Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

دراسة في فيفو أيض الجلوكوز في الفئران تغذية حمية عالية الدهون باستخدام اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار تحمل الأنسولين (ITT)

Published: January 7, 2018 doi: 10.3791/56672
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, Medical University of Vienna

Summary

ويصف المقال الحالي الجيل وتوصيف الأيضية للفئران تغذية حمية عالية الدهون كنموذج للمقاومة الأنسولين الناجمة عن النظام الغذائي والسمنة. ويضم كذلك بروتوكولات مفصلة لإجراء اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم، واختبار تحمل الأنسولين، رصد التعديلات كامل الجسم من الجلوكوز الأيض في الجسم الحي.

Abstract

السمنة تمثل أهم عامل خطر واحد في الآلية المرضية لداء السكري من النوع 2، أمراض التي تتسم بمقاومة للإقبال على حفز الأنسولين الجلوكوز و ديكومبينسيشن إجمالي من استقلاب الجلوكوز الجهازية. وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في فهم استقلاب الجلوكوز، تظل الآليات الجزيئية للائحته في الصحة والمرض تحت التحقيق، بينما هناك حاجة ماسة إلى نهج جديدة لمنع وعلاج مرض السكري. النظام الغذائي المشتقة الجلوكوز يحفز إفراز البنكرياس للأنسولين، والذي بمثابة الجهة الرئيسية العمليات الابتنائية الخلوية أثناء التغذية-الدولة وأرصدة الجلوكوز في الدم وبالتالي المستويات للحفاظ على مركز الطاقة الشاملة. الإتخام المشغلات ميتا-التهاب مزمن، مما يؤدي إلى تغييرات في الأنسولين المحيطية المرتبطة بمستقبلات الإشارات ومما يقلل من الحساسية للتخلص منها بوساطة الأنسولين الجلوكوز. هذه الأحداث في نهاية المطاف إلى جلوكوز الصيام مرتفعة ومستويات الأنسولين، فضلا عن خفض في تحمل الجلوكوز، الذي بدوره بمثابة مؤشرات هامة لمقاومة الأنسولين. نقدم هنا، على بروتوكول لتوليد وتوصيف الأيضية لحمية عالية الدهون (HFD)-تغذية الفئران كنموذج المستخدمة بشكل متكرر من مقاومة الأنسولين الناجمة عن النظام الغذائي. نحن توضح بالتفصيل اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT)، الذي يرصد الطرفية التخلص من الجلوكوز تدار شفويا إفراز الأنسولين وتحميل على مر الزمن. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم بروتوكول لاختبار تحمل الأنسولين (ITT) لمراقبة عمل الأنسولين الجسم بكامله. معا، هذه الأساليب وتطبيقاتها المصب تمثل أدوات قوية لتميز النمط الظاهري الأيضي العام للفئران، وكذلك فيما يتعلق بتقييم التعديلات في الجلوكوز الأيض على وجه التحديد. قد يكون مفيداً بشكل خاص في مجال بحوث واسعة مقاومة الأنسولين ومرض السكري والسمنة توفير فهم أفضل للآلية المرضية، وكذلك فيما يتعلق باختبار آثار التدخلات العلاجية.

Introduction

في العالم المتقدم، السمنة ومرض السكري وصل إلى أبعاد الوباء بسبب الخمول البدني والاستهلاك الزائد من الأغذية المجهزة، الآثار التي تنجم عن سرعة التحضر والتصنيع، فضلا عن العولمة. ورغم أن البحوث على مقاومة الأنسولين وأنها المراضات المشارك، مثل الدهون وتصلب الشرايين، وقد برزت خلال العقود الأخيرة، الآليات البيولوجية المعقدة التي تنظم الأيض في الصحة والمرض ما زالت غير كامل يفهم ولا تزال هناك حاجة ماسة لطرق العلاج الجديدة لمنع وعلاج هذه الأمراض1.

الأنسولين، وأنها التعاقبية هرمون الجلوكاجون بمثابة المنظمين الرئيسيين الطاقة الخلوية الإمداد و macronutrient التوازن، وبالتالي أيضا الحفاظ على تركيزات الجلوكوز الدم المنهجي السليم2. أعمال الجلوكوز نفسه كواحد من أهم محفزات لإفراز الأنسولين من خلايا بيتا في البنكرياس، بينما المغذيات الكبيرة الأخرى، وعوامل خلطيه فضلا عن المدخلات العصبية كذلك تعديل هذا الرد. ونتيجة لذلك مشغلات الأنسولين العمليات الابتنائية الدولة بنك الاحتياطي الفيدرالي بتيسير نشر جلوكوز الدم الزائد في العضلات والخلايا الدهنية وزيادة تفعيل تحلل فضلا عن البروتين أو الأحماض الدهنية التوليف، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، يمنع الأنسولين الجلوكوز الكبدي الناتج عن طريق تثبيط gluconeogenesis. استهلاك الطاقة الزائدة المزمنة وميتا-التهاب يؤدي إلى hyperinsulinemia ومقاومة الأنسولين المحيطية بسبب الأسفل التنظيم التعبير مستقبلات الأنسولين، فضلا عن التعديلات في المصب مسارات الإشارات، مما يؤدي إلى ضعف حساسية للتخلص من الجلوكوز بوساطة الأنسولين، فضلا عن تثبيط غير كافية من الجلوكوز الكبدي الإنتاج3،4،،من56.

مجموعة واسعة من نماذج حيوانية مع التعريفي الوراثية أو التغذية أو التجريبية للمرض قد أثبتت أن تكون أدوات ممتازة دراسة الآليات الجزيئية لمقاومة الأنسولين، وأشكال مختلفة من مرض السكري، فضلا عن الأمراض المصاحبة لها7 . مثال هو نموذج الماوس المستخدمة على نطاق واسع والراسخة التي يسببها HFD، التي تتسم بزيادة الوزن السريع بسبب زيادة المدخول الغذائي في تركيبة مع انخفاض كفاءة التمثيل الغذائي، أسفر عن الأنسولين المقاومة8، 9-سواء في النماذج الحيوانية والبشر، وارتفاع في الصوم الدم الجلوكوز والإنسولين المستويات، فضلا عن التسامح البصر إلى إدارة الجلوكوز هي المؤشرات المستخدمة بشكل متكرر من مقاومة الأنسولين وغيرها التعديلات النظامية من الجلوكوز الأيض. رصد الجلوكوز والإنسولين مستويات الدم في الدولة القاعدية أو بعد التحفيز بالتالي قراءات الوصول إليها بسهولة.

ويوجز هذا البروتوكول توليد تغذية HFD الفئران، فضلا عن الأساليب المستخدمة بشكل متكرر اثنين، اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار مقاومة الأنسولين (ITT)، ومفيدة لتحديد خصائص النمط الظاهري الأيضية والتحقيق التعديلات في الجلوكوز الأيض. يصف لنا OGTT بالتفصيل، الذي يقيم التخلص من الجلوكوز تدار شفويا إفراز الأنسولين وتحميل على مر الزمن. علاوة على ذلك، نحن توفر إرشادات حول كيفية إجراء أي تي تي للتحقيق في كامل الجسم الأنسولين للعمل عن طريق رصد تركيز جلوكوز الدم استجابة لبولس الأنسولين. البروتوكولات المذكورة في هذه المقالة هي الراسخة والتي استخدمت في دراسات متعددة10،،من1112. بالإضافة إلى التعديلات الطفيفة التي قد تساعد على زيادة نجاح، ونحن تقديم مبادئ توجيهية لتصميم التجارب، وتحليل البيانات، فضلا عن تلميحات مفيدة لتجنب المزالق المحتملة. البروتوكولات المبينة في هذا التقرير يمكن أن تكون أدوات قوية جداً للتحقيق في تأثير العوامل البيئية الوراثية والدوائية والغذائية وغيرها على استقلاب الجلوكوز في الجسم كله والاضطرابات المرتبطة به مثل مقاومة الأنسولين. بالإضافة إلى تحفيز مع السكر أو الأنسولين، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من مركبات أخرى للتحفيز استناداً إلى غرض البحث الفردي. على الرغم من خارج نطاق هذه المخطوطة، يمكن تنفيذ العديد من التطبيقات الأخرى المصب على عينات الدم مرسومة، مثل تحليل الدم قيم خلاف الجلوكوز والإنسولين (التشكيلات الجانبيةمثلاًوالدهن والبروتين الدهني) فضلا عن مفصل تحليل علامات الأيضية (مثلاً، بكمية الوقت الحقيقي Polymerase سلسلة من ردود الفعل (PCR) وتحليل لطخة غربية، ومقايسة الممتز Enzyme-Linked (ELISA)). زيادة التدفق الخلوي ويمكن تطبيق Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) للتحقيق في الآثار في السكان خلية مفردة متميزة، في حين ترانسكريبتوميك والبروتين، والنهج metabolomic يمكن استخدامها أيضا لتحليل غير المستهدفة.

عموما، نحن نقدم بروتوكول بسيط لتوليد نموذج المستحثة HFD ماوس، بينما تصف كذلك النهجين قوية لدراسة التعديلات كامل الجسم الأيضية، OGTT وشركة ITT، التي يمكن أن تكون أدوات مفيدة لدراسة منشأ المرض و تطوير علاجات جديدة، لا سيما في مجال أمراض مرتبطة بالتمثيل الغذائي مثل مقاومة الأنسولين ومرض السكري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم وافق عليها العناية بالحيوان واستخدام اللجنة "جامعة فيينا الطبية" جميع الأساليب الموصوفة هنا وأجرى وفقا للاتحاد من الأوروبية مختبر الحيوان العلوم الجمعيات (فيلاسا). يرجى ملاحظة أن جميع الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول ينبغي أن يقوم إلا بعد موافقة المؤسسية والحكومية وكذلك الموظفين الذين يجيدون من الناحية الفنية.

1-HFD-تغذية الفئران

ملاحظة: الحفاظ على جميع C57BL/6J الفئران على دورة الضوء/الظلام 12-ح مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.

  1. في 6 أسابيع من العمر، مكان الفئران لمدة 8-12 أسابيع في HFD (40-60% الدهون السعرات الحرارية) للحث على السمنة، بينما تغذية التحكم--مجموعة العجاف اتباع نظام غذائي منخفض الدهون (LFD) (10% الدهون السعرات الحرارية).
  2. تحديد وزن الجسم من الفئران على أساس أسبوعي. منحنيات الوزن ينبغي أن تظهر أنماط مماثلة في كلا الفريقين، مع منحدر أعلى في المجموعة التي تغذيها HFD.

2-OGTT

ملاحظة: إذا كان يتم اختيار النقاط الزمنية أخذ عينات الدم أثناء OGTT كل 15 دقيقة، التجربة ينبغي إجراء بحد أقصى 15 الفئران في موازاة ذلك، كي يكون على الأقل 1 دقيقة معالجة وقت كل الماوس.

  1. الأعمال التحضيرية في اليوم السابق OGTT
    1. نقل الفئران في قفص مع الفراش الطازجة وسريعة لهم بين عشية وضحاها قبل إجراء الاختبار (ح 14)، مع ضمان أن الفئران يستطيعون الوصول إلى مياه الشرب (مثلاً، إزالة المواد الغذائية في 06:00 م وقت بدء في صباح اليوم التالي الساعة 08:00 ص).
      ملاحظة: هو الفئران الصيام بين عشية وضحاها النهج الموحدة، لكن سريعة أقصر (ح 5-6) فسيولوجية أكثر للفئران (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل).
  2. الأعمال التحضيرية في اليوم للتجربة (ولكن قبل التجربة)
    1. إعداد 10 مل من محلول الجلوكوز 20 ٪ (حل د-(+)-الجلوكوز في الماء المقطر).
      ملاحظة: جميع الكواشف التي تدار على الحيوانات أن يكون الصف الدوائي وعقيمة.
    2. إعداد لوحة 96-جيدا لجمع البلازما، بسد بئر واحدة لكل نقطة في وقت أخذ العينات وكل الماوس، مع 5 ميليلتر نايدتا (م 0.5 يدتا، pH 8.0 في 0.9% كلوريد الصوديوم، مخزن في RT). وخلال التجربة، تخزين هذه اللوحة على الجليد.
      ملاحظة: انظر التكميلية الرقم 1 لقائمة مفصلة.
  3. قياس وزن الجسم من جميع الفئران ومارك ذيولها مع علامة دائمة بغية جعل الفئران يمكن تمييزها بسهولة (مثلاً، داش الماوس 1 = 1، شرطات الماوس 2 = 2، إلخ).
  4. قياس السكر وأخذ عينات من الدم (الشكل 2)
    1. قطع بعناية في 1-2 مم طرف الذيل استخدام مقص حاد ("البديل ألف" في الشكل 2). دائماً تمحو أول قطره دم لتجنب انحلال الدم أو التلوث بسوائل الأنسجة قبل أخذ عينات دم جديد لتحديد الجلوكوز في الدم. رسم عينة دم صغيرة (~ 3 ميليلتر) لقياس مستوى جلوكوز الدم القاعدية (= الوقت النقطة 0) مع السكر.
      تنبيه: فحص وضبط عدد شرائط الاختبار على السكر تهمة.
      ملاحظة: كطريقة أخذ عينات دم بديلة، نك على المنوال الذيل الأفقي بالماوس مع شفرة مشرط حاد ("البديل باء" في الشكل 2). وعلى المنوال الذيل الأفقي عادة الوصول إلى الثلث تقريبا على طول الذيل من طرف الذيل، تتحرك نحو قاعدة الذيل لعينات متعددة. ينصح باستخدام كريم مخدر موضعي. وقف تدفق الدم عن طريق تطبيق ضغط الإصبع على الأنسجة اللينة لمالا يقل عن 30 ثانية قبل أن يتم إرجاع الحيوان إلى قفصة.
    2. جمع عينة دم (حوالي 30 ميليلتر) باستخدام أنبوب شعري طازجة (إبقاء الأفقي الأنبوبة الشعرية). إفراغ الأنبوب الشعرية باستخدام ماصة وضع طرف الماصة في الجزء العلوي من نهاية الأنبوبة الشعرية ودفع الدم التي تم جمعها بعناية في بئر لصفيحة 96-جيدا، مع تجنب فقاعات الهواء. كرر هذا الإجراء لكل الفئران-في وقت واحد.
      ملاحظة: كبديل لجمع الدم عن طريق أنبوب شعري، استخدام ماصة تعديلها على وحدة التخزين الصحيحة (مثلاً، 30 ميليلتر) لجمع الدم، أو جمع قطره من الدم من الذيل في الفيلم البارافين وبيبيت إلى يدتا-الحل. دقة تجنب اتصال فازلين مع شرائط اختبار الدم أو السكر، كما أنها قد تؤثر على القياسات اللاحقة الجلوكوز والإنسولين.
      تنبيه: OGTT مرهقة جداً بالنسبة للفئران: العجاف الفئران يمكن أن يفقد حوالي 15% وزن الجسم أثناء سريع بين عشية وضحاها. بالإضافة إلى ذلك، وأخذ عينات من الدم في نقاط زمنية مختلفة يؤدي إلى فقدان قدر كبير من الدم. لأخذ عينات من الدم أسهل، فمن الممكن تدليك موسيتايل مع فازلين بعناية.
      ملاحظة: قد تحد من المبادئ التوجيهية المؤسسية المبلغ المسموح به للدم التي تم جمعها ضمن فترة زمنية محددة. وينبغي تعديل أحجام العينات وتيميبوينتس عدم تجاوز الحدود القصوى المسموح بها. ينبغي استخدام وزن الجسم من الفئران لحساب الإجمالي الدم الانسحاب المسموح بها.
  5. حساب حجم المطلوب من الجلوكوز الحل استناداً إلى وزن الجسم (ز 1 الجلوكوز/كغ من وزن الجسم؛ وهذا يمكن أن تكون زيادة تصل إلى 3 غرام/كغ) يديره تزقيمية الشفوي لكل الماوس. على سبيل المثال، سيحتاج ماوس مع وزن جسم من 30 جرام 150 ميليلتر من حل الجلوكوز 20 ٪ لإدارة 30 ملغ جلوكوز.
    ملاحظة: لقاعدة جرعة الجلوكوز على وزن الماوس هو الإجراء القياسي. إذا كانت تتوفر بيانات تكوين الهيئة، جرعة السكر OGTT يجب أن يحسب استناداً إلى الهزيل كتلة الجسم (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل).
  6. إدارة الجلوكوز
    1. إعداد افيريثينجثات المسبق خلال التجربة كاملة مقدما (الموقت، ورقة سجل التجربة، المحاقن مراقب وشرائط، الشعيرات الدموية، الجلوكوز، حل الجلوكوز، لوحة 96-جيدا، مشرط، الحاسبة، التوازن، علامة دائمة، أوراق البدلاء، "الماصة؛" مع معلومات سرية، والقفازات).
    2. لتطبيق الجلوكوز، كبح جماح الماوس باستيعاب اعتقادا راسخا أنه قبل القفا. تطبيق الحزم الكافي للجلد حول الرقبة للحيلولة دون التواء من كبح جماح الماوس وآماله رأسه إلى الوراء بشكل صحيح. تأكد أيضا من أن يستطيع التنفس الماوس بشكل صحيح.
      ملاحظة: بمجرد بدء إدارة الجلوكوز، إدارة الوقت المناسب مهم جداً.
    3. عناية إدارة الحل الجلوكوز (استناداً إلى الخطوة 2، 5) مباشرة إلى المعدة باستخدام إبرة تغذية. حذر مباشرة إبرة التغذية عن طريق الفم نحو المريء. تسمح الماوس لابتلاع الإبرة: الإبرة المصارف كلياً إلى المريء السفلي/المعدة للماوس. ثم حقن الجلوكوز الحل (الشكل 3a).
      1. إذا تم استيفاء أي مقاومة أو إذا كان الحيوان تناضل فورا، سحب الإبرة وموضعه. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت فور تزقيمية الأولى وإدارة الجلوكوز لجميع الفئران الأخرى في فواصل زمنية 1 دقيقة.
        ملاحظة: قد يكون من المفيد تطبيق قطره حل الجلوكوز مباشرة من إبرة التغذية بفم الماوس، مما يؤدي إلى حفز لعق وبلع، وبالتالي تسهيل الإدراج أسهل من إبرة التغذية. لا يتم تطبيق الضغط عند إدخال إبرة التغذية كهذا قد خطيرة تصيب الحيوان.
  7. بعد 15 دقيقة، قياس مستويات الجلوكوز في الدم بالسكر و بالإضافة إلى ذلك أخذ عينات الدم (~ 30 ميليلتر) (كما هو موضح في التفاصيل في الخطوة 2، 4) لكل الماوس بنفس الترتيب كما أنها كانت حقن.
    ملاحظة: إدارة الوقت مهم جداً؛ اتبع قدر الإمكان باستخدام الفواصل الزمنية نفسها أما تزقيمية مدتها. واسمحوا الفئران التحرك بحرية قدر الإمكان، وتقييد الحد الأقصى إلى الحد أدنى أثناء الإجراء بأكمله للحد من الإجهاد، ويجوز تعديله النتائج. الحليب الذيل مع يد واحدة وجمع الدم مع الآخر.
  8. كرر الخطوة 2.7 نقطة زمنية محددة تبعاً للنتائج المتوقعة (مثلاً، في 30، 45، 60، 90، 120 و 150 و 180 دقيقة بعد إدارة الجلوكوز). إذا كانت النقاط الزمنية المحددة التي أطول من 120 دقيقة، ضمان أن الفئران يستطيعون الوصول إلى مياه الشرب. ضمان أن الفئران دائماً إمكانية الوصول إلى مياه الشرب. عند الانتهاء من التجربة، تعود الفئران إلى اقفاصها منزل مزودة بالمواد الغذائية والمياه.
    تنبيه: OGTT مرهقة جداً للفئران. ولذلك الانتظار قبل إجراء الاختبار التالي الأيضية، مثل ITT 1 أسبوع على الأقل.
  9. وبعد التجربة، الطرد المركزي عينات الدم في 2,500 س ز، و 30 دقيقة، 4 درجة مئوية. نقل المادة طافية (البلازما) إفراغ آبار بليت وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى التحليل.
    1. تسجيل انحلال الدم عينات إذا كانت موجودة (انظر القسم 3).
  10. تحديد عدة مستويات الأنسولين البلازما باستخدام أليسا متاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد) اتباع إرشادات الشركة المصنعة لهذه المجموعة.
    ملاحظة: اعتماداً على حالة الصيام وكذلك على التمثيل الغذائي للفئران التحقيق، صعوبات أثناء هذا الفحص قد تحدث: مستويات الأنسولين الصيام بين عشية وضحاها (النقطة الزمنية 0) هي منخفضة جداً، وذلك ما يقرب من حد الكشف. لتجنب هذه المشكلة، ومضاعفة كمية حجم البلازما الموصى بها وتبعاً لذلك النصف نتيجة لفحص إليزا. من ناحية أخرى، إذا كانت الفئران تصل إلى ذروة الأنسولين أثناء OGTT، لا سيما في الفئران التي تتغذى HFD، مستويات الأنسولين قد تجاوز الحد الكشف: تمييع العينة (مثلاً، إذ مع 0.9% كلوريد الصوديوم) وكرر الفحص إليزا. انحلال الدم في عينات البلازما قد يؤدي إلى تدهور الأنسولين، مما أدى إلى انخفاض قيم قراءات. التدهور يعتمد على الوقت ودرجة الحرارة وتركيز الهيموغلوبين في العينة. دائماً الاحتفاظ بعينات هيموليزيد الباردة أو على الجليد للحد من تدهور الأنسولين.

3-شركة ITT

ملاحظة: لديك نفس الاحتياطات ووصف ل OGTT (المناولة من الفئران، والدم، والسكر، واستخدام فازلين) أيضا ليتم تطبيقها عند إجراء أي تي تي. على سبيل المثال، حقن جميع ينبغي أن تنفذ ضمن 15 دقيقة في فواصل زمنية 1 دقيقة إذا يتم اختبارها الفئران 15 في نفس الوقت. لشركة ITT، جمع عينات الدم بالأنابيب الشعرية اللاحقة اختياري.

  1. التحضير قبل التجربة
    1. الفئران على الأقل 2 ح قبل حقن الأنسولين، مع ضمان أن الفئران يستطيعون الوصول إلى مياه الشرب بسرعة (مثلإزالة الغذاء الساعة 08:00 ص، واختبار الفئران ح 2-5 في وقت لاحق).
    2. تمييع 1:1,000 الأنسولين في 0.9% كلوريد الصوديوم (الأوراق المالية: 100 يو/مليلتر الأنسولين؛ والعامل تركيز 0.1 U/mL) وإعداد الجلوكوز 20 ٪ (د-(+)-حل السكر يذوب في الماء المقطر) تدار إذا أصبحت الفئران سكر الدم.
      ملاحظة: يتم شركة ITT عادة بعد سريعة قصيرة لتجنب نقص السكر في الدم الذي قد يحدث في خلاف ذلك بين عشية وضحاها صام الحيوانات. جميع الكواشف التي تدار على الحيوانات أن يكون الصف الدوائي وعقيمة.
  2. قياس وزن الجسم الفئران ووضع علامة الذيل وقطع ذيل تلميح باستخدام مقص حاد وقياس مستويات الجلوكوز في الدم القاعدية كما هو موضح مسبقاً ل OGTT في الخطوة 2، 4.
  3. حقن الأنسولين
    1. لحقن الأنسولين إينترابيريتونيلي (0.75 يو الأنسولين/كغ من وزن الجسم، محسوبة مسبقاً)، كبح جماح الماوس بواسطة الأسلوب القفا.
    2. استخدام طازجة، عقيمة 27 أو 30 قياس الإبرة لكل الحيوانات لتجنب الانزعاج وخطر الإصابة بأي مكان الحقن.
      ملاحظة: تعقيم الجلد يمكن أن تطيل مدة الإدارة الأنسولين، وهكذا يمكن أن تسبب اضطرابات إضافية للحيوان. لذلك، من المستحسن عدم.
    3. إمالة الرأس الماوس لأسفل بزاوية طفيفة لفضح الجانب البطني للحيوان. ضع إبرة معقمة مع المجسم مشطوف الحواف أعلى وزاوية 30 درجة في الربع العلوي الأيمن من البطن للحيوان (الشكل 3b). بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت فورا بعد أن يتم حقن الفأرة الأولى.
      ملاحظة: يتولى جرعة منخفضة (0.1 يو/كغ) يمكن أداؤها على وجه التحديد تقييم حساسية الأنسولين الكبدي. أما بالنسبة OGTT، حساب حجم الحقن استناداً إلى وزن الجسم هو الإجراء القياسي، بينما الجرعة مستندة على الجسم النحيل الشامل المفضل إذا توفرت بيانات تكوين الجسم.
  4. قياس مستويات الجلوكوز في الدم عند نقطة زمنية محددة (مثلاً، بعد 15، 30، 45 و 60 و 90 دقيقة).
    ملاحظة: كما قد الأنسولين نصف وقت قصير من ~ 10 دقيقة في الفئران13، الراحل بعد الإدارة الأنسولين (مثلاً، بعد 2 ح) قد لا تعكس الفروق تأثير مباشر لعمل الأنسولين. إدارة الحل الجلوكوز 20 ٪ في حالة ماوس يصبح سكر الدم (الدم مستويات الجلوكوز أقل من 35 ملغ/دل)، وهو في خطر الموت.
  5. بعد المرة الأخيرة تشير، مكان الفئران إلى اقفاصها المنزل أعدت مع الكثير من المواد الغذائية والمياه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 جدول الزمني تخطيطي ل phenotyping الأيضية للفئران في الوجبات الغذائية. في سن 6 أسابيع تقريبا، ينبغي أن توضع الفئران في HFD، بينما قد جماعة LFD بمثابة السيطرة على المجموعة. الأهم من ذلك، ينبغي تحديد وزن الجسم أسبوعيا لمراقبة ما إذا كان هناك زيادة متوقعة في وزن الجسم. أي نوع من الإجهاد (مثلالضوضاء أو انتهاج سلوك الذكور) يمكن أن تتداخل مع زيادة وزن الجسم، وينبغي القضاء على الفور. ينبغي أن يتألف كل فوج من الفئران لإجراء التجارب على نظام غذائي من الفئران على الأقل 10 نظراً لأن هذه الحمية-التجارب تستغرق وقتاً طويلاً، والقيم المتطرفة متكررة (مثلاً، الفئران عدم اكتساب الوزن أو الفئران مع الجلوكوز غير طبيعي أو مستويات الأنسولين). بعد فترة محددة من الوقت (اعتماداً على فرضية الدراسة والنقطة الزمنية للتغيرات المتوقعة)، يمكن إجراء OGTT وأي تي تي لتقييم عمل الجلوكوز التسامح والإنسولين. في هذه الورقة، وقد اختيرت النقاط الزمنية المتأخرة لاختبار التمثيل الغذائي.

الأهم من ذلك، ينبغي أن يكون هناك وقت انتعاش لأسبوع واحد على الأقل بين OGTT وشركة ITT هذه التجارب يؤدي إلى فقدان الدم كبيرة، وهي بالتالي مرهقة جداً بالنسبة للفئران. إذا كانت مجلدات جمع الدم انخفاض (مثلاً، إذا كان أداء ITT دون جمع الدم الإضافي الأول)، فترة الاسترداد هذا أيضا قد تكون تقصير أو محذوفة، تمشيا مع المبادئ التوجيهية لتوجه الدم متعددة في الحيوانات14، 15،،من1617.

في هذه الدراسة الكبيرة مع 60 C57BL/6J الفئران في المجموع، نصف الفئران وضعت على HFD أو LFD في سن 6 أسابيع (n = 30/المجموعة) وتم رصد زيادة وزن الجسم لمدة 16 أسبوعا في النظام الغذائي. استهلاك HFD أدت إلى زيادة كبيرة في وزن الجسم كما هو مبين في الشكل 4. في 6 أسابيع من العمر، كان وزن الجسم ز 20.2 في كلتا المجموعتين. بينما أظهرت الفئران في LFD متناسقة، زيادة طفيفة من وزن الجسم (± ز 31.2 2.7) خلال فترة الملاحظة، الفئران في HFD زاد وزن الجسم بسرعة، وبخاصة خلال الأسابيع الأولى ووصلت إلى أقصى وزن الجسم على بعد 16 أسبوعا في النظام الغذائي. على الرغم من أن منحنيات الوزن أظهرت نمطاً مماثلاً خلال التجربة، بالمقارنة مع الفئران HFD-الفريق الذي تم التوصل إليه من 1.5 إلى 2 إضعاف أعلى من وزن جسم (± ز 44.4 4.0) الفئران LFD التي تغذيها.

وأجريت للتحقيق في النمط الظاهري الأيضية للافواج اثنان، إجراء OGTT (الشكل 5) وشركة ITT (الشكل 6). محدودية حجم الدم القوارض الصغيرة، يستخدم مقايسة (POC) نقطة من رعاية للبشر السكري (السكر) لرصد مستويات السكر في الدم خلال هذه التجارب phenotyping الأيضية. كما هو موضح في الشكل 2، مراقبو الجلوكوز في الدم سهلة الاستخدام، وتحتاج فقط صغيرة قطره من الدم، وعرض مستويات الجلوكوز في الدم في غضون ثوان للوثائق. يعرض الرقم 5 مسار الوقت المطلق الأنسولين والجلوكوز المطلق (الشكل 5a–ب) مستويات (الشكل 5 ج) خلال OGTT. عموما، ماوس صحية مع تحمل الجلوكوز العادي يظهر مميزة ارتفاعا سريعاً في الدم الجلوكوز، وصلت إلى ذروتها 15-30 دقيقة بعد تحدي الجلوكوز.

امتصاص الجلوكوز اللاحقة، أجرتها أساسا في العضلات وأنسجة الدهون وأنسجة الكبد يؤدي إلى انخفاض تدريجي لتركيز الجلوكوز في الدم. في جميع التجارب، بمثابة مجموعة مراقبة متسامح الجلوكوز الفئران LFD التي تغذيها وذلك تف الشخصية الاستقلابية المتوقعة: ذروة مستويات السكر في الدم من ~ 240 mg/dL تم التوصل إلى ما يقرب من 15 دقيقة بعد إدارة الجلوكوز، فورا متبوعاً بانخفاض تصل إلى المستويات القاعدية حوالي 60 دقيقة بعد تحدي الجلوكوز، مما يشير إلى القضاء الجلوكوز السليم. في تناقض حاد، وبلغ ذروته في حوالي ~ 320 mg/dL الجلوكوز HFD-الفئران وأظهر تقريبا لا التخلص من الجلوكوز، مما يشير إلى مقاومة الجلوكوز. عند تختلف مستويات الجلوكوز في الدم بين الفريقين فعلا في حالة الصيام (كما هو الحال في هذا المثال الممثل)، ينبغي إجراء عملية حسابية للمنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) أعلاه الأساس الجلوكوز للتحقق من صحة النتائج (5a الرقم– ب).

بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد مستويات الأنسولين في الدم تعميم استخدام إجراء اختبار أليسا الأنسولين (الشكل 5 ج) بغية تقديم المزيد من المعلومات حول الفيزيولوجيا المرضية الكامنة في هذا النموذج. بينما كانت مستويات الأنسولين دون تغيير تقريبا في السيطرة على المجموعة، الفئران تتغذى HFD أظهرت مرتفعة 16-fold الصيام مستويات مقارنة بمجموعة المراقبة، فضلا عن استجابة الأنسولين زيادة كبيرة، مما يشير إلى فعل HFD hyperinsulinemia تعويضية محاولة لموازنة انخفاض الجلوكوز القضاء على القدرات، الذي قد يكون بسبب مقاومة الأنسولين. ومع ذلك، تكون على علم لا الإفراط في تفسير نتائج OGTT، هذا الاختبار لا يتم تقييم مباشرة عمل الأنسولين، ولا ينبغي أن تستخدم لاختتام البيانات عن مقاومة الأنسولين.

قياس حساسية الأنسولين في الفئران التي تتغذى HFD، أنجز ITT أسبوع واحد بعد OGTT (الشكل 6a). في هذا التحليل، تمثل الدرجة للدم التي تقع تركيزات الجلوكوز بعد الإدارة الأنسولين كفاءة عمل الأنسولين الجسم بكامله. وأظهرت الفئران التي تتغذى HFD إلى تخفيض مستويات السكر في الدم، مقارنة بمجموعة التحكم LFD التي تغذيها، في جميع النقاط الزمنية خلال ITT، ضعف مما يشير إلى مقاومة الأنسولين. وترد نتائج ITT عادة كمسار الوقت مستويات الغلوكوز، ولكن بالإضافة إلى ذلك أيضا معكوس أوك أدناه الجلوكوز خط الأساس قد سيظهر كما هو موضح في الشكل 6b. إذا كان لدى المجموعات التي تتم مقارنة مماثلة أثناء الصيام مستويات الجلوكوز في الدم (والذي ليس هو الحال في هذه التجربة)، ويمكن أيضا عرض على مستويات السكر خلال ITT كنسبة مئوية الجلوكوز القاعدي. كما هو الحال في الفئران، يتم تنشيط استجابة التعاقبية للأنسولين إذا كانت مستويات السكر في الدم وتقل ~ 80 ملغ/دل18: العيوب في هذا الرد التعاقبية في طراز ماوس معينة قد يساء تفسيره زيادة في حساسية الأنسولين. خلال هفدس وتجارب المظهرية الأيضية اللاحقة، القيم المتطرفة قد تحدث بشكل متكرر. الفئران التي لا كسب الوزن في HFD، أو تلك التي تبين جلوكوز الصيام غير طبيعية و/أو مستويات الأنسولين ينبغي أن تستبعد من التحليل. للأخيرين، الخارجة قد يكون إجراء اختبار لكل مجموعة تجريبية على حدة (مثلاً، اختبار جرابز)

في هذه الدراسة، كمثال نحن أظهر وتفسير البيانات من التجارب الأيضية في فيفو، أجريت على الفئران بالسمنة الناجمة عن النظام الغذائي وتعصب الجلوكوز ومقاومة الأنسولين، ومقارنة لهم مجموعة تحكم بوزن الجسم العادي. كما هو متوقع، كان هناك ضعف تحمل الجلوكوز التسامح و hyperinsulinemia في الفئران السمنة متسقة مع مقاومة الأنسولين مقارنة بالفئران التحكم مطابقة العمر؛ وكان هذا الكشف عن استخدام أساليب راسخة، ويمكن الاعتماد عليها، الوقت والميزانية-الصديقة، التي سهلة نسبيا لتنفيذ. الاختلافات في تحمل الجلوكوز، مستويات الأنسولين، وكذلك كما هو الحال في حساسية الأنسولين، كلها مستخلصة بطرق عرض OGTT وشركة ITT، غالباً ما تساعد على خطة الخطوات التالية من الدراسة، التي قد تشمل تجارب أكثر تطورا مثل هايبرجليسيميك أو المشابك hyperinsulinemic، فضلا عن تجارب معزولة جزيرات البنكرياس.

Figure 1
رقم 1. تجارب الجدول الزمني التخطيطي لنظام مقترح في النظام غذائي والايضي في الجسم الحي. بغية التحقيق في آثار HFD الأيضي في الفئران، الحيوانات للمجموعة التجريبية وتوضع على HFD في حوالي 6 أسابيع من العمر، بينما يتلقى مجموعة التحكم LFD. وينبغي تحديد وزن الجسم من الفئران على أساس أسبوعي لتقييم الوزن المناسب. بعد حوالي 12 أسبوعا على نظام غذائي (أو نقطة زمنية محددة تبعاً لفرضية البحث)، OGTT تليها 1 أسبوع من وقت الانتعاش، وفي وقت لاحق ITT تقييم النمط الظاهري الأيضية للفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. الأساليب لأخذ عينات من الدم أثناء التجارب الأيضية. ل OGTT، وكذلك فيما يتعلق بشركة ITT، حيث يقتضي الأمر أخذ عينات الدم المتكررة، نوصي برسم الدم عن طريق قطع بعناية قطعة 1-2 مم من طرف الذيل مع مقص حاد (البديل ألف)، متبوعاً بتحديد مستويات الجلوكوز في الدم مع السكر و كذلك جمع الدم مع شعري تحديد مستويات الأنسولين وغيرها من القيم الدم ذات الصلة. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضا عينات الدم عن طريق الوريد الذيل (البديل باء) أو عن طريق قسطرة الشرايين (غير معروضة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. تزقيمية الشفوي الجلوكوز (أ) وحقن الأنسولين داخل (ب)- صور ممثل إدارة الجلوكوز عن طريق الفم باستخدام إبرة تغذية خلال OGTT () وحقن الأنسولين داخل خلال ITT (ب). انظر البروتوكول للحصول على وصف مفصل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. الجسم زيادة الوزن من الفئران C57BL/6J HFD البعلية والمروية LFD- C57BL/6J الفئران كانت أما مجموعة على 60% HFD, أو 10% LFD بمثابة عنصر تحكم، لمدة 20 أسبوعا. بينما أظهرت الفئران في HFD زيادة متوقعة في وزن الجسم، لا سيما في الأسابيع الأولى في النظام الغذائي، أظهرت الفئران التي تغذيها LFD وزن الجسم ثابتة تقريبا خلال فترة الملاحظة. النتائج هي يعني ± sem. *ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001. n = 30 كل مجموعة. واستخدمت ANOVA واختبار توكي الوظائف المخصصة لاختبار للخلافات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. إجراء OGTT في الحيوانات C57BL/6J HFD البعلية والمروية LFD- () الجلوكوز المستويات أثناء OGTT. بعد سرعة بين عشية وضحاها، تم قياس مستويات السكر (mg/dL) في الدولة الصيام و 15، 30 و 45 و 60 دقيقة بعد إدارة الحل الجلوكوز شفويا عن طريق تزقيمية مدتها (الجلوكوز 1 غ/كغ). مستويات السكر في HFD-المجموعة كانت مرتفعة في حالة الصيام وكذلك بعد تحدي الجلوكوز. خفض الزيادة بلغ ذروته بعد 15 دقيقة تليها من تأخر وبطء. النتائج هي يعني ± sem. *ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001. n = 30 كل مجموعة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA وتوكي الوظائف المخصصة . (ب) جلوكوز المنطقة تحت المنحنى (AUC) أثناء OGTT. لحساب خط الأساس تصحيح أوك، مستويات الغلوكوز القاعدي (النقطة الزمنية 0) تم طرح من كل شيء في وقت لاحق الحصول على مستويات الجلوكوز في الدم للماوس كل على حدة، متبوعاً بحساب أوكس الفردية. أوك أعلاه الأساس الجلوكوز يوضح مقاومة الجلوكوز في الفئران التي تتغذى HFD. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA وتوكي في وظيفة المخصص الاختبار (مستويات السكر) أو الطالب الذيل اثنين تي-اختبار (AUC). (ج) مستويات الأنسولين أثناء OGTT. تم قياس مستويات الأنسولين (نانوغرام/مل) وبعد فترة صيام ح 4 و 15 و 30 و 60 دقيقة بعد إدارة الحل الجلوكوز شفويا عن طريق تزقيمية مدتها (الجلوكوز 1 غ/كغ). HFD تغذية الفئران ليس فقط تعويض لحقن الجلوكوز مع زيادة ارتفاع في مستويات الأنسولين في الدم، أنها أيضا بدأت وانتهت في OGTT مع مستويات الأنسولين مرتفعة مقارنة بمجموعة التحكم. النتائج هي يعني ± sem. *ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001. n = 30 كل مجموعة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA وتوكي الوظائف المخصصة . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6. يتولى تنفيذها في الحيوانات C57BL/6J HFD البعلية والمروية LFD- () الجلوكوز مستويات خلال أي تي تي. تم قياس مستويات الجلوكوز (mg/dL) في دولة الصيام و 15، 30 و 45 و 60 دقيقة بعد حقن الأنسولين إينترابيريتونيلي (0.75 يو الأنسولين/كغ). خلال ITT، HFD تغذية الفئران أظهرت مستويات مرتفعة من السكر. لا على نحو كاف مستويات الجلوكوز في الدم قد خفض في الفئران التي تتغذى HFD بعد حقن الأنسولين. النتائج هي يعني ± sem. *ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001. n = 30 كل مجموعة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA وتوكي الوظائف المخصصة . (ب) الجلوكوز في المنطقة تحت المنحنى (AUC) أثناء أي تي تي. لحساب معكوس الأساس المصححة أوك، مستويات الغلوكوز القاعدي (النقطة الزمنية 0) كان مطروحاً من جميع مستويات الجلوكوز في الدم التي تم الحصول عليها في وقت لاحق للماوس كل على حدة. كانت القيم المقلوب (ضرب مع-1)، تليها حساب أوكس الفردية. نتيجة لارتفاع مستوى الجلوكوز في الفئران التي تتغذى HFD أثناء OGTT، تصحيح خط الأساس معكوس كان أقل في الفئران التي تتغذى HFD مراقبة الفئران، مما يشير إلى زيادة حساسية الأنسولين انخفض بالمقارنة مع/أوك/. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA وتوكي في وظيفة المخصص الاختبار (مستويات السكر) أو الطالب الذيل اثنين تي-اختبار (معكوس أوك). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية الرقم 1. قائمة مرجعية لإعداد تجربة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الرقم 2. مستويات الأنسولين أثناء يتولى. مستويات الأنسولين البلازما خلال ITT في LFD تغذية مقابل المجموعات التي تغذيها HFD أظهرت ديناميات مماثلة في مستويات الأنسولين البلازما بعد حقن الأنسولين في كلتا المجموعتين. كما هو متوقع، أظهرت الفئران HFD مستويات الأنسولين القاعدية بشدة زيادة مقارنة بمجموعة التحكم. علاوة على ذلك، كانت الزيادة في مستويات الأنسولين في الفئران التي تتغذى HFD أقوى، مما قد يكون جزئيا سبب المبالغة في تقدير كتلة الجسم النحيل إذا يتم حساب كمية حقن الأنسولين استناداً إلى كتلة الجسم كله (نهج التطبيع التقليدية) كما أجريت في هذه التجربة. ومع ذلك، كان ضعف استجابة الأنسولين في المجموعة التي تغذيها HFD (عدم كفاية الحد من مستويات الجلوكوز في بلازما)، مما يزيد من التأكيد على حالة مقاومة للأنسولين في هذه الحيوانات. النتائج هي يعني ± sem. *ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA وتوكي الوظائف المخصصة . اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مع ارتفاع معدل انتشار مرض السكري والأمراض المرتبطة بها في سكان العالم، هناك حاجة قوية للبحث تناول الآلية الجزيئية والوقاية، والعلاج من المرض19. البروتوكول قدم وصف أساليب راسخة لتوليد HFD الفئران، نموذج حيوان قوية تستخدم لأبحاث التمثيل الغذائي، فضلا عن التوصيل OGTT وشركة ITT، التي أدوات قوية لتقييم التغيرات الاستقلابية الجسم كله مثل مقاومة الأنسولين. قد يكون من المفيد لدراسة دور الجينات المشتبه فيها، والعوامل البيئية، فضلا عن العلاجات الدوائية والغذائية والمادية، أو الوراثية في الجسم كله استقلاب الجلوكوز9،10طرق المعروضة في هذه الورقة. بينما الجلوكوز بمثابة الحافز الرئيسي لإفراز الأنسولين في OGTT، يجوز تعديل البروتوكول المقدم ب (co-) تطبيق المواد الأخرى مثل الهرمونات التي هي معروفة لتعديل استجابة الأنسولين2والمغذيات الكبيرة الأخرى. وبالمثل، يجوز تعديل البروتوكول ITT بالتطبيق (co-) مواد أخرى (مثلالجلوكاجون أو الكاتيشولامين) وفقا للسؤال البحثي الفردية. قراءات الرئيسي من البروتوكولات OGTT وشركة ITT وصف تركيزات الجلوكوز والإنسولين في الدم؛ ومع ذلك، قياس بارامترات الدم الأخرى مثل الجلوكاجون، والأحماض الدهنية، ومستويات البروتين الدهني، فضلا عن علامات الأيضية المختلفة على مستوى مرناً والبروتين كما قد يكون من المفيد تبعاً لهدف الدراسة.

المحققين ينبغي أن تدرك أن الاستجابات الهرمونية العصبية إلى نقص السكر في الدم، وإفراز الأنسولين، عمل الأنسولين، فضلا عن النمط الظاهري الأيضي عموما تعتمد بشدة على الخلفية الوراثية ل الفئران10. هنا، نحن تستخدم الفئران داخل الخلفية الوراثية C57BL/6J كنموذج HFD الناجمة عن مرض السكري، الذي يعانون من ضعف جزئي في إفراز الأنسولين الجلوكوز بوساطة سبب حذف التي تحدث بشكل طبيعي في الجينات ترانشيدروجيناسي النوكليوتيدات نيكوتيناميد 20، مما يجعلهم نموذجا مناسباً لدراسة السمنة المرتبطة الأنسولين المقاومة8،9. البروتوكولات الموصوفة هنا أيار/مايو لكن كما يستفاد من تميز أيضي نماذج ماوس بديلة لمقاومة الأنسولين ومرض السكري، والتي تستند عادة اضطرابات مونوجينيك أو في تدمير الأسلحة الكيميائية من الخلايا β21، 22 , 23-وتشمل الاحتياطات أثناء التصميم التجريبي اختبار مطابقة سن الفئران، كانخفاض حساسية الأنسولين مع سن24، وإلحاقا بإجراء التجارب في الفئران من نفس الجنس. قد تؤدي الطفرات الوراثية وعلاجات مختلفة تعمل تبعاً للجنس25،26، قد أيضا يكون من المستصوب للتحقيق في كلا الجنسين بشكل منفصل عن بعضها البعض.

طريقة أخذ عينات الدم الموصوفة في هذا البروتوكول لا يتطلب التخدير، التي قد تؤثر على معدل ضربات القلب وتدفق الدم، واستقلاب الجلوكوز، مما أسفر عن نتائج غير الفسيولوجية10. وبدلاً من ذلك، قد مزروع قسطرة الشريانية، التي تسمح بأخذ العينات والأوعية الدموية دون التعامل مع الإجهاد أثناء التجربة، ولكن أيضا بإضافة الجهد والتكاليف، فضلا عن خطر فقدان الحيوانات للتجربة. OGTT، صام الفئران هي عادة بين عشية وضحاها (14-18 ح)، التي تثير دولة تقويضي في الفئران، بشدة المستنفدة لمخازن الجليكوجين في الكبد. على الرغم من أن هذا يقلل من التفاوت في مستويات الجلوكوز في الدم الأساس، ينخفض معدل الأيض السريع المطول ويعزز استخدام الجلوكوز في الفئران، وعلى النقيض من الحالة في البشر10،27. كما أنماط التغذية في الفئران أيضا تقليد سلوك البشر، قد يكون هكذا الفسيولوجية أكثر لأداء OGTT بعد سريعة قصيرة. كما إيقاعات circadian لها تأثير قوي على استقلاب الجلوكوز الجهازية28، من المهم النظر وتجري التجارب الموضحة هنا في أي وقت من اليوم. بغية التحقيق في التمثيل الغذائي للفئران خلال تلك الفترة النشطة (المرحلة السوداء)، قد يكون دورة الضوء الظلام عكس قيمة لتوليد المزيد من النتائج الفسيولوجية.

كما قد تكون متنوعة وصف مسار الإدارة اعتماداً على فرضية محددة يجري اختبارها. الفم من السكر أثناء اختبار جلوكوز التسامح يؤدي إلى إفراز الأنسولين أكثر من متغير، إفراغ المعدة والحركة المعوية والهرمونات (إينكريتينس)، والمدخلات العصبية تعديل وتمديد استجابة الأنسولين2، 10-خلال البئر ووصف "تأثير incretin"، امتصاص الجلوكوز من الأمعاء يؤدي إلى الإفراج عن هرمونات الجهاز الهضمي مثل GLP1، مما يقوي التي تعالج الشفوي الأنسولين الجلوكوز ألقي إطلاق سراح29. للتحايل على هذه الآثار، بولس جلوكوز يمكن أيضا أن تدار عن طريق الوريد (إيفجت) أو إينترابيريتونيلي (إيبجت). الرحلات الجلوكوز والإنسولين تختلف إلى حد كبير اعتماداً على مسار التسليم الذي تم اختياره. مقارنة OGTT، داخل إدارة الجلوكوز يؤدي إلى ذروة المطول وزيادة في مستويات الجلوكوز في البلازما، رغم ارتفاع مستويات الأنسولين البلازما في التأخر، ولكن أكثر الأزياء مستمرة30. وبالمثل، يتسم ب استجابة الأنسولين المتأخر31إدارة الجلوكوز عن طريق الحقن الوريدي. زيادات حادة في مستويات الأنسولين، فضلا عن أقوى أوك-الأنسولين البيانات التي تم الحصول عليها خلال OGTT توحي بأن التسليم الشفوي الجلوكوز قد يكون أكثر حساسية للكشف عن التغييرات في استقلاب الجلوكوز في تغذية تشاو مقابل الفئران التي تتغذى HFD30، 31. إنجاز كل إجراء وداخل تتشابه من حيث الخطورة للصعوبة التقنية والحيوان، بينما الإدارة عن طريق الحقن الوريدي عادة أكثر صعوبة، فضلا عن أكثر إرهاقاً ل الفئران32. يلغي كذلك الفم معدل 10-20% من الخطأ أثناء الحقن داخل تجويف الأمعاء أو المعدة، والتي قد تؤثر على معدل الجلوكوز التسليم والتوزيع33،34.

على الرغم من أنه الطريق الأكثر الفسيولوجية لإيصال الجلوكوز، OGTT ينحصر في المحاسبة لامتصاص الجلوكوز فقط، بينما وجبة كاملة تحتوي أيضا على البروتينات والكربوهيدرات المركبة، والدهون، والألياف والمغذيات الدقيقة. والنهج القياسي خلال OGTT قاعدة جرعة الجلوكوز في وزن الجسم من الماوس، بينما عادة ما تكون 1-3 غرام من السكر/كغ وزن الجسم تدار35،36. وفي بعض الحالات، قد يلزم تحميل جلوكوز أعلى من 1 غرام/كغ لتكشف عن ضعف تحمل جلوكوز التسامح30. العديد من نماذج الماوس من السمنة ومرض السكري تتسم بتغييرات في تكوين الجسم، وبخاصة إلى زيادة هائلة في كتلة الدهون، بينما لا تغيير كتلة الجسم النحيل (العضلات والدماغ، والكبد)، وهو الموقع الرئيسي للتخلص من الجلوكوز بشكل متناسب. وبالتالي سيؤدي إلى نهج التطبيع التقليدية لوزن الجسم جرعة أعلى غير متناسب من الجلوكوز الذي يتعرض له الأنسجة العجاف في ماوس السمنة مقارنة بالماوس غير البدناء. يزيد هذا التحيز مع جرعة جلوكوز أعلى30. ولذلك على النحو الأمثل الجرعة من الجلوكوز (OGTT) فضلا عن الأنسولين (ITT) ينبغي أن تكون حساب استناداً إلى كتلة الجسم النحيل، إذا كان الجسم تكوين البيانات المتاحة37. إذا لم يكن ممكناً تقييم تكوين الجسم بسبب القيود التقنية، الجرعات ينبغي إجراء استناداً إلى وزن الجسم (تكميلية الشكل 2)، بينما تطبيق جرعة ثابتة، كما هو الحال في OGTT بشرية ينبغي أن تكون الملاذ الأخير إذا إجراء هذه الاختبارات في الفئران10،،من3536. وفي البروتوكول المقدم، واستخدمت جهاز الدم كله باليد لقياس مستويات الجلوكوز في الدم، ومفيد في اختبارات مثل OGTT، وشركة ITT التي تتطلب أخذ عينات متعددة لكميات صغيرة من الدم. ومع ذلك، هذه الأجهزة مصممة للدم البشري، وجود مجموعة ديناميكية مخفضة. وبدلاً من ذلك، الآلي الجلوكوز مستويات يمكن أن يقاس في عينات البلازما التي يتم جمعها، مثلاً، بالكامل كيمياء الغلاف الجوي في المختبرات الروتينية. بالإضافة إلى الأنسولين، ويمكن قياس الببتيد C في البروتوكولات وصف كمؤشر مباشرة أكثر من وظيفة افرازية خلايا بيتا، الذي يتم استخراج لا في الكبد خلافا للأنسولين38،39. إذا جلوكونيوجينيسيس تحتاج إلى تقييم، يجوز تطبيق اختبار التسامح بيروفات (PTT)، وهو متغير آخر البروتوكولات الموصوفة هنا، ورصد الرحلات نسبة السكر في الدم بعد إقامة بولس بيروفات40.

النهج المبين هنا يمكن OGTT وشركة ITT غالباً ما شرح الاختلافات المشاهدة في تحمل الجلوكوز وقد تخدم كذلك اقتراح تجري فيها التجارب اللاحقة، وأكثر تطورا التالية (مثلاً، والمشابك هايبرجليسيميك أو دراسات بشأن الجزر الصغيرة المعزولة). وباختصار، يقدم بروتوكول بسيط لتوليد نموذج المستحثة HFD الماوس وكذلك وصف OGTT وشركة ITT، التي هي أدوات قوية لتقييم التعديلات من النمط الظاهري الأيضية في الجسم الحي ، وقد يكون من المفيد دراسة آليات الأمراض المرتبطة بعملية الأيض، فضلا عن نهج علاجية جديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث "صندوق" عمدة مدينة فيينا والوكالة الألمانية عن für لابوراتوريومسميديزين und كيمي كلينش الطبية العلمية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse strain: C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer Roche 6870228 OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips Roche 6454038 OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769 OGTT
Actrapid - Insulin Novo Nordisk 417642 ITT
Reusable Feeding Needles Fine Science Tools #18061-22 OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes Braun 9161406V OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) Braun 304000 ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)   Braun 4657705 ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible Braintree Scientific, Inc. SP0016 OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit Crystam Chem 90080 OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat Research Diets Inc D12492 mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat. Research Diets Inc D12450B mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary Sigma-Aldrich BR749321 OGTT/ITT
Vaseline - creme Riviera P1768677 OGTT/ITT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
  2. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
  3. Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
  4. Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
  5. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
  6. Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
  7. Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
  8. Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
  9. Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, Suppl 3. S215-S219 (2004).
  10. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
  11. Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
  12. Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
  13. Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
  14. First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
  15. McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
  16. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
  17. NIH. National Institute of Health - Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. , Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf (2017).
  18. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
  19. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
  20. Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
  21. Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
  22. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  23. Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Jr Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
  24. Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
  25. Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
  26. Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
  27. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
  28. Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
  29. Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
  30. Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
  31. Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
  32. Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
  33. Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
  34. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  35. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , Chapter 29 Unit 29B 23 (2007).
  36. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
  37. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
  38. Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
  39. Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
  40. Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).

Tags

الطب، 131 قضية، السمنة، ومقاومة الأنسولين، السكري، التوازن الجلوكوز، استقلاب الجلوكوز، حمية عالية الدهون، واختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم، اختبار تحمل الأنسولين، OGTT، شركة ITT
دراسة <em>في فيفو</em> أيض الجلوكوز في الفئران تغذية حمية عالية الدهون باستخدام اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار تحمل الأنسولين (ITT)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nagy, C., Einwallner, E. Study of… More

Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). J. Vis. Exp. (131), e56672, doi:10.3791/56672 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter