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Medicine

Studio In Vivo del metabolismo del glucosio nei topi di dieta-federazione di grassi utilizzando Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e Test di tolleranza dell'insulina (ITT)

Published: January 7, 2018 doi: 10.3791/56672

Summary

L'articolo attuale descrive la generazione e la caratterizzazione metabolica di topi di dieta-federazione di grassi come modello di resistenza all'insulina indotta da dieta e obesità. È dotato di ulteriori protocolli dettagliati per eseguire il test di tolleranza al glucosio orale e la prova di tolleranza dell'insulina, monitoraggio corpo intero alterazioni del metabolismo del glucosio in vivo.

Abstract

L'obesità rappresenta il singolo fattore di rischio più importante nella patogenesi del diabete di tipo 2, una malattia che è caratterizzata da una resistenza all'assorbimento insulina-stimolato del glucosio e un grave scompenso del metabolismo del glucosio sistemico. Nonostante i notevoli progressi nella comprensione del metabolismo del glucosio, i meccanismi molecolari della relativa regolazione nella salute e nella malattia rimangono sotto-studiato, mentre nuovi approcci per prevenire e curare il diabete sono urgentemente necessari. Dieta derivato glucosio stimola la secrezione pancreatica di insulina, che serve come il principale regolatore dei processi anabolici cellulari durante lo stato alimentato e così saldi di glucosio nel sangue livelli per mantenere lo stato energetico sistemico. Sovralimentazione trigger meta-infiammazione cronica, che conduce alle alterazioni in insulina periferica associata al recettore di segnalazione e così riduce la sensibilità all'insulina-mediato del glucosio. Questi avvenimenti in definitiva frutto in glucosio a digiuno elevato e livelli di insulina come pure una riduzione nella tolleranza al glucosio, che a sua volta servire come importanti indicatori di insulino-resistenza. Qui, presentiamo un protocollo per la generazione e la caratterizzazione metabolica di dieta ad alta percentuale di grassi (HFD)-topi alimentati come un modello di uso frequente dell'insulinoresistenza indotta da dieta. Vi illustriamo in dettaglio il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT), che controlla lo smaltimento periferico di una secrezione di insulina e carico di glucosio somministrato per via orale nel corso del tempo. Inoltre, vi presentiamo un protocollo per la prova di tolleranza dell'insulina (ITT) monitorare l'azione dell'insulina del corpo intero. Insieme, questi metodi e le loro applicazioni a valle rappresentano potenti strumenti per caratterizzare il fenotipo metabolico generale dei topi come pure per quanto riguarda in particolare valutare le alterazioni nel metabolismo del glucosio. Possono essere particolarmente utili nel campo della ricerca ampia di insulino-resistenza, diabete e obesità per fornire una migliore comprensione della patogenesi anche per testare gli effetti degli interventi terapeutici.

Introduction

Nel mondo sviluppato, l'obesità e il diabete ha raggiunto dimensioni epidemiche a causa di inattività fisica e il consumo eccessivo di alimenti trasformati, effetti che sono guidati da rapida urbanizzazione, industrializzazione, nonché la globalizzazione. Anche se ricerca su insulino-resistenza e di comorbilità, come iperlipidemia e aterosclerosi, ha guadagnato la protuberanza durante gli ultimi decenni, i complessi meccanismi biologici che regolano il metabolismo nella salute e nella malattia rimangono in modo incompleto capito e c'è ancora un urgente bisogno di nuove modalità di trattamento prevenire e curare queste malattie1.

Insulina e glucagone ormoni contro-regolatori di servire come i principali regolatori dell'equilibrio di alimentazione e dei macronutrienti energia cellulare, mantenendo così anche sangue sistemica adeguata glucosio concentrazioni2. Il glucosio stesso agisce come uno degli principali stimolatori della secrezione dell'insulina da β-cellule pancreatiche, mentre altri macronutrienti, fattori umorali come input neurali ulteriormente modificare questa risposta. Insulina di conseguenza innesca i processi anabolici di stato alimentato facilitando la diffusione di glucosio nel sangue in eccesso nelle cellule muscolari e adipose e ulteriormente attivando la glicolisi come pure proteina - o sintesi degli acidi grassi, rispettivamente. Inoltre, l'insulina sopprime la produzione di glucosio epatico inibendo la gluconeogenesi. Consumo di energia in eccesso cronica e meta-infiammazione portano a iperinsulinemia e insulino-resistenza periferico dovuto il giù-regolamento dell'espressione del recettore dell'insulina, nonché alterazioni in vie di segnalazione a valle, così con conseguente alterata sensibilità a disposizione insulina-mediato del glucosio come pure insufficiente inibizione della produzione epatica di glucosio3,4,5,6.

Una vasta gamma di modelli animali con induzione genetici, nutrizionali o sperimentale della malattia hanno dimostrato di essere ottimi strumenti per studiare i meccanismi molecolari dell'insulino-resistenza e varie forme di diabete come pure le relative malattie accompagnamento7 . Un primo esempio è il modello ampiamente usato e ben consolidata del mouse HFD-indotta, che è caratterizzato da aumento di peso a causa di ingestione dietetica aumentata in combinazione con efficienza metabolica ridotta, con conseguente insulino resistenza8, 9. sia in modelli animali ed in esseri umani, un'elevazione nel digiuno del glucosio e dell'insulina nel sangue, così come un'alterata tolleranza alla somministrazione di glucosio sono frequentemente utilizzati indicatori di insulino-resistenza e altre alterazioni sistemiche di glucosio metabolismo. Monitoraggio del glucosio e dell'insulina nel sangue allo stato basale o dopo stimolazione sono pertanto facilmente accessibile letture.

Il presente protocollo descrive la generazione di topi HFD-federazione così come i due metodi utilizzati di frequente, il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e la prova di resistenza di insulina (ITT), che sono utili per caratterizzare il fenotipo metabolico e per studiare alterazioni nel metabolismo del glucosio. Descriviamo il OGTT in dettaglio, che valuta la disposizione di una secrezione di insulina e carico di glucosio somministrato per via orale nel corso del tempo. Inoltre, forniamo le istruzioni su come condurre la ITT per studiare il corpo intero dell'insulina-azione di monitoraggio concentrazione del glucosio nel sangue in risposta ad un bolo di insulina. I protocolli descritti in questo articolo sono ben stabiliti e sono stati utilizzati in molteplici studi10,11,12. Oltre a lievi modifiche che possono contribuire ad per aumentare il successo, forniamo le linee guida per il disegno sperimentale e analisi dei dati, nonché utili suggerimenti evitare potenziali insidie. I protocolli descritti nel presente documento possono essere strumenti molto potenti per studiare l'influenza della genetici, farmacologici, dietetici e altri fattori ambientali sul metabolismo del glucosio di tutto il corpo e il suoi disturbi associati come l'insulino-resistenza. Oltre alla stimolazione con glucosio o insulina, una varietà di altri composti può essere utilizzata per la stimolazione a seconda dello scopo della ricerca individuale. Anche se fuori dell'ambito di questo manoscritto, molte altre applicazioni a valle possono essere eseguite su campioni di sangue prelevato, come l'analisi dei valori di sangue diverso da quello del glucosio e dell'insulina (ad es., lipidico e lipoproteico profili) così come dettagliate analisi di marcatori metabolici (ad es., da tempo reale quantitativa Polymerase Chain Reaction (PCR), l'analisi Western blot ed Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)). Ulteriormente il flusso cytometry e fluorescenza attivato Cell Sorting (FACS) può essere applicato per studiare gli effetti in popolazioni distinte delle cellule singole, mentre trascrittomica, proteomica e metabolomica approcci possono anche essere utilizzati per l'analisi non mirati.

In generale, forniamo un semplice protocollo per generare un modello di topo HFD-indotta, mentre ulteriormente descrive due approcci potenti per studiare alterazioni metaboliche del corpo intero, il OGTT e ITT, che possono essere strumenti utili per lo studio della patogenesi della malattia e lo sviluppo di nuove terapie, soprattutto nel campo della malattie metabolismo-associate come l'insulino-resistenza e diabete.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso dell'Università medica di Vienna e cura degli animali e condotti secondo la Federazione di europeo laboratorio animale scienza associazioni (FELASA). Siete pregati di notare che tutte le procedure descritte in questo protocollo devono essere eseguite solo dopo approvazione istituzionale e governativa, così come dal personale che sono tecnicamente abile.

1. HFD-federazione topi

Nota: Mantenere tutti i topi C57BL/6J su un ciclo di luce/buio di 12 h con accesso gratuito per cibo e acqua.

  1. A 6 settimane dell'età, luogo topi per 8-12 settimane su un HFD (40-60% di calorie grasse) per indurre l'obesità, mentre il gruppo di controllo magro di alimentazione una dieta a basso contenuto di grassi (LFD) (10% calorie grasse).
  2. Determinare il peso corporeo dei topi su una base settimanale. Le curve di peso dovrebbero mostrare modelli simili in entrambi i gruppi, con una pendenza superiore nel gruppo HFD-federazione.

2. OGTT

Nota: Se punti tempo campionamento di sangue sono stati scelti durante il OGTT ogni 15 min, l'esperimento deve eseguito con un massimo di 15 topi in parallelo, al fine di avere almeno 1 min movimentazione-tempo per topo.

  1. Preparati il giorno prima OGTT
    1. Trasferire i topi in una gabbia con biancheria fresca e veloce durante la notte prima del test (14 h), garantendo nel contempo che i topi hanno accesso all'acqua potabile (per esempio, rimuovere il cibo alle 18:00 per un tempo di avvio sulla mattina successiva alle 8:00).
      Nota: Topi digiuno durante la notte è l'approccio standard, tuttavia un veloce più breve (5-6 h) è più fisiologico per topi (Vedi discussione per dettagli).
  2. Preparati il giorno dell'esperimento (ma prima dell'esperimento)
    1. Preparare 10 mL di soluzione glucosata al 20% (sciogliere D-(+)-glucosio in acqua distillata).
      Nota: Tutti i reagenti che vengono somministrati agli animali devono essere grado farmacologico e sterile.
    2. Preparare una piastra a 96 pozzetti per la raccolta di plasma, riempiendo un pozzetto per ogni punto del tempo di campionamento e ogni topo, con 5 µ l NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8.0 in 0,9% NaCl, deposito presso RT). Durante l'esperimento, è necessario memorizzare questa piastra sul ghiaccio.
      Nota: Vedere complementare Figura 1 per un elenco dettagliato.
  3. Misurare il peso corporeo di tutti i topi e le loro code con un pennarello indelebile al fine di rendere i topi facilmente distinguibili (ad esempio, mouse 1 = 1 dash, trattini del mouse 2 = 2, ecc.).
  4. Misurazione della glicemia e il prelievo di sangue (Figura 2)
    1. Accuratamente tagliato fuori 1-2 mm della punta della coda utilizzando delle forbici affilate ("variante A" nella Figura 2). Sempre asciugare la prima goccia di sangue per evitare emolisi o contaminazione con tessuto fluido prima del prelievo di campioni di sangue nuovo per la determinazione del glucosio nel sangue. Disegnare un campione di sangue piccolo (~ 3 µ l) per misurare il livello di glucosio del sangue basale (= punto di tempo 0) con il glucometro.
      Attenzione: Controllare e regolare il numero di carica delle strisce su un glucometro.
      Nota: Come un metodo di campionamento del sangue alternativi, nick vena caudale laterale di un mouse con un bisturi affilato ("variante B" nella Figura 2). Vena caudale laterale avviene solitamente circa un terzo lungo la lunghezza della coda dalla punta della coda, lo spostamento verso la base della coda per campioni multipli. È consigliato l'uso di una crema anestetica locale. Interrompere il flusso di sangue applicando pressione con le dita sui tessuti molli per almeno 30 s prima che l'animale venga restituito alla sua gabbia.
    2. Raccogliere un campione di sangue (circa 30 µ l) utilizzando un tubo capillare fresco (mantenere il tubo capillare in posizione orizzontale). Svuotare il tubo capillare, utilizzando una pipetta mettendo la punta della pipetta nella parte superiore dell'estremità del tubo capillare e attentamente spingendo il sangue raccolto in un pozzetto della piastra 96 pozzetti, evitando bolle d'aria. Ripetere questa procedura per tutti i topi - uno alla volta.
      Nota: Come un'alternativa per la raccolta del sangue tramite un tubo capillare, utilizzare una pipetta regolata al volume corretto (ad esempio, 30 µ l) per raccogliere il sangue, o raccogliere una goccia di sangue dalla coda sul film di paraffina e dispensare e nella soluzione di EDTA. Rigorosamente evitare il contatto della gelatina di petrolio con sangue o glucometer strisce reattive, come può influenzare le misurazioni successive di glucosio e di insulina.
      Attenzione: L'OGTT è molto stressante per topi: topi magri possono perde circa il 15% del loro peso corporeo durante il digiuno notturno. Inoltre, il prelievo di sangue a intervalli di tempo differenti conduce ad una notevole perdita di sangue. Per il prelievo di sangue più facile, è possibile massaggiare accuratamente la vista con vaselina.
      Nota: Le linee guida istituzionali possono limitare la quantità ammissibile di campioni di sangue prelevati entro un periodo prefissato. I volumi di campionamento e punti temporali devono essere regolata per non superare i valori massimi consentiti. Il peso corporeo dei topi deve essere utilizzato per calcolare il totale ritiro consentito di sangue.
  5. Calcolare il volume richiesto di soluzione di glucosio basata sul peso corporeo (1 g glucosio/kg peso corporeo; questo può essere aumentato fino a 3 g/kg) deve essere somministrato mediante sonda gastrica orale per ogni mouse. Ad esempio, un mouse con un peso corporeo di 30 g avrebbe bisogno di 150 µ l di una soluzione di glucosio di 20% per l'amministrazione di 30 mg di glucosio.
    Nota: Per la dose di glucosio in base al peso del mouse è la procedura standard. Se sono disponibili dati di composizione del corpo, la dose di glucosio OGTT dovrebbe essere calcolato sulla base la magra massa corporea (Vedi discussione per dettagli).
  6. Somministrazione di glucosio
    1. Preparare tutto quelloche è necessaria durante l'intero esperimento in anticipo (timer, esperimento di foglio di registrazione, glucosio monitor e strisce, capillari, siringhe, soluzione di glucosio, piastra a 96 pozzetti, bisturi, calcolatrice, equilibrio, pennarello indelebile, carte del banco, un pipetta con una punta e guanti).
    2. Per applicazione di glucosio, trattenga il mouse afferrando saldamente per la collottola. Applicare abbastanza fermezza alla pelle intorno al collo per impedire la torsione fuori la trattenga il mouse e correttamente inclinare la testa all'indietro. Assicurarsi inoltre che il mouse può respirare correttamente.
      Nota: Una volta avviato Gestione del glucosio, buona gestione di tempo è molto importante.
    3. Accuratamente di somministrare la soluzione di glucosio (basata su passo 2.5) direttamente nello stomaco con un ago d'alimentazione. Diretto con cautela l'ago d'alimentazione attraverso la bocca verso l'esofago. Consentire il mouse di ingoiare l'ago: l'ago interamente sprofonda nell'esofago/stomaco inferiore del mouse. Quindi iniettare la soluzione di glucosio (Figura 3a).
      1. Se si riscontra qualsiasi resistenza o se l'animale lotta immediatamente, ritirare l'ago e riposizionarlo. Avviare il timer immediatamente dopo la prima sonda gastrica e somministrare glucosio a tutti gli altri topi in intervalli di 1 min.
        Nota: Potrebbe essere utile applicare una goccia di soluzione di glucosio direttamente dall'ago d'alimentazione fino alla foce del mouse, che stimolerà leccare e inghiottire, facilitando così facilitare l'inserimento dell'ago d'alimentazione. Non applicare pressione quando si inserisce l'ago d'alimentazione come questo può ferire seriamente l'animale.
  7. Dopo 15 min, misurare i livelli di glucosio nel sangue con il glucometro e inoltre prelevare campioni di sangue (~ 30 µ l) (come descritto in dettaglio nel passaggio 2.4) di ogni mouse nello stesso ordine come sono stati iniettati.
    Nota: La gestione del tempo è molto importante; seguire quanto più possibile utilizzando gli stessi intervalli di tempo per quanto riguarda l'alimentazione mediante sonda gastrica. Lasciate che i topi muoversi liberamente come possibile e limite restrittivo al minimo durante l'intera procedura per ridurre lo stress, che può modificare i risultati. Coda con una mano di latte e raccogliere il sangue con l'altro.
  8. Ripetere il passaggio 2.7 a intervalli di tempo selezionati in base ai risultati attesi (ad es., a 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 min dopo somministrazione di glucosio). Se i punti di tempo selezionato sono più lunghi di 120 min, accertarsi che i topi hanno accesso all'acqua potabile. Assicurarsi che i topi abbiano sempre accesso all'acqua potabile. Al termine dell'esperimento, tornare i topi alla loro casa gabbie con cibo e acqua potabile.
    Attenzione: L'OGTT è molto faticoso per i topi. Quindi aspettare almeno 1 settimana prima di eseguire il prossimo test metabolici, quali un ITT.
  9. Dopo l'esperimento, centrifugare i campioni di sangue a 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Trasferire il surnatante (plasma) per vuotare i pozzetti della piastra e conservarla a-20 ° C fino all'analisi.
    1. Registrare l'emolisi dei campioni se presente (Vedi sezione 3).
  10. Determinare i livelli di insulina del plasma usando una ELISA disponibile in commercio kit (vedere la Tabella materiali) seguendo le istruzioni del produttore del kit.
    Nota: A seconda dello stato di digiuno, così come sul metabolismo dei topi studiati, possono verificarsi difficoltà durante questo test: livelli di insulina di digiuno durante la notte (punto di tempo 0) sono molto basso e quindi vicino al limite di rilevazione. Per evitare questo problema, raddoppiare la quantità di volume plasmatico raccomandato e di conseguenza dimezzare il risultato del test ELISA. D'altra parte, se topi raggiungono il picco di insulina durante OGTT, soprattutto nei topi HFD-federazione, i livelli di insulina possono superare il limite di rilevabilità: diluire il campione (ad esempio, 10 volte con 0,9% NaCl) e ripetere il test ELISA. Emolisi in campioni di plasma possono causare la degradazione dell'insulina, con conseguente diminuzione dei valori di lettura. La degradazione dipende dal tempo, la temperatura e la concentrazione di emoglobina nel campione. Tenere sempre i campioni emolizzati freddo o il ghiaccio per ridurre la degradazione dell'insulina.

3. ITT

Nota: Le stesse cautele previste per OGTT (trattamento dei topi, sangue, glucometer e l'uso di gelatina di petrolio) hanno anche da applicare quando si esegue l'ITT. Ad esempio, tutte le iniezioni devono essere effettuate entro 15 min in intervalli di 1 min se 15 topi sono testati in parallelo. Per le ITT, successiva raccolta di campioni di sangue con tubi capillari è facoltativo.

  1. Preparativi prima dell'esperimento
    1. Veloce di topi per almeno 2 h prima dell'iniezione di insulina, garantendo nel contempo che i topi hanno accesso all'acqua potabile (per esempio, rimuovere il cibo alle 8:00, topi di prova 2-5 ore più tardi).
    2. Diluire l'insulina 1:1,000 nello 0,9% NaCl (Stock: insulina di 100 U/mL; lavoro concentrazione 0,1 U/mL) e preparare il 20% di glucosio (D-(+)-soluzione di glucosio disciolto in acqua distillata) devono essere somministrati se i topi diventano ipoglicemici.
      Nota: La ITT viene in genere eseguita dopo una breve veloce per evitare l'ipoglicemia che può altrimenti verificarsi in una notte a digiuno gli animali. Tutti i reagenti che vengono somministrati agli animali devono essere grado farmacologico e sterile.
  2. Misurare il peso corporeo dei topi, contrassegnare la coda, tagliare la punta della coda utilizzando delle forbici affilate e misurare i livelli della glicemia basale come descritto in precedenza per l'OGTT al punto 2.4.
  3. Iniezione dell'insulina
    1. Per iniettare insulina per via intraperitoneale (0.75 U insulina/kg di peso corporeo, calcolata in anticipo), trattenere il mouse dal metodo collottola.
    2. Utilizzare un fresco, sterile 27 o 30 gauge dell'ago per ogni animale evitare il disagio e il rischio di eventuali infezioni del sito di iniezione.
      Nota: Sterilizzazione della pelle può prolungare la durata della somministrazione di insulina e quindi può causare ulteriori disturbi all'animale. Di conseguenza, non è consigliabile.
    3. Inclinare la testa del mouse verso il basso con una leggera angolazione per esporre il lato ventrale dell'animale. Inserire l'ago sterile con lo smusso e a un angolo di 30 ° nel quadrante inferiore destro dell'addome dell'animale (Figura 3b). Avviare il timer immediatamente dopo il primo mouse viene iniettato.
      Nota: Basso-dose ITTs (0,1 U/kg) può essere eseguita per valutare specificamente la sensibilità dell'insulina epatica. Per quanto riguarda l'OGTT, calcolo del volume di iniezione basato sul peso corporeo è la procedura standard, pur basando la dose sulla magra massa è comodo se sono disponibili dati di composizione del corpo.
  4. Misurare i livelli di glucosio nel sangue (ad es., dopo 15, 30, 45, 60 e 90 min) a intervalli di tempo selezionati.
    Nota: Come l'insulina ha un breve intervallo di ~ 10 min in topi13, tarda differenze dopo la somministrazione di insulina (per esempio, dopo 2 h) non possono riflettere un effetto diretto dell'azione dell'insulina. Somministrare la soluzione di glucosio 20% nel caso in cui un mouse diventa ipoglicemico (livelli di glucosio inferiore a 35 mg/dL di sangue) ed è a rischio di morire.
  5. Dopo il tempo finale punti, rimettere i topi nella loro casa gabbie preparate con abbondanza di cibo e acqua.

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Representative Results

La figura 1 illustra una tabella schematica tempo per fenotipizzazione metabolica dei topi sulle diete. Ad un'età di circa 6 settimane, topi dovrebbero essere posizionati su un HFD, mentre un gruppo di LFD può servire come gruppo di controllo. D'importanza, peso corporeo deve essere determinato settimanale per osservare se c'è un aumento previsto del peso corporeo. Qualsiasi tipo di stress (ad esempio, rumore o comportamento aggressivo maschile) possa interferire con aumento di peso corporeo e dovrebbe essere eliminato immediatamente. Ogni coorte dei topi per esperimenti di dieta dovrebbe consistere di almeno 10 topi perché questi esperimenti di dieta sono che richiede tempo, e valori erratici sono frequenti (per esempio, topi non aumentare di peso o topi con anormale del glucosio o i livelli di insulina). Dopo il periodo di tempo (secondo l'ipotesi di studio e il punto di tempo dei cambiamenti attesi) selezionato, OGTT e ITT può essere eseguita per la valutazione dell'azione dell'insulina e la tolleranza al glucosio. In questa carta, fine tempo punti per il test metabolico sono stati scelti.

D'importanza, ci dovrebbe essere un tempo di recupero di almeno 1 settimana tra l'OGTT e ITT come questi esperimenti portano a notevole perdita di sangue e sono quindi molto stressanti per i topi. Se i volumi di raccolta di sangue sono in diminuzione (per esempio, se si esegue un ITT senza ulteriore prelievo sangue prima), questo periodo di recupero può anche essere abbreviato o omesso, in linea con le linee guida per più sangue disegna in animali14, 15,16,17.

In questo ampio studio con 60 topi C57BL/6J in totale, la metà dei topi sono stata fissata su HFD o LFD ad un'età di 6 settimane (n = 30/gruppo) e aumento di peso corporeo è stato monitorato per 16 settimane di dieta. Il consumo di HFD ha provocato un aumento significativo del peso corporeo come mostrato nella Figura 4. A 6 settimane dell'età, il peso corporeo era 20,2 g in entrambi i gruppi. Considerando che topi su LFD ha mostrato una costante, un lieve aumento del peso corporeo (31,2 g ± 2,7) durante il periodo osservato, topi su HFD loro peso corporeo è aumentato velocemente, soprattutto durante le prime settimane e ha raggiunto il loro massimo di peso di corpo dopo 16 settimane sulla dieta. Anche se le curve di peso ha mostrato un simile modello durante l'esperimento, i topi del gruppo HFD-raggiunto un 1,5 - 2 volte più elevato peso corporeo (44,4 g ± 4.0) rispetto ai topi alimentati LFD.

Per studiare il fenotipo metabolico delle due coorti, un OGTT (Figura 5) e ITT (Figura 6) sono stati effettuati. Come volume di sangue è limitato a piccoli roditori, un saggio di point-of-care (POC) per gli esseri umani diabetici (glucometer) è stato utilizzato per monitorare i livelli della glicemia durante questi esperimenti metabolici phenotyping. Come dimostrato nella Figura 2, il monitor di glucosio nel sangue sono facili da usare, serve solo una piccola goccia di sangue e visualizzare i livelli di glucosio nel sangue in pochi secondi per la documentazione. Figura 5 presenta il corso di tempo di assoluta dell'insulina e glucosio assoluto (Figura 5ab) (Figura 5C) livelli durante il OGTT. Generalmente, un sano mouse con tolleranza al glucosio normale Mostra un caratteristico aumento rapido nel sangue del glucosio, raggiungendo il suo picco 15-30 min dopo la sfida del glucosio.

L'assorbimento del glucosio successive, condotta principalmente da muscolo, grasso-tessuto e tessuto di fegato conduce ad una graduale diminuzione della concentrazione di glucosio nel sangue. In tutti gli esperimenti, i topi LFD-Federazione servito come il gruppo di controllo tollerante di glucosio e pertanto soddisfatti il profilo metabolico previsto: il picco dei livelli ematici del glucosio di ~ 240 mg/dL è stato raggiunto circa 15 min dopo somministrazione di glucosio, immediatamente seguito da una diminuzione raggiungendo livelli basali circa 60 min dopo la sfida del glucosio, che indica l'eliminazione corretta del glucosio. In netto contrasto, HFD-topi raggiunse circa ~ 320 mg/dL di glucosio e ha mostrato quasi nessuna disposizione di glucosio, che indica la resistenza del glucosio. Quando i livelli di glucosio nel sangue tra i due gruppi già differiscono nello stato di digiuno (come in questo esempio rappresentativo), dovrebbe essere eseguito un calcolo dell'area sotto la curva (AUC) di sopra del glucosio basale per convalidare i risultati (Figura 5a b).

Inoltre, i livelli di insulina circolanti di sangue sono stati determinati mediante una prova di insulina-ELISA (Figura 5C) al fine di fornire ulteriori informazioni circa la patofisiologia di fondo in questo modello. Considerando che i livelli dell'insulina erano quasi immutati nel gruppo di controllo, i topi hanno alimentato un HFD ha mostrato 16 volte elevati livelli rispetto al gruppo di controllo, come pure una risposta notevolmente aumentata dell'insulina, che indica l'iperinsulinemia compensatoria HFD-indotta come digiuno un tentativo di controbilanciare la capienza di eliminazione in diminuzione del glucosio, che può essere causato da insulino-resistenza. Tuttavia, essere consapevoli di non sovra-interpretare i risultati dell'OGTT, come questo test non valuta direttamente l'azione dell'insulina e non deve essere utilizzato per concludere le dichiarazione circa l'insulino-resistenza.

Per misurare la sensibilità dell'insulina nei topi alimentati HFD, un ITT è stato effettuato 1 settimana dopo OGTT (Figura 6a). In questo test, il grado a cui il sangue le concentrazioni di glucosio cadono dopo la somministrazione di insulina rappresentano l'efficienza dell'azione dell'insulina del corpo intero. I topi HFD-federazione hanno mostrato un'alterata riduzione dei livelli di glucosio nel sangue rispetto al gruppo di controllo ha alimentato LFD, presso tutti i punti di tempo durante il ITT, suggerendo così l'insulino-resistenza. I risultati ITT sono solitamente presentati come il corso di tempo dei livelli di glucosio, ma ulteriormente anche l'inverso che AUC di sotto del glucosio basale può essere mostrato come dimostrato in Figura 6b. Se i gruppi che vengono confrontati hanno simili digiuno i livelli della glicemia (che non è il caso in questo esperimento), i livelli di glucosio durante il ITT possono anche essere presentati come la percentuale di glucosio basale. Come topi, una contro-regolatori risposta ad insulina viene attivata se i livelli di glucosio nel sangue inferiori a 80 mg/dL18: difetti in questa risposta contro-regolatori in un modello murino particolare potrebbero essere interpretata erroneamente come un aumento nella sensibilità dell'insulina. Durante HFDs e successivi esperimenti metabolici fenotipici, outlier possono verificarsi frequentemente. Topi che non avere peso su HFD, o quelli che mostrano anormale glucosio a digiuno e/o i livelli di insulina dovrebbero essere esclusi dall'analisi. Per le ultime due, una prova di outlier può essere eseguita separatamente per ogni gruppo sperimentale (ad esempio, test di Grubbs)

In questo studio, ad esempio ci ha mostrato e interpretato dati di esperimenti metabolici in vivo, effettuato sui topi con obesità indotta da dieta, intolleranza al glucosio e l'insulino-resistenza e li hanno confrontati ad un gruppo di controllo con peso corporeo normale. Come previsto, c'era alterata tolleranza al glucosio e iperinsulinemia in topi obesi coerenti con insulino-resistenza rispetto ai topi controllo di pari età; Questo è stato scoperto usando metodi ben consolidata, affidabile, tempo e budget-friendly, che sono relativamente facili da eseguire. Differenze nella tolleranza al glucosio, i livelli di insulina così come nella sensibilità dell'insulina, che sono tutti ottenuti con i metodi presentati di OGTT e ITT, spesso possono aiutare a pianificare i prossimi passi di uno studio, che può includere più sofisticati esperimenti come hyperglycemic o morsetti hyperinsulinemic, come pure esperimenti con isolotti pancreatici isolati.

Figure 1
Figura 1. Tabella schematica tempo per un regime di dieta suggerita e metaboliche gli esperimenti in vivo. Al fine di indagare gli effetti metabolici di HFD nei topi, gli animali del gruppo sperimentale sono collocati su HFD a circa 6 settimane di età, mentre il gruppo di controllo riceve un LFD. Il peso corporeo dei topi dovrebbe essere determinato su base settimanale per valutare il guadagno di peso adeguato. Dopo circa 12 settimane sulla dieta (o un punto di tempo selezionato a seconda l'ipotesi di ricerca), il fenotipo metabolico dei topi è valutato da un OGTT seguite da 1 settimana di tempo di recupero e, successivamente, un ITT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Metodi per il prelievo di sangue durante gli esperimenti metabolici. Per l'OGTT anche per quanto riguarda la ITT, dove il prelievo di sangue ripetute è necessario, si consiglia di disegno di sangue tramite attentamente tagliare un pezzo di 1-2mm di punta della coda con forbici affilate (variante A), seguito dalla determinazione dei livelli di glucosio nel sangue con un glucometro e ulteriormente la raccolta di sangue con un capillare per determinare i livelli di insulina e di altri valori di sangue rilevanti. In alternativa, sangue potrebbe essere provato anche tramite vena caudale (variante B) o di cateterizzazione arteriosa (non mostrato). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Alimentazione mediante sonda gastrica orale di glucosio (un) e iniezione intraperitoneale dell'insulina (b). Immagini rappresentative di somministrazione orale di glucosio utilizzando un ago d'alimentazione durante il OGTT (un) e l'iniezione intraperitoneale di insulina durante il ITT (b). Vedi protocollo per una descrizione dettagliata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Il corpo aumento di peso dei topi C57BL/6J HFD-alimentato ed alimentato LFD. I topi C57BL/6J erano impostati su 60% HFD, o 10% LFD per servire come un controllo, per un periodo di 20 settimane. Mentre topi su HFD ha mostrato un aumento previsto del peso corporeo, soprattutto nelle prime settimane su dieta, LFD-ha alimentato i topi hanno mostrato peso corporeo quasi costante durante il periodo osservato. I risultati sono la media ± SEM. *p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001. n = 30 per gruppo. ANOVA e test post hoc di Tukey sono stati utilizzati per verificare le differenze. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. OGTT eseguita negli animali C57BL/6J HFD-alimentato ed alimentato LFD. (un) glucosio livelli durante il OGTT. Dopo un digiuno notturno, i livelli della glicemia (mg/dL) sono stati misurati in stato di digiuno e 15, 30, 45 e 60 min dopo la somministrazione di soluzione di glucosio per via orale tramite sonda gastrica (1 g glucosio/kg). I livelli della glicemia nel gruppo HFD sono stati elevati a digiuno, così come dopo la sfida del glucosio. Diminuire l'aumento raggiunta il suo picco dopo 15 min seguita da un ritardo e lento. I risultati sono la media ± SEM. *p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001. n = 30 per gruppo. Analisi statistica è stata eseguita mediante test ANOVA e di Tukey post hoc . (b) area del glucosio sotto la curva (AUC) durante il OGTT. Per calcolare la previsione corretta AUC, livelli della glicemia basale (punto di tempo 0) sono stati sottratti da tutto in seguito acquisiti individualmente i livelli della glicemia per ogni mouse, seguita dal calcolo dell'AUC individuo. L'AUC sopra il glucosio basale illustra la resistenza di glucosio nei topi alimentati HFD. L'analisi statistica è stata effettuata usando test post hoc, ANOVA e di Tukey (livelli di glucosio) o munito di due di Student t-test (AUC). (c) Livelli dell'insulina durante il OGTT. I livelli di insulina (ng/mL) sono stati misurati dopo un periodo di digiuno di 4 h e 15, 30 e 60 min dopo la somministrazione di soluzione di glucosio per via orale tramite sonda gastrica (1 g glucosio/kg). Topi alimentati HFD compensati non solo per l'iniezione di glucosio con un aumento più alto nel sangue dei livelli dell'insulina, hanno anche iniziato e finito il OGTT con i livelli elevati dell'insulina rispetto al gruppo di controllo. I risultati sono la media ± SEM. *p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001. n = 30 per gruppo. Analisi statistica è stata eseguita mediante test ANOVA e di Tukey post hoc . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. ITTs eseguita negli animali C57BL/6J HFD-alimentato ed alimentato LFD. (un) glucosio livelli durante il ITT. I livelli di glucosio (mg/dL) sono stati misurati in stato di digiuno e 15, 30, 45 e 60 min dopo l'iniezione di insulina per via intraperitoneale (0.75 U insulina/kg). Durante il ITT, HFD-ha alimentato i topi hanno mostrato livelli elevati del glucosio. I livelli di glucosio nel sangue non erano adeguatamente abbassati nei topi HFD-federazione dopo l'iniezione di insulina. I risultati sono la media ± SEM. *p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001. n = 30 per gruppo. Analisi statistica è stata eseguita mediante test ANOVA e di Tukey post hoc . (b) area del glucosio sotto la curva (AUC) durante il ITT. Per calcolare l'inverso corretto riferimento AUC, livelli della glicemia basale (punto di tempo 0) sono stati sottratti tutti successivamente ottenuti i livelli della glicemia per ogni mouse individualmente. I valori erano invertito (moltiplicazione con -1), seguita dal calcolo dell'AUC individuo. In conseguenza del livello di glucosio maggiore nei topi HFD-federazione durante il OGTT, la linea di base corretto inverso che AUC era più basso nei topi alimentati HFD rispetto ai topi di controllo, che più ulteriormente hanno suggerito la sensibilità dell'insulina in diminuzione. L'analisi statistica è stata effettuata usando test post hoc, ANOVA e di Tukey (livelli di glucosio) o munito di due di Student t-test (inverso AUC). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Complementare figura 1. Elenco di controllo per la preparazione di esperimento. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Complementare nella figura 2. I livelli dell'insulina durante ITTs. I livelli di insulina del plasma durante il ITT in LFD-Federazione contro i gruppi HFD-federazione hanno mostrati dinamiche simili nei livelli dell'insulina del plasma dopo l'iniezione dell'insulina in entrambi i gruppi. Come previsto, i topi HFD hanno esibito i livelli di insulina basale fortemente aumentato rispetto al gruppo di controllo. Inoltre, l'aumento dei livelli di insulina nei topi HFD-federazione era più forte, che può essere parzialmente causata dalla sovrastima della massa magra del corpo se la quantità di insulina iniettata è calcolata in base alla massa del corpo intero (l'approccio convenzionale normalizzazione) come avviene in questo esperimento. Tuttavia, la risposta dell'insulina è stata alterata nel gruppo HFD-federazione (insufficiente riduzione dei livelli di glucosio del plasma), così più ulteriormente sottolineando lo stato insulina resistente in questi animali. I risultati sono la media ± SEM. *p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001. Analisi statistica è stata eseguita mediante test ANOVA e di Tukey post hoc . Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Con l'alta prevalenza di diabete e le malattie associate nella popolazione del mondo, c'è una forte esigenza di ricerca affrontando il meccanismo molecolare, prevenzione e trattamento della malattia19. Il protocollo presentato descrive metodi consolidati per la generazione di topi HFD, un robusto modello animale utilizzato per ricerca metabolica, come pure la conduzione del OGTT e ITT, che sono potenti strumenti per la valutazione delle alterazioni metaboliche del corpo intero come insulino-resistenza. I metodi presentati in questo documento possono essere utili per studiare il ruolo dei geni sospetti, fattori ambientali, nonché terapie farmacologiche, dietetiche, fisiche o genetiche su tutto il corpo il metabolismo del glucosio9,10. Mentre il glucosio serve come il principale stimolo per la secrezione di insulina in un OGTT, il protocollo presentato potrebbe essere modificato da (co-) l'applicazione di altre sostanze quali altri macronutrienti e ormoni che sono conosciuti per modificare la risposta dell'insulina2. Analogamente, il protocollo ITT può essere modificato dall'applicazione (co-) di altre sostanze (ad es., glucagone o catecolamine) secondo la domanda di ricerca individuale. Le principali letture dei protocolli OGTT e ITT descritti sono le concentrazioni nel sangue del glucosio e dell'insulina; Tuttavia, la misurazione degli altri parametri del sangue quali glucagone, acidi grassi e i livelli della lipoproteina, così come di vari indicatori metabolici a livello di mRNA e proteina può essere anche utile a seconda l'obiettivo dello studio.

Gli investigatori dovrebbero essere consapevoli del fatto che le risposte neuroendocrine per l'ipoglicemia, la secrezione dell'insulina, l'azione dell'insulina, nonché il fenotipo metabolico nel complesso dipendono fortemente il background genetico dei topi10. Qui, abbiamo utilizzato topi all'interno del background genetico di C57BL/6J come un modello di HFD-indotto del diabete, che hanno un danno parziale nella secrezione di insulina glucosio-mediata a causa di un'omissione natura del gene di nicotinammide del nucleotide transidrogenasi 20, che li rende un modello adatto per lo studio dell'obesità associata insulina resistenza8,9. I protocolli descritti qui maggio tuttavia anche essere utilizzate per caratterizzare metabolicamente modelli del mouse alternativi di insulino-resistenza e diabete, che sono di solito basate su malattie monogeniche o la distruzione chimica di β-cellule21, 22 , 23. precauzioni durante il disegno sperimentale includono test topi di pari età, come insulino sensibilità declini con età24e in seguito effettuare gli esperimenti in topi dal sesso stesso. Trattamenti e mutazioni genetiche possono causare fenotipi differenti a seconda del sesso25,26, è anche consigliabile studiare entrambi i sessi separatamente gli uni dagli altri.

Il metodo di campionamento di sangue descritto in questo protocollo non richiede anestesia, che può influenzare la frequenza cardiaca, il flusso sanguigno e il metabolismo del glucosio, producendo risultati non-fisiologica10. In alternativa, può essere impiantato un catetere arterioso, che consente il campionamento vascolare senza gestione dello stress durante l'esperimento, ma aggiunge anche sforzo, costi, così come il rischio di perdita di animale per l'esperimento. Per l'OGTT, topi in genere tenere a digiuno durante la notte (14-18 h), che provoca uno stato catabolico nei topi, fortemente che impoveriscono lo strato di glicogeno del fegato. Anche se questo riduce la variabilità nei livelli della glicemia basale, il digiuno prolungato diminuisce il tasso metabolico e migliora l'utilizzazione del glucosio nei topi, che è in contrasto con la situazione in esseri umani10,27. Come i modelli di alimentazione nei topi anche non imitare il comportamento umano, può essere così più fisiologico per eseguire un OGTT dopo un digiuno breve. Come i ritmi circadiani hanno un forte effetto sul metabolismo di glucosio sistemico28, è importante considerare in quale momento della giornata sono condotti gli esperimenti descritti qui. Al fine di studiare il metabolismo dei topi durante il loro periodo attivo (fase scura), un ciclo luce-buio invertito può essere utile per generare altri risultati fisiologici.

Il percorso descritto dell'amministrazione può anche essere variato a seconda l'ipotesi specifica in fase di test. Somministrazione orale di glucosio durante un test di tolleranza al glucosio conduce alla secrezione di insulina più variabile, come lo svuotamento gastrico, motilità gastrointestinale, ormoni (incretine) e input neurali modificare e prolungare l'insulina risposta2, 10. durante il pozzo descritto "incretine effetto", l'assorbimento di glucosio dall'intestino conduce al rilascio di ormoni gastrointestinali quali GLP1, che rafforza orale dell'insulina glucosio-consegnato rilascio29. Per ovviare a questi effetti, un bolo di glucosio può anche essere somministrato per via endovenosa (IVGTT) o intraperitonealmente (IPGTT). Escursioni dell'insulina e del glucosio differiscono significativamente a seconda del percorso di spedizione scelto. Rispetto all'OGTT, somministrazione intraperitoneale di glucosio conduce ad un picco maggiore e prolungato nei livelli del glucosio del plasma, mentre i livelli di insulina del plasma aumentano in un ritardo, ma più sostenuta moda30. Allo stesso modo, la somministrazione di glucosio per via endovenosa è caratterizzata da un'insulina ritardata risposta31. I forti aumenti nei livelli dell'insulina come pure più robusto AUC-insulina i dati ottenuti durante il OGTT suggeriscono che la consegna orale di glucosio può essere più sensibile per rilevare le alterazioni nel metabolismo del glucosio in cibo-federazione contro topi HFD-federazione30, 31. consegna sia intragastrica e intraperitoneale sono simili in termini di gravità per la difficoltà tecnica e degli animali, mentre la somministrazione endovenosa è di solito più difficile, così come più stressante per i topi32. Somministrazione orale ulteriormente Elimina il 10-20% di tasso di errore durante le iniezioni intraperitoneali nel lume intestinale o lo stomaco, che può influenzare il tasso di glucosio consegna e ridistribuzione33,34.

Anche se è il percorso più fisiologico della consegna del glucosio, l'OGTT è limitato nella contabilità per solo l'assorbimento del glucosio, mentre un pasto completo contiene anche proteine, carboidrati complessi, grassi, fibre e micronutrienti. L'approccio standard durante il OGTT è basare la dose di glucosio sul peso corporeo del mouse, mentre di solito 1-3 g di glucosio/kg di peso corporeo sono amministrati35,36. In alcuni casi, può essere necessario un carico di glucosio superiore a 1g/kg rivelano un di tolleranza alterata del glucosio30. Molti modelli murini di obesità e diabete sono caratterizzate da alterazioni nella composizione corporea, specialmente un massiccio incremento della massa grassa, mentre la massa magra del corpo (muscoli, cervello e fegato), che è il principale sito di disposizione del glucosio non cambia proporzionalmente. L'approccio convenzionale normalizzazione al peso corporeo così si tradurrà in una sproporzionatamente più alta dose di glucosio a cui è esposto il tessuto magro in un topo obeso rispetto al mouse non obesi. Questa tendenza aumenta con una maggiore dose di glucosio30. Di conseguenza, in modo ottimale la dose di glucosio (OGTT), nonché dell'insulina (ITT) va calcolata in base alla massa magra del corpo, se i dati di composizione del corpo sono disponibili37. Se la valutazione della composizione corporea non è possibile a causa di limitazioni tecniche, il dosaggio deve essere eseguito secondo il peso corporeo (Supplemental figura 2), mentre applicando una dose fissa, come in un OGTT umano dovrebbe essere l'ultima risorsa se esecuzione di questi test in topi10,35,36. Nel protocollo presentato, un monitor portatile di sangue intero è stato utilizzato per misurare i livelli di glucosio nel sangue, che è vantaggioso nei test quali OGTT e ITT che richiedono il campionamento multiplo dei volumi piccoli il sangue. Tuttavia, questi dispositivi sono progettati per il sangue umano, avendo una ridotta gamma dinamica. In alternativa, il glucosio livelli possono essere misurati nei campioni del plasma raccolti, ad esempio, da completamente automatizzato analizzatori di chimica in laboratori sistematici. Oltre a insulina, C-peptide può essere misurato in protocolli descritti come un indicatore più diretto della funzione secretiva delle cellule β, che non viene estratta dal fegato in contrasto con insulina38,39. Se gluconeogenesi deve essere valutata, la prova di tolleranza del piruvato (PTT) può essere applicata, che è un'altra variante dei protocolli descritti qui, monitoraggio glicemico escursioni dopo la somministrazione di un bolo di piruvato40.

Gli approcci descritti qui del OGTT e ITT può spesso spiegare le differenze osservate nella tolleranza al glucosio e può servire ulteriormente per suggerire quali esperimenti successivi, più sofisticati vengano effettuati successivamente (ad es., hyperglycemic morsetti o studi su isolotti isolati). In sintesi, presentiamo un protocollo semplice per la generazione di un modello di topo HFD-indotta e descrivere ulteriormente il OGTT e ITT, che sono potenti strumenti per valutare le alterazioni del fenotipo metabolico in vivo e può essere utile per studiare meccanismi di malattia metabolismo-collegata, nonché approcci terapeutici innovativi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dal Comitato medico scientifico del fondo del sindaco della città di Vienna e la Österreichische Gesellschaft für Gießen und Klinische Chemie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse strain: C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer Roche 6870228 OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips Roche 6454038 OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769 OGTT
Actrapid - Insulin Novo Nordisk 417642 ITT
Reusable Feeding Needles Fine Science Tools #18061-22 OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes Braun 9161406V OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) Braun 304000 ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)   Braun 4657705 ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible Braintree Scientific, Inc. SP0016 OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit Crystam Chem 90080 OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat Research Diets Inc D12492 mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat. Research Diets Inc D12450B mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary Sigma-Aldrich BR749321 OGTT/ITT
Vaseline - creme Riviera P1768677 OGTT/ITT

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Nagy, C., Einwallner, E. Study ofMore

Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). J. Vis. Exp. (131), e56672, doi:10.3791/56672 (2018).

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