Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Vivo glikoz metabolizması farelerde Oral glukoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) kullanarak yüksek yağlı diyet beslenen incelenmesi

Published: January 7, 2018 doi: 10.3791/56672
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, Medical University of Vienna

Summary

Geçerli makalenin üretimi ve yüksek yağlı diyet beslenen farelerin metabolik karakterizasyonu diyet kaynaklı insülin direnci ve obezite bir model olarak açıklar. Daha fazla oral glukoz tolerans testi ve glukoz metabolizma vivo içindetüm vücut değişikliklere izleme insülin tolerans testi gerçekleştirmek için detaylı iletişim kuralları bulunmaktadır.

Abstract

Obezite en önemli tek risk faktörü tip 2 diyabet, insülin uyarılmış glikoz alımı ve Brüt dekompansasyon sistemik glikoz metabolizmasının bir direnç ile karakterize bir hastalık patogenezinde temsil eder. Önlemek ve diyabet tedavisinde yeni yaklaşımlar acilen ihtiyaç vardır glikoz metabolizmasının anlamada önemli ilerlemeye rağmen onun yönetmelikte sağlık ve hastalık moleküler mekanizmaları altında soruşturma, kalır. Sistemik enerji durumu korumak için türetilmiş glikoz hücresel anabolik işlemler asıl regülatör beslenen devlet sırasında hizmet vermektedir ve böylece kan şekeri dengeleri insülin pankreas salgısı uyarır diyet düzeyleri. Kronik overfeeding Tetikleyicileri meta-periferik insülin reseptör ilişkili değişikliklere yol açan inflamasyon, sinyal ve böylece glikoz insülin-aracılı bertaraf karşı hassasiyetini azaltır. Bu olaylar sonuçta bir azalma yanı sıra yükselmiş açlık şekeri ve insülin düzeyleri glikoz toleransı, sırayla insülin direnci önemli göstergeleri olarak hizmet neden. Burada, üretimi ve yüksek yağlı diyet (HFD) metabolik karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut-diyet kaynaklı insülin direnci sık kullanılan bir model olarak fareler beslenir. Zaman içinde bir sözlü olarak yönetilen glikoz yük ve insülin salgısı periferik elden izler oral glukoz tolerans testi (OGTT), ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Ayrıca, biz tüm vücut insülin eylem izlemek insülin tolerans testi (ITT) için bir iletişim kuralı mevcut. Birlikte, bu yöntemleri ve aşağı akım uygulamaları genel metabolik fenotip farelerin özellikle değişiklikler glikoz metabolizması değerlendirmek için de karakterize etmek için güçlü araçlar temsil eder. İnsülin direnci, diyabet ve obezite daha iyi de patogenezinde etkileri tedavi müdahaleler test olarak anlaşılması için geniş araştırma alanında özellikle yararlı olabilirler.

Introduction

Gelişmiş dünyada obezite ve diyabet fiziksel hareketsizlik ve işlenmiş gıda, aşırı tüketiminin hızlı kentleşme, sanayileşme gibi Küreselleşme tarafından tahrik edilmektedir etkileri nedeniyle salgın boyutlara ulaştı. Her ne kadar araştırma hiperlipidemi ve ateroskleroz, kazanmıştır gibi gibi önem son yıllarda, insülin direnci ve 's komorbiditeler, sağlığı ve hastalıkları metabolizma düzenleyen karmaşık biyolojik mekanizmaları eksik olarak kalır anlaşılır ve hala önlemek ve bu hastalıkları1tedavi yeni tedavi yöntemleri için acil bir ihtiyaç.

İnsülin ve onun counter-regulatory hormon glukagon hücresel enerji temini ve macronutrient denge, böylece de sağlamak uygun sistemik kan şekeri konsantrasyonları2asıl düzenleyiciler hizmet vermektedir. İken diğer macronutrients, humoral faktörler gibi sinirsel giriş daha fazla bu yanıtı değiştirmek glikoz kendisi pankreas β-hücreleri tarafından insülin salgılanması ana Bitikilerin biri olarak davranır. İnsülin anabolik işlemler Federal devletin aşırı kan şekeri Difüzyon kas ve yağ hücrelerinin içine kolaylaştırmak ve daha fazla Glikoliz yanı sıra protein veya yağ asidi sentezi, sırasıyla etkinleştirme sonuç olarak tetikler. Ayrıca, insülin hepatik glikoz çıkış gluconeogenesis engelleyerek bastırır. Kronik aşırı enerji tüketimi ve meta-inflamasyon Hiperinsülinemi ve insülin reseptör ifade hem de değişiklikler böylece Engelli sonuçlanan aşağı akım sinyal yolları içinde aşağı düzenleme nedeniyle periferik insülin direnci yol glikoz insülin-aracılı elden çıkarma gibi yetersiz hepatik glukoz üretimi3,4,5,6inhibisyonu için duyarlılık.

Hayvan modelleri geniş bir hastalık genetik, beslenme veya deneysel indüksiyon ile insülin direnci ve diyabet gibi onun eşlik eden hastalıklar7 çeşitli formları moleküler mekanizmaları incelemek için mükemmel araçlar olmak kanıtlanmıştır . Bir ilk örnek hızlı kilo alımı nedeniyle artan besin alımını birlikte insülin direnci8', kaynaklanan düşük metabolik verimlilik ile karakterizedir yaygın olarak kullanılan ve iyi kurulmuş HFD kaynaklı fare modeli olduğunu 9. hayvan modelleri ve insanlar, açlık kan şekeri ve insülin düzeyleri, bir ayrıcalık hem de glikoz yönetim Engelli bir hoşgörü yanı sıra diğer sistemik değişiklik glukoz ve insülin direnci sık kullanılan göstergeler vardır metabolizma. İzleme kan şekeri ve insülin düzeyleri Bazal devlet veya stimülasyon sonra bu nedenle kolayca erişilebilir veriler vardır.

Mevcut iletişim kuralı HFD beslenen farelerin yanı sıra iki sık kullanılan yöntem, oral glukoz tolerans testi (OGTT) ve insülin direnci testi (ITT), metabolik fenotip karakterize etmek ve incelemek için yararlı olan nesil özetliyor değişiklikler glikoz metabolizması. OGTT bir sözlü olarak yönetilen glikoz yük ve insülin salgısı zaman içinde atılması değerlendiriyor ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Ayrıca, kan glikoz konsantrasyonu insülin yanıt bir bolus olarak izleyerek tüm vücut insülin-eylem araştırmak için ITT kuralları konusunda yönergeler sağlar. Bu makalede açıklanan protokoller köklü ve birden fazla çalışmalar10,11,12' kullanılmıştır. Başarı artırmak için yardımcı olabilir hafif değişiklikler yanı sıra deneysel tasarım ve veri analizi, aynı zamanda yararlı ipuçları potansiyel tuzaklar önlemek için yönergeler sağlar. Burada açıklanan protokoller tüm vücut glikoz metabolizması ve insülin direnci gibi onun ilişkili bozukluklar genetik, farmakolojik, diyet ve diğer çevresel faktörler etkisini araştırmak için çok güçlü araçlar olabilir. Glikoz veya insülin ile stimülasyon yanı sıra, diğer bileşikler çeşitli bireysel araştırma amacına bağlı olarak uyarılması için kullanılabilir. Bu yazının kapsamı, ancak dışında diğer birçok aşağı akım uygulama üzerinde çizilmiş kan örnekleri, glukoz ve insülin (örneğin, lipid ve lipoprotein profilleri) dışındaki kan değerleri çözümlemesi gibi detaylı yanı sıra gerçekleştirilen metabolik işaretleri (örneğin, nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR), Western blot analizi ve Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) tarafından) analizi. Daha fazla Akış Sitometresi ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) transcriptomic, proteomik ve metabolomic yaklaşımlar Ayrıca hedeflenmemiş analiz için kullanılan süre ayrı tek hücre popülasyonlarının, etkileri araştırmak için uygulanabilir.

Genel olarak, biz daha da tüm vücut metabolik değişiklikler, OGTT ve hastalık patogenezinde çalışmak için yararlı araçlar olabilir ITT çalışma için iki güçlü yaklaşım tasvir ederken bir HFD kaynaklı fare modeli oluşturmak için basit bir protokol sağlar ve insülin direnci ve şeker hastalığı gibi metabolizma ilişkili hastalıklar alanında özellikle yeni tedavilerin geliştirilmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakım ve Viyana Tıp Üniversitesi kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Federasyon, Avrupa laboratuvar hayvan bilim dernekler (FELASA göre) yürütülen. Unutmayın ki bu protokol için açıklanan tüm yordamları yalnızca kurumsal ve hükümet onaylandıktan sonra yanı sıra teknik olarak uzman personel tarafından yapılmalıdır.

1. HFD beslemeli fareler

Not: tüm C57BL/6J fareler yiyecek ve su için 12-h açık/koyu döngüsü ücretsiz erişimi korumak.

  1. 6 hafta-in yaş, fareler obezite, ikna etmek için bir HFD (% 40-60 yağ kalori) 8-12 hafta boyunca düşük yağlı diyet (LFD) yalın kontrol grubu beslerken yerleştirin (% 10 yağ kalori).
  2. Haftalık olarak fareler vücut ağırlığını belirlemek. Ağırlık eğrileri benzer modeller HFD beslemeli grubunda daha yüksek eğimli her iki grup'yi göstermesi gerekir.

2. OGTT

Not: kan örnekleme zaman Puan OGTT sırasında her 15dk seçilirse deneme en fazla paralel, 15 fareler fare başına en az 1 min işleme-süre için yapılmalıdır.

  1. Bir gün önce OGTT hazırlıkları
    1. Fareler içme suyuna erişimi olmasını sağlarken fareler taze yatak ve onları gece (14 h), test etmeden önce hızlı bir kafes içine transfer (örneğin, 6:00 de ertesi sabah 8:00 am tarihinde bir başlangıç kez gıda kaldırın).
      Not: Oruç fareler gecede yaklaşımdır standart, ancak daha kısa hızlı (5-6 h) daha fizyolojik ( tartışma Ayrıntılar için bakınız) fareler için.
  2. Hazırlıklar gün deneme (ama deneme önce)
    1. 10 mL % 20 glukoz çözeltisi hazırlamak (D-(+) dağıtılması-distile su glikoz).
      Not: hayvanlar için yönetilen tüm reaktifler farmakolojik sınıf olmak zorunda ve steril.
    2. Her örnekleme süresi noktası ve her fare için bir şey ile 5 µL doldurarak plazma koleksiyonu için bir 96-şey tabak hazırlamak NaEDTA (0,5 M EDTA, pH % 8.0 içinde 0.9 NaCl, depolama, RT). Deneme sırasında bu plaka buz üstünde depolar.
      Not: Ek Resim 1 ayrıntılı bir denetim listesi için bkz:.
  3. Bütün fareler vücut ağırlığını ölçmek ve fare ismi (örneğin, fare 1 = 1 dash, fare 2 = 2 tire, vb) yapmak için kalıcı bir kalem ile onların kuyrukları işaretlemek.
  4. Glikoz ölçüm ve kan örnekleme (Şekil 2)
    1. 1-2 mm keskin makas ("değişken A" Şekil 2) kullanarak kuyruk ucu kapalı dikkatle kesin. Her zaman ilk damla kan hemoliz veya kan glikoz tayini için taze kan örnekleri çekmeden önce kirlenme doku sıvısı ile önlemek için yok etmek. (Süresi noktası 0 =) Bazal kan şekeri düzeyini Şeker Ölçüm ile ölçüm için bir küçük kan örneği (~ 3 µL) çizin.
      Dikkat: Kontrol edin ve üzerinde bir Şeker Ölçüm Çubuğu Strip şarj sayısını ayarlayın.
      Not: bir keskin neşter bıçak ("varyant B" Şekil 2) bir fare yan kuyruk ven bir alternatif kan örnekleme yöntemi olarak nick. Yanal kuyruk ven genellikle yaklaşık üçte birden fazla örnekleri için kuyruk Bankası doğru hareket kuyruk ucundan kuyruk uzunluğu boyunca erişilir. Bir lokal anestezik krem kullanılması önerilir. Kan akışını durdurmak için en az 30 yumuşak doku üzerinde parmak basınç uygulayarak hayvan onun kafes döndürülmeden önce s.
    2. Taze kılcal tüp (keep kılcal tüp yatay) kullanarak bir kan örneği (yaklaşık 30 µL) toplamak. Bir pipet pipet ucu kılcal tüp sonuna üstündeki koyarak ve dikkatli 96-şey plaka bir kuyunun içine hava kabarcıkları kaçınırken toplanan kan iterek kullanarak kılcal tüp boş. Bütün fareler - teker teker için bu yordamı yineleyin.
      Not: alternatif için kan toplama yolu ile kılcal tüp gibi doğru birim (örneğin, 30 µL) ayarlanmış bir pipet kan toplamak veya bir damla toplamak için kuyruk parafin film ve damlalıklı üzerinden EDTA çözümde kan. Sonraki glukoz ve insülin ölçümleri etkileyebilir gibi kesinlikle vazelin kan veya Şeker Ölçüm Çubuğu Strip ile temasından kaçının.
      Dikkat: OGTT fareler için çok stresli: yalın fareler kaybedebilir civarında kendi vücut ağırlığının % 15 bir gecede Bayramı sırasında. Ayrıca, kan örnekleme farklı zaman noktalarda önemli bir kan kaybına yol açar. Daha kolay kan örnekleme için vazelin ile mouse-tail dikkatle masaj mümkündür.
      Not: Kurumsal yönergeleri izin verilen bir zaman dilimi içinde toplanan kan miktarını sınırlayabilir. Örnekleme birimleri ve timepoints izin verilen en yüksek değerler aşmayacak şekilde ayarlanmalıdır. Fareler vücut ağırlığını toplamını hesaplamak için kullanılması gereken kan izin verilen para çekme.
  5. Vücut ağırlığı (1 g glikoz/kg vücut ağırlığı; 3 g/kg kadar artış bu can) göre glikoz çözüm gerekli hacmi hesaplamak için her fare oral gavaj tarafından yönetilecek. Örneğin, bir fare ile bir vücut ağırlığı 30 g 30 mg glikoz yönetmek için bir % 20 glikoz çözümün 150 µL gerekir.
    Not: farenin ağırlığını glikoz dozu üsse standart bir uygulamadır. Vücut kompozisyonu veri yoksa, OGTT hesaplanması gereken glikoz dozu yaslan temel vücut kitle (Ayrıntılar için konuya bakın).
  6. Glikoz yönetim
    1. Hazırlamak herşeyi önceden tüm deneme sırasında gerekli (zamanlayıcı, deney kayıt sayfası, glukoz monitör ve şeritler, kılcal damarlar, şırınga, glikoz çözüm, 96-şey plaka, neşter, hesap makinesi, denge, daimi marker, tezgah kağıtları, bir pipet) bahşiş ve eldiven.
    2. Glikoz kullanma için fareyi sıkıca tarafından scruff tarafından açgözlü dizginlemek. Yeterli sıkılık boynuna dizginlemek dışarı büküm fare engellemek ve düzgün kafasını geri yatırmak için cilde uygulanır. Ayrıca fare düzgün nefes alabilir emin olun.
      Not: glikoz yönetim başladıktan sonra iyi bir zaman yönetimi çok önemlidir.
    3. Dikkatle (Adım 2.5 dayalı) glikoz çözüm besleme iğne kullanarak mide doğrudan yönetmek. Dikkatli bir şekilde doğru yemek borusu ağız yoluyla besleme iğne doğrudan. İğne yutmak için fareyi izin: iğne tamamen alt özofagus/karın fare batar. O zaman glikoz çözüm (şekil 3a) enjekte et.
      1. Herhangi bir direnç olması durumunda ya da hayvan hemen mücadeleler, iğne geri çekilin ve yeniden konumlandırmak. Sonra hemen ilk gavaj Sayacı başlatmak ve glikoz diğer fareler için 1 dk aralıklarla yönetmek.
        Not: Glikoz çözüm bir damla besleme iğneyi yalamak ve yutma, böylece daha kolay ekleme besleme iğne kolaylaştırmak teşvik edecek fare, ağız için uygulamak yararlı olabilir. Bu cidden hayvan zarar gibi beslenme iğne eklerken basınç uygulamayın.
  7. 15 dk sonra kan şekeri Şeker Ölçüm ile ölçmek ve ayrıca her fare kan örnekleri (~ 30 µL) (olarak açıklandığı ayrıntılı olarak adım 2.4) sırayla enjekte edildi almak.
    Not: Zaman yönetimi çok önemlidir; sonda ile besleme gelince aynı zaman aralıkları kullanarak mümkün olduğunca yakın olarak izleyin. Sonuçları değiştirebilir stresi azaltmak için mümkün ve sınırı en az tüm prosedürü sırasında frenleyici olarak serbestçe hareket fare izin. Kuyruk tek elle süt ve diğer kan toplamak.
  8. 2.7 beklenen sonuçları (örneğin, 30, 45, 60, 90, 120, 150 ve glikoz yönetim sonra 180 dk at) bağlı olarak seçilen zaman noktalarda arasındaki adımları yineleyin. Seçili zaman Puan 120 dk uzun olması durumunda, fareler içme suyuna erişimi olduğundan emin olun. Fareler her zaman içme suyuna erişimi olduğundan emin olun. Ne zaman tamamlanmak ile deneme, fareler yiyecek ve su ile donatılmış ev onların kafes dönün.
    Dikkat: OGTT fareler için çok yorucudur. Bu nedenle bir ITT gibi sonraki metabolik test yapmadan önce en az 1 hafta beklemesi.
  9. Bunu deneyden sonra kan örnekleri 2500 x g, 30 dk, 4 ° c, santrifüj kapasitesi Kuyu plaka boş ve depolamak için süpernatant (plazma)-20 ° C'de analiz kadar aktarın.
    1. Kayıt örneklerinin hemoliz varsa (bkz. Bölüm 3).
  10. Piyasada bulunan bir ELISA kullanarak plazma insülin düzeyleri Kiti ( Tablo reçetesigörmek) belirlemek kitinin üreticinin yönergeleri izleyin.
    Not: Açlık durumuna bağlı olarak yanı sıra incelenen farelerin metabolizmasına zorluklar bu tahlil sırasında oluşabilir: gece açlık insülin düzeyleri (süresi noktası 0) çok düşük ve bu nedenle algılama sınıra yakın vardır. Bu sorunu engellemek için önerilen plazma birim miktarı iki katına ve buna göre ELISA tahlil sonucu yarıya indirmek. Fareler insülin OGTT sırasında özellikle HFD beslenen farelerde ulaşmak, öte yandan, insülin düzeyleri algılama sınırı aşabilir: örnek seyreltik (örneğin, 10 kat ile % 0,9 NaCl) ve ELISA tahlil tekrarlayın. Plazma numuneleri hemoliz insülin, okuma değerleri bir düşüş ortaya çıkan bozulma yol açabilir. Zaman, sıcaklık ve hemoglobin konsantrasyonu örnek bozulması bağlıdır. Her zaman hemolyzed örnekleri soğuk veya insülin bozulması azaltmak için buz üzerinde tutun.

3. ITT

Not: OGTT (fareler, kan, Şeker Ölçüm ve Vazelin kullanım işleme) için açıklanan aynı önlemler aynı zamanda ITT işlemi sırasında uygulanacak olması. 15 fareler paralel olarak test edilir eğer örneğin, tüm enjeksiyon içinde 15 dk 1 dk aralıklarla yapılmalıdır. ITT için sonraki kan örnekleri kılcal tüpler ile isteğe bağlı oluşur.

  1. Deneme önce hazırlıklar
    1. Hızlı fare fareler içme suyuna erişimin sağlanması ise insülin enjeksiyonu, daha önce en az 2 h için (örneğin, yemek 8: 00'de kaldırmak için test fareler 2-5 h daha sonra).
    2. İnsülin 1:1,000 %0,9 oranında seyreltin NaCl (Stok: 100 U/mL insülin; çalışma konsantrasyonu 0,1 U/mL) ve % 20 glikoz hazırlamak (D-(+)-glikoz çözüm içinde çözünmüş distile su) fareler Hipoglisemik olursam yönetilecek.
      Not: hangi aksi takdirde gecede oluşabilir hipoglisemi önlemek için kısa hızlı hayvanlar oruç sonra ITT genellikle gerçekleştirilir. Hayvanlar için yönetilen tüm reaktifler farmakolojik sınıf olmak zorunda ve steril.
  2. Fareler vücut ağırlığı ölçmek, kuyruk işareti, keskin makas kullanarak kuyruk ucu kesilmiş ve OGTT adım 2.4 için daha önce açıklandığı gibi Bazal kan şekeri düzeylerini ölçmek.
  3. İnsülin enjeksiyon
    1. İntraperitoneally insülin enjekte etmek (önceden hesaplanan 0,75 U insülin/kg vücut ağırlığı,), fare scruff yöntemle dizginlemek.
    2. Bir taze kullanın, steril 27-30 iğne rahatsızlık ve herhangi bir enjeksiyon izi enfeksiyon riski önlemek her hayvan için ölçmek.
      Not: Sterilizasyon deri insülin yönetim süresini uzatmak ve böylece ek bozuklukları için hayvan neden olabilir. Bu nedenle, bu tavsiye edilmez.
    3. Fare baş hayvan ventral tarafında ortaya çıkarmak için hafif bir açıyla aşağı eğ. Steril iğne eğimi yukarı ve 30 ° açı ile hayvanın karın (şekil 3b) sağ alt çeyreğinde yerleştirin. Hemen ilk fare enjekte edilir sonra Sayacı başlatmak.
      Not: Düşük doz Üstelik (0.1 U/kg) özellikle hepatik insülin duyarlılığı değerlendirmek için gerçekleştirilen. OGTT gelince, vücut ağırlığı üzerinde tabanlı enjeksiyon hacmi hesaplama standart dozu dayandırarak yordamdır vücut kompozisyon veri yoksa yağsız vücut kitle tercih edilir.
  4. Kan şekeri (örneğin, 15, 30, 45, 60 ve 90 dakika sonra) seçilen zaman noktalarda ölçmek.
    Not: insülin kısa bir yarı ~ 10 dk fareler13' te olduğu gibi insülin Yönetim (örneğin, sonra 2 s) sonra geç farklılıklar insülin eylem doğrudan bir etkisi yansıtmaz. Bir fare Hipoglisemik olur diye % 20 glikoz çözüm yönetmek (kan şekeri düzeyleri 35 mg/dL altında) ve ölme riski.
  5. Son kez Puan sonra fareler geri ev onların kafes bol yiyecek ve su ile hazırlanan yerleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 şematik saat tablo için fare üstünde yiyecek metabolik fenotipleme göstermektedir. Bir LFD grup kontrol grubu hizmet verebilir süre yaklaşık 6 hafta bir yaşta, fareler bir HFD üzerinde yerleştirilmelidir. Önemlisi, vücut ağırlığı haftalık beklenen artış vücut ağırlığı olup olmadığını gözlemlemek için tespit edilmelidir. Stres (örneğin, gürültü veya saldırgan erkek davranış) her türlü vücut kilo alımı ile engelleyebilir ve hemen bertaraf edilmelidir. Her kohort farelerin diyet deneyler için en az 10 fareler çünkü bu diyet deneyler zaman alıcı ve aykırı sık (örneğin, fare ağırlık veya fareler anormal glikoz veya insülin düzeyleri ile kazanıyor değil) oluşmalıdır. Seçili süreyi (bağlı olarak çalışma hipotez ve beklenen değişiklikler zaman noktası) sonra OGTT ve ITT glikoz toleransı ve insülin eylem değerlendirme için gerçekleştirilebilir. Bu yazıda, geç zaman Puan metabolik test için seçilmiştir.

Önemlisi, bu deneyler önemli kan-kaybına neden ve böylece fareler için çok stresli bir kurtarma zaman OGTT ve ITT arasında en az 1 hafta olmalıdır. Kan toplama birimleri (Eğer bir ITT ek kan toplama olmadan önce performans azalmaörneğin,) varsa, bu iyileşme döneminde olabilir Ayrıca kısaltılmış ya da atlanmış, birden fazla kan berabere, hayvanlar14için kurallar doğrultusunda, 15,16,17.

Toplam 60 C57BL/6J fareler ile büyük bu çalışmada, fareler yarısı HFD veya LFD üzerinde 6 hafta bir yaşta kuruldu (n = 30/grup) ve vücut kilo diyet 16 hafta için sınıf başkanı. Şekil 4' te gösterildiği gibi vücut ağırlığı önemli bir artış HFD tüketimi sonuçlandı. 6 hafta-in yaş, vücut ağırlığı her iki grupta 20.2 g yapıldı. Fareler LFD üzerinde tutarlı, biraz vücut ağırlığı (31.2 g ± 2.7) gözlenen döneminde artan gösterdi ise fareler HFD üzerinde kendi vücut ağırlığı hızla, özellikle ilk hafta boyunca artmış ve diyet 16 hafta sonra kendi vücut ağırlığı maksimum ulaştı. Ağırlık eğrileri deneme sırasında benzer bir yol gösterdi, fareler bir 1.5 - için 2 - kat daha yüksek vücut ağırlığı (44,4 g ± 4.0) ulaştı HFD grubunun LFD beslemeli fareler için karşılaştırıldığında.

İki tabur metabolik fenotip araştırmak için bir OGTT (şekil 5) ve ITT (şekil 6) yapıldı. Kan hacmi küçük kemirgen sınırlı olduğu gibi bir bakım nokta (PT) tahlil Diyabetik insanlar (Şeker Ölçüm) için bu metabolik fenotipleme deneyler sırasında kan glikoz düzeyleri izlemek için kullanıldı. Şekil 2' de gösterildiği gibi kan glukoz monitör kullanımı kolay, sadece küçük bir damla kan ve saniyeler sonra belgeleri için kan şekeri düzeylerini görüntülemek. Şekil 5 saat ders mutlak glikoz (şekil 5a-b) ve mutlak insülin OGTT sırasında (şekil 5 c) seviyeleri sunuyor. Genellikle, normal glukoz toleransı ile sağlıklı bir fare bir karakteristik hızlı artış kan glikoz, gösterir zirveye ulaşan 15-30 dakika sonra glikoz meydan okuma.

Öncelikle kas, yağ dokusu ve karaciğer doku tarafından yürütülen sonraki glikoz alımı kan glukoz konsantrasyonu kademeli bir düşüş için yol açar. Tüm deneyler, LFD beslenen farelerin glikoz hoşgörülü kontrol grubu görev yaptı ve bu nedenle beklenen metabolik profili yerine: ~ 240 mg/dL kan glikoz düzeyleri zirvesine yaklaşık 15 dk sonra glikoz yönetim, hemen ulaşıldı Bazal düzeyleri yaklaşık 60 dk uygun glikoz eleme gösteren glikoz meydan sonra ulaşan bir düşüş ardından. Tezat içinde HFD-fareler ve yaklaşık ~ 320 mg/dL glikoz doruğa glikoz direnç gösteren glikoz, neredeyse hiçbir bertaraf gösterdi. Açlık durumunda (örnekte olduğu gibi bu temsilcisi) kan şekeri düzeyleri iki grubu zaten farklı olduğu zaman, temel glikoz yukarıda (AUC) eğri altındaki alan hesaplama sonuçları (şekil 5a- doğrulamak için yapılmalıdır b).

Ayrıca, dolaşımdaki kan insülin düzeyleri bu modelde temel patofizyolojisi hakkında daha fazla bilgi sağlamak için bir insülin-ELISA testi (şekil 5 c) kullanılarak belirlenmiştir. İnsülin düzeyleri kontrol grubunda neredeyse değişmeden olduğunu ise, bir HFD beslenen farelerin telafi Hiperinsülinemi HFD kaynaklı olarak gösteren bir büyük ölçüde artmış insülin yanıt yanı sıra kontrol grubu ile karşılaştırıldığında düzeyleri oruç 16-fold yükseltilmiş gösterdi insülin direnci tarafından neden glikoz eleme kapasitesi, dengelemek için bir girişim. Ancak, bu test doğrudan insülin eylem değerlendirmez ve insülin direnci hakkında ifadeler sonuç olarak kullanılmamalıdır olarak OGTT sonuçlarını aşırı Yorumlar değil unutmayın.

HFD beslenen farelerde insülin duyarlılığı ölçmek için bir ITT 1 hafta sonra OGTT (şekil 6a) gerçekleştirildi. Bu tahlil hangi kan glukoz konsantrasyonu insülin yönetim takip düşmek derecesi tüm vücut insülin eylem verimliliğini temsil eder. HFD beslenen farelerin böylece insülin direnci düşündüren kan şekeri ITT sırasında tüm zaman noktalarda LFD beslemeli kontrol grubuna göre Engelli bir azalma gösterdi. ITT sonuçlar genellikle glikoz düzeyleri, aynı zamanda Ayrıca AUC temel glikoz aşağıda şekil 6bgösterildiği gibi gösterilebilir ters zaman tabii olarak sunulur. Karşılaştırılır grupları (ki bu deney içinde durum böyle değil) benzer açlık kan şekeri düzeyleri varsa, şekeri ITT sırasında da Bazal glikoz yüzdesi olarak sunulabilir. Kan şekeri ~ 80 mg/dL18düşersen fare olduğu gibi insülin counter-regulatory yanıt etkinleştirilir: belirli fare modeli counter-regulatory bu yanıt kusurları insülin duyarlılığı bir artış yanlış. HFDs ve sonraki metabolik fenotipik deneyler sırasında outliers sık oluşabilir. HFD kilo veya bu anormal açlık şekeri ve/veya insülin düzeylerini gösteren kazanmak değil fareler analizinden dışlanmaları gerekir. Son iki için bir aykırı testi deneysel her grup için ayrı ayrı gerçekleştirilebilir (örneğin, Grubbs test)

Bu çalışmada, örnek olarak biz gösterdi ve metabolik deneyler vivo içindeveri yorumlanır, obezite diyet kaynaklı, glukoz intoleransı ve insülin direnci ile fareler üzerinde yürütülen ve onları normal vücut ağırlığı ile kontrol grubu ile karşılaştırıldığında. Beklendiği gibi bozulmuş glikoz toleransı ve Hiperinsülinemi obez farelerde yaş eşlemeli kontrol fareler karşılaştırıldığında insülin direnci ile tutarlı oldu; Bunu gerçekleştirmek nispeten kolay olan köklü, güvenilir, zaman ve bütçe dostu yöntemler kullanarak ortaya çıkarılmıştır. Glikoz toleransı, tüm OGTT ve ITT sunulan yöntemlerle elde edilen, insülin düzeyleri de insülin duyarlılık, olduğu gibi farklılıkları kez daha sofistike deneyler gibi içerebilir bir çalışmanın sonraki adımlar planlamak için yardımcı olabilir Hiperglisemik veya hyperinsulinemic kelepçeler yanı sıra izole pankreas adacıkları ile deneyler.

Figure 1
Şekil 1. Şematik zaman tablo için önerilen diyet rejim ve metabolik in vivodeneyler. İse kontrol grubu bir LFD alır HFD metabolik etkileri farelerde araştırmak için deney grubu hayvanlar üzerinde HFD yaklaşık 6 hafta-in yaş, yerleştirilir. Fareler vücut ağırlığını doğru kilo değerlendirmek için haftalık olarak tespit edilmelidir. Yaklaşık 12 hafta diyet (ya da araştırma hipotezi bağlı olarak seçilen zaman noktası sonra), metabolik fenotip farelerin kurtarma-zaman ve daha sonra bir ITT 1 hafta takip bir OGTT tarafından değerlendirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Metabolik deneyler sırasında kan örnekleme yöntemleri. OGTT de kan örnekleme nerede gerekli, ITT gelince için dikkatli bir şekilde kan glikoz düzeyleri ile bir şeker ölçüm belirlenmesi ardından 1-2 mm biteviye-in keskin makas (değişken A), kuyruk ucuyla kesme yoluyla kan çizim tavsiye ve daha fazla insülin düzeyleri ve diğer ilgili kan değerleri belirlemek için bir kılcal kan toplanması. Alternatif olarak, kan da Arteryel Kateterizasyon (gösterilmez) veya kuyruk ven (varyant B) aracılığıyla tatmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Glikoz (a) ve mayi insülin enjeksiyon (b) oral gavaj. OGTT (bir) sırasında beslenme iğne ve ITT (b) sırasında insülin enjeksiyon mayi kullanarak oral glukoz yönetim temsilcisi görüntüler. Protokolü ayrıntılı bir açıklama için bkz:. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Vücut kilo HFD beslenen ve LFD beslenen C57BL/6J farelerin. C57BL/6J fareler vardı her iki seti üzerinde %60 HFD % 10 veya 20 haftalık bir süre için bir denetimi hizmet LFD. Fareler HFD üzerinde beklenen artış vücut ağırlığının, özellikle içinde belgili tanımlık ilk hafta diyet gösterdi ise LFD beslenen farelerin gözlenen döneminde hemen hemen sürekli vücut ağırlığı gösterdi. -Den sonuçlanmak are ortalama ± SEM *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. n = 30 grup başına. ANOVA ve Tukey'nın post hoc testi farkları için test etmek için kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. OGTT gerçekleştirilen HFD beslenen ve LFD beslenen C57BL/6J hayvanlarda. (bir) glikoz düzeyleri OGTT sırasında. Bir gecede hızlı sonra kan şekeri değeri (mg/dL) oruç devlet ve 15, 30, 45 ve 60 dk glikoz eriyik sonda ile besleme (1 g glikoz/kg) yolu ile sözlü olarak yönetme sonra ölçüldü. Şekeri HFD grubunda açlık durumunda yanı sıra glikoz meydan sonra yüksek. Ardından 15 dakika gecikmiş ve yavaş sonra doruğa artarak azaltın. -Den sonuçlanmak are ortalama ± SEM *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 grup başına. İstatistiksel analizi ANOVA ve Tukey'nın post hoc testi kullanılarak gerçekleştirildi. (b) OGTT sırasında (AUC) eğri altındaki alan glikoz. Taban düzeltilmiş AUC hesaplamak için Bazal glikoz düzeyleri (süresi noktası 0) üzerinden düşülen sonra kan şekeri düzeyleri her fare için tek tek elde edilen, bireysel AUCs hesaplama tarafından takip. Temel glikoz yukarıda AUC HFD beslenen farelerde glikoz direnç gösterir. İstatistiksel analiz yapılan ANOVA ve Tukey'nın post hoc testi (glikoz düzeyleri) veya öğrencinin iki kuyruklu t-testi (AUC). (c) OGTT sırasında insülin düzeyleri. İnsülin (ng/mL) düzeyleri glikoz eriyik sonda ile besleme (1 g glikoz/kg) yolu ile sözlü olarak yönetme sonra bir açlık dönemi 4 h ve 15, 30 ve 60 dk sonra ölçüldü. Sadece kan insülin düzeyleri daha yüksek bir artış ile glikoz enjeksiyon için telafi fare, HFD beslenen Ayrıca başladı ve OGTT kontrol grubuna kıyasla yüksek insülin seviyeleri ile sona erdi. -Den sonuçlanmak are ortalama ± SEM *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 grup başına. İstatistiksel analizi ANOVA ve Tukey'nın post hoc testi kullanılarak gerçekleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Üstelik HFD beslenen ve LFD beslenen C57BL/6J hayvanlarda yapılan. (bir) glikoz düzeyleri ITT sırasında. Şekeri (mg/dL) oruç devlet ve 15, 30, 45 ve 60 dk sonra insülin enjeksiyon intraperitoneally ölçüldü (0,75 U insülin/kg). ITT sırasında HFD beslenen farelerde yüksek glikoz düzeyleri gösterdi. Kan şekeri düzeyleri yeterli HFD beslenen farelerde insülin enjeksiyon sonra indirdi değil. -Den sonuçlanmak are ortalama ± SEM *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 grup başına. İstatistiksel analizi ANOVA ve Tukey'nın post hoc testi kullanılarak gerçekleştirildi. (b) ITT sırasında (AUC) eğri altındaki alan glikoz. Bazal glikoz düzeyleri (süresi noktası 0) temel düzeltilmiş tersini AUC hesaplamak için tüm sonra elde edilen kan şekeri düzeyleri için her fare üzerinden ayrı ayrı düşülen. Değerleri ters (-1 ile çarpma), edildi bireysel AUCs hesaplama tarafından takip. OGTT sırasında HFD beslenen farelerde yüksek glikoz düzeyi sonucu olarak temel AUC alt daha da azalmış insülin duyarlılığı önerilen kontrol fareler için karşılaştırıldığında HFD beslenen farelerde ters düzeltildi. İstatistiksel analiz yapılan ANOVA ve Tukey'nın post hoc testi (glikoz düzeyleri) veya öğrencinin iki kuyruklu t-testi (ters AUC). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek resim 1. Deney hazırlık için denetim listesi. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 2. Üstelik sırasında insülin düzeyleri. LFD beslenen karşı benzer dinamikleri plazma insülin düzeyleri insülin enjeksiyon her iki grupta sonra gösterdi HFD beslemeli grupları içinde ITT sırasında plazma insülin düzeyleri. Beklendiği gibi HFD fareler şiddetle artan Bazal insülin düzeyleri kontrol grubuna göre sergiledi. Ayrıca, HFD beslenen farelerde insülin düzeylerinde artış enjekte insülin miktarı temel alınarak tüm vücut kitle (geleneksel normalleştirme yaklaşım) hesaplanıyorsa hangi kısmen yağsız vücut kitle tahmindi tarafından neden olabilir daha güçlü, Bu deneyde gibi. Ancak, insülin yanıt HFD beslemeli grubunda (plazma glukoz düzeylerinin yetersiz Redüksiyon) engelliler, böylece bu hayvanların insüline dirençli durumda vurgulayan daha fazla. -Den sonuçlanmak are ortalama ± SEM *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. İstatistiksel analizi ANOVA ve Tukey'nın post hoc testi kullanılarak gerçekleştirildi. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Şeker hastalığı ve dünya nüfusunun ilişkili hastalıkları yüksek yaygınlığı, araştırma moleküler mekanizması, önlenmesi ve tedavisi hastalığı19adresleme için güçlü bir gereklilik vardır. Sunulan Protokolü HFD fareler, nesil metabolik araştırma yanı sıra tüm vücut metabolik değişiklikler değerlendirilmesi için güçlü araçlardır OGTT ve ITT, iletim için kullanılan güçlü bir hayvan modeli için köklü yöntem açıklanır insülin direnci gibi. Bu raporda sunulan yöntemleri şüpheli genler, çevresel faktörler yanı sıra tüm vücut glikoz metabolizması9,10farmakolojik, diyet, fiziksel veya genetik tedaviler rolü eğitim yararlı olabilir. Glikoz insülin salgılanması bir OGTT için asıl uyarıcı olarak hizmet veren iken, sunulan Protokolü (co-) tarafından değiştirilebilir diğer macronutrients ve insülin yanıt2değiştirmek için bilinen hormonlar gibi diğer maddeleri uygulamak. Benzer şekilde, ITT Protokolü (co-) uygulama bireysel araştırma soru göre diğer maddelerin (örneğin, glukagon veya katekolaminler) tarafından değiştirilebilir. Ana veriler açıklanan OGTT ve ITT kurallarının kan şekeri ve insülin konsantrasyonları vardır; Ancak, glukagon, yağ asidi ve lipoprotein düzeyleri gibi diğer kan parametrelerinin yanı sıra çeşitli metabolik işaretleri mRNA ve protein düzeyi üzerinde ölçüm de çalışmanın amacı bağlı olarak yararlı olabilir.

Müfettişler, hipoglisemi, insülin salgılanması, insülin eylem yanı sıra genel olarak metabolik fenotip nöroendokrin yanıtlarını güçlü fareler10genetik arka plan üzerinde bağlıdır dikkat etmelidir. Burada, biz fareler C57BL/6J genetik arka plan içinde şeker hastalığı, bir HFD kaynaklı model olarak glikoz-aracılı insülin salgılanması nedeniyle doğal olarak meydana gelen silme Nikotinamid nükleotit transhydrogenase gen içinde kısmi bir bozukluk olan kullanılan 20, obezite eğitim için uygun bir model geliştirmelerde insülin direnci8,9ilişkili. İletişim kuralları burada açıklanan Mayıs ancak da metabolik olarak insülin direnci ve şeker hastalığı, genellikle monogenic bozuklukları veya β-hücreleri21, kimyasal imha temel alternatif fare modelleri tanımlamak için kullanılan 22 , 23. deneysel tasarım sırasında önlemleri dahil olarak insülin duyarlılık yaş24ile ve aynı cinsiyetten üzerinden farelerde deneyler yürütmek daha fareler, yaş eşlemeli test. Genetik mutasyonlar ve tedavileri seks25,26bağlı olarak farklı fenotipleri neden olabilir gibi aynı zamanda her iki cinsiyette birbirinden ayrı olarak araştırmak için tavsiye olabilir.

Bu protokol için açıklanan kan örnekleme yöntem kalp hızı, kan akımı ve glikoz metabolizması, fizyolojik olmayan sonuçları10verimli etkileyebilir anestezi gerektirmez. Alternatif olarak, bir arter kateter, hangi, vasküler örnekleme stres deneme sırasında işleme olmadan sağlar aynı zamanda deney için çaba, maliyetleri gibi hayvan kaybı riski ekler implante olması. OGTT için fareler genellikle oruç geceleme (14-18 h), hangi fare, güçlü karaciğer glikojen depoları tüketen bir Katabolik durumda kışkırtır. Bu temel kan şekeri düzeyleri değişkenliği azaltır rağmen uzun süreli hızlı metabolizma hızı azalır ve insanlar10,27durumda aksine olan glikoz kullanımını farelerde, geliştirir. Farelerde beslenme alışkanlıkları da insan davranışını taklit değil gibi böylece daha sonra kısa bir hızlı bir OGTT gerçekleştirmek için fizyolojik olabilir. Sirkadiyen ritim sistemik glikoz metabolizması28üzerinde güçlü bir etkisi gibi günün hangi saatinde burada açıklanan deneyler yaptı dikkate almak önemlidir. Fareler metabolizma onların aktif dönemde (karanlık faz) araştırmak için tersine çevrilmiş bir koyu döngüsü daha fazla fizyolojik sonuçları üretmek için değerli olabilir.

Yönetim açıklanan rota aynı zamanda belirli hipotezi sınanmakta bağlı olarak farklı olabilir. Oral glikoz yönetirken glikoz tolerans testi yol açar daha değişken insülin salgılanması için mide boşalma, gastrointestinal hareketliliği, hormonlar (incretins) ve sinirsel giriş değiştirmek ve insülin yanıt2, uzatmak gibi 10. "incretin etkisi", bağırsak yol üzerinden glikoz emilimini oral glikoz teslim insülin yayın29potentiates GLP1 gibi gastrointestinal hormonlar sürümü için iyi sırasında açıklanan. Bu etkileri aşmak için glikoz bolus Ayrıca intravenöz yönetilemez duruma (IVGTT) veya intraperitoneally (IPGTT). Glukoz ve insülin geziler önemli ölçüde bağlı olarak seçilen teslim yolu farklı. Gecikmiş, ama daha fazla sürekli moda30plazma insülin düzeyleri yükselişi iken OGTT için karşılaştırıldığında, glukoz mayi yönetim bir artan ve uzun süreli en yüksek plazma glikoz düzeyleri, yol açar. Benzer şekilde, intravenöz glikoz yönetim tarafından gecikmeli insülin yanıt31karakterizedir. OGTT sırasında elde edilen daha sağlam AUC-insülin verilerin yanı sıra insülin düzeyleri keskin artışlar oral glikoz teslimini chow beslemeli HFD beslenen farelerin30karşı, glikoz metabolizması değişiklikleri algılamak için daha duyarlı olabilir ki öneririz 31. intragastric ve mayi teslim olmakla birlikte intravenöz yönetim genellikle daha zor yanı sıra daha stresli fareler32için hayvan ve teknik zorluk için önem açısından benzer. Sözlü yönetim daha fazla hata % 10-20 oranında intestinal Lümen veya glikoz teslim ve yeniden dağıtım33,34oranını etkileyebilir mide içine mayi enjeksiyonlar sırasında ortadan kaldırır.

Glikoz teslimat en fizyolojik yol olmasına rağmen tok Ayrıca protein, kompleks karbonhidratlar, yağlar, lifler ve mikro içerirken OGTT sadece glikoz emme için muhasebe sınırlıdır. Standart OGTT sırasında genellikle 1-3 g glikoz/kg vücut ağırlığı olmakla birlikte yönetilen35,36fareyi, vücut ağırlığını glikoz dozu üsse yaklaşımdır. Belirli durumlarda, 1g/kg daha yüksek glikoz yükleme bozulmuş glikoz toleransı30ortaya çıkarmak için gerekli olabilir. Glikoz bertarafı ana sitesi, yağsız vücut kitle (kas, beyin ve karaciğer) orantılı olarak değişmez iken obezite ve diyabet birçok fare modelleri değişiklikler vücut kompozisyon, yağ kitlesi, özellikle büyük bir artış ile karakterizedir. Vücut ağırlığı için geleneksel normalleştirme yaklaşım böylece obez bir fare yalın dokusunda maruz glikoz obez sigara fareyi göre orantısız daha yüksek bir doz neden olur. Bu önyargı bir daha yüksek glikoz dozu30ile artar. Vücut kompozisyonu veri kullanılabilir37varsa bu nedenle, en iyi şekilde glikoz (OGTT) olarak (ITT) insülin dozu tabanlı yağsız vücut kitle üzerinde hesaplanmalıdır. Vücut kompozisyonu değerlendirilmesi teknik sınırlamaları nedeniyle mümkün değilse, bir insan OGTT gibi sabit bir doz uygulama son çare Eğer gerekirken dozaj vücut ağırlığı (tamamlayıcı Şekil 2) göre yapılmalıdır Bu testler fareler10,35,36gerçekleştiriliyor. Sunulan protokolünde bir el tam kan monitör OGTT ve ITT gibi küçük kan birimlerin birden fazla örnekleme gerektiren testlerde avantajlı olduğu kan şekeri düzeylerini ölçmek için kullanıldı. Ancak, bu aygıtların azaltılmış bir dinamik alana sahip insan kanı için tasarlanmıştır. Alternatif olarak, glikoz düzeyleri toplanan plazma örnekleri, örneğin, tarafından tam olarak ölçülebilir kimya Analizörleri rutin laboratuarlarında otomatik. İnsülin yanı sıra, C-peptid açıklanan protokollerin aksine insülin38,39karaciğer tarafından çıkarılan değil β-hücre salgı işlevi daha doğrudan bir göstergesi olarak ölçülen. Gluconeogenesis değerlendirilmek gerekiyorsa, pyruvate tolerans testi (BK), hangi başka bir Glisemik geziler pyruvate bolus40yönetim sonra izleme burada açıklanan protokoller çeşididir uygulanabilir.

OGTT ve ITT can burada açıklanan yaklaşımlar sık sık gözlenen glukoz tolerans farklılıkları açıklamak ve daha fazla hangi sonraki, daha karmaşık denemeler sonraki yapılır önermek için hizmet edebilir (örneğin, Hiperglisemik kelepçeler veya izole adacıkları üzerinde çalışmalar). Özetle, bir HFD kaynaklı fare modeli oluşturmak için basit bir protokol sunmak ve hakkında diğer OGTT ve ITT, metabolik fenotip vivo içinde değişikliklere değerlendirmek için güçlü araçlar ve eğitim yararlı olabilir açıklamak metabolizma ilişkili hastalık mekanizmaları yanı sıra yeni tedavi yaklaşımları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma Belediye Başkanı Viyana kenti ve Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie tıbbi bilimsel Fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse strain: C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer Roche 6870228 OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips Roche 6454038 OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769 OGTT
Actrapid - Insulin Novo Nordisk 417642 ITT
Reusable Feeding Needles Fine Science Tools #18061-22 OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes Braun 9161406V OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) Braun 304000 ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)   Braun 4657705 ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible Braintree Scientific, Inc. SP0016 OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit Crystam Chem 90080 OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat Research Diets Inc D12492 mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat. Research Diets Inc D12450B mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary Sigma-Aldrich BR749321 OGTT/ITT
Vaseline - creme Riviera P1768677 OGTT/ITT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
  2. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
  3. Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
  4. Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
  5. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
  6. Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
  7. Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
  8. Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
  9. Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, Suppl 3. S215-S219 (2004).
  10. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
  11. Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
  12. Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
  13. Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
  14. First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
  15. McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
  16. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
  17. NIH. National Institute of Health - Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. , Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf (2017).
  18. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
  19. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
  20. Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
  21. Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
  22. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  23. Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Jr Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
  24. Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
  25. Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
  26. Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
  27. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
  28. Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
  29. Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
  30. Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
  31. Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
  32. Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
  33. Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
  34. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  35. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , Chapter 29 Unit 29B 23 (2007).
  36. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
  37. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
  38. Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
  39. Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
  40. Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).

Tags

Tıp sayı: 131 obezite insülin direnci diyabet glikoz Homeostazı glikoz metabolizması yüksek yağlı diyet oral glukoz tolerans testi insülin tolerans testi OGTT ITT
<em>Vivo</em> glikoz metabolizması farelerde Oral glukoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) kullanarak yüksek yağlı diyet beslenen incelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nagy, C., Einwallner, E. Study of… More

Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). J. Vis. Exp. (131), e56672, doi:10.3791/56672 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter