाले आहार के चयापचय लक्षण वर्णन-आहार प्रेरित इंसुलिन प्रतिरोध और मोटापे का एक मॉडल के रूप में चूहों खिलाया । यह आगे विस्तृत प्रोटोकॉल मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण और इंसुलिन सहिष्णुता परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए सुविधाएँ, vivo मेंग्लूकोज चयापचय के पूरे शरीर में परिवर्तन की निगरानी.

Abstract

मोटापा प्रकार के रोगजनन में सबसे महत्वपूर्ण एकल जोखिम कारक का प्रतिनिधित्व करता है 2 मधुमेह, एक रोग है जो इंसुलिन के लिए एक प्रतिरोध की विशेषता है-ग्लूकोज को बढ़ावा देने और प्रणालीगत ग्लूकोज चयापचय का एक घोर क्षतिपूर्ति. ग्लूकोज चयापचय की समझ में काफी प्रगति के बावजूद, स्वास्थ्य और रोग में अपने विनियमन के आणविक तंत्र के तहत रहने की जांच की, जबकि उपंयास को रोकने और मधुमेह के इलाज के लिए तत्काल जरूरत है । आहार व्युत्पन्न ग्लूकोज इंसुलिन के स्राव को उत्तेजित करता है, जो फेड-राज्य के दौरान सेलुलर anabolic प्रक्रियाओं के प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करती है और इस तरह प्रणालीगत ऊर्जा की स्थिति को बनाए रखने के लिए रक्त शर्करा के स्तर को संतुलित रखता. जीर्ण पिलाए मेटा-सूजन से चलाता है, जो परिधीय इंसुलिन रिसेप्टर संबद्ध संकेतन में परिवर्तन की ओर जाता है और इस तरह इंसुलिन मध्यस्थता ग्लूकोज निपटान के लिए संवेदनशीलता को कम करता है. इन घटनाओं अंततः ऊंचा उपवास ग्लूकोज और इंसुलिन के स्तर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ग्लूकोज सहिष्णुता में कमी है, जो बारी में इंसुलिन प्रतिरोध के महत्वपूर्ण संकेतकों के रूप में सेवा परिणाम. यहां, हम पीढ़ी और उच्च वसा वाले आहार (HFD) के चयापचय लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित-आहार के एक बार इस्तेमाल किया मॉडल के रूप में चूहों खिलाया इंसुलिन प्रतिरोध प्रेरित । हम विस्तार से मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (OGTT) है, जो एक मौखिक रूप से प्रशासित ग्लूकोज लोड और समय के साथ इंसुलिन स्राव के परिधीय निपटान पर नज़र रखता है उदाहरण देकर स्पष्ट करना. साथ ही, हम इंसुलिन सहिष्णुता परीक्षण (ITT) के लिए एक प्रोटोकॉल पूरे शरीर इंसुलिन कार्रवाई की निगरानी करने के लिए प्रस्तुत करते हैं । साथ में, इन तरीकों और उनके बहाव अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से ग्लूकोज चयापचय में परिवर्तन का आकलन करने के लिए चूहों की सामान्य चयापचय phenotype की विशेषता के लिए शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । वे विशेष रूप से इंसुलिन प्रतिरोध के व्यापक अनुसंधान क्षेत्र में उपयोगी हो सकता है, मधुमेह और मोटापा रोगजनन की एक बेहतर समझ प्रदान करने के लिए और साथ ही चिकित्सकीय हस्तक्षेप के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए.

Introduction

विकसित दुनिया में, मोटापा और मधुमेह शारीरिक निष्क्रियता के कारण महामारी आयामों तक पहुंच गया और प्रोसेस्ड फूड की अधिक खपत, प्रभाव जो तेजी से शहरीकरण, औद्योगीकरण के साथ-साथ वैश्वीकरण से प्रेरित हैं । हालांकि इंसुलिन प्रतिरोध पर अनुसंधान और यह सह-रुग्णता, जैसे hyperlipidemia और atherosclerosis, पिछले दशकों के दौरान शोहरत प्राप्त की है, जटिल जैविक तंत्र जो स्वास्थ्य और रोग में चयापचय को विनियमित करने के लिए पूरी तरह से रहते हैं समझ में आया और वहां अभी भी नए उपचार विधियों को रोकने और इन रोगों के इलाज के लिए एक तत्काल जरूरत है1।

इंसुलिन, और यह काउंटर विनियामक हार्मोन ग्लूकागन सेलुलर ऊर्जा की आपूर्ति और macronutrient संतुलन के प्रमुख नियामकों के रूप में सेवा, इस प्रकार भी उचित प्रणालीगत रक्त ग्लूकोज सांद्रता2बनाए रखने । ग्लूकोज ही अग्नाशय β-कोशिकाओं द्वारा इंसुलिन स्राव के मुख्य उत्तेजितताओं में से एक के रूप में कार्य करता है, जबकि अन्य macronutrients, विनोदी कारकों के साथ ही तंत्रिका इनपुट आगे इस प्रतिक्रिया को संशोधित. इंसुलिन फलस्वरूप मांसपेशियों और वसा कोशिकाओं में अतिरिक्त रक्त ग्लूकोज के प्रसार को सुविधाजनक बनाने और आगे glycogen के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन या फैटी एसिड संश्लेषण, क्रमशः सक्रिय द्वारा फेड राज्य के anabolic प्रक्रियाओं से चलाता है । इसके अतिरिक्त, इंसुलिन gluconeogenesis बाधा द्वारा यकृत ग्लूकोज उत्पादन को रोकता है । जीर्ण अतिरिक्त ऊर्जा की खपत और मेटा सूजन का नेतृत्व करने के लिए hyperinsulinemia और परिधीय इंसुलिन प्रतिरोध के कारण इंसुलिन रिसेप्टर अभिव्यक्ति के नीचे विनियमन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहाव संकेत रास्ते में परिवर्तन, इस प्रकार बिगड़ा में जिसके परिणामस्वरूप इंसुलिन-मध्यस्थ ग्लूकोज निपटान के लिए संवेदनशीलता के साथ ही यकृत ग्लूकोज उत्पादन की अपर्याप्त निषेध3,4,5,6.

आनुवंशिक, पोषण, या रोग के प्रयोगात्मक प्रेरण के साथ पशु मॉडलों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्कृष्ट उपकरण इंसुलिन प्रतिरोध और मधुमेह के विभिंन रूपों के आणविक तंत्र के अध्ययन के रूप में अच्छी तरह के रूप में इसके साथ बीमारियों 7 साबित हो गया है . एक प्रमुख उदाहरण के व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और अच्छी तरह से स्थापित HFD प्रेरित माउस मॉडल है, जो तेजी से वजन कम चयापचय क्षमता के साथ संयोजन में वृद्धि हुई आहार के सेवन के कारण लाभ की विशेषता है, इंसुलिन प्रतिरोध में जिसके परिणामस्वरूप8, 9. दोनों पशु मॉडल और मनुष्यों में, उपवास रक्त ग्लूकोज और इंसुलिन के स्तर में एक उन्नयन, साथ ही ग्लूकोज प्रशासन के लिए एक बिगड़ा सहिष्णुता अक्सर इंसुलिन प्रतिरोध और ग्लूकोज के अन्य प्रणालीगत परिवर्तन के संकेतकों का उपयोग किया जाता है चयापचय. बेसल राज्य में रक्त ग्लूकोज और इंसुलिन के स्तर की निगरानी या उत्तेजना के बाद इसलिए आसानी से सुलभ readouts हैं.

वर्तमान प्रोटोकॉल HFD खिलाया चूहों की पीढ़ी के रूप में अच्छी तरह से दो बार इस्तेमाल किया तरीकों की रूपरेखा, मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (OGTT) और इंसुलिन प्रतिरोध परीक्षण (ITT), जो चयापचय phenotype की विशेषता के लिए और जांच करने के लिए उपयोगी होते हैं ग्लूकोज चयापचय में परिवर्तन. हम विस्तार में OGTT का वर्णन है, जो समय के साथ एक मौखिक रूप से प्रशासित ग्लूकोज लोड और इंसुलिन स्राव के निपटान का आकलन. इसके अलावा, हम इंसुलिन की एक बोल्स के जवाब में रक्त ग्लूकोज एकाग्रता की निगरानी द्वारा पूरे शरीर इंसुलिन कार्रवाई की जांच करने के लिए ITT का संचालन करने के लिए कैसे पर निर्देश प्रदान करते हैं. इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित है और कई अध्ययनों में उपयोग किया गया है10,11,12। मामूली संशोधनों जो सफलता बढ़ाने में मदद कर सकते है के अलावा, हम प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा विश्लेषण के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं, साथ ही उपयोगी संकेत संभावित नुकसान से बचने के लिए । यहां वर्णित प्रोटोकॉल बहुत शक्तिशाली उपकरण को आनुवंशिक, औषधीय, आहार के प्रभाव की जांच हो सकता है, और अंय पूरे शरीर पर ग्लूकोज चयापचय और इंसुलिन प्रतिरोध के रूप में इसके जुड़े विकारों पर पर्यावरणीय कारकों । ग्लूकोज या इंसुलिन के साथ उत्तेजना के अलावा, अन्य यौगिकों की एक किस्म के व्यक्तिगत अनुसंधान के उद्देश्य के आधार पर उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पांडुलिपि के दायरे के बाहर हालांकि, कई अन्य बहाव अनुप्रयोगों ग्लूकोज और इंसुलिन के अलावा अन्य रक्त मूल्यों के विश्लेषण के रूप में तैयार रक्त के नमूनों, पर किया जा सकता है (उदा., लिपिड और लिपोप्रोटीन प्रोफाइल) के रूप में अच्छी तरह के रूप में विस्तृत चयापचय मार्कर का विश्लेषण (उदा, मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), पश्चिमी दाग विश्लेषण, और एंजाइम से जुड़े Immunosorbent परख (एलिसा)) । इसके अलावा प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) अलग एकल कोशिका आबादी में प्रभाव की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है, जबकि transcriptomic, proteomic, और metabolomic दृष्टिकोण भी अनलक्षित विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है.

कुल मिलाकर, हम एक सरल करने के लिए एक HFD प्रेरित माउस मॉडल उत्पंन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जबकि आगे दो शक्तिशाली दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए पूरे शरीर चयापचय परिवर्तन, OGTT और ITT, जो रोग रोगजनन अध्ययन के लिए उपयोगी उपकरण हो सकता है अध्ययन और नए उपचारों का विकास, विशेष रूप से चयापचय के क्षेत्र में, इंसुलिन प्रतिरोध और मधुमेह जैसे रोगों से जुड़े.

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित पशु देखभाल और वियना के चिकित्सा विश्वविद्यालय के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और यूरोपीय संघ के प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों (FELASA) के अनुसार आयोजित की । कृपया ध्यान दें कि सभी प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित केवल संस्थागत और सरकारी अनुमोदन के बाद प्रदर्शन किया जाना चाहिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कर्मचारियों कि तकनीकी रूप से कुशल हैं ।

1. HFD-फेड चूहों

नोट: भोजन और पानी के लिए नि: शुल्क पहुंच के साथ एक 12-h प्रकाश/अंधेरे चक्र पर सभी C57BL/6J चूहों को बनाए रखें ।

  1. उम्र के 6 हफ्तों में, एक HFD पर 8-12 सप्ताह के लिए जगह चूहों (40-60% वसा कैलोरी) मोटापे को प्रेरित करने के लिए, जबकि दुबला नियंत्रण समूह एक कम वसा वाले आहार (LFD) (10% वसा कैलोरी) खिला.
  2. एक साप्ताहिक आधार पर चूहों के शरीर का वजन निर्धारित करें । वजन घटता HFD-फेड समूह में एक उच्च ढलान के साथ, दोनों समूहों में समान पैटर्न दिखाना चाहिए ।

2. OGTT

नोट: यदि रक्त नमूना समय अंक OGTT हर 15 मिनट के दौरान चुना जाता है, प्रयोग समानांतर में 15 चूहों की एक अधिकतम के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए, आदेश में कम से कम 1 मिनट हैंडलिंग-माउस प्रति समय है ।

  1. OGTT से पहले दिन पर तैयारियां
    1. चूहों के ताजा बिस्तर के साथ एक पिंजरे में स्थानांतरण और तेजी से उन्हें परीक्षण से पहले रातोंरात (14 एच), जबकि यह सुनिश्चित करना है कि चूहों पीने के पानी के लिए उपयोग किया है (उदा, अगले सुबह 8:00 पर एक शुरुआत समय के लिए 6:00 बजे भोजन को दूर कर रहा हूं) ।
      नोट: उपवास चूहों रातोंरात मानक दृष्टिकोण है, लेकिन एक छोटी तेजी (5-6 ज) चूहों के लिए अधिक शारीरिक है (विवरण के लिए चर्चा देखें) ।
  2. प्रयोग के दिन की तैयारी (लेकिन प्रयोग करने से पहले)
    1. तैयार 20% ग्लूकोज समाधान की 10 मिलीलीटर (भंग डी-(+)-आसुत जल में ग्लूकोज) ।
      नोट: सभी एजेंट है कि पशुओं के लिए प्रशासित रहे है के लिए औषधीय ग्रेड और बाँझ हो गया है ।
    2. प्लाज्मा संग्रह के लिए एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट तैयार, एक नमूना समय बिंदु और प्रत्येक माउस के लिए अच्छी तरह से भरने के द्वारा, 5 µ एल NaEDTA (०.५ एम EDTA, ०.९% NaCl में पीएच ८.०, आरटी पर भंडारण) के साथ । प्रयोग के दौरान इस प्लेट को बर्फ पर स्टोर करें ।
      नोट: विस्तृत चेकलिस्ट के लिए अनुपूरक आंकड़ा 1 देखें ।
  3. सभी चूहों के शरीर के वजन को मापने और चूहों आसानी से भेद करने के लिए एक स्थायी मार्कर के साथ उनकी पूंछ निशान (उदा., माउस 1 = 1 डैश, माउस 2 = 2 डैश, आदि) ।
  4. ग्लूकोज माप और रक्त का नमूना (चित्रा 2)
    1. ध्यान से पूंछ तेज कैंची का उपयोग टिप के 1-2 mm कट ("संस्करण एक" में चित्रा 2) । रक्त शर्करा निर्धारण के लिए नए रक्त के नमूने लेने से पहले ऊतक द्रव के साथ hemolysis या संदूषण से बचने के लिए हमेशा रक्त की पहली बूंद को पोंछें । ग्लूकोमीटर के साथ एक छोटे से रक्त का नमूना (~ 3 µ एल) बेसल रक्त ग्लूकोज स्तर (= समय बिंदु 0) की माप के लिए ड्रा ।
      चेतावनी: जांच करें और एक ग्लूकोमीटर पर परीक्षण स्ट्रिप्स के प्रभारी संख्या को समायोजित ।
      नोट: एक वैकल्पिक रक्त नमूना विधि के रूप में, निक एक तेज स्केलपेल ब्लेड के साथ एक माउस के पार्श्व पूंछ नस (" 2 चित्रामें संस्करण बी") । पार्श्व पूंछ नस आमतौर पर पूंछ टिप से पूंछ की लंबाई के साथ लगभग एक तिहाई तक पहुंचा है, कई नमूनों के लिए पूंछ के आधार की ओर बढ़ रहा है । एक स्थानीय संवेदनाहारी क्रीम के उपयोग की सिफारिश की है । नरम ऊतक पर उंगली दबाव से पहले पशु अपने पिंजरे में वापस आ जाता है के लिए कोमल ऊतकों पर लागू करने से रक्त का प्रवाह बंद करो ।
    2. एक ताजा केशिका ट्यूब (केशिका ट्यूब क्षैतिज रखने के लिए) का उपयोग कर एक रक्त का नमूना (30 µ एल के आसपास) ले लीजिए । केशिका ट्यूब अंत के शीर्ष पर पिपेट टिप डाल द्वारा एक पिपेट का उपयोग कर केशिका ट्यूब खाली और ध्यान से ९६-अच्छी तरह से थाली का एक कुआं में एकत्र रक्त धक्का, जबकि हवा बुलबुले से परहेज । सभी चूहों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ-एक एक समय में.
      नोट: एक केशिका ट्यूब के माध्यम से रक्त संग्रह के लिए एक विकल्प के रूप में, एक सही मात्रा में समायोजित पिपेट का उपयोग करें (उदा., 30 µ l) रक्त इकट्ठा करने के लिए, या तेल फिल्म पर पूंछ से खून की एक बूंद इकट्ठा, और EDTA-समाधान में प्लास्टिक । कड़ाई से रक्त या ग्लूकोमीटर परीक्षण स्ट्रिप्स के साथ पेट्रोलियम जेली के संपर्क से बचने के लिए, के रूप में यह बाद में ग्लूकोज और इंसुलिन माप को प्रभावित कर सकते हैं.
      चेतावनी: OGTT चूहों के लिए बहुत तनावपूर्ण है: दुबला चूहे एक रात में तेजी के दौरान अपने शरीर के वजन के 15% के आसपास खो सकते हैं । इसके अतिरिक्त, विभिन्न समय बिंदुओं पर रक्त का नमूना लेने से रक्त का काफी नुकसान होता है । आसान रक्त नमूना के लिए, यह ध्यान से पेट्रोलियम जेली के साथ माउस-पूंछ मालिश करने के लिए संभव है ।
      नोट: संस्थागत दिशानिर्देश एक निर्धारित अवधि के भीतर एकत्र रक्त की स्वीकार्य मात्रा को सीमित कर सकते हैं । नमूने की मात्रा और timepoints की अनुमति दी अधिकतम से अधिक नहीं करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । चूहों के शरीर के वजन की कुल रक्त निकासी की अनुमति की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  5. शरीर के वजन के आधार पर ग्लूकोज समाधान की आवश्यक मात्रा की गणना (1 ग्राम ग्लूकोज/हर माउस के लिए मौखिक gavage द्वारा प्रशासित किया जा करने के लिए यह 3 ग्राम/ उदाहरण के लिए, 30 जी के एक शरीर के वजन के साथ एक माउस की आवश्यकता होगी १५० µ एल के एक 20% ग्लूकोज समाधान के लिए 30 मिलीग्राम ग्लूकोज की प्रशासन.
    नोट: माउस के वजन पर ग्लूकोज की खुराक आधार करने के लिए मानक प्रक्रिया है. शरीर संरचना डेटा उपलब्ध हैं, तो OGTT के लिए ग्लूकोज की खुराक दुबला शरीर द्रव्यमान के आधार पर गणना की जानी चाहिए (विवरण के लिए चर्चा देखें).
  6. ग्लूकोज प्रशासन
    1. तैयार everythingthat अग्रिम में पूरे प्रयोग के दौरान की जरूरत है (टाइमर, प्रयोग रिकॉर्ड शीट, ग्लूकोज की निगरानी और स्ट्रिप्स, केशिकाओं, सीरिंज, ग्लूकोज समाधान, ९६-अच्छी तरह से थाली, स्केलपेल, कैलकुलेटर, शेष, स्थायी मार्कर, बेंच कागज, एक एक टिप के साथ पिपेट, और दस्ताने) ।
    2. ग्लूकोज आवेदन के लिए, दृढ़ता से यह कूड़ा द्वारा लोभी द्वारा माउस को नियंत्रित । गर्दन के आसपास की त्वचा के लिए पर्याप्त दृढ़ता लागू करने के लिए रोक से बाहर घुमा से माउस को रोकने के लिए और ठीक से अपने सिर वापस झुकाव । यह भी सुनिश्चित करें कि माउस ठीक से साँस ले सकते हैं ।
      नोट: एक बार ग्लूकोज प्रशासन शुरू कर दिया है, अच्छा समय प्रबंधन बहुत महत्वपूर्ण है ।
    3. ध्यान से ग्लूकोज समाधान प्रशासन (२.५ कदम के आधार पर) सीधे पेट में एक खिला सुई का उपयोग कर । सावधानी से घेघा की ओर मुंह के माध्यम से खिला सुई प्रत्यक्ष । सुई को निगलने के लिए माउस की अनुमति दें: सुई पूरी तरह से कम घेघा में डूब/ फिर ग्लूकोज समाधान (चित्र 3ए) इंजेक्षन.
      1. यदि किसी भी प्रतिरोध से मुलाकात होती है या फिर पशु तुरंत संघर्ष करते हैं तो सुई को वापस ले लें और उसकी स्थिति को ठीक करें । पहले gavage के तुरंत बाद टाइमर प्रारंभ करें और 1 मिनट के अंतराल में अन्य सभी चूहों के लिए ग्लूकोज प्रशासन.
        नोट: यह फ़ीड सुई से माउस के मुंह को ग्लूकोज समाधान की एक बूंद सीधे लागू करने के लिए उपयोगी हो सकता है, जो चाट और निगलने को प्रोत्साहित करेंगे, इस प्रकार खिला सुई की आसान प्रविष्टि की सुविधा । यह गंभीर रूप से पशु घायल हो सकता है के रूप में खिला सुई डालने जब दबाव लागू न करें ।
  7. 15 मिनट के बाद, ग्लूकोमीटर के साथ रक्त शर्करा के स्तर को मापने और इसके अतिरिक्त रक्त के नमूने ले (~ 30 µ l) (के रूप में कदम २.४ में विस्तार से वर्णित) एक ही क्रम में प्रत्येक माउस के रूप में वे इंजेक्शन थे.
    नोट: समय प्रबंधन बहुत महत्वपूर्ण है; gavage के लिए के रूप में एक ही समय अंतराल का उपयोग यथासंभव निकटता का पालन करें । चूहों के रूप में संभव के रूप में स्वतंत्र रूप से ले जाने के लिए और पूरी प्रक्रिया के दौरान तनाव को कम करने के लिए एक न्यूनतम करने के लिए निरोध सीमा, जो परिणामों को संशोधित कर सकते हैं. एक हाथ से दूध की पूंछ और दूसरे के साथ खून इकट्ठा ।
  8. चयनित समय बिंदुओं पर अपेक्षित परिणाम (जैसे, 30, ४५, ६०, ९०, १२०, १५०, और १८० मिनट पर ग्लूकोज व्यवस्थापन के बाद) के आधार पर चरण २.७ दोहराएँ । यदि चयनित समय अंक १२० मिनट से अधिक लंबा है, तो सुनिश्चित करें कि चूहों को पीने के पानी तक पहुँच प्राप्त है. सुनिश्चित करें कि चूहों हमेशा पीने के पानी के लिए उपयोग किया है । जब प्रयोग के साथ समाप्त हो, भोजन और पानी से सुसज्जित उनके घर पिंजरों चूहों को वापस ।
    सावधानी: OGTT चूहों के लिए बहुत थकाऊ है । इसलिए एक ITT के रूप में अगले चयापचय परीक्षण, प्रदर्शन करने से पहले सबसे कम 1 सप्ताह प्रतीक्षा करें ।
  9. प्रयोग के बाद, २,५०० x g, 30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर रक्त के नमूने केंद्रापसारक । supernatant (प्लाज्मा) प्लेट के खाली कुओं के लिए स्थानांतरण और विश्लेषण जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
    1. यदि वर्तमान (अनुभाग 3 देखें) नमूनों की रिकॉर्ड hemolysis ।
  10. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा किट का उपयोग कर प्लाज्मा इंसुलिन के स्तर का निर्धारण ( सामग्री की तालिकादेखें) किट के निर्माता के निर्देशों का पालन.
    नोट: उपवास राज्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जांच चूहों के चयापचय पर पर निर्भर करता है, इस परख के दौरान कठिनाइयों हो सकती है: रातोंरात उपवास इंसुलिन का स्तर (समय बिंदु 0) बहुत कम है और इसलिए पता लगाने की सीमा के करीब । इस मुद्दे से बचने के लिए, की सिफारिश की प्लाज्मा मात्रा दोगुनी और तदनुसार एलिसा परख का परिणाम आधा । दूसरी ओर, यदि चूहों OGTT के दौरान इंसुलिन चोटी तक पहुंच, विशेष रूप से HFD-फेड चूहों में, इंसुलिन का स्तर पता लगाने की सीमा से अधिक हो सकता है: नमूना पतला (उदा., 10-०.९% NaCl के साथ गुना) और एलिसा परख दोहराएं । प्लाज्मा नमूनों में Hemolysis इंसुलिन की गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, readout मूल्यों की कमी में जिसके परिणामस्वरूप. क्षरण समय, तापमान और नमूने में हीमोग्लोबिन एकाग्रता पर निर्भर करता है । इंसुलिन क्षरण को कम करने के लिए हमेशा hemolyzed के नमूनों को ठंडा या बर्फ पर रखें ।

3. ITT

नोट: OGTT (चूहों, रक्त, ग्लूकोमीटर, और पेट्रोलियम जेली उपयोग की हैंडलिंग) के लिए वर्णित एक ही सावधानियों भी ITT प्रदर्शन करते समय लागू किया जाना है । उदाहरण के लिए, सभी इंजेक्शन 15 मिनट में 1 मिनट के भीतर बाहर किया जाना चाहिए अगर 15 चूहों समानांतर में परीक्षण कर रहे हैं. ITT के लिए, केशिका ट्यूबों के साथ रक्त के नमूनों के बाद के संग्रह वैकल्पिक है ।

  1. प्रयोग से पहले की तैयारी
    1. जल्दी चूहों इंसुलिन इंजेक्शन से पहले, यह सुनिश्चित करना है कि चूहों पीने के पानी के लिए उपयोग किया है (उदा., 8:00 am, परीक्षण चूहों 2-5 ज बाद में) पर भोजन को दूर करने के लिए कम 2 ज के लिए ।
    2. इंसुलिन पतला 1:०.९% NaCl में 1000 (स्टॉक: १०० u/एमएल इंसुलिन; कार्य एकाग्रता ०.१ u/एमएल) और 20% ग्लूकोज तैयार (डी-(+)-आसुत जल में भंग ग्लूकोज समाधान) यदि चूहों hypoglycemic हो गया है ।
      नोट: ITT आम तौर पर हाइपोग्लाइसीमिया जो अंयथा रातोंरात तेजी से पशुओं में हो सकता है से बचने के लिए एक छोटी तेजी के बाद किया जाता है । सभी एजेंट है कि पशुओं के लिए प्रशासित रहे है के लिए औषधीय ग्रेड और बाँझ हो गया है ।
  2. चूहों की bodyweight को मापने, मार्क पूंछ, पूंछ कट तेज कैंची का उपयोग कर टिप, और बेसल रक्त शर्करा की मात्रा को मापने के रूप में पहले OGTT चरण २.४ में वर्णित है ।
  3. इंसुलिन इंजेक्शन
    1. इंसुलिन intraperitoneally सुई (०.७५ यू इंसुलिन/किलो शरीर के वजन, पहले से गणना), कूड़ा विधि द्वारा माउस को नियंत्रित ।
    2. असुविधा से बचने के लिए प्रत्येक जानवर के लिए एक ताजा, बाँझ 27 या 30 गेज सुई का उपयोग करें और किसी भी इंजेक्शन-साइट संक्रमण का खतरा ।
      नोट: त्वचा की नसबंदी इंसुलिन प्रशासन की अवधि को लम्बा कर सकते हैं, और इस प्रकार पशु के लिए अतिरिक्त गड़बड़ी पैदा कर सकता है. इसलिए, यह अनुशंसित नहीं है ।
    3. एक मामूली कोण पर माउस सिर नीचे झुकाव जानवर के ventral की ओर बेनकाब करने के लिए । बेवल के साथ बाँझ सुई प्लेस और पशु के पेट के निचले सही वृत्त का चक्र में एक 30 ° कोण पर (चित्र बी). पहले माउस इंजेक्ट करने के बाद तुरंत टाइमर प्रारंभ करें ।
      नोट: कम खुराक ITTs (०.१ U/किग्रा) विशेष रूप से यकृत इंसुलिन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । OGTT के लिए के रूप में, शरीर के वजन के आधार पर इंजेक्शन मात्रा की गणना मानक प्रक्रिया है, जबकि दुबला शरीर द्रव्यमान पर खुराक आधारित अगर शरीर संरचना डेटा उपलब्ध है पसंद है ।
  4. चयनित समय बिंदुओं पर रक्त शर्करा के स्तर को मापने (उदा., 15, 30, ४५, ६०, और ९० मिनट के बाद) ।
    नोट: के रूप में इंसुलिन का एक छोटा आधा समय है चूहों में ~ 10 मिनट13, इंसुलिन प्रशासन के बाद देर मतभेद (जैसे, 2 ज के बाद) इंसुलिन कार्रवाई का प्रत्यक्ष प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है. प्रशासन 20% ग्लूकोज समाधान के मामले में एक माउस hypoglycemic हो जाता है (रक्त शर्करा का स्तर नीचे ३५ मिलीग्राम/डीएल) और मरने के जोखिम में है.
  5. अंतिम समय अंक के बाद, चूहों को वापस अपने घर भोजन और पानी के बहुत से तैयार पिंजरों में जगह है ।

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Representative Results

चित्रा 1 आहार पर चूहों की चयापचय phenotyping के लिए एक योजनाबद्ध समय तालिका दिखाता है. एक LFD-समूह नियंत्रण समूह के रूप में सेवा कर सकते हैं, जबकि लगभग 6 सप्ताह की एक उम्र में, चूहों एक HFD पर रखा जाना चाहिए. महत्वपूर्ण बात, शरीर के वजन साप्ताहिक निर्धारित किया जाना चाहिए अगर वहां शरीर के वजन में एक उंमीद की वृद्धि हुई है । किसी भी तरह का तनाव (जैसे, शोर या आक्रामक पुरुष व्यवहार) शरीर के वजन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं और तुरंत समाप्त किया जाना चाहिए । आहार प्रयोगों के लिए चूहों के प्रत्येक पलटन कम से अधिक 10 चूहों से मिलकर बनता है क्योंकि इन आहार-प्रयोगों समय लेने वाली हैं, और outliers अक्सर कर रहे हैं (उदा., चूहों असामान्य ग्लूकोज या इंसुलिन के स्तर के साथ वजन या चूहों को प्राप्त नहीं). समय की चयनित अवधि के बाद (अध्ययन परिकल्पना और अपेक्षित परिवर्तन के समय बिंदु पर निर्भर करता है), OGTT और ITT ग्लूकोज सहिष्णुता और इंसुलिन कार्रवाई के मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है. इस पेपर में मेटाबोलिक टेस्ट के लिए देर से टाइम पॉइंट्स चुना गया ।

महत्वपूर्ण बात, इन प्रयोगों के लिए पर्याप्त रक्त-हानि के लिए सीसा और इस प्रकार चूहों के लिए बहुत तनावपूर्ण रहे हैं के रूप में OGTT और ITT के बीच कम से कम 1 सप्ताह के एक वसूली समय होना चाहिए. यदि रक्त संग्रह की मात्रा में कमी आई है (उदा., यदि अतिरिक्त रक्त संग्रह के बिना कोई ITT कर रहा हो), तो इस वसूली अवधि को भी छोटा किया जा सकता है या छोड़ दिया गया है, पशुओं में एक से अधिक रक्त के लिए दिशा निर्देशों के साथ कतार में14, 15,16,17.

६० C57BL/6J चूहों के साथ इस बड़े अध्ययन में कुल, चूहों के आधे HFD या LFD पर 6 सप्ताह (n = 30/समूह) की एक उम्र में सेट किया गया था और शारीरिक वजन लाभ आहार पर 16 सप्ताह के लिए निगरानी की गई । HFD की खपत शरीर के वजन में एक उल्लेखनीय वृद्धि के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया । उम्र के 6 हफ्तों में दोनों समूहों में शरीर का वजन २०.२ ग्राम था । जबकि LFD पर चूहों एक सुसंगत दिखाया, थोड़ा शरीर के वजन में वृद्धि (३१.२ जी ± २.७) मनाया अवधि के दौरान, HFD पर चूहों अपने शरीर के वजन में तेजी से वृद्धि हुई है, विशेष रूप से पहले सप्ताह के दौरान और उनके शरीर के वजन तक पहुंच अधिकतम 16 आहार पर सप्ताह के बाद । हालांकि वजन घटता प्रयोग के दौरान एक समान पैटर्न दिखाया, HFD-समूह के चूहों LFD खिलाया चूहों की तुलना में एक १.५-2 गुना उच्च शरीर के वजन (४४.४ ग्राम ± ४.०) तक पहुंच गया ।

दो साथियों के चयापचय phenotype की जांच करने के लिए, एक OGTT (चित्रा 5) और ITT (चित्रा 6) प्रदर्शन किया गया । के रूप में रक्त की मात्रा छोटे कुतर में सीमित है, मधुमेह मनुष्यों (ग्लूकोमीटर) के लिए एक बिंदु की देखभाल (POC) परख इन चयापचय phenotyping प्रयोगों के दौरान रक्त शर्करा की मात्रा की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया था । के रूप में चित्रा 2में प्रदर्शन किया, रक्त ग्लूकोज पर नज़र रखता है उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, रक्त की केवल एक छोटी सी बूंद की जरूरत है, और प्रदर्शन रक्त शर्करा के स्तर प्रलेखन के लिए सेकंड के भीतर. चित्रा 5 OGTT के दौरान पूर्ण ग्लूकोज (चित्रा धारा 5-ख) और निरपेक्ष इंसुलिन (आंकड़ा 5c) के स्तर के समय पाठ्यक्रम प्रस्तुत करता है. आम तौर पर, सामान्य ग्लूकोज सहिष्णुता के साथ एक स्वस्थ माउस रक्त ग्लूकोज में एक विशेषता तेजी से वृद्धि से पता चलता है, ग्लूकोज चुनौती के बाद अपने चरम 15-30 मिनट तक पहुँचने.

बाद में ग्लूकोज, मुख्य रूप से मांसपेशियों, वसा ऊतक द्वारा आयोजित किया, और जिगर ऊतक रक्त ग्लूकोज एकाग्रता की एक क्रमिक कमी की ओर जाता है । सभी प्रयोगों में, LFD-फेड चूहों ग्लूकोज सहिष्णु नियंत्रण समूह के रूप में सेवा की है और इसलिए अपेक्षित चयापचय प्रोफ़ाइल को पूरा: रक्त शर्करा का स्तर के चरम ~ २४० मिलीग्राम/डीएल लगभग 15 मिनट तक पहुँच गया था ग्लूकोज प्रशासन के बाद, तुरंत एक कमी बेसल स्तर लगभग ६० मिनट तक पहुंचने के बाद ग्लूकोज चैलेंज के बाद, उचित ग्लूकोज उंमूलन का संकेत है । तीव्र विपरीत में, HFD-चूहों लगभग पर नुकीला ~ ३२० mg/dL ग्लूकोज और ग्लूकोज के लगभग कोई निपटान दिखाया, ग्लूकोज प्रतिरोध का संकेत. जब दो समूहों के बीच रक्त शर्करा का स्तर पहले से ही उपवास स्थिति में अलग (के रूप में इस प्रतिनिधि उदाहरण में), आधार रेखा ग्लूकोज ऊपर वक्र (ईमेज) के तहत क्षेत्र की गणना करने के लिए किया जाना चाहिए परिणामों को मान्य (चित्र 5- ख) ।

इसके अतिरिक्त, परिसंचारी रक्त इंसुलिन का स्तर इस मॉडल में अंतर्निहित pathophysiology के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने के क्रम में एक इंसुलिन एलिसा परीक्षण (चित्रा 5c) का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । जबकि इंसुलिन का स्तर लगभग नियंत्रण समूह में अपरिवर्तित रहे थे, चूहों एक HFD खिलाया 16 गुना ऊंचा उपवास के स्तर को दिखाया नियंत्रण समूह की तुलना में, साथ ही एक बहुत बढ़ इंसुलिन प्रतिक्रिया, संकेत HFD-प्रेरित क्षतिपूरक hyperinsulinemia के रूप में एक प्रयास counterbalance कम ग्लूकोज उंमूलन क्षमता है, जो इंसुलिन प्रतिरोध की वजह से हो सकता है । हालांकि, इस परीक्षण सीधे इंसुलिन कार्रवाई का मूल्यांकन नहीं करता है और इंसुलिन प्रतिरोध के बारे में बयान समाप्त करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए के रूप में, OGTT के परिणामों की व्याख्या नहीं करने के लिए जागरूक होना.

HFD-फेड चूहों में इंसुलिन संवेदनशीलता को मापने के लिए, एक ITT OGTT (चित्रा 6a) के बाद 1 सप्ताह प्रदर्शन किया गया था । इस परख में, जो करने के लिए रक्त शर्करा सांद्रता गिरावट इंसुलिन प्रशासन की डिग्री पूरे शरीर इंसुलिन कार्रवाई की क्षमता का प्रतिनिधित्व करते हैं । HFD-फेड चूहों LFD-फेड नियंत्रण समूह की तुलना में रक्त शर्करा के स्तर की एक ख़राब कमी से पता चला, ITT के दौरान सभी समय बिंदुओं पर, इस प्रकार इंसुलिन प्रतिरोध का सुझाव. ITT परिणाम आमतौर पर ग्लूकोज के स्तर के समय पाठ्यक्रम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, लेकिन इसके अलावा भी आधारभूत ग्लूकोज नीचे व्युत्क्रम ईमेज के रूप में दिखाया जा सकता है चित्रा घमण्डमें प्रदर्शित किया. यदि समूहों की तुलना कर रहे है जो समान उपवास रक्त शर्करा का स्तर (जो इस प्रयोग में मामला नहीं है), ITT के दौरान ग्लूकोज का स्तर भी बेसल ग्लूकोज के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है । चूहों में के रूप में, इंसुलिन के लिए एक काउंटर नियामक प्रतिक्रिया सक्रिय है अगर रक्त शर्करा का स्तर नीचे गिर ~ ८० mg/dL18: दोष इस काउंटर में एक विशेष माउस मॉडल में विनियामक प्रतिक्रिया इंसुलिन संवेदनशीलता में वृद्धि के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती है । HFDs और बाद में चयापचय phenotypic प्रयोगों के दौरान, outliers अक्सर हो सकता है । चूहों जो HFD पर वजन नहीं है, या असामान्य उपवास ग्लूकोज और/या इंसुलिन का स्तर दिखा उन विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. बाद के दो के लिए, एक ग़ैर परीक्षण अलग से प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए किया जा सकता है (उदा, Grubbs परीक्षण)

इस अध्ययन में, एक उदाहरण के रूप में हमने दिखाया है और vivo मेंचयापचय प्रयोगों के डेटा की व्याख्या, आहार प्रेरित मोटापा, ग्लूकोज असहिष्णुता, और इंसुलिन प्रतिरोध के साथ चूहों पर किए गए, और सामान्य शरीर के वजन के साथ एक नियंत्रण समूह की तुलना में उन्हें. के रूप में अपेक्षित, वहां था बिगड़ा ग्लूकोज सहिष्णुता और hyperinsulinemia मोटापे से ग्रस्त चूहों में इंसुलिन प्रतिरोध के अनुरूप उम्र-मिलान नियंत्रण चूहों की तुलना में; यह अच्छी तरह से स्थापित, विश्वसनीय, समय और बजट के अनुकूल तरीकों, जो अपेक्षाकृत करने के लिए आसान कर रहे है का उपयोग कर खुला था । ग्लूकोज सहनशीलता में अंतर, इंसुलिन के स्तर के रूप में अच्छी तरह से इंसुलिन संवेदनशीलता में, जो सभी OGTT और ITT के प्रस्तुत तरीकों द्वारा प्राप्त कर रहे हैं, अक्सर एक अध्ययन के अगले कदम की योजना बनाने में मदद कर सकते हैं, जो इस तरह के रूप में और अधिक परिष्कृत प्रयोग शामिल हो सकता है hyperglycemic या hyperinsulinemic clamps, साथ ही साथ प्रयोग पृथक अग्नाशय के टाप के साथ ।

Figure 1
चित्र 1. विवो मेंएक सुझाए गए आहार शासन और चयापचय प्रयोगों के लिए योजनाबद्ध समय सारणी । चूहों में HFD के चयापचय प्रभाव की जांच के क्रम में, प्रायोगिक समूह के जानवरों लगभग 6 सप्ताह की उम्र में HFD पर रखा जाता है, जबकि नियंत्रण समूह एक LFD प्राप्त करता है । उचित वजन का आकलन करने के लिए चूहों के शरीर के वजन को साप्ताहिक आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए । लगभग 12 सप्ताह के बाद आहार पर (या एक चयनित समय बिंदु अनुसंधान परिकल्पना के आधार पर), चूहों के चयापचय phenotype एक OGTT द्वारा मूल्यांकन किया जाता है 1 वसूली के सप्ताह के बाद समय और बाद में एक ITT. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. चयापचय प्रयोगों के दौरान रक्त के नमूने के लिए तरीके. OGTT के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में ITT, जहां दोहराया रक्त नमूना आवश्यक है के लिए, हम ध्यान से एक 1-2 mm टुकड़ा तेज कैंची (संस्करण ए) के साथ पूंछ टिप के काटने के माध्यम से रक्त ड्राइंग की सिफारिश, रक्त शर्करा के स्तर के निर्धारण के बाद एक ग्लूकोमीटर के साथ और इंसुलिन के स्तर और अन्य प्रासंगिक रक्त मूल्यों का निर्धारण करने के लिए एक केशिका के साथ रक्त के आगे संग्रह. वैकल्पिक रूप से, रक्त भी पूंछ नस (संस्करण बी) या धमनी कैथीटेराइजेशन द्वारा (दिखाया नहीं) के माध्यम से नमूना हो सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. ग्लूकोज (ए) और intraperitoneal इंसुलिन इंजेक्शन (बी) के ओरल gavage. OGTT (ए) और ITT (बी) के दौरान इंसुलिन की intraperitoneal इंजेक्शन के दौरान एक खिला सुई का उपयोग मौखिक ग्लूकोज प्रशासन के प्रतिनिधि छवियाँ. विस्तृत वर्णन के लिए प्रोटोकॉल देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. HFD-फेड और LFD-फेड C57BL/6J चूहों के शरीर वजन लाभ । C57BL/6J चूहों या तो ६०% HFD पर सेट किया गया, या 10% LFD एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए, 20 सप्ताह की अवधि के लिए. जबकि HFD पर चूहों शरीर के वजन में एक उंमीद की वृद्धि दिखाई, विशेष रूप से आहार पर पहले सप्ताह में, LFD खिलाया चूहों मनाया अवधि के दौरान लगभग लगातार शरीर वजन दिखाया । परिणाम ± SEM मतलब है. *p < ०.०५, * * p < ०.०१, * * * p < ०.००१ । n = 30 प्रति समूह । ANOVA और Tukey की पोस्ट हॉक टेस्ट में अंतर के लिए परीक्षा का इस्तेमाल किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. OGTT HFD-फेड और LFD फेड C57BL/6J पशुओं में प्रदर्शन किया । (क) OGTT के दौरान ग्लूकोजकास्तर. एक रात में तेजी के बाद, ग्लूकोज (mg/dL) के स्तर को उपवास अवस्था में मापा गया और 15, 30, ४५, और ६० न्यूनतम gavage के माध्यम से मौखिक रूप से ग्लूकोज समाधान व्यवस्थापित करने के बाद (1 ग्राम ग्लूकोज/ HFD-समूह में ग्लूकोज का स्तर उपवास राज्य में और साथ ही ग्लूकोज चैलेंज के बाद ऊंचा किया गया । वृद्धि एक देरी और धीमी गति से कम के बाद 15 मिनट के बाद अपने चरम पर पहुंच गया । परिणाम ± SEM मतलब है. *p < ०.०५, * *p < ०.०१, * * *p < ०.००१ । n = 30 प्रति समूह । सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA और Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग किया गया था । (ख) OGTT के दौरान वक्र (ईमेज) के अंतर्गत ग्लूकोज क्षेत्र. आधार रेखा सही ईमेज की गणना करने के लिए, बेसल ग्लूकोज का स्तर (समय बिंदु 0) सभी बाद में प्राप्त रक्त शर्करा के स्तर से प्रत्येक चूहे के लिए अलग से घटाया गया था, व्यक्तिगत AUCs की गणना के बाद । आधारभूत ग्लूकोज के ऊपर ईमेज HFD-फेड चूहों में ग्लूकोज प्रतिरोध दिखाता है । सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA और Tukey के पोस्ट हॉक टेस्ट (ग्लूकोज का स्तर) या छात्र दो पूंछ टीपरीक्षण (ईमेज) का उपयोग किया गया था । (ग) OGTT के दौरान इंसुलिन का स्तर. इंसुलिन (एनजी/एमएल) स्तर 4 एच और 15, 30, और ६० मिनट के एक उपवास अवधि के बाद मौखिक रूप से gavage के माध्यम से ग्लूकोज समाधान प्रशासन के बाद मापा गया (1 ग्राम ग्लूकोज/ HFD-फेड चूहों को न केवल ग्लूकोज इंजेक्शन के लिए क्षतिपूर्ति रक्त इंसुलिन के स्तर में एक उच्च वृद्धि के साथ, वे भी शुरू कर दिया और नियंत्रण समूह की तुलना में ऊपर उठाया इंसुलिन के स्तर के साथ OGTT समाप्त हो गया. परिणाम ± SEM मतलब है. *p < ०.०५, * *p < ०.०१, * * *p < ०.००१ । n = 30 प्रति समूह । सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA और Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. ITTs HFD-फेड और LFD फेड C57BL/6J पशुओं में प्रदर्शन किया । (क) ITT के दौरान ग्लूकोजकास्तर. ग्लूकोज (mg/dL) के स्तर को उपवास अवस्था में मापा जाता था और 15, 30, ४५, और ६० मिनट इंसुलिन intraperitoneally के इंजेक्शन के बाद (०.७५ U इंसुलिन/ ITT के दौरान, HFD-फेड चूहों ऊंचा ग्लूकोज का स्तर दिखाया । इंसुलिन इंजेक्शन के बाद HFD से परेशान चूहों में रक्त शर्करा का स्तर पर्याप्त रूप से कम नहीं था । परिणाम ± SEM मतलब है. *p < ०.०५, * *p < ०.०१, * * *p < ०.००१ । n = 30 प्रति समूह । सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA और Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग किया गया था । (b) ITT के दौरान वक्र (ईमेज) के अंतर्गत ग्लूकोज़ का क्षेत्र । आधार रेखा सही व्युत्क्रम ईमेज की गणना करने के लिए, बेसल ग्लूकोज का स्तर (समय बिंदु 0) अलग से प्रत्येक माउस के लिए बाद में प्राप्त रक्त शर्करा के स्तर से घटाया गया था । मूल्यों उल्टे थे (गुणा-1), व्यक्तिगत AUCs की गणना के बाद । OGTT के दौरान HFD खिलाया चूहों में उच्च शर्करा के स्तर का एक परिणाम के रूप में, आधार रेखा सही उलटा ईमेज चूहों को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में HFD खिलाया चूहों में कम था, जो आगे कम इंसुलिन संवेदनशीलता का सुझाव दिया. सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA और Tukey के पोस्ट हॉक टेस्ट (ग्लूकोज का स्तर) या छात्र दो पूंछ टीपरीक्षण (व्युत्क्रम ईमेज) का उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक आंकड़ा 1. प्रयोग तैयारी के लिए चेकलिस्ट । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक आंकड़ा 2. ITTs के दौरान इंसुलिन का स्तर. प्लाज्मा इंसुलिन का स्तर LFD-फेड बनाम HFD-फेड समूहों में ITT के दौरान दोनों समूहों में इंसुलिन इंजेक्शन के बाद प्लाज्मा इंसुलिन के स्तर में इसी तरह की गतिशीलता दिखाया । उम्मीद के रूप में, HFD चूहों नियंत्रण समूह की तुलना में जोरदार बेसल इंसुलिन के स्तर का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, HFD-फेड चूहों में इंसुलिन के स्तर में वृद्धि मजबूत था, जो आंशिक रूप से दुबला शरीर द्रव्यमान का अनुमान की वजह से हो सकता है अगर इंजेक्शन इंसुलिन की मात्रा पूरे शरीर द्रव्यमान (पारंपरिक सामान्यीकरण दृष्टिकोण) के आधार पर गणना की जाती है के रूप में इस प्रयोग में प्रदर्शन किया । हालांकि, इंसुलिन प्रतिक्रिया HFD-फेड समूह में ख़राब हो गया था (प्लाज्मा ग्लूकोज के स्तर की अपर्याप्त कमी), इस प्रकार आगे इन जानवरों में इंसुलिन प्रतिरोधी राज्य पर बल. परिणाम ± SEM मतलब है. *p < ०.०५, * *p < ०.०१, * * *p < ०.००१ । सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA और Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग किया गया था । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

मधुमेह और दुनिया की आबादी में जुड़े रोगों के उच्च व्यापकता के साथ, वहाँ आणविक तंत्र को संबोधित अनुसंधान के लिए एक मजबूत आवश्यकता है, रोकथाम, और रोग के उपचार19. प्रस्तुत प्रोटोकॉल HFD चूहों, एक मजबूत पशु चयापचय अनुसंधान के लिए इस्तेमाल मॉडल की पीढ़ी के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीकों का वर्णन है, साथ ही साथ OGTT और ITT के संचालन, जो पूरे शरीर चयापचय परिवर्तन के आकलन के लिए शक्तिशाली उपकरण है जैसे इंसुलिन प्रतिरोध । इस पत्र में प्रस्तुत तरीकों संदिग्ध जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है, पर्यावरणीय कारकों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से औषधीय, आहार, शारीरिक, या आनुवंशिक चिकित्सा पूरे शरीर पर ग्लूकोज-चयापचय9,10. जबकि ग्लूकोज एक OGTT में इंसुलिन स्राव के लिए प्रमुख उत्तेजना के रूप में कार्य करता है, प्रस्तुत प्रोटोकॉल द्वारा संशोधित किया जा सकता है (सह) अन्य पदार्थ जैसे अन्य पदार्थों को लागू करने के लिए अन्य macronutrients और हार्मोन जो इंसुलिन प्रतिक्रिया को संशोधित करने के लिए जाना जाता है2. इसी प्रकार, ITT प्रोटोकॉल (co-) अनुप्रयोग द्वारा अन्य पदार्थों (उदा., ग्लूकागन या catecholamines) के व्यक्तिगत शोध प्रश्न के अनुसार संशोधित किया जा सकता है । वर्णित OGTT और ITT प्रोटोकॉल के मुख्य readouts रक्त ग्लूकोज और इंसुलिन सांद्रता हैं; हालांकि, ग्लूकागन, फैटी एसिड, और लिपोप्रोटीन के स्तर के रूप में अंय रक्त मानकों की माप, साथ ही mRNA और प्रोटीन स्तर पर विभिंन चयापचय मार्कर के अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर भी उपयोगी हो सकता है ।

जांचकर्ताओं को पता होना चाहिए कि हाइपोग्लाइसीमिया के लिए neuroendocrine प्रतिक्रियाओं, इंसुलिन स्राव, इंसुलिन कार्रवाई के साथ ही समग्र चयापचय phenotype दृढ़ता से चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर निर्भर करता है10. यहां, हम C57BL के भीतर चूहों का उपयोग/6J आनुवंशिक पृष्ठभूमि के रूप में मधुमेह का एक HFD प्रेरित मॉडल है, जो ग्लूकोज में एक आंशिक हानि-मध्यस्थता इंसुलिन स्राव nicotinamide न्यूक्लियोटाइड transhydrogenase जीन में एक स्वाभाविक रूप से विलोपन के कारण है 20, उंहें मोटापा जुड़े इंसुलिन प्रतिरोध8,9के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल बना । प्रोटोकॉल यहां वर्णित है लेकिन यह भी चयापचय इंसुलिन प्रतिरोध और मधुमेह है, जो आम तौर पर monogenic विकारों पर या β-कोशिकाओं के रासायनिक विनाश पर आधारित है के वैकल्पिक माउस मॉडलों की विशेषता का उपयोग किया जा सकता है21, 22 , 23. प्रयोगात्मक डिजाइन के दौरान सावधानियां आयु मिलान चूहों का परीक्षण शामिल है, के रूप में इंसुलिन संवेदनशीलता में गिरावट आती है के रूप में24, और आगे एक ही सेक्स से चूहों में प्रयोगों को बाहर ले जाने के लिए. आनुवंशिक उत्परिवर्तनों और उपचार के रूप में सेक्स के आधार पर अलग phenotypes में परिणाम हो सकता है25,26, यह भी दोनों लिंगों एक दूसरे से अलग से जांच करने के लिए उचित हो सकता है ।

रक्त नमूना विधि इस प्रोटोकॉल में वर्णित संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं है, जो दिल की दर, रक्त के प्रवाह को प्रभावित कर सकते हैं, और ग्लूकोज चयापचय, गैर शारीरिक परिणाम10उपज. वैकल्पिक रूप से, एक धमनी कैथेटर प्रत्यारोपित किया जा सकता है, जो प्रयोग के दौरान तनाव से निपटने के बिना संवहनी नमूने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी प्रयास कहते हैं, लागत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रयोग करने के लिए पशु नुकसान का खतरा । OGTT के लिए, चूहों आम तौर पर रात भर उपवास कर रहे हैं (14-18 ज), जो चूहों में एक catabolic राज्य भड़काने, दृढ़ता से घट जिगर ग्लाइकोजन स्टोर. हालांकि इस आधारभूत रक्त शर्करा के स्तर में परिवर्तनशीलता कम कर देता है, लंबे समय तक तेजी से चयापचय दर कम हो जाती है और चूहों में ग्लूकोज उपयोग को बढ़ाता है, जो मनुष्य में स्थिति के विपरीत है10,27. के रूप में चूहों में खिला पैटर्न भी मानव व्यवहार की नकल नहीं है, यह इस प्रकार अधिक शारीरिक के लिए एक छोटी तेजी के बाद एक OGTT प्रदर्शन हो सकता है । के रूप में circadian लय प्रणालीगत ग्लूकोज चयापचय पर एक मजबूत प्रभाव है28, यह महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए दिन के समय जो यहां वर्णित प्रयोगों का आयोजन किया जाता है । आदेश में अपने सक्रिय अवधि के दौरान चूहों के चयापचय की जांच करने के लिए (अंधेरे चरण), एक उलट प्रकाश अंधेरे चक्र अधिक शारीरिक परिणाम उत्पन्न करने के लिए मूल्यवान हो सकता है.

प्रशासन के वर्णित मार्ग भी विशिष्ट परिकल्पना परीक्षण किया जा रहा है के आधार पर विविध किया जा सकता है । एक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण के दौरान ग्लूकोज के मौखिक प्रशासन अधिक चर इंसुलिन स्राव की ओर जाता है, गैस्ट्रिक खाली के रूप में, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल गतिशीलता, हार्मोन (incretins), और तंत्रिका इनपुट को संशोधित करने और इंसुलिन प्रतिक्रिया को लम्बा2, 10. के दौरान अच्छी तरह से वर्णित "incretin प्रभाव", आंत से ग्लूकोज का अवशोषण ऐसे GLP1, जो मौखिक ग्लूकोज दिया इंसुलिन potentiates रिलीज29के रूप में जठरांत्र हार्मोन की रिहाई की ओर जाता है. इन प्रभावों को दरकिनार करने के लिए, एक ग्लूकोज बोल्स भी नसों (IVGTT) या intraperitoneally (IPGTT) प्रशासित किया जा सकता है । दोनों ग्लूकोज और इंसुलिन यात्रा काफी चुना वितरण मार्ग के आधार पर अलग । OGTT की तुलना में, ग्लूकोज के intraperitoneal प्रशासन प्लाज्मा ग्लूकोज के स्तर में एक वृद्धि हुई और लंबे समय तक चोटी की ओर जाता है, जबकि प्लाज्मा इंसुलिन का स्तर एक देरी में वृद्धि, लेकिन अधिक निरंतर फैशन30. इसी तरह, नसों में ग्लूकोज प्रशासन एक देरी इंसुलिन प्रतिक्रिया की विशेषता है31. इंसुलिन के स्तर में तेजी से बढ़ जाती है और साथ ही अधिक मजबूत ईमेज-इंसुलिन OGTT के दौरान प्राप्त डेटा सुझाव है कि ग्लूकोज की मौखिक प्रसव के लिए चाउ-फेड बनाम HFD चूहों में ग्लूकोज चयापचय में परिवर्तन का पता लगाने के लिए और अधिक संवेदनशील हो सकता है30, 31. दोनों intragastric और intraperitoneal वितरण पशु और तकनीकी कठिनाई के लिए गंभीरता के मामले में समान हैं, जबकि नसों में प्रशासन आमतौर पर अधिक कठिन है और साथ ही चूहों के लिए अधिक तनावपूर्ण३२। मौखिक प्रशासन आगे आंत्र लुमेन या पेट में intraperitoneal इंजेक्शन के दौरान त्रुटि की 10-20% की दर को समाप्त, जो ग्लूकोज की दर को प्रभावित कर सकते हैं वितरण और पुनर्वितरण३३,३४.

हालांकि यह ग्लूकोज प्रसव के सबसे शारीरिक मार्ग है, OGTT केवल ग्लूकोज अवशोषण के लिए लेखांकन में सीमित है, जबकि एक पूर्ण भोजन भी प्रोटीन होते हैं, जटिल कार्बोहाइड्रेट, वसा, फाइबर, और माइक्रोंयूट्रेंट्स. OGTT के दौरान मानक दृष्टिकोण के लिए माउस के शरीर के वजन पर ग्लूकोज खुराक आधार है, जबकि आम तौर पर 1-3 ग्लूकोज के शरीर के वजन के प्रति किलो३५,३६प्रशासित रहे हैं । कुछ मामलों में, 1g/kg से अधिक ग्लूकोज लोडिंग एक बिगड़ा ग्लूकोज सहिष्णुता प्रकट करने के लिए आवश्यक हो सकता है30. मोटापा और मधुमेह के कई माउस मॉडल शरीर संरचना में परिवर्तन की विशेषता है, विशेष रूप से वसा द्रव्यमान में एक बड़े पैमाने पर वृद्धि, जबकि दुबला शरीर द्रव्यमान (मांसपेशी, मस्तिष्क, और जिगर), जो ग्लूकोज निपटान के मुख्य साइट है आनुपातिक परिवर्तन नहीं. शरीर के वजन के लिए पारंपरिक सामांयीकरण दृष्टिकोण इस प्रकार ग्लूकोज की एक पैस उच्च खुराक जो करने के लिए एक मोटापे से ग्रस्त माउस में दुबला ऊतक गैर-मोटापे से ग्रस्त माउस की तुलना में उजागर होता है में परिणाम होगा । यह पूर्वाग्रह एक उच्च ग्लूकोज खुराक के साथ बढ़ जाता है30. इसलिए, इष्टतम रूप से ग्लूकोज (OGTT) की खुराक के रूप में अच्छी तरह से इंसुलिन (ITT) दुबला शरीर द्रव्यमान के आधार पर गणना की जानी चाहिए, यदि शरीर संरचना डेटा उपलब्ध हैं३७. अगर शरीर की संरचना का आकलन तकनीकी सीमाओं के कारण संभव नहीं है, खुराक शरीर के वजन (पूरक चित्रा 2) के अनुसार किया जाना चाहिए, जबकि एक निश्चित खुराक लागू करने, जैसे एक मानव OGTT में अंतिम उपाय होना चाहिए अगर चूहों10,३५,३६में इन परीक्षणों के प्रदर्शन. प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, एक हाथ से आयोजित पूरे रक्त की निगरानी के लिए रक्त शर्करा के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो OGTT और ITT कि छोटे रक्त की मात्रा के कई नमूने की आवश्यकता होती है जैसे परीक्षणों में लाभप्रद है । हालांकि, इन उपकरणों मानव रक्त के लिए तैयार कर रहे हैं, एक कम गतिशील रेंज होने । वैकल्पिक रूप से, ग्लूकोज के स्तर को एकत्र प्लाज्मा नमूनों में मापा जा सकता है, जैसे, नियमित प्रयोगशालाओं में पूरी तरह से स्वचालित रसायन विश्लेषक द्वारा. इंसुलिन के अलावा, सी-पेप्टाइड के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल में मापा जा सकता है β-सेल स्रावी समारोह के एक अधिक प्रत्यक्ष संकेतक, जो जिगर द्वारा निकाला नहीं है इंसुलिन के विपरीत३८,३९. यदि gluconeogenesis मूल्यांकन की जरूरत है, पाइरूवेट सहिष्णुता परीक्षण (PTT) लागू किया जा सकता है, जो यहां का एक और संस्करण वर्णित प्रोटोकॉल है, एक पाइरूवेट बोल्स४०के प्रशासन के बाद glycemic यात्रा की निगरानी ।

यहां OGTT और ITT के दृष्टिकोण का वर्णन अक्सर ग्लूकोज सहिष्णुता में मनाया मतभेद समझा सकते है और आगे सुझाव है जो बाद में, और अधिक परिष्कृत प्रयोग अगले आयोजित किया जाएगा की सेवा (जैसे, hyperglycemic clamps या पृथक टाप पर अध्ययन) । संक्षेप में, हम एक HFD प्रेरित माउस मॉडल की पीढ़ी के लिए एक सरल प्रोटोकॉल मौजूद है और आगे OGTT और ITT, जो शक्तिशाली उपकरण के लिए vivo में चयापचय phenotype के परिवर्तन का आकलन कर रहे है और अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है का वर्णन चयापचय से जुड़े रोग तंत्र के साथ ही उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को शहर के विएना के मेयर और Österreichische Gesellschaft फर Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie के मेडिकल साइंटिफिक फंड ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse strain: C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer Roche 6870228 OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips Roche 6454038 OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769 OGTT
Actrapid - Insulin Novo Nordisk 417642 ITT
Reusable Feeding Needles Fine Science Tools #18061-22 OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes Braun 9161406V OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) Braun 304000 ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)   Braun 4657705 ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible Braintree Scientific, Inc. SP0016 OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit Crystam Chem 90080 OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat Research Diets Inc D12492 mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat. Research Diets Inc D12450B mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary Sigma-Aldrich BR749321 OGTT/ITT
Vaseline - creme Riviera P1768677 OGTT/ITT

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उच्च वसा वाले आहार में <em>Vivo</em> ग्लूकोज चयापचय में का अध्ययन-खिलाया चूहों मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (OGTT) और इंसुलिन सहिष्णुता परीक्षण (ITT) का उपयोग
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Nagy, C., Einwallner, E. Study of… More

Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). J. Vis. Exp. (131), e56672, doi:10.3791/56672 (2018).

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