Summary
Het huidige artikel beschrijft het genereren en metabole karakterisering van vetrijke dieet-gevoed muizen als een model van dieet-geïnduceerde insulineresistentie en overgewicht. Het beschikt verder over gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van de orale glucose tolerantie test en de insuline tolerantie test, toezicht op de gehele lichaam wijzigingen van het glucose metabolisme in vivo.
Abstract
Obesitas vertegenwoordigt de belangrijkste risico factor in de pathogenese van type 2 diabetes, een ziekte die wordt gekenmerkt door een weerstand tegen insuline-gestimuleerd glucose-opname- en een bruto decompensation van systemische glucose metabolisme. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in het begrip van het glucose metabolisme blijven de moleculaire mechanismen van de verordening in gezondheid en ziekte onder-onderzocht, terwijl nieuwe benaderingen voor preventie en behandeling van diabetes zijn dringend noodzakelijk. Dieet afgeleide glucose stimuleert de alvleesklier secretie van insuline, die fungeert als de belangrijkste regulator van cellulaire anabole processen tijdens de gevoed statuswaarden en dus sluitend bloedglucose niveaus om systemische energie status te handhaven. Chronische overvoeren triggers meta-ontsteking, die tot veranderingen in het perifere insuline receptor-associated leidt signaling en dus vermindert de gevoeligheid voor insuline-gemedieerde glucose verwijdering. Deze gebeurtenissen uiteindelijk resulteren in verhoogde nuchtere glucose en insulineniveaus, alsmede een vermindering in de glucosetolerantie, die op zijn beurt als belangrijke indicatoren van insulineresistentie fungeren. Hier presenteren we een protocol voor het genereren en metabole karakterisering van vetrijke dieet (HFD)-muizen gevoed als een veelgebruikte model van dieet-geïnduceerde insulineresistentie. We illustreren in detail de orale glucose tolerantie test (OGTT), die toezicht houdt op de perifere verwijdering van een oraal toegediende glucose laden en insuline secretie na verloop van tijd. Daarnaast presenteren we een protocol voor de insuline tolerantie test (ITT) om te controleren van gehele lichaam insuline actie. Samen vertegenwoordigen deze methoden en hun downstream toepassingen krachtige hulpmiddelen te karakteriseren de algemene metabole fenotype van muizen ook specifiek evalueren van wijzigingen in het glucose metabolisme. Zij kunnen vooral nuttig op het gebied van de brede onderzoek van insulineresistentie, diabetes en obesitas tot een beter inzicht in de pathogenese alsmede over het testen van de effecten van therapeutische interventies.
Introduction
In de ontwikkelde wereld bereikte obesitas en diabetes epidemische afmetingen als gevolg van fysieke inactiviteit en de excessieve consumptie van verwerkte voedingsmiddelen, effecten die worden gedreven door de snelle urbanisatie, industrialisering evenals globalisering. Hoewel onderzoek op insulineresistentie en het co-morbiditeit, zoals hyperlipidemie en atherosclerose, heeft bekendheid gekregen tijdens de laatste decennia, de complexe biologische mechanismen tot regeling van de stofwisseling bij gezondheid en ziekte nog onvolledig begrepen en er is nog steeds dringend behoefte aan nieuwe behandelmodaliteiten ter voorkoming en behandeling van deze ziekten1.
Insuline, en het counter-regulatory hormoon glucagon dienen als de belangrijkste regulatoren van cellulaire levering en macronutriënten energiebalans, dus ook de handhaving van goede systemische bloed glucose concentraties2. Glucose zelf fungeert als een van de belangrijkste stimulatoren van insuline secretie door de alvleesklier β-cellen, terwijl andere macronutriënten, de humorale factoren evenals de neurale inbreng verder deze reactie wijzigen. Insuline activeert de anabole processen van de fed staat bijgevolg door bevordering van de verspreiding van overtollige bloedglucose in spier- en vetcellen en verder glycolyse alsmede eiwit- of vetzuursynthese, respectievelijk te activeren. Bovendien onderdrukt de insuline hepatische glucose uitvoer door remming van de gluconeogenese. Chronische overtollige energieverbruik en meta-ontsteking leiden tot hyperinsulinemia en perifere insulineresistentie als gevolg van de down-regulatie van insuline receptor expressie, alsmede wijzigingen in de stroomafwaartse signaalroutes, aldus resulterend in verminderde gevoeligheid voor insuline-gemedieerde glucose verwijdering, alsmede onvoldoende remming van hepatische glucose productie3,4,5,6.
Een breed scala aan dierlijke modellen met genetische, voeding of experimentele inductie van ziekte hebben bewezen als uitstekende instrumenten te bestuderen van de moleculaire mechanismen van insulineresistentie en verschillende vormen van diabetes, alsmede de begeleidende ziekten7 . Een goed voorbeeld is de meest gebruikte en bekende HFD-geïnduceerde muismodel, dat wordt gekenmerkt door snelle gewichtstoename als gevolg van verhoogde inname in combinatie met verminderde metabole efficiëntie, resulterend in insuline resistentie8, 9. zowel in diermodellen en mensen, een hoogte in nuchtere bloed glucose en insuline niveaus, alsook een verminderde tolerantie-doorbraak tot glucose administratie zijn vaak gebruikte indicatoren van insulineresistentie en andere systemische wijzigingen van glucose metabolisme. Controle bloed glucose en insuline niveaus bij de basale stand of na stimulatie zijn daarom gemakkelijk toegankelijke uitlezingen.
Dit protocol beschrijft de generatie van muizen HFD-gevoed, alsmede twee veelgebruikte methoden, de orale glucose tolerantie test (OGTT) en de insuline resistentie test (ITT), die nuttig zijn te karakteriseren de metabole fenotype en te onderzoeken wijzigingen in het glucose metabolisme. We beschrijven de OGTT in detail dat de verwijdering van een oraal toegediende glucose laden en insuline secretie na verloop van tijd beoordeelt. Verder geven we instructies over de wijze van uitvoering van de ITT om te onderzoeken van gehele lichaam insuline-actie door controle van bloed glucose concentratie in reactie op een bolus insuline. De protocollen die in dit artikel beschreven zijn gevestigde en zijn gebruikt in meerdere studies10,-11,12. Wij bieden naast lichte wijzigingen die helpen kunnen om succes te verhogen, richtsnoeren voor de proefopzet en data-analyse, alsmede nuttige tips om te voorkomen dat potentiële valkuilen. De hierin beschreven protocollen kunnen zeer krachtige hulpmiddelen te onderzoeken van de invloed van genetische, farmacologische, voeding en andere omgevingsfactoren over hele lichaam glucose metabolisme en zijn geassocieerde aandoeningen zoals insulineresistentie. Naast stimulatie met glucose of insuline, kan een scala aan andere verbindingen worden gebruikt voor stimulatie afhankelijk van het doel van individuele onderzoek. Hoewel buiten het bereik van dit manuscript, kunnen vele andere downstream toepassingen worden uitgevoerd op de getekende bloedmonsters, zoals de analyse van bloedwaarden dan glucose en insuline (b.v., lipide en lipoproteïne profielen) evenals gedetailleerde analyse van metabole markers (bijvdoor kwantitatieve real-time Polymerase Chain Reaction (PCR), westelijke vlekkenanalyse en Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)). Verder stroom cytometry en fluorescentie geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden toegepast om te onderzoeken van de effecten in verschillende eencellige populaties, terwijl transcriptomic, proteomic en metabolomic benaderingen kunnen ook worden gebruikt voor irrelevante analyse.
Over het geheel genomen, bieden we een eenvoudig protocol voor het genereren van een HFD-geïnduceerde muismodel, terwijl verder beschrijven twee krachtige benaderingen om te bestuderen van gehele lichaam metabolische omzetting, de OGTT en de ITT, die nuttige hulpmiddelen worden kan voor het bestuderen van de pathogenese van de ziekte en het ontwikkelen van nieuwe therapieën, vooral op het gebied van metabolisme-geassocieerde ziekten zoals insulineresistentie en diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik van het Comité van de medische universiteit van Wenen en uitgevoerd volgens de Federatie van Europese Laboratory Animal Science verenigingen (FELASA). Houd er rekening mee dat alle procedures die worden beschreven in dit protocol alleen na goedkeuring van de institutionele en gouvernementele alsmede door personeel dat technisch bedreven zijn moeten worden uitgevoerd.
1. HFD-gevoed muizen
Opmerking: Handhaven alle C57BL/6J muizen op een 12-h licht/donker cyclus met gratis toegang tot voedsel en water.
- Op de leeftijd van 6 weken, plaats muizen voor 8-12 weken op een HFD (40-60% vetcalorieën) voor het opwekken van obesitas, terwijl voeden de mager controle-groep een vetarm dieet (LFD) (10% vetcalorieën).
- Het bepalen van het lichaamsgewicht van de muizen op een wekelijkse basis. De curven van het gewicht moeten vergelijkbare patronen in beide groepen, met een hogere helling in de HFD-gevoed groep weergeven.
2. OGTT
Opmerking: Als monsternemingspunten keer bloed worden gekozen tijdens OGTT elke 15 min, het experiment moet worden uitgevoerd met een maximum van 15 muizen parallel, om ten minste 1 min-verwerkingstijd per muis.
- Voorbereidingen op de dag vóór OGTT
- Breng de muizen in een kooi met frisse beddengoed en snel ze 's nachts vóór de proef van 14 h, terwijl ervoor te zorgen dat de muizen toegang tot drinkwater hebben (b.v., het voedsel verwijderen om 6:00 uur voor een begintijd op de volgende ochtend om 8:00 am).
Opmerking: Vasten muizen is's nachts de standaardbenadering, maar een kortere snel (5-6 h) is meer fysiologische voor muizen (Zie bespreking voor details).
- Breng de muizen in een kooi met frisse beddengoed en snel ze 's nachts vóór de proef van 14 h, terwijl ervoor te zorgen dat de muizen toegang tot drinkwater hebben (b.v., het voedsel verwijderen om 6:00 uur voor een begintijd op de volgende ochtend om 8:00 am).
- Voorbereidingen op de dag van het experiment (maar vóór het experiment)
- 10 mL van 20% glucose-oplossing te bereiden (ontbinden D-(+)-Glucose in gedestilleerd water).
Opmerking: Alle reagentia die worden toegediend aan de dieren moeten farmacologische rang en steriel. - Bereiden van een 96-wells-plaat voor plasma collectie, door het invullen van een goed voor elk tijdstip van monsterneming en elke muis, met 5 µL NaEDTA (0.5 M EDTA, pH 8.0 in 0,9% NaCl, opslag bij RT). Bewaar deze plaat op ijs tijdens het experiment.
Opmerking: Zie aanvullende Figuur 1 voor een gedetailleerde checklist.
- 10 mL van 20% glucose-oplossing te bereiden (ontbinden D-(+)-Glucose in gedestilleerd water).
- Meten van het lichaamsgewicht van alle muizen en hun staarten te markeren met een permanent marker zodat de muizen gemakkelijk te onderscheiden (bijvoorbeeld, 1 = 1 muis dash, muis 2 = 2 streepjes, enz.).
- Glucose meting en bloedmonsters (Figuur 2)
- Zorgvuldig afgesneden 1-2 mm van het uiteinde van de staart met scherpe schaar ('Variant A' in Figuur 2). Altijd de eerste druppel bloed te vermijden hemolyse of verontreiniging met weefsel vloeistof alvorens new bloedmonsters voor bloed glucose bepaling in te vegen. Teken een kleine bloedsteekproef (~ 3 µL) voor het meten van de basale bloedglucose niveau (= tijdstip 0) met de glucometer.
Let op: Controleren en aanpassen van het gratis nummer van test strips op een glucometer.
Opmerking: Als een alternatieve bloed bemonsteringsmethode, nick de ader van de laterale staart van een muis met een scherpe scalpel mes ("Variant B" in Figuur 2). De laterale staart ader is meestal ongeveer eenderde langs de lengte van de staart van het uiteinde van de staart, op weg naar de onderkant van de staart voor meerdere monsters toegankelijk. Het gebruik van een plaatselijke verdoving crème wordt aangeraden. Stoppen van de bloedstroom door de vinger druk uit te oefenen op het zachte weefsel voor ten minste 30 s voordat het dier aan de kooi wordt geretourneerd. - Het verzamelen van een bloedmonster (ongeveer 30 µL) met behulp van een verse capillair (Houd het capillair horizontale vlak). Leeg de capillaire buis met behulp van een precisiepipet door de invoering van het uiteinde van de pipet op de top van het einde capillair en zorgvuldig het verzamelde bloed te duwen in een putje van de 96-wells-plaat, terwijl het vermijden van luchtbellen. Herhaal deze procedure voor alle muizen - één filter tegelijk.
Opmerking: Als alternatief voor de bloedinzameling van via een capillaire buis, een pipet aangepast aan het juiste volume (b.v., 30 µL) gebruiken voor het verzamelen van bloed of verzamelen een druppel bloed uit de staart op paraffine film en Pipetteer het in de EDTA-oplossing. Strikt Vermijd het contact van vaseline met bloed of glucometer test strips, zoals het latere glucose en insuline metingen kan beïnvloeden.
Let op: De OGTT is zeer belastend voor muizen: mager muizen kunnen ongeveer 15% van hun lichaamsgewicht verliezen tijdens een overnachting snel. Bovendien leidt de bloedmonsters op verschillende tijdstippen tot een aanzienlijk verlies van bloed. Voor gemakkelijker bloedmonsters is het mogelijk om zorgvuldig de massage van de mouse-tail met vaseline.
Opmerking: Institutionele richtsnoeren kunnen maximaal de toegestane hoeveelheid bloed verzameld binnen een bepaalde periode. De bemonstering volumes en timepoints moet worden aangepast om de toegestane maximumwaarden niet te overtreffen. Het lichaamsgewicht van de muizen moet worden gebruikt voor het berekenen van de totale terugtrekking toegestaan bloed.
- Zorgvuldig afgesneden 1-2 mm van het uiteinde van de staart met scherpe schaar ('Variant A' in Figuur 2). Altijd de eerste druppel bloed te vermijden hemolyse of verontreiniging met weefsel vloeistof alvorens new bloedmonsters voor bloed glucose bepaling in te vegen. Teken een kleine bloedsteekproef (~ 3 µL) voor het meten van de basale bloedglucose niveau (= tijdstip 0) met de glucometer.
- Berekenen van de benodigde hoeveelheid glucose oplossing op basis van lichaamsgewicht (1 g glucose/kg lichaamsgewicht; dit kan worden verhoogd tot 3 g/kg) te worden toegediend via een mondelinge maagsonde voor elke muis. Bijvoorbeeld, zou een muis met een lichaamsgewicht van 30 g 150 µL van een 20% glucose-oplossing voor het beheren van 30 mg van glucose nodig.
Opmerking: U kunt de dosis van glucose baseren op het gewicht van de muis is de standaardprocedure. Als het lichaam samenstellingsgegevens voorhanden zijn, de dosis van glucose voor OGTT moet worden berekend op basis van de lean body mass (Zie bespreking voor details). - Glucose administratie
- Voorbereiden everythingthat nodig is tijdens het hele experiment op voorhand (timer, experiment registratieblad, glucose monitor en strips, haarvaten, spuiten, glucose oplossing, 96-wells-plaat, scalpel, rekenmachine, evenwicht, permanente marker, Bank documenten, een Pipetteer met een tip en handschoenen).
- Voordetoepassing van glucose, beperken de muis door stevig grijpen het door de scruff. Voldoende stevigheid van toepassing op de huid rond de nek om te verhinderen dat de muis draaien uit de weerhouden en te goed haar hoofd achterover te kantelen. Ook voor zorgen dat de muis goed kan ademen.
Opmerking: Zodra glucose administratie is gestart, goed timemanagement is zeer belangrijk. - Zorgvuldig beheren de glucose-oplossing (gebaseerd op stap 2.5) rechtstreeks in de maag met behulp van een voeding naald. Voorzichtig direct de voeding naald via de mond naar de slokdarm. Laat de muis te slikken van de naald: de naald volledig zinkt in de onderste slokdarm/maag van de muis. Vervolgens spuiten de glucose-oplossing (Figuur 3a).
- Als enige weerstand wordt voldaan of als het dier onmiddellijk worstelt, terugtrekken van de naald en verplaatsen. Start de timer onmiddellijk na de eerste maagsonde en beheren glucose aan alle andere muizen in 1 min. intervallen.
Opmerking: Het nuttig kan zijn voor een daling van de glucose-oplossing rechtstreeks vanuit de voeding naald toepassen naar de monding van de muis, die stimuleren zal likken en slikken, waardoor makkelijker inbrengen van de naald in de voeding. Niet van toepassing druk bij het invoegen van de voeding naald als deze kan het dier ernstig verwonden.
- Als enige weerstand wordt voldaan of als het dier onmiddellijk worstelt, terugtrekken van de naald en verplaatsen. Start de timer onmiddellijk na de eerste maagsonde en beheren glucose aan alle andere muizen in 1 min. intervallen.
- Na 15 min, meten van de niveaus van de glucose van het bloed met de glucometer en daarnaast nemen bloedmonsters (~ 30 µL) (als beschreven in detail in stap 2.4) van elke muis in dezelfde volgorde zoals ze waren geïnjecteerd.
Opmerking: Het beheer van de tijd is zeer belangrijk; Volg zo nauw mogelijk met behulp van dezelfde tijdsintervallen als bij middel van een maagsonde. Laat de muizen bewegen zo vrij mogelijk en beteugeling van de limiet tot een minimum beperkt tijdens de hele procedure ter vermindering van stress, die de resultaten kan wijzigen. Melk staart met één hand en vang het bloed met de andere. - Herhaal stap 2.7 op geselecteerde tijd punten afhankelijk van de verwachte resultaten (bijv, op 30, 45, 60, 90, 120, 150 en 180 min na toediening van glucose). Als de geselecteerde tijdstippen langer dan 120 min, ervoor zorgen dat de muizen toegang tot drinkwater hebben. Ervoor zorgen dat de muizen altijd toegang tot drinkwater hebben. Wanneer u klaar bent met het experiment, keren de muizen naar hun huis kooien voorzien van voedsel en water.
Let op: De OGTT is zeer vermoeiend voor de muizen. Wacht daarom minstens 1 week voor het uitvoeren van de volgende metabole test, zoals een ITT. - Na het experiment, centrifugeer bloedmonsters bij 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Overdracht van de bovendrijvende substantie (plasma) toe op lege putjes van de plaat en opslaan bij-20 ° C tot analyse.
- Opnemen van hemolyse van monsters, indien aanwezig (zie paragraaf 3).
- Bepalen plasma insulineniveaus met behulp van een commercieel beschikbare ELISA kit (Zie de Tabel van materialen) na de instructies van de fabrikant van de kit.
Opmerking: Afhankelijk van de nuchtere toestand, alsook op het metabolisme van de onderzochte muizen, moeilijkheden tijdens deze test kunnen optreden: overnachting nuchtere insuline niveaus (tijdstip 0) zijn erg laag en daarom dicht bij de detectiegrens. U kunt dit probleem voorkomen, dubbel de hoeveelheid aanbevolen plasmavolume en dienovereenkomstig het halveren van het resultaat van de analyse van de ELISA. Aan de andere kant, als muizen de insuline piek tijdens OGTT, met name in muizen HFD-gevoed bereiken, de niveaus van de insuline mogen de detectiegrens: verdunnen van het monster (bijv, 10-fold met 0,9% NaCl) en herhaal de ELISA-test. Hemolyse in plasma monsters kan leiden tot de afbraak van insuline, resulterend in een daling van de waarden van de uitlezing. De afbraak is afhankelijk van tijd, temperatuur en de concentratie van hemoglobine in het monster. Houd altijd hemolyzed monsters koud of op ijs te verminderen van de aantasting van de insuline.
3. ITT
Opmerking: Dezelfde voorzorgsmaatregelen beschreven voor OGTT (behandeling van muizen, bloed, glucometer en vaseline gebruik) moeten ook worden toegepast bij het uitvoeren van de ITT. Bijvoorbeeld, moeten alle injecties worden uitgevoerd binnen 15 min in 1 min intervallen 15 muizen zijn getest in parallel. Voor de ITT, de daaropvolgende verzameling van bloedmonsters met capillaire buisjes is optioneel.
- Preparaten voor het experiment
- Snel van muizen gedurende ten minste 2 uur vóór insuline-injectie, terwijl ervoor te zorgen dat de muizen toegang tot drinkwater hebben (bijvoorbeeldvoedsel verwijderen bij 8:00 am, muizen test 2-5 h later).
- Verdun insuline 1:1,000 in 0,9% NaCl (voorraad: 100 U/mL insuline; werken concentratie 0.1 U/mL) en bereiden van 20% glucose (D-(+)-Glucose oplossing opgelost in gedestilleerd water) worden toegediend als de muizen hypoglycemic geworden.
Opmerking: De ITT worden doorgaans uitgevoerd na een korte snel om te voorkomen dat de hypoglykemie die anders op in's nachts treedt dieren gevast. Alle reagentia die worden toegediend aan de dieren moeten farmacologische rang en steriel.
- Meten van het lichaamsgewicht van muizen, mark staart, knip het uiteinde van de staart met scherpe schaar en meten van de niveaus van de glucose van de basale bloed, zoals eerder is beschreven voor de OGTT in stap 2.4.
- Insuline-injectie
- Injecteren insuline intraperitoneally (0,75 U insuline/kg lichaamsgewicht, vooraf berekend), beperken de muis door de scruff methode.
- Gebruik een frisse, steriele 27 of 30 meten naald voor elk dier ongemak en het risico op elke injectieplaats infectie te voorkomen.
Opmerking: Sterilisatie van de huid kan verlengen de duur van toediening van insuline, en dus kan leiden tot extra storingen aan het dier. Het wordt daarom niet aangeraden. - Kantel het hoofd van de muis naar beneden onder een lichte hoek met bloot de ventrale zijde van het dier. Plaats de steriele naald met de schuine kant boven en onder een hoek van 30 ° in de lagere juiste kwadrant van de buik van het dier (Figuur 3b). De timer te starten zodra de eerste muis wordt geïnjecteerd.
Opmerking: Lage dosis ITTs (0.1 U/kg) kan worden uitgevoerd om een specifiek beoordelen hepatische insulinegevoeligheid. Wat betreft de OGTT, berekening van het geïnjecteerde volume op basis van lichaamsgewicht is de standaard procedure, terwijl de dosis te baseren op de vetvrije massa heeft de voorkeur als lichaam samenstellingsgegevens beschikbaar zijn.
- Maatregel de niveaus van de glucose van het bloed op geselecteerde tijdstippen (bvna 15, 30, 45, 60 en 90 min).
Opmerking: Zoals insuline een korte halftijds van ~ 10 min in muizen13 heeft, laat verschillen na insuline toediening (bijvoorbeeldna 2 h) kunnen niet weerspiegelen een rechtstreekse werking van insuline actie. 20% glucose oplossing beheren in het geval dat een muis wordt hypoglycemic (bloed glucoseniveaus onder de 35 mg/dL) en is in gevaar om te sterven. - Na de laatste keer punten, plaats de muizen terug in hun huis kooien bereid met overvloed van voedsel en water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert een schematische tijdschema voor metabole fenotypering van muizen op diëten. Op een leeftijd van ongeveer 6 weken, moeten muizen worden geplaatst op een HFD, terwijl een LFD-groep als de controlegroep dienen kan. Lichaamsgewicht moet bovenal wekelijks worden bepaald om te observeren als er een verwachte toename in lichaamsgewicht is. Elke vorm van stress (bv, lawaai of agressief gedrag van de mannelijke) kan interfereren met gewichtstoename en onmiddellijk moet worden opgeheven. Elk cohort van muizen voor dieet experimenten moet bestaan uit ten minste 10 muizen omdat deze dieet-experimenten tijdrovend zijn en uitschieters zijn frequente (bijvoorbeeldmuizen niet het verkrijgen van gewicht of muizen met abnormale glucose of insulineniveaus). Na de geselecteerde periode (afhankelijk van de hypothese van de studie en het tijdstip van de verwachte veranderingen), kan OGTT en ITT worden uitgevoerd voor de evaluatie van glucose tolerantie en insuline optreden. In deze paper, werden late tijdstippen voor de metabole test gekozen.
Bovenal moet er een hersteltijd van minimaal 1 week tussen de OGTT en de ITT zoals deze experimenten tot aanzienlijke bloedverlies leiden en dus zeer belastend is voor muizen zijn. Als het bloed collectie volumes zijn verminderde (bv, als eerste een ITT zonder extra bloedinzameling uitvoert), kan deze herstelperiode ook worden verkort of is weggelaten, in overeenstemming met de richtsnoeren voor meerdere bloed trekt in dieren14, 15,16,17.
In deze grote studie met 60 C57BL/6J muizen in totaal, de helft van de muizen werden aangezet HFD of LFD op een leeftijd van 6 weken (n = 30/groep) en gewichtstoename werd gecontroleerd voor 16 weken op dieet. De consumptie van HFD resulteerde in een aanzienlijke toename van het lichaamsgewicht zoals weergegeven in Figuur 4. Op 6 weken leeftijd was het lichaamsgewicht 20.2 g in beide groepen. Overwegende dat de muizen op LFD toonde een consistent, iets verhogen lichaamsgewicht (31.2 g ± 2,7) waargenomen gedurende de muizen op HFD verhoogd van hun lichaamsgewicht snel, vooral tijdens de eerste weken en hun lichaam gewicht maximum bereikt na 16 weken op het dieet. Hoewel het gewicht curven een vergelijkbaar patroon tijdens het experiment toonde, de muizen van de HFD-groep bereikt een 1,5 - tot 2 keer hoger lichaamsgewicht (44.4 g ± 4.0) in vergelijking tot de LFD gevoed muizen.
Om te onderzoeken het metabole fenotype van de twee cohorten, werden een OGTT (Figuur 5) en de ITT (Figuur 6) uitgevoerd. Zoals bloed volume in kleine knaagdieren beperkt is, werd een point-of-care (POC) assay voor diabetische mensen (glucometer) gebruikt voor het controleren van de niveaus van de glucose van het bloed tijdens deze metabole fenotypering experimenten. Zoals aangetoond in Figuur 2, de bloed glucose monitoren zijn makkelijk te gebruiken, moet alleen een kleine druppel bloed en niveaus van de glucose van het bloed binnen seconden voor documentatie weer te geven. Figuur 5 geeft de tijdsverloop van absolute glucose (figuur 5a-b) en absolute insuline (Figuur 5 c) niveaus tijdens de OGTT. In het algemeen, een gezonde muis met normale glucosetolerantie toont een karakteristiek snelle stijging in bloed glucose, bereikte haar piek 15-30 min na de uitdaging van glucose.
Latere glucose-opname, voornamelijk olv spier-, vet-weefsel- en lever-weefsel leidt tot een geleidelijke daling van de concentratie van bloed glucose. In alle experimenten, de muizen LFD gevoed diende als de glucose tolerant controlegroep en daarom vervulde het verwachte metabole profiel: het hoogtepunt van de niveaus van de glucose van het bloed van ~ 240 mg/dL werd bereikt ongeveer 15 min na toediening van de glucose, onmiddellijk gevolgd door een daling bereiken van basale niveaus ongeveer 60 min na de glucose-uitdaging, met vermelding van de juiste glucose eliminatie. In schril contrast, HFD-muizen bedroeg ongeveer ~ 320 mg/dL glucose en bleek bijna geen verwijdering van glucose, waarmee glucose weerstand wordt aangegeven. Wanneer de niveaus van de glucose van het bloed tussen de twee groepen al verschillen in de vasten (zoals in dit representatief voorbeeld), moet een berekening van het gebied onder de curve (AUC) boven de basislijn glucose worden uitgevoerd voor het valideren van de resultaten (figuur 5a- b).
Bovendien, werden het circulerende bloed insulineniveaus bepaald met behulp van een insuline-ELISA-test (Figuur 5 c) zodat er meer informatie over de onderliggende pathofysiologie in dit model. Overwegende dat de insulineniveaus nagenoeg ongewijzigd in de controlegroep waren, toonde muizen gevoed een HFD 16-fold verhoogde niveaus ten opzichte van de controlegroep, alsmede een sterk verhoogde insuline respons, met vermelding van compenserende hyperinsulinemia HFD-geïnduceerde als vasten een poging om tegenwicht bieden aan verminderde glucose eliminatie capaciteit, die kan worden veroorzaakt door insulineresistentie. Echter, Let niet te te interpreteren van de resultaten van de OGTT, als deze test direct geen insuline actie worden geëvalueerd en moet niet worden gebruikt voor het sluiten van uitspraken over insulineresistentie.
Voor het meten van insulinegevoeligheid bij de muizen HFD-gevoed, werd een ITT 1 week na OGTT (Figuur 6a) uitgevoerd. In deze test vertegenwoordigen de mate aan waarin bloed glucose concentraties vallen na de toediening van insuline de doeltreffendheid van het optreden van de gehele lichaam insuline. De muizen HFD-gevoed toonde een bijzondere waardevermindering heeft ondergaan verlaging van bloedsuikerspiegel in vergelijking met de LFD gevoed controlegroep, op alle tijdstippen tijdens de ITT, zo suggereert insulineresistentie. De ITT-resultaten worden meestal gepresenteerd als het tijdsverloop van glucoseniveaus, maar daarnaast ook de inverse die AUC onder basislijn glucose kan worden getoond, zoals aangetoond in Figuur 6b. Als de groepen die worden vergeleken hebben soortgelijke nuchtere bloedglucosespiegels (wat niet het geval is in dit experiment), kunnen de niveaus van de bloedglucose tijdens ITT ook worden gepresenteerd als het percentage van basale glucose. Zoals muizen, in een counter-regulatory reactie op insuline wordt geactiveerd als de niveaus van de glucose van het bloed onder ~ 80 mg/dL18 vallen: gebreken in dit counter-regulatory antwoord in een bepaalde muismodel kunnen worden geïnterpreteerd als een verhoging in insulinegevoeligheid. Tijdens HFDs en latere metabole fenotypische experimenten, kunnen uitschieters vaak optreden. Muizen die niet winnen gewicht op HFD, of de abnormale glucosegehalte en/of insulineniveaus moeten worden uitgesloten van de analyse. Voor de laatste twee, een uitschieter test kan worden uitgevoerd voor elke experimentele groep afzonderlijk (bijvoorbeeldGrubbs test)
In deze studie, als voorbeeld wij toonde en geïnterpreteerd gegevens van metabole experimenten in vivouitgevoerd op muizen met dieet-geïnduceerde zwaarlijvigheid, glucose-intolerantie en insulineresistentie en hen ten opzichte van een controlegroep met normale lichaamsgewicht. Zoals verwacht, was er verminderde glucosetolerantie en hyperinsulinemia in zwaarlijvige muizen overeenstemming met insulineresistentie t.o.v. de leeftijd-matched controle muizen; Dit werd ontdekt met behulp van gevestigde, betrouwbare, tijd - en budget-vriendelijke methodes, die relatief gemakkelijk uit te voeren. Verschillen in glucosetolerantie, insulineniveaus zo goed zoals in insulinegevoeligheid, worden alle verkregen door de gepresenteerde methoden van OGTT en ITT, kunnen vaak helpen bij het plannen van de volgende stappen van een studie, waaronder eventueel meer geavanceerde experimenten zoals hyperglycemic of hyperinsulinemic klemmen, evenals experimenten met geïsoleerde alvleesklier eilandjes.
Figuur 1. Schematische Marokaanse tijdzone, voor een regeling van de voorgestelde dieet metabole experimenten in vivo. Om te onderzoeken de metabole effecten van HFD in muizen, de dieren van de experimentele groep staan op HFD op ongeveer 6 weken leeftijd, terwijl de controlegroep een LFD ontvangt. Het lichaamsgewicht van de muizen moet worden bepaald op een wekelijkse basis te beoordelen van de juiste gewichtstoename. Na ongeveer 12 weken op dieet (of een geselecteerde tijdstip afhankelijk van de onderzoek-hypothese), wordt de metabole fenotype van de muizen geëvalueerd door een OGTT gevolgd door 1 week hersteltijd en vervolgens een ITT. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Methoden voor bloedmonsters tijdens metabole experimenten. Voor de OGTT alsook wat betreft de ITT, waar herhaalde bloedmonsters vereist is, is het raadzaam tekening bloed via een stukje van de 1-2 mm van het uiteinde van de staart met een scherpe schaar (Variant A), gevolgd door de bepaling van de niveaus van de glucose van het bloed met een glucometer zorgvuldig te snijden en verder collectie van bloed met een capillair insulineniveaus en andere relevante bloedwaarden te bepalen. Bloed kan anderzijds ook via de staart ader (Variant B) of door arteriële catheterisatie (niet afgebeeld) worden bemonsterd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Mondelinge maagsonde uit glucose (a) en intraperitoneaal insuline-injectie (b). Representatieve beelden van orale glucose beheer met een voeding naald tijdens OGTT (een) en het intraperitoneaal injecteren van insuline tijdens ITT (b). Zie protocol voor een gedetailleerde beschrijving. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Lichaam van de aanwinst van het gewicht van HFD-gevoed en gevoed LFD C57BL/6J muizen. C57BL/6J muizen werden ingesteld op 60% HFD, of 10% LFD om te dienen als een besturingselement voor een periode van 20 weken. Overwegende dat muizen op HFD een verwachte toename in lichaamsgewicht, vooral in de eerste weken op dieet toonde, LFD gevoed muizen bleek bijna constante lichaamsgewicht gedurende de waargenomen. Resultaten zijn gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. n = 30 per groep. ANOVA en van Tukey post hoc test werden gebruikt om te testen voor verschillen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. OGTT uitgevoerd in HFD-gevoed en gevoed LFD C57BL/6J dieren. (een) Glucose niveaus tijdens OGTT. Na een overnachting snel, werden niveaus van de bloedglucose (mg/dL) gemeten in nuchtere toestand en 15, 30, 45 en 60 min na beheren glucose oplossing mondeling via maagsonde (glucose 1 g/kg). Niveaus van de glucose in de HFD-groep werden verheven in de vasten staat en na glucose uitdaging. De groei bereikte zijn hoogtepunt na 15 minuten gevolgd door een vertraagde en langzaam dalen. Resultaten zijn gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 per groep. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van ANOVA en van Tukey post hoc test. (b) Glucose gebied onder de curve (AUC) tijdens OGTT. Voor het berekenen van de basislijn gecorrigeerd AUC, basale glucose niveaus (tijdstip 0) werden afgetrokken van alle later verkregen niveaus van de glucose van het bloed voor elke muis individueel, gevolgd door de berekening van de individuele AUCs. De AUC boven de basislijn glucose illustreert de weerstand van de glucose in de HFD-gevoed muizen. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van ANOVA en van Tukey post hoc test (de niveaus van de bloedglucose) of twee tailed Student t-test (AUC). (c) Insuline niveaus tijdens OGTT. Insuline (ng/mL) niveaus werden gemeten na een vasten periode van 4 uur en 15, 30 en 60 min na beheren glucose oplossing mondeling via maagsonde (glucose 1 g/kg). HFD-gevoed muizen niet slechts gecompenseerd voor de injectie van de glucose met een hogere stijging van de bloed insulineniveaus, zij ook begon en eindigde de OGTT met verhoogde insulineniveaus in vergelijking met de controlegroep. Resultaten zijn gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 per groep. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van ANOVA en van Tukey post hoc test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. ITTs uitgevoerd in HFD-gevoed en gevoed LFD C57BL/6J dieren. (een) Glucose niveaus tijdens ITT. De niveaus van de bloedglucose (mg/dL) werden gemeten in nuchtere toestand en 15, 30, 45 en 60 min na injectie van insuline intraperitoneally (0,75 U insuline/kg). HFD-gevoed muizen toonde tijdens ITT, verhoogde glucoseniveaus. De niveaus van de glucose van het bloed waren niet voldoende verlaagd in de HFD-gevoed muizen na injectie van insuline. Resultaten zijn gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 per groep. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van ANOVA en van Tukey post hoc test. (b) Glucose gebied onder de curve (AUC) tijdens ITT. Voor het berekenen van de basislijn gecorrigeerde inverse AUC, basale glucose niveaus (tijdstip 0) werden afgetrokken van alle niveaus van de glucose van de later verkregen bloed voor elke muis individueel. De waarden waren omgekeerde (vermenigvuldigen met -1), gevolgd door de berekening van de individuele AUCs. Als gevolg van het hogere niveau van de glucose in muizen HFD-gevoed tijdens OGTT gecorrigeerd de basislijn inverse die AUC was lager in de HFD-gevoed muizen in vergelijking met controle muizen, die verder voorgesteld verminderde insulinegevoeligheid. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van ANOVA en van Tukey post hoc test (de niveaus van de bloedglucose) of twee tailed Student t-test (inverse AUC). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1. Controlelijst voor de voorbereiding van het experiment. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2. Insulineniveaus tijdens ITTs. Plasma insuline niveaus tijdens de ITT in de LFD gevoed versus de HFD-gevoed groepen bleek vergelijkbare dynamiek in de niveaus van de insuline plasma na insuline injectie in beide groepen. Zoals verwacht, tentoongesteld de muizen HFD sterk gestegen basale insulineniveaus in vergelijking met de controlegroep. Verder, de toename van de niveaus van de insuline in de muizen HFD-gevoed was sterker, die kan worden deels veroorzaakt door de overschatting van de vetvrije massa als de hoeveelheid ingespoten insuline is berekend op basis van de gehele lichaam massa (de conventionele normalisatie-benadering) zoals in dit experiment is uitgevoerd. Echter, de insuline respons was geschaad in de HFD-gevoed groep (onvoldoende vermindering van de niveaus van de glucose van de plasma), waardoor verder benadrukken de insulineresistentie staat in deze dieren. Resultaten zijn gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van ANOVA en van Tukey post hoc test. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de hoge prevalentie van diabetes en geassocieerde ziekten in de wereldbevolking is er een sterke behoefte aan onderzoek aanpakken van het moleculaire mechanisme, preventie en behandeling van de ziekte19. Het gepresenteerde protocol gevestigde worden methoden beschreven voor de generatie van HFD muizen, een robuuste diermodel gebruikt voor metabole onderzoek, evenals de geleiding van de OGTT en de ITT, die krachtige hulpmiddelen voor de beoordeling van het gehele lichaam metabolische omzetting zijn zoals insulineresistentie. De methoden die in deze paper gepresenteerd kunnen nuttig zijn voor de rol van vermoedelijke genen, milieufactoren, alsook farmacologische, voeding, fysieke of genetische therapieën op hele lichaam glucose-metabolisme9,10te bestuderen. Terwijl glucose als de belangrijkste stimulans voor insuline secretie in een OGTT fungeert, het voorgestelde protocol kan worden gewijzigd door (co-) andere stoffen zoals andere macronutriënten en hormonen waarvan bekend is dat het wijzigen van de insuline reactie2toe te passen. Ook kan het ITT-protocol worden gewijzigd door de (co-) toepassing van andere stoffen (bijvoorbeeld, glucagon of catecholamines) volgens de individuele onderzoeksvraag. De belangrijkste uitlezingen van de beschreven OGTT en ITT protocollen zijn bloed glucose en insuline concentraties; echter, de meting van andere bloedparameters zoals glucagon, vetzuren en lipoproteïne niveaus en van verschillende metabole markeringen op het mRNA en eiwit niveau kan ook zinvol zijn afhankelijk van het doel van de studie.
Onderzoekers moeten zich bewust dat de neuro-endocriene reacties op hypoglykemie, insuline secretie, insuline optreden, alsmede de algemene metabole fenotype sterk afhankelijk is van de genetische achtergrond van de muizen10. Hier gebruikt we muizen binnen de genetische achtergrond van C57BL/6J als HFD-geïnduceerde model van diabetes, die een gedeeltelijke bijzondere waardevermindering in glucose-gemedieerde insuline secretie wegens een natuurlijk voorkomende schrapping in het nicotinamide nucleotide transhydrogenase gen hebben 20, waardoor ze een geschikt model voor het bestuderen van obesitas geassocieerd met insuline resistentie8,9. De protocollen beschreven hier mei echter ook worden gebruikt om het metabolisch karakteriseren alternatieve Muismodellen van insulineresistentie en diabetes, die meestal gebaseerd zijn op monogene aandoeningen of op de chemische vernietiging van de β-cellen21, 22 , 23. voorzorgsmaatregelen tijdens proefopzet zoals leeftijd-matched muizen, testen als insuline gevoeligheid afneemt met de leeftijd24, en naar aanleiding van verrichten de experimenten in muizen van hetzelfde geslacht. Zoals genetische mutaties en behandelingen in verschillende fenotypes afhankelijk van geslacht25,26 resulteren kunnen, kan het ook wenselijk om te onderzoeken van de beide geslachten gescheiden van elkaar.
De in dit protocol beschreven methode voor de bemonstering van bloed vereist geen anesthesie, die invloed hebben op de kan hartfrequentie, doorbloeding en glucose metabolisme, niet-fysiologische resultaten10oplevert. U kunt ook kan een arteriële katheter worden geïmplanteerd, die maakt vasculaire bemonstering zonder behandeling van stress tijdens het experiment, maar voegt ook inspanning, kosten, alsmede het risico van dierlijke verlies aan het experiment. Voor de OGTT, muizen zijn meestal gevast overnachting (14-18 h), die een katabole staat in muizen oproept, sterk afbreken lever glycogeen winkels. Hoewel hierdoor de variabiliteit in de basislijn bloed de niveaus van de bloedglucose, de langdurige snel afneemt van de stofwisseling en verhoogt glucose-gebruik in muizen, die in tegenstelling de situatie in mensen10,27 tot. Als de voeding patronen in muizen ook niet menselijk gedrag nabootsen doen, wellicht dus meer fysiologische voor het uitvoeren van een OGTT na een korte snel. Zoals circadiane ritmen een sterk effect op systemische glucose metabolisme28 hebben, is het belangrijk om te overwegen op welk moment van de dag de experimenten die hier beschreven worden uitgevoerd. Om te onderzoeken van het metabolisme van muizen in hun actieve periode (de donkere fase), een omgekeerde licht-donker cyclus mogelijk waardevolle om meer fysiologische resultaten te genereren.
De beschreven wijze van toediening kan ook variëren afhankelijk van de specifieke hypothese wordt getest. Orale toediening van glucose tijdens een glucose tolerantie test leidt tot meer variabele insuline secretie, zoals het leegmaken van de maag, gastro-intestinale motiliteit hormonen (incretins) en neurale invoer wijzigen en verlengen van de insuline reactie2, 10. tijdens de put beschreef "incretin effect", de absorptie van glucose uit de darm leidt tot de vrijlating van gastro-intestinale hormonen zoals GLP1, die potentiates van orale glucose-geleverd insuline release29. Om te omzeilen deze effecten, een bolus glucose kan ook worden intraveneus toegediend (IVGTT) of intraperitoneally (IPGTT). Zowel glucose en insuline excursies, is sterk afhankelijk van de gekozen bezorgingsroute. Vergeleken bij de OGTT, leidt intraperitoneale toediening van glucose tot een verhoogde en verlengde piek in de niveaus van de glucose van de plasma, terwijl plasma insulineniveaus in een vertraagde, maar meer duurzame mode30 stijgen. Ook wordt intraveneuze glucose administratie gekenmerkt door een vertraagde insuline reactie31. De scherpe stijgingen in de insulineniveaus evenals robuustere AUC-insuline gegevens die zijn verkregen tijdens de OGTT suggereren dat mondelinge levering van glucose kan meer gevoelig zijn voor het detecteren van wijzigingen in het glucose metabolisme in chow-gevoed versus HFD-gevoed muizen30, 31. intragastric zowel intraperitoneaal levering zijn vergelijkbaar wat betreft ernst voor de dierlijke en technische moeilijkheid, terwijl intraveneuze toediening is meestal moeilijker evenals meer belastend voor de muizen32. Orale toediening verder elimineert de 10-20%-tarief van fout tijdens intraperitoneaal injecties in de lumen van de darm of de maag, die mogelijk van invloed op de hoeveelheid glucose levering en herverdeling33,34.
Hoewel het is de meest fysiologische route voor de levering van glucose, is de OGTT beperkt bij de administratieve verwerking alleen glucose absorptie, terwijl een volledige maaltijd ook eiwitten, complexe koolhydraten, vetten, vezels en micronutriënten bevat. De standaardbenadering tijdens OGTT is de dosis glucose baseren op het lichaamsgewicht van de muis, terwijl meestal 1-3 g glucose/kg lichaamsgewicht zijn door de overheid gereguleerde35,,36. In bepaalde gevallen kan een hogere glucose laden dan 1g/kg te onthullen van een verminderde glucose tolerantie30nodig zijn. Vele Muismodellen van obesitas en diabetes worden gekenmerkt door veranderingen in lichaamssamenstelling, vooral een enorme toename van vet massa, terwijl de vetvrije massa (spieren, hersenen en lever), dat de belangrijkste site van glucose verwijdering is verandert niet proportioneel. De normalisatie van de conventionele aanpak van lichaamsgewicht zal dus resulteren in een disproportioneel hogere dosis van glucose waaraan de mager weefsel in een zwaarlijvige muis is blootgesteld in vergelijking met de nietzwaarlijvige muis. Dit vooroordeel verhoogt met een hogere dosis glucose-30. Daarom moet optimaal de dosis van glucose (OGTT), alsmede de insuline (ITT) worden berekend op basis van de vetvrije massa, als lichaam samenstellingsgegevens beschikbaar37. Als de beoordeling van de lichaamssamenstelling niet mogelijk als gevolg van technische beperkingen is, moet de dosering volgens het lichaamsgewicht (aanvullende figuur 2), worden uitgevoerd terwijl de toepassing van een vaste dosis, zoals in een menselijke OGTT moet het laatste redmiddel als het uitvoeren van deze tests in muizen10,35,,36. In het voorgestelde protocol, werd een hand-held volbloed monitor gebruikt voor het meten van de niveaus van de glucose van het bloed, dat is gunstig in proeven zoals OGTT en ITT waarvoor meerdere bemonstering van kleine bloed volumes. Echter, deze apparaten zijn ontworpen voor menselijk bloed, hebben een beperkte dynamisch bereik. U kunt ook de glucose niveaus kunnen worden gemeten in de verzamelde plasma monsters, bijvoorbeelddoor volledig geautomatiseerd chemie analyzers in routine laboratoria. Naast insuline, kan C-peptide worden gemeten in de beschreven protocollen als een meer directe indicator van β-cel secretoire functie, die niet door de lever in tegenstelling tot insuline38,39wordt geëxtraheerd. Als gluconeogenese dient te worden beoordeeld, kan de pyruvaat tolerantie test (PTT) worden toegepast, dat is een andere variant van de hier beschreven protocollen, toezicht op glycemische excursies na de toediening van een pyruvaat bolus40.
De hier beschreven aanpak van de OGTT en ITT kan vaak verklaren de waargenomen verschillen in glucosetolerantie en kan verder dienen voor te stellen welke latere, meer geavanceerde experimenten zal vervolgens plaatsvinden (bijvoorbeeld, hyperglycemic klemmen of studies op geïsoleerde eilandjes). Kortom, wij presenteren een eenvoudige protocol voor het genereren van een HFD-geïnduceerde muismodel en verder beschrijven de OGTT en ITT, die zijn krachtige tools voor het evalueren van de wijzigingen van de metabole fenotype in vivo en kan nuttig zijn te onderzoeken metabolisme-geassocieerde ziekte mechanismen alsook nieuwe therapeutische benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de medische wetenschappelijke Fonds van de burgemeester van de stad van Wenen en de Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa - Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa - Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid - Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline - creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
References
- Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
- Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
- Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
- Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
- Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
- Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
- Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, Suppl 3. S215-S219 (2004).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
- Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
- Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
- First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
- McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- NIH. National Institute of Health - Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. , Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf (2017).
- Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
- Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
- Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Jr Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
- Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
- Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
- Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
- Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
- Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
- Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
- Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
- Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
- Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , Chapter 29 Unit 29B 23 (2007).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
- Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
- Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
- Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).
