Summary
O atual artigo descreve a geração e caracterização metabólica de ratos alimentados com dieta de alto teor de gordura como um modelo de obesidade e resistência à insulina induzida pela dieta. Possui ainda mais protocolos detalhados para executar o teste de tolerância à glicose oral e o teste de tolerância à insulina, monitoramento de alterações de todo o organismo de glicose metabolismo na vivo.
Abstract
A obesidade representa o mais importante fator de risco único na patogênese do diabetes tipo 2, uma doença que se caracteriza por uma resistência à captação de glicose estimulada por insulina e uma descompensação bruta do metabolismo da glicose sistémica. Apesar dos progressos consideráveis na compreensão do metabolismo da glicose, os mecanismos moleculares da sua regulação na saúde e na doença permanecem sob-investigado, enquanto novas abordagens para prevenir e tratar o diabetes são urgentemente necessárias. Níveis de dieta derivada de glicose estimula a secreção pancreática de insulina, que serve como o principal regulador dos processos anabólicos celulares durante o estado alimentado e, assim, equilibra a glicose no sangue para manter o status de energia sistêmica. Sobrealimentação disparadores meta-inflamação crônica, que leva a alterações na insulina periférica associada do receptor a sinalização e assim reduz a sensibilidade à eliminação de glicose mediada por insulina. Esses eventos, finalmente, resultam na glicemia de jejum elevada e níveis de insulina, bem como uma redução na tolerância à glicose, que por sua vez, servem como importantes indicadores da resistência à insulina. Aqui, apresentamos um protocolo para a geração e caracterização metabólica de dieta hiperlipídica (HFD)-alimentou ratos como modelo usado com frequência de resistência à insulina induzida pela dieta. Podemos ilustrar em detalhes o teste de tolerância à glicose oral (OGTT), que monitora a disposição periférica de uma secreção de carga e insulina glicose administrada por via oral ao longo do tempo. Além disso, apresentamos um protocolo para o teste de tolerância à insulina (ITT) monitorar a ação da insulina de corpo inteiro. Juntos, esses métodos e suas aplicações a jusante representam ferramentas poderosas para caracterizar o fenótipo metabólico geral de ratos, bem como avaliar especificamente alterações no metabolismo da glicose. Eles podem ser especialmente úteis no campo de pesquisa amplo de resistência à insulina, diabetes e obesidade para fornecer uma melhor compreensão da patogênese, bem como para testar os efeitos de intervenções terapêuticas.
Introduction
No mundo desenvolvido, obesidade e diabetes atingiu dimensões epidemias devido à inatividade física e o consumo excessivo de alimentos processados, efeitos que são impulsionados pela rápida urbanização, industrialização, bem como a globalização. Embora pesquisas sobre resistência à insulina e é co-morbidades, tais como dislipidemia e aterosclerose, ganhou destaque durante as últimas décadas, os mecanismos biológicos complexos que regulam o metabolismo na saúde e na doença permanecem incompleta Entendido e ainda há uma necessidade urgente de novas modalidades de tratamento prevenir e tratar essas doenças1.
Insulina e é counter-regulatory hormônio glucagon servem como os principais reguladores do balanço de oferta e macronutrientes energia celular, mantendo assim também de concentrações de glicose de sangue sistêmico adequado2. Glicose em si atua como um dos principais estimuladores da secreção de insulina pelas células β do pâncreas, enquanto outros macronutrientes, fatores humorais bem como entrada neural mais modificar essa resposta. Insulina, consequentemente, desencadeia os processos anabólicos do estado federal facilitando a difusão de glicose no sangue em excesso em músculos e células de gordura e mais ativando glicólise, bem como proteínas ou síntese de ácidos graxos, respectivamente. Além disso, insulina suprime a saída de glicose hepática, inibindo a gliconeogênese. Consumo de energia em excesso crônico e meta-inflamação levar a hiperinsulinemia e a resistência de insulin periférica devido a para baixo-regulamento da expressão do receptor de insulina, bem como alterações nas vias de sinalização a jusante, resultando assim em prejudicada sensibilidade à eliminação de glicose mediada por insulina, bem como a insuficiente inibição da produção hepática de glicose3,4,5,de6.
Uma vasta gama de modelos animais com indução experimental, nutricional ou genética da doença tem sido provado para ser excelentes ferramentas para estudar os mecanismos moleculares da resistência à insulina e várias formas de diabetes, bem como seus acompanhamento doenças7 . Um exemplo é o modelo amplamente utilizado e bem estabelecida HFD-induzido do rato, que é caracterizado pelo rápido ganho de peso devido ao aumento da ingestão dietético em combinação com redução da eficiência metabólica, resultando em insulina resistência8, 9. tanto em modelos animais e humanos, uma elevação em jejum níveis sanguíneos glicose e insulina, bem como uma tolerância prejudicada à administração de glicose são utilizados indicadores de resistência à insulina e outras alterações sistêmicas de glicose metabolismo. Monitoramento glicose e insulina os níveis de sangue no estado basal ou após estimulação, portanto, são leituras facilmente acessíveis.
O presente protocolo descreve a geração de HFD-alimentou ratos, bem como dois métodos usados com frequência, o teste de tolerância à glicose oral (OGTT) e teste de resistência a insulina (ITT), que são úteis para caracterizar o fenótipo metabólico e investigar alterações no metabolismo da glicose. Descrevemos o OGTT detalhadamente, que avalia a eliminação de uma secreção de carga e insulina glicose administrada por via oral ao longo do tempo. Além disso, nós fornecemos instruções sobre como conduzir a ITT para investigar a insulina-ação do corpo inteiro ao monitorar a concentração de glicose do sangue em resposta a um bolus de insulina. Os protocolos descritos neste artigo são bem estabelecidos e têm sido usados em vários estudos10,11,12. Além de pequenas modificações que podem ajudar a aumentar o sucesso, nós fornecemos orientações para delineamento experimental e análise de dados, bem como dicas úteis evitar possíveis armadilhas. Os protocolos descritos neste documento podem ser ferramentas muito poderosas para investigar a influência da genéticas, farmacológicas, dietéticas e outros fatores ambientais sobre o metabolismo de glicose de corpo inteiro e em seus distúrbios associados como resistência à insulina. Estimulação com glicose ou insulina, além de uma variedade de outros compostos pode ser utilizada para estimulação dependendo da finalidade da pesquisa individual. Embora fora do escopo deste manuscrito, muitas outras aplicações a jusante podem ser executadas sobre as amostras de sangue desenhada, como a análise dos valores de sangue além de glicose e insulina (por exemplo, lipídios e lipoproteínas perfis) bem como detalhadas análise dos marcadores metabólicos (por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR) quantitativa em tempo real, análise ocidental do Borrão e ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA)). Ainda mais a citometria de fluxo e fluorescência ativado celular classificação (FACS) podem ser aplicadas para investigar os efeitos nas populações distintas única célula, enquanto transcriptomic, proteómica e metabolómica abordagens também podem ser utilizadas para análise não segmentado.
No geral, nós fornecemos um protocolo simples para gerar um modelo de rato induzida por HFD, enquanto descrevia ainda mais duas abordagens poderosas para estudar alterações metabólicas de todo o corpo, o OGTT e a ITT, que pode ser ferramentas úteis para estudar a patogênese da doença e desenvolvimento de novas terapias, especialmente no campo do metabolismo associadas a doenças como resistência à insulina e diabetes.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da universidade médica de Viena e cuidado Animal e realizados de acordo com a Federação de Europeu laboratório Animal ciência associações (FELASA). Por favor, note que todos os procedimentos descritos no presente protocolo só devem ser realizados após a aprovação governamental e institucional, bem como pelo pessoal que são tecnicamente eficientes.
1. HFD-alimentou ratos
Nota: Manter todos os camundongos C57BL/6J em um ciclo de luz/escuro de 12-h com acesso gratuito à comida e água.
- Com 6 semanas de idade, coloque os ratos para 8-12 semanas em um HFD (40-60% gordura calorias) para induzir a obesidade, enquanto o grupo-controle magro de alimentação uma dieta de baixo teor de gordura (LFD) (10% de gordura calorias).
- Determine o peso corporal dos ratos em uma base semanal. As curvas de peso devem mostrar padrões similares em ambos os grupos, com uma inclinação superior no grupo HFD-alimentados.
2. OGTT
Nota: Se os pontos de tempo de amostragem de sangue são escolhidos durante OGTT a cada 15 min, o experimento deve ser realizado com um máximo de 15 ratos em paralelo, a fim de ter pelo menos 1 min-tempo de manuseio por rato.
- Preparativos no dia anterior OGTT
- Transferir os ratos em uma gaiola com roupa de cama fresca e rápido-los durante a noite antes do teste (14 h), garantindo que os ratos têm acesso à água potável (por exemplo, remover o alimento às 18:00 para uma hora de início, na manhã seguinte às 08:00).
Nota: Ratos de jejum durante a noite é a abordagem padrão, no entanto um jejum mais curto (5-6 h) é mais fisiológico para ratos (veja a discussão para detalhes).
- Transferir os ratos em uma gaiola com roupa de cama fresca e rápido-los durante a noite antes do teste (14 h), garantindo que os ratos têm acesso à água potável (por exemplo, remover o alimento às 18:00 para uma hora de início, na manhã seguinte às 08:00).
- Preparativos no dia do experimento (mas antes da experiência)
- Prepare-se 10 mL da solução de glicose de 20% (dissolver D-(+)-glicose em água destilada).
Nota: Todos os reagentes que são administrados aos animais tem que ser classe farmacológica e estéril. - Preparar uma placa de 96 poços para coleta de plasma, através do preenchimento de um poço para cada ponto de tempo de amostragem e cada rato, com 5 µ l NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8.0 em 0,9% NaCl, armazenamento em RT). Durante o experimento, armazene esta placa no gelo.
Nota: Ver complementar Figura 1 para uma lista de verificação detalhada.
- Prepare-se 10 mL da solução de glicose de 20% (dissolver D-(+)-glicose em água destilada).
- Medir o peso corporal de todos os mouses e marcar suas caudas com um marcador permanente para que os ratos facilmente distinguíveis (por exemplo, traço do rato 1 = 1, traços de rato 2 = 2, etc.).
- Medição de glicose e de amostra de sangue (Figura 2)
- Cuidadosamente corte 1-2 mm da ponta da cauda com uma tesoura afiada ("A variante" na Figura 2). Sempre limpe a primeira gota de sangue para evitar hemólise ou contaminação com fluido de tecido antes de tomar amostras de sangue novo para determinação de glicose do sangue. Desenhe uma amostra pequena de sangue (~ 3 µ l) para a medição do nível de glicose sangue basal (= ponto de tempo 0) com o glicosímetro.
Atenção: Verifique e ajuste o número de carga de tiras de teste em um monitor de glicose.
Nota: Como um método de amostragem de sangue alternativo, cortar a veia lateral da cauda de um rato com uma lâmina de bisturi afiado ("variante B" na Figura 2). Veia lateral da cauda geralmente é acessada aproximadamente um terço ao longo do comprimento da cauda da ponta da cauda, movendo-se em direção à base da cauda para várias amostras. Recomenda-se o uso de um creme anestésico local. Interromper o fluxo de sangue, aplicando pressão com o dedo sobre os tecidos moles pelo menos 30 s antes que o animal é retornado à sua jaula. - Recolha uma amostra de sangue (cerca de 30 µ l) usando um tubo capilar fresco (manter o tubo capilar horizontal). Esvazie o tubo capilar com uma pipeta, colocando a ponta da pipeta na parte superior da extremidade do tubo capilar e, com cuidado, empurrando o sangue coletado em um poço da placa de 96 poços, evitando bolhas de ar. Repita este procedimento para todos os mouses - um de cada vez.
Nota: Como uma alternativa para coleta de sangue através de um tubo capilar, usar uma pipeta ajustada para o volume correcto (por exemplo, 30 µ l) para coletar o sangue, ou coletar uma gota de sangue da cauda na película de parafina e pipeta-para a solução de EDTA. Estritamente, evite o contato da vaselina com tiras de teste de sangue ou glucometer, como ele pode influenciar medições posteriores de glicose e insulina.
Atenção: O OGTT é muito estressante para ratos: ratos magros podem perder cerca 15% de seu peso corporal durante um jejum durante a noite. Além disso, amostras de sangue em pontos diferentes do tempo leva a uma considerável perda de sangue. Para amostragem de sangue mais fácil, é possível massagear cuidadosamente o mouse-tail com vaselina.
Nota: As orientações institucionais podem limitar a quantidade admissível de sangue coletado dentro de um determinado período. Os volumes de amostragem e momentos devem ser ajustados para não exceder os valores máximos permitidos. O peso corporal dos ratos deve ser usado para calcular o total permitida de retirada de sangue.
- Cuidadosamente corte 1-2 mm da ponta da cauda com uma tesoura afiada ("A variante" na Figura 2). Sempre limpe a primeira gota de sangue para evitar hemólise ou contaminação com fluido de tecido antes de tomar amostras de sangue novo para determinação de glicose do sangue. Desenhe uma amostra pequena de sangue (~ 3 µ l) para a medição do nível de glicose sangue basal (= ponto de tempo 0) com o glicosímetro.
- Calcular o volume necessário de solução de glicose com base no peso corporal (1G glicose/kg de peso; esta pode ser aumentada até 3 g/kg) deve ser administrado por gavagem oral para cada rato. Por exemplo, um mouse com um peso de 30 g precisaria de 150 µ l de uma solução de glicose de 20% para administrar a 30 mg de glicose.
Nota: Para a base a dose de glicose no peso do rato é o procedimento padrão. Se estiverem disponíveis dados de composição do corpo, a dose de glicose OGTT deve ser calculado com base na carne magra massa corporal (ver discussão para detalhes). - Administração de glicose
- Prepare tudo o que é necessário durante todo o experimento com antecedência (temporizador, folha de registo do experimento, seringas de tiras, capilares e monitor de glicose, solução de glicose, placa de 96 poços, bisturi, calculadora, equilíbrio, marcador permanente, os papéis do banco, um pipeta com uma ponta e luvas).
- Para aplicação de glicose, contenha o rato agarrando-a firmemente pela nuca. Aplique bastante firmeza para a pele ao redor do pescoço para impedir que o mouse torcendo fora a conter e devidamente incline sua cabeça para trás. Também, certifique-se de que o rato pode respirar corretamente.
Nota: Uma vez que a administração de glicose é iniciada, gerenciamento de tempo bom é muito importante. - Administre com cuidado a solução de glicose (com base na etapa 2.5) diretamente para o estômago, usando uma agulha de alimentação. Cautelosamente direto a agulha alimentação através da boca para o esôfago. Permitir que o mouse para engolir a agulha: a agulha afunda-se inteiramente dentro do esôfago/estômago inferior do mouse. Então injete a solução de glicose (Figura 3a).
- Se encontrar qualquer resistência ou se o animal se esforça imediatamente, retirar a agulha e reposicioná-lo. Iniciar o temporizador imediatamente após a primeira gavagem e administrar glicose para todos os outros ratos em intervalos de 1 min.
Nota: Pode ser útil aplicar uma gota de solução de glicose diretamente da agulha de alimentação para a boca do rato, que estimulará a lamber e engolir, facilitando, assim, mais fácil inserção da agulha alimentação. Não aplique pressão ao inserir a agulha de alimentação como isto pode ferir gravemente o animal.
- Se encontrar qualquer resistência ou se o animal se esforça imediatamente, retirar a agulha e reposicioná-lo. Iniciar o temporizador imediatamente após a primeira gavagem e administrar glicose para todos os outros ratos em intervalos de 1 min.
- Depois de 15 min, medir os níveis de glicose do sangue com o glicosímetro e além disso tirar amostras de sangue (~ 30 µ l) (como descrito em detalhe na etapa 2.4) de cada mouse na mesma ordem, como eles foram injetados.
Nota: A gestão do tempo é muito importante; seguem-se tanto quanto possível, usando os mesmo intervalos de tempo quanto a gavagem. Deixe os ratos circular tão livremente quanto possível e limite de restrição a um mínimo durante todo o processo para reduzir o stress, que pode modificar os resultados. Leite a cauda com uma mão e coletar o sangue com o outro. - Repita a etapa 2.7 em pontos de tempo selecionado, dependendo dos resultados esperados (por exemplo, em 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 min após a administração de glicose). Se os pontos de tempo selecionado são mais de 120 min, certifique-se de que os ratos têm acesso à água potável. Certifique-se de que os ratos sempre têm acesso à água potável. Quando terminar com o experimento, retorne os ratos para casa gaiolas equipadas com comida e água.
Atenção: O OGTT é muito desgastante para os ratos. Portanto, espere pelo menos 1 semana antes de realizar o próximo teste metabólico, tais como um ITT. - Após o experimento, Centrifugar as amostras de sangue em 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Transferi o sobrenadante (plasma) para esvaziar as cavidades da placa e armazená-lo a-20 ° C até análise.
- Gravar a hemólise das amostras, se presente (ver secção 3).
- Determinar os níveis de insulina de plasma usando um ELISA comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as instruções do fabricante do kit.
Nota: Dependendo do estado de jejum, bem como sobre o metabolismo dos ratos investigados, dificuldades durante este ensaio podem ocorrer: níveis de insulina de jejum durante a noite (ponto de tempo 0) aproximam-se muito baixo e, portanto, o limite de detecção. Para evitar esse problema, dobrar a quantidade de volume de plasma recomendados e consequentemente reduzir pela metade o resultado do ensaio ELISA. Por outro lado, se os ratos alcançar o pico de insulina durante OGTT, especialmente em ratos HFD-fed, os níveis de insulina podem exceder o limite de detecção: diluir a amostra (por exemplo, 10 vezes com 0,9% NaCl) e repetir o ensaio de ELISA. Hemólise em amostras de plasma pode levar à degradação da insulina, resultando em uma diminuição dos valores de leitura. A degradação depende do tempo, temperatura e a concentração de hemoglobina na amostra. Sempre manter amostras hemolisadas frio ou no gelo para reduzir a degradação de insulina.
3. ITT
Nota: As mesmas precauções descritas para OGTT (manipulação de camundongos, sangue, glicosímetro e uso vaselina) também deve ser aplicada ao realizar a ITT. Por exemplo, todas as injeções devem ser efectuadas 15 min em intervalos de 1 min se 15 ratos são testados em paralelo. Para a ITT, subsequente coleta de amostras de sangue com tubos capilares é opcional.
- Preparações antes do experimento
- Rápido de ratos pelo menos 2 h antes da injeção de insulina, garantindo que os ratos têm acesso à água potável (por exemplo, remover o alimento às 08:00, teste de ratos 2-5 h mais tarde).
- Diluir a insulina 1:1,000 em 0,9% NaCl (estoque: 100 insulina U/mL; trabalho concentração 0.1 U/mL) e prepare-se 20% de glicose (D-(+)-solução de glicose dissolvida em água destilada) deve ser administrado se os ratos tornam-se hipoglicemia.
Nota: A ITT normalmente é realizada após um rápido curto para evitar o hipoglicemia, que caso contrário pode ocorrer na noite jejuou animais. Todos os reagentes que são administrados aos animais precisam ser classe farmacológica e estéril.
- Medir o peso corporal de ratos, marcar a cauda, corte a ponta da cauda com uma tesoura afiada e medir glicemia basal como descrito anteriormente para o OGTT na etapa 2.4.
- Injeção de insulina
- Para injetar insulina intraperitonealmente (0,75 U insulina/kg de peso corporal, calculado de antemão), conter o mouse pelo método de nuca.
- Use um fresco, estéril 27 ou 30 medidor de agulha para cada animal evitar o desconforto e o risco de qualquer infecção do local da injeção.
Nota: A esterilização da pele pode prolongar a duração da administração de insulina e assim pode causar perturbações adicionais para o animal. Portanto, não é recomendável. - Incline a cabeça do rato para baixo em um ângulo ligeiro para expor o lado ventral do animal. Coloque a agulha com o bisel para cima e em um ângulo de 30 ° no quadrante inferior direito do abdômen do animal (Figura 3b). Inicie o temporizador imediatamente após o primeiro rato é injetado.
Nota: É de baixa dose (0,1 U/kg) podem ser realizados para avaliar especificamente a sensibilidade hepática à insulina. Quanto o OGTT, cálculo do volume de injeção com base no peso corporal é o procedimento padrão, enquanto baseando a dose corporal magra massa é preferida se estiverem disponíveis dados de composição do corpo.
- Medir os níveis de glicose no sangue em pontos de tempo selecionado (por exemplo, após 15, 30, 45, 60 e 90 min).
Nota: Como a insulina tem um curto intervalo de ~ 10 min em ratos13, tarde diferenças após a administração de insulina (por exemplo, depois de 2 h) podem não refletir um efeito direto da ação da insulina. Administrar a solução de glicose de 20% no caso de um mouse torna-se hipoglicemia (níveis de glicose abaixo de 35 mg/dL de sangue) e está em risco de morrer. - Depois que o tempo final aponta, coloque os ratos volta em suas gaiolas casa preparadas com muita comida e água.
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Representative Results
A Figura 1 ilustra um cronograma esquemático para fenotipagem metabólico de ratos em dietas. Com uma idade de aproximadamente 6 semanas, os ratos devem ser colocados em um HFD, enquanto um LFD-grupo pode servir como grupo controle. Importante, peso corporal deve ser determinado semanalmente para observar se há um esperado aumento no peso corporal. Qualquer tipo de stress (por exemplo, ruído ou comportamento agressivo masculino) pode interferir no ganho de peso do corpo e deve ser eliminado imediatamente. Cada coorte de ratos para experimentos de dieta deve consistir de pelo menos 10 ratos porque estas experiências-dieta são demoradas, e valores atípicos são frequentes (por exemplo, ratos não ganhando peso ou ratos com anormal da glicose ou os níveis de insulina). Depois de determinado período de tempo (dependendo da hipótese de estudo e o ponto de tempo de mudanças esperadas), OGTT e ITT podem ser realizados para a avaliação da acção de tolerância e insulina glicose. Neste trabalho, foram escolhidos pontos de tempo final para o teste de esforço metabólico.
Importante, deve haver um tempo de recuperação de pelo menos 1 semana entre o OGTT e ITT como estas experiências levam a perda de sangue substancial e são, portanto, muito estressantes para os ratos. Se os volumes de coleta de sangue são diminuída (por exemplo, se executar um ITT sem coleta de sangue adicional primeiro), este período de recuperação também pode ser encurtado ou omitido, em consonância com as diretrizes para vários empates de sangue em animais14, 15,16,17.
Neste estudo grande com 60 camundongos C57BL/6J no total, metade dos ratos foram definidas no HFD ou LFD em uma idade de 6 semanas (n = 30/grupo) e ganho de peso foi monitorizado por 16 semanas na dieta. O consumo de HFD resultou em um aumento significativo no peso corporal, como mostrado na Figura 4. Com 6 semanas de idade, o peso corporal foi de 20,2 g em ambos os grupos. Considerando que os ratos na LFD mostraram uma consistente, aumentando ligeiramente o peso corporal (31,2 g ± 2,7) durante o período observado, ratos na HFD aumentaram seu peso corporal rapidamente, especialmente durante as primeiras semanas e atingiu o seu máximo de peso de corpo após 16 semanas na dieta. Embora as curvas de peso mostraram um padrão semelhante durante o experimento, os ratos do grupo HFD alcançada um 1.5 - a 2 vezes maior peso corporal (44,4 g ± 4.0) em comparação com os ratos LFD-fed.
Para investigar o fenótipo metabólico das duas coortes, foram realizados um OGTT (Figura 5) e ITT (Figura 6). Como o volume de sangue é limitado em pequenos roedores, um ensaio de (POC) point-of-care para os seres humanos diabéticos (glicosímetro) foi utilizado para monitorar níveis de glicose no sangue durante estas experiências de fenotipagem metabólica. Conforme demonstrado na Figura 2, os monitores de glicose do sangue são fáceis de usar, precisa de apenas uma pequena gota de sangue e indicam níveis de glicose no sangue dentro de segundos para documentação. Figura 5 apresenta o curso de tempo absoluto glicose (Figura 5a–.b) e insulina absoluta (Figura 5C) níveis durante o OGTT. Geralmente, um rato saudável com tolerância à glicose normal mostra uma característica rápida ascensão no sangue, glicose, atingindo seu pico 15-30 min após o desafio de glicose.
Absorção de glicose subsequentes, principalmente conduzida pelo fígado-tecido, músculo e gordura-tecido leva a uma diminuição gradual da concentração de glicose no sangue. Em todos os experimentos, os ratos alimentados com LFD serviu como grupo de controle tolerante de glicose em, portanto, cumprido o perfil metabólico esperado: o pico dos níveis de glicose de sangue de ~ 240 mg/dL foi alcançado aproximadamente 15 min após a administração de glicose, imediatamente seguido de uma diminuição, atingindo níveis basais de aproximadamente 60 min após o desafio de glicose, indicando a eliminação adequada de glicose. Em contraste, HFD-ratos atingiu um pico de cerca de ~ 320 mg/dL de glicose em não mostraram quase nenhuma eliminação de glicose, indicando resistência de glicose. Quando os níveis de glicose de sangue entre os dois grupos já diferem no estado de jejum (como neste exemplo representativo), um cálculo da área sob a curva (AUC) acima da glicose deve ser realizado para validar os resultados (Figura 5a– b).
Além disso, os níveis de insulina do sangue circulante foram determinados utilizando um teste de insulina-ELISA (Figura 5C) a fim de fornecer mais informações sobre a fisiopatologia subjacente neste modelo. Considerando que os níveis de insulina eram quase inalterados no grupo controle, ratos alimentados um HFD mostraram 16-fold elevados níveis em relação ao grupo controle, bem como uma resposta de insulina há elevado, indicando a hiperinsulinemia compensatória HFD-induzido, como o jejum uma tentativa de contrabalançar a capacidade de eliminação de diminuição da glicose, que pode ser causada por resistência à insulina. No entanto, esteja ciente para não over interpretar os resultados do OGTT, como este teste não avalia diretamente ação de insulina e não deve ser usado para concluir a declarações sobre a resistência à insulina.
Para medir a sensibilidade à insulina em ratos alimentados HFD, um ITT foi realizada 1 semana após o OGTT (Figura 6a). Neste ensaio, o grau para que o sangue, as concentrações de glicose cair após a administração de insulina representam a eficiência da ação da insulina de corpo inteiro. Os HFD-alimentou ratos mostraram uma prejudicada redução dos níveis de glicose do sangue em relação ao grupo controle LFD-alimentados, em todos os pontos de tempo durante o ITT, sugerindo assim a resistência à insulina. Os ITT resultados apresentam-se geralmente como o curso do tempo dos níveis de glicose, mas além disso também o inverso que auc abaixo da glicose pode ser mostrado como demonstrado na Figura 6b. Se os grupos que são comparados têm semelhante jejum glicemia (que não é o caso neste experimento), os níveis de glicose durante a ITT também podem ser apresentados como a porcentagem de glicose basal. Como em ratos, uma counter-regulatory resposta à insulina é ativada se a glicemia cair abaixo de ~ 80 mg/dL18: defeitos nesta resposta counter-regulatory em um modelo particular do rato podem ser interpretados como um aumento na sensibilidade à insulina. Durante HFDs e subsequentes experimentos fenotípicos metabólicos, valores atípicos podem ocorrer frequentemente. Os ratos que não ganham peso na HFD, ou aqueles mostrando níveis de insulina e/ou anormal da glicose jejum devem ser excluídos da análise. Para os dois últimos, um teste de outlier pode ser realizado para cada grupo experimental separadamente (por exemplo, teste de Grubbs)
Neste estudo, como um exemplo nós mostrou e interpretar dados de experimentos metabólicos na vivo, realizados em ratos com obesidade induzida por dieta, intolerância à glicose e resistência à insulina e comparou-os com um grupo controle com peso corporal normal. Como esperado, houve tolerância à glicose prejudicada e hiperinsulinemia em ratos obesos consistentes com resistência à insulina em comparação com os ratos controle idade-combinadas; Isto foi descoberto usando métodos bem estabelecida, de confiança, tempo e orçamento-amigável, que são relativamente fáceis de executar. As diferenças na tolerância à glicose, os níveis de insulina, bem como a sensibilidade à insulina, que são todos obtidos com os métodos apresentados de OGTT e ITT, muitas vezes podem ajudar a planejar as próximas etapas do estudo, que pode incluir experiências mais sofisticadas tais como hiperglicêmicos ou hiperinsulinêmica grampos, bem como experiências com ilhotas pancreáticas isoladas.
Figura 1. Tabela de tempo esquemático para um regime de dieta sugerida e metabólica experiências na vivo. Para investigar os efeitos metabólicos de HFD em ratos, os animais do grupo experimental são colocados em HFD em aproximadamente 6 semanas de idade, enquanto o grupo de controle recebe um LFD. O peso corporal dos ratos deve ser determinado numa base semanal, para avaliar o ganho de peso adequado. Depois de aproximadamente 12 semanas na dieta (ou um ponto de tempo selecionado dependendo a hipótese de investigação), o fenótipo metabólico dos ratos é avaliado por um OGTT seguido de 1 semana de tempo de recuperação e, posteriormente, um ITT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Métodos de amostragem de sangue durante experimentos metabólicos. Para o OGTT tão bem quanto o ITT, onde a colheita de sangue repetidas é necessária, recomenda-se tirar sangue através de cuidadosamente, corte um pedaço de 1-2 mm da ponta da cauda com uma tesoura afiada (A variante), seguido pela determinação dos níveis de glicose do sangue com um glicosímetro e Além disso, coleta de sangue com um capilar para determinar os níveis de insulina e outros valores relevantes de sangue. Alternativamente, sangue também pode ser saboreada através da veia da cauda (variante B) ou por cateterismo arterial (não mostrado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Gavagem oral de glicose (a) e injeção de insulina intraperitoneal (b). Imagens representativas da administração de glicose oral usando uma agulha alimentação durante OGTT (um) e a injeção intraperitoneal de insulina durante ITT (b). Veja o protocolo para uma descrição detalhada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Corpo de ganho de peso de HFD-alimentados e LFD-alimentados camundongos C57BL/6J. Camundongos C57Bl/6J foram qualquer conjunto em 60% ou 10% HFD LFD para servir como um controle, por um período de 20 semanas. Considerando que os ratos na HFD mostraram um esperado aumento no peso corporal, especialmente nas primeiras semanas na dieta, LFD-alimentou ratos mostraram peso corporal quase constante durante o período observado. Os resultados são média ± SEM. *p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001. n = 30 por grupo. ANOVA e teste post hoc de Tukey foram usados para testar as diferenças. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. OGTT realizada em HFD-alimentados e LFD-alimentados animais C57BL/6J. (um) glicose níveis durante OGTT. Após um rápido durante a noite, os níveis de glicose (mg/dL) foram medidos em jejum e 15, 30, 45 e 60 min após a administração de solução de glicose por via oral através de gavagem (1 g/kg de glicose). Os níveis de glicose no grupo HFD foram elevados no estado de jejum, bem como após o desafio de glicose. Diminuir o aumento atingiu o seu auge após 15 min seguido por um atraso e lento. Os resultados são média ± SEM. *p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001. n = 30 por grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA e do Tukey teste post hoc . (b) área de glicose sob a curva (AUC) durante OGTT. Para calcular a linha de base corrigida AUC, os níveis de glicose basal (ponto de tempo 0) foram subtraídas mais tarde obteve níveis de glicose do sangue para cada mouse individualmente, seguido pelo cálculo das AUCs individuais. A AUC acima da glicose ilustra a resistência de glicose em ratos os HFD-fed. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA e do Tukey teste post hoc (níveis de glicose) ou cauda do aluno, dois t-teste (AUC). (c) Níveis de insulina durante o OGTT. Os níveis de insulina (ng/mL) foram medidos após um período de jejum de 4h e 15, 30 e 60 min após a administração de solução de glicose por via oral através de gavagem (1 g/kg de glicose). HFD-alimentou ratos não só compensados a injeção de glicose com um maior aumento nos níveis de insulina do sangue, eles também começaram e terminaram o OGTT com níveis elevados de insulina em relação ao grupo controle. Os resultados são média ± SEM. *p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001. n = 30 por grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA e do Tukey teste post hoc . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. É realizada em HFD-alimentados e LFD-alimentados animais C57BL/6J. (um) glicose níveis durante ITT. Os níveis de glicose (mg/dL) foram medidos em jejum e 15, 30, 45 e 60 min após a injeção de insulina intraperitonealmente (0,75 insulina U/kg). Durante ITT, HFD-alimentou ratos mostraram níveis elevados de glicose. Os níveis de glicose do sangue não foram adequadamente reduzidos nos ratos alimentados HFD após a injeção de insulina. Os resultados são média ± SEM. *p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001. n = 30 por grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA e do Tukey teste post hoc . (b) área de glicose sob a curva (AUC) durante a ITT. Para calcular o inverso de linha de base corrigida AUC, níveis de glicose basal (ponto de tempo 0) foram subtraídos de todos os níveis de glicose mais tarde sangue obtidos para cada mouse individualmente. Os valores foram invertida (multiplicação com -1), seguido pelo cálculo das AUCs individuais. Como consequência o nível mais elevado de glicose em ratos HFD-fed durante OGTT, a linha de base corrigida inverso que auc foi menor nos ratos alimentados HFD comparados aos ratos controle, que sugeriu mais sensibilidade diminuída à insulina. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA e do Tukey teste post hoc (níveis de glicose) ou cauda do aluno, dois t-teste (inverso AUC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1. Lista de verificação para preparação do experimento. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementar Figura 2. Os níveis de insulina durante ITTs. Níveis de plasma de insulina durante o ITT em alimentados a LFD contra os grupos HFD-alimentados mostrou dinâmica similar nos níveis de insulina no plasma após a injeção de insulina em ambos os grupos. Como esperado, os ratos HFD exibiram os níveis de insulina basal fortemente aumentado em relação ao grupo controle. Além disso, o aumento dos níveis de insulina em ratos os HFD-fed foi mais forte, que pode ser parcialmente causado pela superestimação da massa corporal magra se a quantidade de insulina injetada é calculada com base na massa todo o corpo (a abordagem convencional de normalização) como realizado neste experimento. No entanto, a resposta de insulina foi prejudicada no grupo HFD-alimentados (insuficiente redução dos níveis de glicose do plasma), ainda enfatizando o estado resistente à insulino nestes animais. Os resultados são média ± SEM. *p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA e do Tukey teste post hoc . Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Com a alta prevalência de diabetes e doenças associadas na população do mundo, há uma forte exigência de pesquisa abordando o mecanismo molecular, prevenção e tratamento da doença de19. O protocolo apresentado descreve métodos bem estabelecidos para a geração de ratos HFD, um robusto modelo animal usado para investigação metabólica, bem como a condução do OGTT e ITT, que são potentes ferramentas para a avaliação de alterações metabólicas de corpo inteiro tais como resistência à insulina. Os métodos apresentados neste artigo podem ser útil para estudar o papel dos genes suspeitos, fatores ambientais, bem como terapias farmacológicas, dietéticas, físicas ou genéticas em todo o corpo, metabolismo da glicose9,10. Enquanto a glicose serve como o principal estímulo para a secreção de insulina em um OGTT, o protocolo apresentado pode ser modificado por (co-) aplicar outras substâncias, tais como outros macronutrientes e hormônios que são sabidos para modificar a resposta de insulina2. Da mesma forma, o protocolo ITT pode ser modificado pelo aplicativo (co-) de outras substâncias (por exemplo, o glucagon ou catecolaminas) de acordo com a pergunta de pesquisa individual. O mostrador principal dos protocolos OGTT e ITT descritos é concentrações de glicose e insulina do sangue; no entanto, a medição de outros parâmetros de sangue como o glucagon, ácido graxo e níveis de lipoproteína, bem como de vários marcadores metabólicos no nível de mRNA e proteína também pode ser útil dependendo do objetivo do estudo.
Os investigadores devem estar cientes de que as respostas neuroendócrinas a hipoglicemia, a secreção de insulina, ação de insulina, bem como o fenótipo metabólico geral dependem fortemente do fundo genético dos ratos10. Aqui, utilizamos ratos dentro o fundo genético C57BL/6J como um modelo HFD-induzida de diabetes, que têm uma deficiência parcial na secreção de insulina glicose-mediada devido a uma exclusão ocorre naturalmente no gene nicotinamida nucleotídeo transhydrogenase 20, tornando-os um modelo adequado para o estudo de obesidade associada a insulina resistência8,9. Os protocolos descritos aqui no entanto maio também ser utilizado para caracterizar metabolicamente modelos de mouse alternativos de resistência à insulina e diabetes, que são geralmente baseados em doenças monogénicas ou na destruição química de células β-21, 22 , 23. precauções durante o desenho experimental incluem testes ratos idade-combinadas, como insulin sensibilidade diminui com a idade de24e ainda para realizar os experimentos em ratos do mesmo sexo. Como tratamentos e mutações genéticas podem resultar em fenótipos diferentes dependendo do sexo25,26, também pode ser aconselhável investigar a ambos os sexos separadamente do outro.
O método de amostragem de sangue descrito neste protocolo não requer anestesia, o que pode influenciar a frequência cardíaca, fluxo sanguíneo e metabolismo da glicose, produzindo resultados não-fisiológicos10. Alternativamente, um cateter arterial pode ser implantado, que permite a amostragem vascular sem manipulação stress durante o experimento, mas também adiciona o esforço, custos, bem como o risco de perda de animais para o experimento. Para o OGTT, ratos são tipicamente jejuou durante a noite (14-18 h), que provoca um estado catabólico em camundongos, fortemente esgotar o Glicogênio hepático. Embora isto reduz a variabilidade nos níveis de glicose no sangue de base, o jejum prolongado diminui a taxa metabólica e melhora a utilização da glicose em ratos, que contrasta com a situação em seres humanos10,27. Como os padrões de alimentação nos ratos também não imitam o comportamento humano, pode ser, portanto, mais fisiológica para realizar um OGTT após um curto jejum. Como ritmos circadianos têm um forte efeito sobre o metabolismo de glicose sistémica28, é importante considerar a que hora do dia são realizados os experimentos descritos aqui. A fim de investigar o metabolismo de ratos durante seu período ativo (fase escura), um ciclo claro-escuro invertido pode ser valioso para gerar mais resultados fisiológicos.
A rota descrita da administração também pode variar dependendo da hipótese específica a ser testado. A administração oral de glicose durante um teste de tolerância à glicose leva à secreção de insulina mais variável, como o esvaziamento gástrico, motilidade gastrointestinal, hormônios (incretins) e entrada neural modificar e prolongam a resposta de insulina2, 10. durante o bem descrito "efeito Incretina", a absorção de glicose a partir da intestino leva à liberação de hormônios gastrointestinais como GLP1, que potencializa o lançamento de insulina glicose-entregues oral29. Para contornar esses efeitos, um bólus de glicose também podem ser administrado por via intravenosa (IVGTT) ou intraperitonealmente (IPGTT). Excursões de glicose e insulina tanto diferem significativamente dependendo da rota de entrega escolhido. Em comparação com o OGTT, administração intraperitoneal de glicose leva a um pico prolongado e aumento nos níveis de glicose do plasma, enquanto o aumento dos níveis de insulina de plasma em um atrasado, mas de forma sustentada mais30. Da mesma forma, administração de glicose intravenosa é caracterizada por uma resposta de insulina atrasada31. Os aumentos acentuados em níveis de insulina, bem como dados mais robustos de AUC-insulina obtidos durante o OGTT sugerem que entrega oral de glicose pode ser mais sensível para detectar alterações no metabolismo da glicose em alimentados com comida versus HFD-alimentou ratos30, 31. entrega intragástrico e intraperitoneal são semelhantes em termos de severidade para a dificuldade técnica e animal, enquanto a administração intravenosa é geralmente mais difícil, bem como mais estressante para os ratos de32. Administração oral mais elimina a 10-20% de taxa de erro durante injeções intraperitoneal para o lúmen intestinal ou o estômago, o que pode afetar a taxa de glicose entrega e redistribuição33,34.
Embora seja a via mais fisiológica de entrega a glicose, o OGTT é limitada na contabilização de apenas a absorção de glicose, enquanto que uma refeição completa também contém proteínas, carboidratos, gorduras, fibras e micronutrientes. A abordagem padrão durante o OGTT é basear a dose de glicose no peso do corpo do mouse, enquanto são geralmente 1-3 g de glicose/kg de peso corporal administrado35,36. Em certos casos, uma maior carga de glicose superior a 1g/kg pode ser necessária para revelar um de tolerância de glicose prejudicada30. Muitos modelos de rato de obesidade e diabetes são caracterizados por alterações na composição corporal, especialmente um enorme aumento na massa de gordura, enquanto a massa corporal magra (músculo, cérebro e fígado), que é o principal local de eliminação de glicose não muda proporcionalmente. A abordagem convencional de normalização para peso corporal, assim, irá resultar em uma dose desproporcionalmente maior de glicose a que está exposto o tecido magro em um rato obeso em comparação com o mouse não-obesos. Este enviesamento aumenta com um maior dose de glicose30. Portanto, idealmente a dose de glicose (OGTT), bem como a insulina (ITT) deve ser calculada com base na massa corporal magra, se dados de composição do corpo estão disponíveis37. Se a avaliação da composição corporal não é possível devido a limitações técnicas, a dosagem deve ser realizada de acordo com o peso do corpo (Supplemental Figura 2), enquanto aplicar uma dose fixa, como em um OGTT humana deve ser o último recurso, se executar esses testes em ratos10,35,36. O protocolo apresentado, um monitor portátil de sangue total foi usado para medir os níveis de glicose do sangue, que é uma vantagem em testes como o OGTT e ITT que requerem amostragem múltipla de volumes pequenos de sangue. No entanto, estes dispositivos são projetados para sangue humano, tendo uma reduzida gama dinâmica. Alternativamente, a glicose, os níveis podem ser medidos em amostras de plasma coletado, por exemplo, por totalmente automatizado analisadores químicos em laboratórios de rotina. Além de insulina, peptídeo-C pode ser medido nos protocolos descritos como um indicador mais direto da função secretora de células β, que não é extraído pelo fígado em contraste com insulina38,39. Se gliconeogênese deve ser avaliada, pode ser aplicado o teste de tolerância de piruvato (PTT), que é uma outra variante dos protocolos descritos aqui, monitoramento glicêmico excursões após a administração de um bolus de piruvato40.
As abordagens descritas aqui do OGTT e ITT pode muitas vezes explicar as diferenças observadas na tolerância à glicose e pode servir mais para sugerir quais experiências subsequentes, mais sofisticadas devem efectuar-se em seguida (por exemplo, grampos hiperglicêmicos ou estudos sobre ilhotas isoladas). Em resumo, apresentamos um protocolo simples para a geração de um modelo de mouse HFD-induzido e descrever melhor o OGTT e ITT, que são ferramentas poderosas para avaliar alterações do fenótipo metabólico na vivo e pode ser útil para estudar mecanismos de doença associada a metabolismo, bem como novas abordagens terapêuticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo médico científico do prefeito da cidade de Viena e o Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa - Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa - Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid - Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline - creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
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