Summary
現在の記事では、生成および食事療法誘導されたインシュリン抵抗性および肥満のモデルとして高脂肪食飼育マウスの代謝特性について説明します。さらに、経口ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験、グルコース代謝体内の全身の変化の監視を実行する詳細なプロトコルを備えています。
Abstract
肥満は 2 型糖尿病、インスリン刺激によるグルコース吸収と全身糖代謝の総代償不全への抵抗によって特徴付けられる病気の発症に最も重要な危険因子を表します。グルコース代謝の理解にかなりの進歩にもかかわらず健康と病気その制御の分子機構に残る下調査間小説を防止し、糖尿病の治療への取り組みが急務します。派生のグルコース供給状態の間に細胞の同化プロセスの主レギュレータとして機能し、こうして血糖値のバランスをインスリンの膵臓の分泌を刺激するダイエットは、全身のエネルギー状態を維持するレベルします。慢性過食トリガー メタ-炎症、末梢インスリン受容体関連での変更につながるシグナルとインスリンを介したグルコース処理への感受性を削減します。これらのイベント最終的に結果減少と同様、高い絶食のブドウ糖とインスリン レベルの耐糖能のターンではインスリン抵抗性の重要な指標となります。ここでは、生成と高脂肪食 (HFD) の代謝特性のプロトコルを提案-食事療法誘導されたインシュリン抵抗性の頻繁に使用されるモデルとしてマウスを供給します。経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT)、監視時間をかけて経口投与されたグルコース負荷とインスリン分泌の周辺機器の処分の詳細に示します。さらに、インスリン負荷試験 (ITT) 全身のインスリン作用を監視するためのプロトコルを提案する.一緒に、これらのメソッドとその下流の応用は、特に糖代謝の変化を評価するだけでなくマウスの一般的な代謝表現型を特徴付けるための強力なツールを表します。彼らはインスリン抵抗性、糖尿病および肥満治療介入の効果をテストとして同様の病態のより良い理解を提供する広範な研究分野で、特に便利。
Introduction
先進国の肥満や糖尿病は、物理的な不活動と加工食品の過剰な消費の急速な都市化、工業化、グローバル化によって駆動される効果による流行の寸法を達した。ただし、研究インスリン抵抗性およびそれの併存、高脂血症や動脈硬化、最後の十年の間に卓越性を得たが、健康および病気の代謝を調節する複雑な生物学的メカニズムのまま不完全理解、まだ防ぎ1これらの疾患を治療する新しい治療法のための緊急の必要性があります。
インスリン、およびそれの counter-regulatory ホルモンのグルカゴン細胞のエネルギー供給と栄養素のバランス、適切な全身血ブドウ糖濃度2をまた維持の主レギュレータとして役立ちます。インスリン分泌の主要な刺激の 1 つとして膵 β 細胞によるグルコース自体機能他栄養素、液性因子としてそれ以上の神経入力は、この応答を変更します。インスリンは、筋肉や脂肪細胞に余分な血中グルコースの拡散を促進し、解糖系と同様にタンパク質や脂肪酸合成をそれぞれさらに活性その結果供給状態の同化のプロセスをトリガーします。さらに、インスリンは、糖新生を抑制することによって肝糖放出を抑制します。慢性的な過剰なエネルギー消費やメタ炎症は障害の結果、下流のシグナル伝達経路の変化と同様に、インスリン受容体の発現のダウンレギュレーションにより末梢のインスリン抵抗性と高インスリン血につながる肝糖生産3,4,5,6の不十分な抑制と同様、インスリンを介したグルコース処理する感度。
病の遺伝、栄養、または実験的誘導と動物モデルの広い範囲は、その付随の病気7 と同様、糖尿病の様々 な形態およびインスリン抵抗性の分子機構を研究する優れたツールであると証明されています。.典型的な例は広く使われていると定評の HFD 誘発マウス モデルは、代謝効率が低下、インスリン抵抗8,の結果での組み合わせで食事摂取量増加による急速な体重増加によって特徴付けられる9しますよく使用するインスリン抵抗性の指標とグルコースの他の全身の変化は、グルコースの投与に対する障害耐性だけでなく、両方のモデル動物と人間、空腹時血中グルコースとインスリン濃度の上昇。代謝。したがって、基底状態で、または刺激に監視の血中グルコースとインスリン濃度、簡単にアクセス可能な読み出しです。
この議定書の概要 HFD 給電マウスとして経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン抵抗性試験 (ITT)、代謝の表現型を特徴付けるそして調査するために役立つ 2 つの頻繁に使用されるメソッドの生成糖代謝の変化。詳細は、時間の経過とともに経口投与されたグルコース負荷とインスリン分泌の処分を評価で OGTT をについて説明します。さらに、インスリンのボーラスへの応答の血中グルコース濃度を監視することによって全身のインスリン作用を調査する ITT を実施する方法の指示を提供します。この資料で説明されているプロトコルは定評あり複数研究10、11,12で使用されています。成功を高めるを助けるかもしれないわずかな変更、に加えて、我々 は実験デザインとデータ解析と同様有用なヒント潜在的な落とし穴を避けるのためのガイドラインを提供します。ここ記載されているプロトコルは、全身糖代謝とインスリン抵抗性などの関連疾患、遺伝的、薬理学的、食物、および他の環境要因の影響を調査するための非常に強力なツールをすることができます。グルコースとインスリン刺激、他は、個々 の研究の目的によって刺激のためさまざまな他の化合物を使用すること。この原稿のスコープの範囲外が他の多くのダウン ストリーム アプリケーションの詳細なだけでなく、グルコースとインスリン (例えば、脂質およびリポタンパク質プロファイル) 以外の血液の値の分析など、描かれた血液サンプルで実行できます。代謝マーカー (例えば、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、西部のしみの分析、および酵素結合抗体法 (ELISA) による) の分析。さらにフローサイトメトリー、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームのアプローチについても、不特定多数に向けた分析のため利用されるかもしれない一方単一細胞集団の効果を調査する並べ替え蛍光活性化セル (FACS) を適用可能性があります。
全体的に、我々 は全身代謝の変化、分泌、ITT は、病気の発症を勉強するための便利なツールをすることができますを検討する 2 つの強力なアプローチをさらに説明しながら HFD 誘発マウス モデルを生成するための単純なプロトコルを提供し、インスリン抵抗性・糖尿病など代謝疾患の分野を中心に、新しい治療法を開発します。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは動物愛護とウィーンの医学大学の利用委員会によって承認され実施によると、連合の欧州研究所動物科学連合 (FELASA)。制度や政府の承認の後だけでなく、技術的に精通しているスタッフによってのみこのプロトコルで説明したすべての手順は実行されることに注意してください。
1. HFD 給電マウス
注: は、食料と水を無料で 12 h 光/暗いサイクルですべての c57bl/6 j マウスを保持します。
- 6 週齢、場所でマウス、肥満を誘発する、HFD (40-60% 脂肪カロリー) の 8-12 週の低脂肪ダイエット (LFD) リーン コントロール グループを供給しながら (10% 脂肪カロリー)。
- 週単位でマウスの体重を決定します。ウェイト カーブ HFD 供給グループの高い斜面で、両方のグループで同じようなパターンが表示されます。
2。 OGTT
注: 15 分毎、OGTT 中血液サンプリング タイム ポイントが選択されている場合実験対象となる最大並行して、15 匹のマウスのマウスあたり少なくとも 1 分処理時間を持つために。
- OGTT の前日準備
- マウスに飲料水へのアクセスがあることを確保しながら新鮮な寝具と高速 (14 h) をテストする前に夜間にケージにマウスを転送 (例えば、18:00 次の朝 8:00 に開始時刻のために食べ物を削除) します。
メモ: 断食マウス一晩は標準的なアプローチが短く高速 (5 〜 6 時間) がより生理的マウス (詳細については説明を参照)。
- マウスに飲料水へのアクセスがあることを確保しながら新鮮な寝具と高速 (14 h) をテストする前に夜間にケージにマウスを転送 (例えば、18:00 次の朝 8:00 に開始時刻のために食べ物を削除) します。
- 準備日に実験 (ただし実験開始前)
- 20% ブドウ糖液 10 mL を準備 (溶解 d-(+)-グルコース蒸留水で)。
注: 動物に投与されるすべての試薬は、薬理学的グレードでなければならないと滅菌します。 - 5 μ L で各サンプリング時点の各マウス 1 つの井戸を埋めることでプラズマ コレクションの 96 ウェル プレートを準備 NaEDTA (0.5 M EDTA、pH 8.0 で 0.9% 食塩水、常温保管)。実験では、氷にこのプレートを保存します。
注: は、補足図 1詳細なチェックリストを参照してください。
- 20% ブドウ糖液 10 mL を準備 (溶解 d-(+)-グルコース蒸留水で)。
- すべてのマウスの体重を測定し、マウスは簡単に区別できる (例えばマウス 1 = 1 ダッシュ、マウス 2 = 2 ダッシュのなど) を作るために永久的なマーカーと彼らの尾をマークします。
- グルコース測定と採血 (図 2)
- 慎重に鋭いはさみ("バリアント"図 2の A) を使用して尻尾の先端の 1-2 mm を切った。常に溶血または血糖値測定のための新しい血液サンプルを取る前に組織液の混入を避けるために血の最初の滴を拭き取ってください。基底血糖値 (= 0 の時点)、glucometer との測定のため、少量の血液サンプル (〜 3 μ L) を描画します。
注意: を確認し、glucometer のテスト ストリップの充満数を調整します。
注: 代替血液サンプリング方法として鋭いメスの刃 (図 2には"バリアント B") でマウスの外側尾静脈をニックします。外側尾静脈に多数のサンプル、尾の根元に向かって尻尾先端から尾の長さに沿って約 3 分の 1 は、通常します。局所麻酔クリームの使用をお勧めします。少なくとも 30 の軟部組織に指の圧力を適用することによって血流を停止 s 動物は檻に戻される前に。 - 新鮮な毛細管 (キャピラリー チューブの水平維持) を使用して血液サンプル (約 30 μ L) を収集します。ピペットを用いたキャピラリー チューブの端の上部にピペット チップを入れて、慎重に空気の泡を回避しながら 96 ウェル プレートのウェルに集められた血を押すキャピラリー チューブを空にします。すべてのマウスの 1 つずつのこの手順を繰り返します。
注: キャピラリー チューブを介して血のコレクションのための代替血液を収集し、収集のドロップする (例えば、30 μ L) 適切なボリューム調整ピペットを使用して血液パラフィン フィルムとピペットで尻尾からは EDTA 溶液に。厳密にその後グルコースとインスリンの測定に影響を与える可能性があります血または glucometer テスト ストリップとゼリーに石油の接触を避けます。
注意: OGTT は非常にマウスのストレス: 無駄のないマウスを失うことが前後の体重の 15% 夜行高速で。さらに、別の時点で採血は血液のかなりの損失につながります。簡単に採血、ワセリンと mouse-tail を慎重にマッサージすることが可能です。
注: 制度のガイドラインは、一定期間内に集められた血の許容量を制限があります。サンプリング ボリュームと縦長に許可されている最大値を超えないように調整してください。マウスの体重の合計を計算に使用する血液の撤退を許可します。
- 慎重に鋭いはさみ("バリアント"図 2の A) を使用して尻尾の先端の 1-2 mm を切った。常に溶血または血糖値測定のための新しい血液サンプルを取る前に組織液の混入を避けるために血の最初の滴を拭き取ってください。基底血糖値 (= 0 の時点)、glucometer との測定のため、少量の血液サンプル (〜 3 μ L) を描画します。
- 体重 (体重 1 g グルコース/kg; 3 g/kg まで増加するこのことができます) に基づくブドウ糖輸液の必要量を計算にすべてのマウスの経口投与による投与されます。たとえば、30 g の体重を持つマウスは、30 mg のグルコースを管理する 20% ブドウ糖溶液を 150 μ l 添加を必要があります。
注: マウスの重量を基にグルコースの投与量を標準的な手順です。OGTT を計算する必要がありますのブドウ糖の投与量が、リーンに基づく体組成データが利用可能な場合本体質量 (詳細については説明を参照)。 - グルコースの投与
- 準備に関するすべてのことは、前もって全体の実験中に必要な (タイマー、実験記録シート、グルコース モニターとストリップ、毛細血管、注射器、グルコース溶液、96 ウェル プレート、メス、電卓、バランス、永久的なマーカー、ベンチのペーパー、ピペット チップ、そして手袋をして)。
- グルコース アプリケーションのしっかりと首筋を把握することによりマウスを抑制します。マウスの抑制からのねじれを防ぐために正しく戻って頭を傾けると首の周りの皮膚に十分な硬さを適用されます。また、マウスが正しく呼吸できることを確認します。
注: グルコースの投与を開始すると、良い時間管理は非常に重要です。 - 慎重に餌針を使用して胃の中に直接 (2.5 のステップに基づいて) グルコース溶液を管理します。慎重に直接食道に向かって口から給餌針。針を飲み込むには、マウスを許可する: マウスの下の食道/胃に完全、針のシンクします。その後、グルコース溶液 (図 3 a) を挿入します。
- どんな抵抗が満たされる動物はすぐに戦う場合や、針を撤回し、それを移動します。最初の強制経口投与後すぐにタイマーを開始および他のすべてのマウスに 1 分間隔でブドウ糖を管理します。
注: それが舐めていると嚥下、餌針の簡単挿入容易に刺激するマウスの口に餌針から直接ブドウ糖溶液の一滴を適用するあります。これは真剣に動物を傷つける可能性があります、餌針を挿入する場合は、圧力は適用されません。
- どんな抵抗が満たされる動物はすぐに戦う場合や、針を撤回し、それを移動します。最初の強制経口投与後すぐにタイマーを開始および他のすべてのマウスに 1 分間隔でブドウ糖を管理します。
- 15 分後、glucometer と血糖値を測定し、また採血 (〜 30 μ L) (ステップ 2.4 で説明されている詳細) として各マウスの同じ順序で彼らを注入したよう。
注: 時間管理は非常に重要です。強制経口投与と同じ時間間隔を使用して可能な限り、従ってください。結果を変更可能性があります、ストレスを軽減することと、全体の手順中に制限を最小限に抑制自由に移動マウスをしましょう。片方の手で尻尾を牛乳し、他の血液を収集します。 - (例えば30、45、60、90、120、150、およびグルコースの投与後 180 分で) 期待される結果によって選択した時点で 2.7 手順を繰り返します。選択した時間ポイントが 120 分を超える場合、マウスに飲料水へのアクセスがあることを確認します。マウス常に飲料水へのアクセスがあることを確認します。実験を完了したら、マウスを食料と水装備ホーム檻に返します。
注意: OGTT はマウスに非常に疲れるです。したがって、ITT など次の代謝テストを実行する前に、少なくとも 1 週を待ちます。 - 2,500 × g、30 分、4 ° C での血液サンプルを遠心実験の後分析まで、-20 ° C でプレートの井戸を空にして保管して上清 (プラズマ) を転送します。
- 存在する場合は、サンプルの溶血を記録 (セクション 3 を参照してください)。
- 市販 elisa 法を用いた血漿インスリン キット (材料の表を参照) を決定するキットの製造元の指示に従います。
注: 空腹の状態に応じてだけでなく、調査のマウスの代謝には、この試金の時に困難が発生する: 夜間空腹時インスリン レベル (時点 0) が非常に低く、したがって検出限界の近くにあります。この問題を回避するには、推奨される血漿量の量を倍増し、ELISA アッセイの結果をそれに応じて半減します。一方でマウス HFD 与えられたマウスで特に OGTT、中にインスリンのピークに達すると場合、インスリン レベルは検出限界を超える可能性があります: サンプルを希釈 (例えば、10 倍 0.9 %nacl)、ELISA アッセイを繰り返します。血漿検体の溶血は、読み取り値の減少、インスリンの低下につながる可能性があります。劣化は、時間、温度、およびサンプルのヘモグロビン濃度に依存します。寒さやインスリンの低下を減らすために氷の上に、溶血サンプルを常に保ちます。
3. ITT
注: OGTT (ワセリン使い glucometer、血マウスの取扱い) について同じ注意は ITT の実行時に適用するまたあります。たとえば、すべての注射行なう 15 分以内で 1 分間隔で並列で 15 匹のマウスをテストする場合。ITT、毛細管での採血の後に収集はオプションです。
- 実験前に、の準備
- マウスに飲料水へのアクセスがあることを確保しながら、インスリン注射の前に少なくとも 2 時間マウスを高速 (例えば、8:00 で食品を削除、マウスをテスト 2 5 h 後)。
- 0.9% でインスリン縮尺を希薄 NaCl (株式: 100 U/mL インスリン; 作業濃度 0.1 U/mL) 20% ブドウ糖を準備 (d-(+)-グルコース溶液に溶解した蒸留水) マウスが低血糖になった場合に投与します。
注: 一晩で発生する可能性がありますそれ以外の場合、低血糖を避けるために短い高速動物を絶食後、ITT は、通常実行されます。動物に投与されるすべての試薬が薬理学的グレードでなければならないと滅菌します。
- マウスの体重を測定、尾をマーク、鋭いはさみを使用して尻尾先端をカットし、ステップ 2.4 で OGTT は前述のように基底の血ブドウ糖のレベルを測定します。
- インスリン注射
- 腹腔内にインスリンを注入する (0.75 U インスリン/kg 体重、事前計算)、首筋法によるマウスを抑制します。
- 滅菌の 27 か 30 ゲージの針の不快感と、注射部位の感染のリスクを避けるために各動物のため、新鮮なを使用します。
注: 皮膚の殺菌インスリン投与の期間を延ばすことができる、動物に付加的な妨害を起こすことができます。したがって、それはお勧めしません。 - 動物の腹側を公開するわずかな角度でマウスの頭を傾けてください。動物の腹部 (図 3 b) の右下の象限に滅菌針と 30 ° の角度で傾斜面を配置します。最初のマウスは、注入後すぐに、タイマーを開始します。
注: 低用量 ITTs (0.1 U/kg) が具体的には肝のインスリン感受性を評価するために行われます。投与量を基づかせている間標準的な手順は、体重に基づいて注入量の計算、OGTT は体組成データが利用可能な場合は無駄のない体の質量が最寄り。
- 選択した時点で (例えば15、30、45、60、90 分後) に血糖値を測定します。
注: インスリン マウス13〜 10 分の短い半時間があり、(例えば2 h 後) インスリン投与後半違い表さない場合がありますインスリン作用の直接影響。マウスは低血糖になる場合に 20% ブドウ糖溶液を管理 (血糖値 35 mg/dL 以下) と死亡のリスクは、します。 - 最終的な時間のポイントの後、食料と水をたっぷり用意してホーム ケージに戻ってマウスを配置します。
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Representative Results
図 1は、食事療法のマウスの代謝フェノタイピングのスケマティック タイム テーブルを示しています。約 6 週間の年齢で LFD グループは対照群として役立つかもしれない間、HFD のマウスを配置する必要があります。重要なは、体重は、体重増加が予想されるかを観察する毎週決定する必要があります。ストレス (例えば、ノイズまたは積極的な男性の行動) の任意の種類は体重増加を妨げることができるし、すぐに除去する必要があります。これらのダイエット実験は、時間がかかると外れ値は頻繁に (例えば、マウス重量または糖能異常やインスリン レベルを持つマウスを得ていない) ので、少なくとも 10 マウスのダイエット実験用マウスの各コホートを含みます。(研究仮説と予想される変更の時点) に応じて時間の選択した期間の後、グルコース トレランスとインスリン作用の評価のため、OGTT と ITT が実行できます。この稿では、代謝試験の後半の時間ポイントが選ばれました。
重要なは、これらの実験は実質的な血損失につながるし、非常にマウスのストレスは、このように、OGTT と ITT の間、少なくとも 1 週間の回復時間が必要があります。この回復期間が短縮または省略すると、複数の血描画動物14、ガイドラインに沿ったならないも血液コレクション ボリュームは次の減少 (例えば、最初追加採血なし ITT を実行している場合) がある場合 15,16,17。
合計で 60 の c57bl/6 j マウスでこの大きな研究で、マウスの半分は 6 週間の年齢で HFD または LFD に設定された (n = 30/グループ) 体重がダイエットで 16 週間の監視と。HFD の消費量は、図 4に示すように、体重の大幅な増加の結果。6 週齢、体重ともに 20.2 g であった。LFD のマウスを一貫した、わずかに増加する体重 (31.2 g ± 2.7) 観測期間中に示したに対し HFD のマウスは最初の週の間に特に急速に自分の体重を増加し、国会に 16 週間後、本体重量最大に達した。ウェイト カーブは、実験中に同様のパターンを示したが 1.5 〜 2 倍高い体重 (44.4 g ± 4.0) に達した HFD グループのマウスに比べて LFD 給電マウス。
2 つのコホートの代謝表現型を調べるためには、OGTT (図 5) と ITT (図 6) を行った。小さい齧歯動物血液量は制限されている糖尿病の人間 (glucometer) のためのポイント ・ オブ ・ ケア (POC) アッセイこれら代謝フェノタイピング実験中に血糖値を監視する使用だった。図 2に示す、血ブドウ糖のモニターが使いやすい、必要がありますわずかな血のドロップし数秒以内にマニュアルの血ブドウ糖のレベルを表示します。図 5は、OGTT の中に絶対血糖 (図 5 a-b)、絶対的なインスリンの経時 (図 5 c) レベルを示します。一般的に、そのピークに達して耐糖能正常の健康なマウスに示します血の特徴的な急激な上昇グルコース、グルコース チャレンジ後 15-30 分。
その後のグルコース取り込み、筋肉、脂肪組織、肝臓組織が主に実施は、血中グルコース濃度を徐々 に減少につながります。すべての実験で LFD 給電マウスはグルコース耐性コントロール グループを務め、したがって予想される代謝プロファイルを達成: ~ 240 Mg/dl の血糖値のピークは、すぐにはグルコース投与後約 15 分に到達しました。適切なグルコースの除去を示すグルコース チャレンジ後基底レベル約 60 分に到達減少が続きます。対照的に、HFD マウス約 〜 320 mg/dL グルコースでピークを示し、ブドウ糖の処分はほぼグルコース耐性を示しませんします。(図 5 a-の結果を検証する基準血糖上 (AUC) 曲線下面積の計算を実行する必要があります (この代表的な例) のように空腹の状態で既に 2 つのグループ間の血糖値が異なる場合、b)。
さらに、このモデルの基になる病態の詳細についてを提供するためにインシュリン ELISA テスト (図 5 c) を使用して循環血中インスリン濃度を求めた.飼育、HFD マウスを示した 16-fold 断食レベルとして HFD による代償高インスリン血を示す大幅増加したインスリン応答と同様に、対照群に比較して高いインスリン レベルはほぼコントロール グループに変更したに対しインスリン抵抗性によって引き起こされる減らされたブドウ糖除去能力を相殺しようとしました。ただし、過剰解釈、OGTT の結果このテストはインスリン作用を直接評価されませんし、インスリン抵抗性についての声明を締結する使用しないでくださいに注意してください。
HFD 給電マウスにおけるインスリン感受性を測定、ITT は、OGTT (図 6 a) 後 1 週間に行った。このアッセイでは、血にグルコース濃度はインスリン投与落ちる程度は全身のインスリン作用の効率を表しています。HFD 給電マウスは、インスリン抵抗性を示唆、ITT の中にすべての時点で、LFD 給電制御グループと比較して血糖値の障害の減少を示した。ITT の結果は通常、血糖値がさらにまた図 6bに示されているようにベースライン グルコース下 AUC を示す可能性があります逆の時間経過として提示されます。比較グループの似たような空腹時血糖値 (これはこの実験の場合ではない) であれば、ITT の中に血糖値も基底ブドウ糖の割合として表示できます。血糖値を下回る18〜 80 mg/dL した場合、インスリン counter-regulatory 応答マウスにようにアクティブ化: 特定のマウス モデルでこの counter-regulatory の応答の欠陥は、インスリン感受性の増加として誤解されること。HFDs とその後の代謝表現型実験の間に飛び地が頻繁に発生します。HFD、重量または異常な空腹時血糖やインスリン レベルを示すものを得るかマウスは、解析から除外する必要があります。後者の 2 つの外れ値テストが実験グループごとに個別に実行する (例えばグラブスのテスト)
本研究で例として示したと生体内での代謝実験のデータを解釈をマウスの食事が誘発する肥満、耐糖能異常、インスリン抵抗性を行い正常体重のコントロール グループにそれらを比較します。耐糖能障害と肥満マウス; 年齢をマッチさせた対照マウスと比較してインスリン抵抗性と一貫性のある高インスリン血があった予想通り、これは比較的実行しやすい老舗で信頼性の高いの時間と、予算にやさしいメソッドを使用して発見されました。耐糖能、インスリンのレベルもインスリン感受性のようにすべては OGTT と ITT の示された方法によって得られるの違いはしばしばなどより高度な実験を含む研究の次のステップを計画する助けることができます。高血糖や応じてクランプだけでなく、単離膵島での実験。
図 1。推奨される食事療法の政体と代謝回路図タイム テーブルは、生体内で実験します。マウスにおける HFD の代謝効果を調査するために実験群の動物に HFD 生後約 6 週でコントロール グループが、LFD を受け取ります。マウスの体重は、適切な体重を評価するために週単位で決定する必要があります。約 12 週間ダイエット (または研究仮説によって選択された時点) 後、回復時間とその後、ITT の 1 週間続いて、OGTT によるマウスの代謝表現型の評価します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。代謝実験中に採血方法。繰り返しの採血が必要な ITT は OGTT を同様に、glucometer と血糖値の決定に続いて鋭いハサミ (バリアント A)、尾の先端の 1-2 mm 部分を慎重に切って経由で採血をお勧めしますと。さらにインスリン レベルとその他の関連の血液の値を決定する毛細血管血のコレクションです。また、血液もサンプリングされる尾静脈 (バリアント B) を介して、または動脈カテーテル (表示されていません)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。グルコース (a) と腹腔内のインスリン注射 (b) の経口。OGTT (、) の間に給餌針と ITT (b) 中にインスリンの腹腔内注入を使用した経口ブドウ糖管理の代表的なイメージ。詳細な説明のためのプロトコルを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。HFD 給電し、LFD 給電 c57bl/6 j マウスの体重増加を体します。C57bl/6 j マウスが 60 に設定 %hfd、または 10% LFD 20 週間の期間のコントロールとして機能します。HFD のマウスの食事療法の最初の週を中心に体重の増加が予想を示した、LFD 与えられたマウスは、観測期間中ほぼ一定の体重を示した。結果は、平均 ± SEM. *p < 0.05 * * p < 0.01、 * * * p < 0.001。n = グループあたり 30。ANOVA とテューキー投稿アドホックテストの違いをテストする使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。HFD 給電し、LFD 給電 c57bl/6 j 動物で OGTT を実行します。OGTT の間に (、) ブドウ糖のレベル。一晩絶食後血糖 (mg/dL) は強制経口投与 (1 g グルコース/kg) を介して経口ブドウ糖溶液の投与の後空腹状態、15、30、45、60 分で測定した.HFD グループの血糖上昇グルコース チャレンジ後だけでなく、空腹の状態で。ピークに達した後 15 分遅れ、遅い増加を減らします。結果は、平均 ± SEM. *p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001。n = グループあたり 30。ANOVA および Tukey のホックをポストのテストを使用して統計分析を行った。(b) ブドウ糖「OGTT 中 (AUC) 曲線下面積。ベースライン修正 AUC を計算する基底グルコース レベル (時点 0) すべての後それぞれのマウスの血糖値を個別に取得、個々 の Auc の計算の順から引かれて。上記基準血糖 AUC は、HFD 給電マウスにおけるグルコース耐性を示しています。ANOVA および Tukey のホックを投稿テスト (血糖値) または学生の 2 尾tを使用して統計分析を行った-テスト (AUC)。(c)OGTT の中にインシュリンのレベル。強制経口投与 (1 g グルコース/kg) を介して経口ブドウ糖溶液の投与後 4 h ・ 15、30、60 分の断食期間後 (ng/mL) のインスリン レベルを測定しました。HFD 給電マウスの血中インスリン濃度が増加してブドウ糖注射液の補償だけでなく、彼らはまた開始し、対照群と比較して高いインシュリンのレベルで、OGTT を終わった。結果は、平均 ± SEM. *p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001。n = グループあたり 30。ANOVA および Tukey のホックをポストのテストを使用して統計分析を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。ITTs HFD 給電し、LFD 給電 c57bl/6 j 動物で実行します。ITT の間に (、) ブドウ糖のレベル。(Mg/dL) 血糖測定した空腹状態、15、30、45、60 分のインスリンの注入後腹腔内 (0.75 U インスリン/kg)。なのかとか、中には、HFD 与えられたマウスは高いブドウ糖のレベルを示した。血糖値は、インスリン注射後の HFD 給電マウスで適切の下げられたないです。結果は、平均 ± SEM. *p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001。n = グループあたり 30。ANOVA および Tukey のホックをポストのテストを使用して統計分析を行った。(b) ブドウ糖「ITT 中 (AUC) 曲線下面積。ベースライン修正逆 AUC を計算する基底グルコース レベル (時点 0) 個別にそれぞれのマウスのすべての後で得られた血ブドウ糖のレベルから引かれて。値が-1 と倒立 (乗算)、個々 の Auc の計算が続きます。OGTT 時 HFD 給電マウスにおけるグルコース レベルの結果としては、ベースラインは AUC が低かったさらに減らされたインシュリンの感受性が示唆されたコントロール マウスと比較された HFD 給電マウス逆を修正しました。ANOVA および Tukey のホックを投稿テスト (血糖値) または学生の 2 尾tを使用して統計分析を行った-テスト (逆 AUC)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1。実験準備のためのチェックリストです。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 2。ITTs 中レベルのインスリン。血漿インスリンのレベル両方のグループでインスリン投与後血中インスリン類似のダイナミクスを示した HFD 供給グループ対 LFD 供給で ITT の中に。予想通り、HFD マウスは対照群と比較して強く高められた基礎インスリン レベルを示した。さらに、HFD 給電マウスのインスリン濃度の上昇が強くが部分的に原因除脂肪体重の過大評価によって全身の質量 (従来の正規化のアプローチ) にして、インスリン注射の量を計算する場合この実験で実行します。しかし、インスリン応答された HFD 供給グループ (血漿グルコース レベルの不十分な減少) の障害、これらの動物のインスリン抵抗性の状態を強調したため、さらに。結果は、平均 ± SEM. *p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001。ANOVA および Tukey のホックをポストのテストを使用して統計分析を行った。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
糖尿病および世界の人口に関連する疾患の有病率高がある分子メカニズム、予防、および19疾患の治療に対処研究強い要件。提案するプロトコルは、世代 HFD マウスの全身代謝変化の評価のための強力なツールは、OGTT と ITT、伝導と同様に代謝の研究に使用される堅牢な動物モデルの確立した方法をについて説明しますなどインスリン抵抗性。本稿で示される方法は、薬理学的、物理的、または遺伝的食餌療法療法全身糖代謝9,10と同様に、疑いのある遺伝子、環境要因の役割を研究する役に立つかもしれません。(Co-) によって提示されたプロトコルを変更ことがあります、ブドウ糖で、OGTT のインスリン分泌のための主刺激としては、他の栄養素とインスリン応答2を変更する知られているホルモンなどの物質を適用します。同様に、ITT プロトコルは、個々 の研究の質問によると、他の物質 (例えばグルカゴンやカテコールアミン) (co-) アプリケーションによって修正されるかもしれません。記述されていた OGTT と ITT プロトコルの主な読み出しが血中のブドウ糖とインスリンの濃度;しかし、mRNA やタンパク質のレベルでさまざまな代謝マーカーだけでなく、グルカゴン、脂肪酸、リポ蛋白など他の血液パラメーターの測定は、研究の目的に応じて有用なもあります。
調査官は、全体的な代謝表現型と同様に、低血糖、インスリン分泌、インスリン作用への神経内分泌応答が強く10マウスの遺伝的背景に依存する注意すべき。ここでは、我々 を使用マウス c57bl/6 j の遺伝的背景の中で糖尿病の HFD 誘起モデルとしてニコチン酸アミド ヌクレオチド トランスヒドロゲナーゼ遺伝子で自然に発生する削除によるグルコースによるインスリン分泌の部分に障害があります。20、インスリン抵抗8,9を関連付けられたそれらの肥満を研究するための適切なモデルを作るします。しかしここで説明の 5 月をプロトコルまた代謝、インスリン抵抗性と糖尿病、イネの障害または β 細胞21,の化学的破壊に基づく通常の代替のマウス ・ モデルを特徴付けるに利用します。22,23. 実験的なデザイン上のご注意は、インスリン感受性低下年齢24で、同性からマウスで実験を行うと年齢をマッチさせたマウスをテストします。とおり遺伝の突然変異および治療セックス25,26に応じて異なる表現型があります、それを個別に男女を調査することをお勧めことがあります。
このプロトコルで記述されている、採血法では、心拍、血流、非生理的結果10をもたらすブドウ糖の新陳代謝に影響を与える可能性があります、麻酔は必要ありません。また、動脈カテーテルを植え付けられるが、実験では、ストレスを処理することがなく血管のサンプリングを可能、また実験に努力、コストだけでなく、動物の損失のリスクを追加します。マウスは、通常、OGTT の断食したマウスは、肝臓のグリコーゲン貯蔵を強く破壊で異化状態を誘発する一晩 (14-18 h)。基準血糖値の変動を低減これ長時間高速代謝率が低下、人間10,27の状況とは対照的であるマウスでのグルコース利用を亢進します。マウスにおける摂食パターンはまた、人間の行動を模倣しないとより短い絶食後、OGTT を行う生理をこうしてかもしれない概日リズムは、全身のブドウ糖代謝28に強い影響を持って、ここに記載されている実験を行った日の時点で考慮することが重要です。アクティブ期間 (暗期) にマウスの代謝を検討するために逆の明暗サイクルがより多くの生理学的な結果を生成する貴重な可能性があります。
投与経路の説明は、テストされている特定の仮説によっても変わるかもしれない。ブドウ糖負荷試験におけるグルコースの経口投与は、胃、消化管運動、ホルモン (インクレチン)、および神経の入力変更し、インスリン応答2,を延長より変数のインスリン分泌につながる10. 井戸の中に「インクレチン効果」、腸のリードからブドウ糖の吸収など GLP1 は、経口ブドウ糖配信インスリン リリース29を促進する消化管ホルモンのリリースを説明しました。これらの影響を回避するためにブドウ糖の塊がありますもされる静脈内投与 (IVGTT) または腹腔内 (IPGTT)。グルコースとインスリンの両方のツアーの選択した配送ルートによって異なります。OGTT に比べると、グルコースの腹腔内投与につながる血中ブドウ糖増加し、延長ピーク血漿中インスリン濃度上昇遅延、しかしより多くの持続的な方法30。同様に、ブドウ糖の静脈内投与は、遅延インスリン応答31が特徴です。OGTT で得られたより堅牢な AUC インスリン データと同様、インシュリンの急激な増加、グルコースの経口デリバリーかもしれない示唆における糖代謝の変化を検出するより敏感な HFD 給電マウス30,対チョウ飼育31. 胃内および腹腔内の配信が、静脈内投与は通常より困難としてマウス32よりストレスの多い動物および技術的な難しさの重要度の点で似ています。さらに経口投与は、腸管内腔やグルコース配信と再配布の33,のための34の率に影響を与える可能性があります胃に腹腔内注射時にエラー率 10-20% を排除します。
グルコース配信の最も生理的なルートですが、OGTT は、完全な食事には、タンパク質、炭水化物、脂肪、繊維、微量栄養素も含まれています、グルコース吸収のみのための会計で制限されます。グルコース投与マウスの体重を基に、通常 1-3 g グルコース/kg 体重の投与35,36する OGTT の中に標準的な方法です。特定のケースでは、糖耐性30を明らかにする 1 g/kg より高い糖負荷が必要。肥満や糖尿病のマウスモデルの多くは、除脂肪体重 (筋肉・脳・肝臓) グルコース処理のメインのサイトであるがそれに比例して変わらない、体組成、特に体脂肪量の大幅な増加の変化によって特徴付けられます。体重に従来の正規化手法は非肥満のマウスに比べて肥満マウスで無駄のない組織は、公開されているブドウ糖の disproportionally 高い線量でこうしてなります。このバイアスは高いブドウ糖投与30に増加します。したがって、最適な (ITT) インスリンと同様にブドウ糖 (OGTT) の投与する必要がありますに基づいて計算されます除脂肪体重体組成データが利用可能な37場合。技術的な制限により体組成の評価ができない場合投与対象となる体重 (補足図 2) によると場合に最後の手段など人間 OGTT で固定用量を適用する必要がありますしながらマウス10,35,36でこれらのテストを実行します。提案するプロトコル、手持ち全血モニター OGTT と ITT などの少量の血液ボリュームの複数のサンプリングを必要とするテストで有利な血糖値の測定に使用されました。ただし、これらのデバイスは、ダイナミック レンジが低下を有する人間の血のため設計されています。また、血糖値のレベルで測定できる収集した血漿検体、例えば、によって完全に自動化ルーチン研究所での化学分析装置です。に加えてインスリン、C-ペプチド単位 β 細胞の分泌機能は、インスリン38,39と対照をなして肝臓によって抽出されていませんより直接的な指標として記述されていたプロトコルで可能性があります。糖新生は、評価する必要があります、ピルビン酸負荷試験 (PTT) が適用されて、ピルビン酸塊40投与後血糖ツアーを監視、ここで記述されていたプロトコルの別の亜種であります。
OGTT と ITT 缶のここで説明されているアプローチはしばしば耐糖能の観察された相違を説明し、どのそれに続くより高度な実験を次に実施を示唆するさらなる (例えば、血糖クランプまたは膵島に関する研究)。要約すると、我々 は HFD 誘発マウス モデルの生成のための単純なプロトコルを提示、さらに OGTT と ITT、体内新陳代謝の表現型の変化を評価するための強力なツールと研究に有用である可能性がありますを記述します。代謝関連疾患のメカニズムだけでなく、新規治療法。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、ウィーン市、Österreichische 協会 für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie の市長の医療科学基金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa - Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa - Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid - Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline - creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
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