Summary
Hier bespreken we een methode-protocol waarmee een gemakkelijke analyse van de volwassen tg(fli:EGFP) zebrafish retinale therapieën als een snel uitlezing in instellingen van lange termijn vasculaire pathologieën gekoppeld aan neoangiogenesis en structurele veranderingen.
Abstract
Diabetische retinopathie is de belangrijkste oorzaak van blindheid bij volwassenen van middelbare leeftijd. De toenemende prevalentie van diabetes wereldwijd zal maken de preventie van diabetische microvasculaire complicaties één van de belangrijkste onderzoeksgebieden van de komende decennia. Gespecialiseerde, gerichte therapie en nieuwe therapeutische medicijnen nodig zijn voor het beheer van het toenemend aantal patiënten met risico van visie-verlies. De zebravis is een gevestigde diermodel voor ontwikkelingsstoornissen onderzoeksvragen met toenemende relevantie voor het modelleren van multifactoriële stofwisselingsziekte processen. De voordelen van de soorten toestaan voor optimale visualisatie en hoge doorvoer drug screening benaderingen, gecombineerd met de sterke mogelijkheid om knock-out genen van belang. Hier beschrijven we een protocol waarmee gemakkelijk analyse van de volwassen tg(fli:EGFP) zebrafish retinale therapieën als een snel uitlezing in instellingen van lange termijn vasculaire pathologieën gekoppeld aan neoangiogenesis of schip schade. Dit wordt bereikt via dissectie van de zebravis retina en geheel-montage van het weefsel. Visualisatie van de blootgestelde schepen wordt vervolgens bereikt via confocale microscopie van de groene EGFP verslaggever uitgedrukt in de volwassen retinale therapieën. Juiste behandeling van het weefsel zal leiden tot betere resultaten en minder interne vaartuig breuk te verzekeren van de visualisatie van de ongewijzigde vasculaire structuur. De methode kan worden gebruikt in zebrafish modellen van retinale vasculopathy verband houden met veranderingen in het vaartuig architectuur evenals neoangiogenesis.
Introduction
Diabetes mellitus is een stofwisselingsziekte die zijn gedefinieerd door hyperglykemie als gevolg van disfunctionele insuline secretie of onvoldoende weefsel reactie op secreted insuline. De WHO schat dat 422 miljoen volwassenen met diabetes mellitus in 20141 leefden en de prevalentie van diabetes wereldwijd naar verwachting toenemen tot 8-10% van de bevolking tot 20352, waardoor diabetes een van de belangrijkste onderzoeksterreinen in de komende decennia. Leven met chronische hoge bloedsuikerspiegel leidt tot langdurige microvasculaire complicaties, zoals diabetische retinopathie, nefropathie en polyneuropathie. Het beheer en de preventie van deze complicaties zijn moeilijk; inderdaad, diabetes wordt steeds de meest voorkomende oorzaak van eind-fase nierziekte (ESRD), die tot dialyse2 leidt, en diabetes is de belangrijkste oorzaak van blindheid onder volwassenen van middelbare leeftijd3.
De oorspronkelijke oorzaken van microvasculaire schade in het diabetische oog zijn chronische hyperglycemie, metabolische omzetting, evenals bepaalde risicofactoren (bijv., hypertensie, dyslipidemia), leidt tot vasculaire endothelial dysfunctie, uitval van de pericyte, en capillaire regressie die in Acellulair vasculaire mouwen resulteert. De resulterende retinale ischemie is de oorzaak van neovascularization en toegenomen vasculaire permeabiliteit, bevordering van de ontwikkeling van de proliferatieve diabetische retinopathie (PDR)4. Diabetische retinopathie is over het algemeen aangetroffen in 37% van de diabetespatiënten, terwijl zicht-bedreigende diabetische retinopathie is geconstateerd in 12% van de gescreende wit Europese cohort in de studie van UKADS5. De huidige behandeling kan alleen voorkomen dat verdere complicaties en is niet in staat zijn om de reeds veroorzaakte schade volledig te herstellen. Panretinal photocoagulation, naast de glycemische controle, is de standaard therapie voor proliferatieve diabetische retinopathie (PDR) maar is van invloed op de aangrenzende gezond weefsel zo goed. Anti-VEGF interventies veelbelovend Showresultaten als alternatieven voor laser behandeling6,7, maar uiteindelijk, gespecialiseerde, gerichte therapie en nieuwe geneesmiddelen nodig zijn voor het beheer van het groeiende aantal patiënten met risico van visie-verlies.
De onderzoeksmodellen van de gevestigde dierlijke van diabetische retinopathie deel niet elk aspect van menselijke pathofysiologie. Gebruik van de juiste soort inspelen op de specifieke vereisten van de wetenschappelijke onderzoeksvraag is één van de meest wezenlijke onderdelen van de experimentele opstelling. Het embryo zebrafish (Danio rerio) wordt al veel gebruikt in developmental onderzoek en biedt een optimale praktische achtergrond knockdown of afvalrace specifieke genen via morpholinos of de CRISPR/Cas9 techniek8. Deze methoden kunnen gemakkelijk worden gebruikt in zebrafish te onderzoeken van genen, die door grootschalige genoom-brede vereniging studies (GWAS), genereren inzicht in specifieke mechanismen van progressie van de ziekte en gevoeligheid9werden geïdentificeerd. Korte generaties tijd, grote hoeveelheden nakomelingen, gemakkelijke en goedkope behandeling en groeiende assay ondersteuning gestegen de relevantie van de zebravis model, vooral gezien de grote groeimogelijkheden voor het modelleren van metabole ziekte. Instandhouding van de biologische mechanismen in de zebravis is als basis voor de ontwikkeling van de farmacologische therapie aangetoond. Bijvoorbeeld, is de antidiabetica drug metformine en cholesterol-verlagende simvastatin aangetoond dat ze "aandoeningen" in modellen van cAMP/dexamethason-veroorzaakte hoge PEPCK expressie en hoge-cholesterol dieet-geïnduceerde hypercholesterolemie10 , 11 , 12. dit oprukkende inzicht in het overkoepelende geconserveerde metabole mechanismen wordt verder ondersteund door het groeiende aantal zebrafish diabetes modellen, door middel van experimenten zoals: afwisselend incubatie in glucose-oplossingen Streptozotocin-geïnduceerde ablatie van beta cellen, nitroreductase-gemedieerde bèta cel ablatie met behulp van het voorstadium metronidazol, monogeen diabetes gemedieerde via pdx1 gene knockdown of knock-out, evenals modellen van verhoogde insulineresistentie in skeletspier 12. deze reeds protocollen, de bovengenoemde specifieke kenmerken van de soorten, en de mogelijkheid om efficiënt het manipuleren van het genoom in een groot aantal monsters alle tonen de voordelen van de zebravis voor de studie van de mechanismen rijden complexe ziekteprocessen evenals de capaciteit aan het scherm voor farmacologische interventies.
Een algemeen begrip van de fundamentele zebrafish oog anatomie (Figuur 1) is noodzakelijk voor de dissector om de zebravis als model voor retinale angiopathie gebruiken. De zebravis oog heeft zes extraocular spieren, vier rectus en twee schuine spieren die invoegen aan de buitenkant van de bol op de sclera-13. Het hoornvlies is het transparante weefsel die betrekking hebben op de lens en blijft rechtstreeks in de sclera, dat de buitenste schil van het oog vormt. De sclera is niet-transparante, heeft een gedeeltelijk lichte reflecterend oppervlak en is sterk gepigmenteerde. Het objectief zelf is meer bal-vormige dan de menselijke tegenhanger. Het netvlies bestaat uit drie nucleaire lagen van neuronale cellen, terwijl de zuurstof liquiditeitsverschaffende retinale therapieën nauw verbonden met de binnenste ganglion cellaag is maar niet een subretinal netwerk vormt. Choroidal schepen, in tegenstelling, liggen tussen de sclera en netvlies en zijn gekoppeld aan de retinale pigment epitheel (RPE). Dit capillaire netwerk levert zuurstof naar de buitenste delen van het netvlies14.
Figuur 1: schematische voorstelling van het oog van de volwassen zebrafish. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Eenvoudige visualisatie van het netvlies therapieën kan worden bereikt door gebruik van de transgene tg(fli:EGFP) zebrafish lijn15. De groen fluorescente proteïne uitgedrukt onder controle van het fli-promotor in de endotheliale cellen van de therapieën is de basis voor de visualisatie via een laser scanning microscoop in de latere stappen. Dit wordt bereikt via dissectie van de zebravis retina en geheel-montage van het weefsel. Dit transgene model biedt een snel vasculaire uitlezing zonder toevoer van intravasculaire labeling of geheel-mount immunohistochemistry. Als u wilt analyseren diabetische retinopathie in zebrafish, moet een stap voor stap en gestandaardiseerde voorbereiding routine worden gebruikt door elke dissector.Het volgende voorbereiding-protocol biedt andere onderzoeksgroepen kunt gemakkelijk evalueren vasculaire veranderingen in de blootgestelde schepen van het volwassen zebrafish oog en als leidraad om vast te stellen van een geoptimaliseerde dissectie routine voor de zebravis netvlies.
Protocol
Alle procedures, met inbegrip van de stappen aan dierlijke onderwerpen gerelateerde, zijn goedgekeurd door de ethische commissie van dieren (Regierungspräsidium Karlsruhe) en volg de richtlijnen van de verzorging van de dieren van de Universiteit van Heidelberg.
1. bereiding van fixeer (4% PFA/PBS)
- Kleefpoeders vers bereiden elke dag om optimaal behoud van histologische weefsel integriteit.
- Los 0.2 g zuivere natriumhydroxide (NaOH) in 90 mL dubbel gedestilleerd water (ddH2van O) voortdurend roeren bij kamertemperatuur.
- 4 g paraformaldehyde (PFA) toevoegen en roer tot de oplossing volledig duidelijk voor minstens 5-10 min is depolymerization van macromoleculen verzekeren.
Let op: PFA is giftig, voorzichtig behandelen. - Los 0.84 g natriumfosfaat Natriumdiwaterstoffosfaat (NaH2PO4) in de oplossing en controle van pH op 7,2 via meting.
- Het volume met ddH2O tot 100 mL en filtreer de oplossing door filterpapier 3.
- Opslaan 4% PFA/PBS op ijs.
2. bereiding van de oplossing van de euthanasie
Opmerking: De volgende stappen werden gedaan met ABTL wild-type zebrafish stam op een algemene leeftijd van 6-8 mon.
- Ethyl 3-aminobenzoaat methaan sulfonaat, ook met de naam "tricaïne" of MS-222, in een concentratie van 0.31 mg/mL voor zebrafish euthanasie16gebruiken Gebruik 1 x ei, gebruikte water te verhogen zebrafish de embryo's daarvan, als oplosmiddel voor de oplossing van de euthanasie. In het algemeen de juiste verdoving diepte controleren voordat u gaat werken met ingetogen vis door het tonen van verlies van evenwicht en touch reactie verlies.
- Ter verwezenlijking van 1000 mL 10 x ei water, voeg deze zouten aan 1000 mL dubbel gedestilleerd water (ddH2van O) terwijl het voortdurend roeren in de volgende volgorde: 10 g NaCl, 0,3 g KCl, 0.4 g CaCl2 *6 H2O, 1,32 g MgSO4 *6 H2O.
3. fixatie van Zebrafish weefsel
- Pipetteer 6 mL 4% PFA/PBS oplossing per monster in de putten van zes-Wells-platen op voorhand.
- De volwassen zebrafish (eerder behouden op een standaard licht-daagse cyclus, bijvoorbeeld12 h: 12u) euthanaseren 2 h nadat verlichting in de ochtend, inschakelen door ze te plaatsen in de tricaïne oplossing en wachten totdat ze euthanasie hebben bereikt. Na de beëindiging van de operculaire beweging, kan die maximaal 10 minuten duren.
- Neem de vis uit de tricaïne euthanasie oplossing en leg ze op verse papieren handdoeken. De vis drogen en gebruik een scalpel te snijden van de hoofden achter de operculum (Zie figuur 2A). Breng de hoofden rechtstreeks in de klaargestoomd goed platen, die de vers bereide fixeerspray bevatten.
- Winkel de goed platen met de viskoppen bij 4 ° C's nachts gedurende ten minste 24 uur om te verzekeren het fixeer doordringt de diepere lagen van de retina.
Opmerking: Zebravis hoofden kunnen worden opgeslagen voor een maximum van 48 uur in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C voor de bereiding zonder relevante verlies van de sterkte van het signaal van de fluorescentie. Verhoogde latentie kan leiden tot verlies van weefsel integriteit en beeldkwaliteit verminderd, en dus moet worden vermeden.
4. voorbereiding van de zebravis Retinal therapieën
- Een petrischaal tot één derde vullen met verwarmde 2% agarose en wacht totdat de agar vast is. Afdekplaat de agar met 1 x PBS om een werkruimte te ontleden de ogen te maken.
Nota: Dit zal toestaan beide behoud van voorbereiding pincet en lage druk op het weefsel terwijl ontleden, verminderen de kans op schade aan de constructie. Alle verdere voorbereiding stappen moeten worden uitgevoerd in deze werkruimte met behulp van de rechte pincet #5 met fijne tips onder een ontleden Microscoop met extra epi-verlichting.- Gebruik tijdens het ontleden, vergroting tussen 4.0 x en 6.0 x wilt toestaan voor zowel overzicht en detail-diagnosticeren van het weefsel.
- Breng het vaste monster in de petrischaal en invoegen door het hoofd op het snijvlak geconstateerd met een pincet, een ander vastgemaakt samen-pincetten onder de oogbol op de orbitale holte. Langzaam opent de pincetten onder het oog en grip van de oogzenuw, dan zorgvuldig scheuren en loskoppelen van de ogen (figuur 2B).
Figuur 2: verwijdering van de volwassen zebrafish oog. Hoornvlies zijaanzicht met het oog nog steeds in de orbitale Holte en intact oogzenuw (A). Hoornvlies zijaanzicht met vrijstaande oog (B). Schematische voorstelling van het oog van de zebravis bij deze stap (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Verwijderen van een van de vier rectus en twee schuine extraocular spieren die zijn nog steeds aangesloten op het oog, evenals de residuele extraocular weefsel het oog verbinden met de orbitale Holte (Vergelijk Figuur 3 en Figuur 4).
- Dit bereiken door het belemmeren van het oog door een half gesloten pincetten en aangrijpend de structuur met de andere pincetten, zacht bestelen het met een ordinaten beweging. Aangezien de oogbol direct aangrijpend tot interne vaartuig breuk leidt, is deze techniek op de juiste wijze zacht voor het behoud van de therapieën.
Figuur 3: volwassen zebrafish oog met extraocular spieren in focus. Laterale weergave met gehechtheid van een extraocular spier aan de linker buitenste rand van de oogbeschadigingen en/of bol in focus (A). Zijaanzicht van de oogzenuw met extraocular spieren symmetrisch flankerend de oogzenuw (B). Schematische voorstelling van het oog van de zebravis bij deze stap (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Hiermee kunt u dat een 27G (0,4 x 19 mm) besteedbaar naald punctie van het hoornvlies (figuur 4C, rode pijl) op het buitenste bereik. Door deze opening Houd het hoornvlies met beide pincet en lichtjes scheur het open. Daarna zorgvuldig werken om een gecentreerde traan ongeveer de grootte van de desbetreffende leerling.
Figuur 4: volwassen zebrafish oog na verwijdering van alle extraocular spieren. Laterale weergave met de gewiste buitenste rand van het oculair globe zichtbaar (A).Zijaanzicht van de oogzenuw met oogzenuw in het midden. De licht-reflecterende sclera is niet die betrekking hebben op het hele gebied rond de zenuw (rode stippellijn) (B). Schematische voorstelling van het oog van de zebravis bij deze stap (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Oefen druk uit op het hoornvlies kant van de oogbeschadigingen en/of aardbol (bulbus oculi) aan de buitenste hoornvlies rand boven de iris. Dit zal maken van een kleine deuk en duw de lens naar de hoogte van het hoornvlies scheur. De pincet onder de lens te draaien en verwijderen (figuur 5A).
Figuur 5: volwassen zebrafish oog in het proces van lens verwijdering. Hoornvlies zijaanzicht met de lens geduwd door het hoornvlies scheur (A). Hoornvlies zijaanzicht met de lens naast de oogbeschadigingen en/of bol (B). Schematische voorstelling van het oog van de zebravis bij deze stap (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- De ogen ondersteboven aan de oogzenuw geconfronteerd met de onderzoeker. Merk op dat de sclera hoornvlies zijn verbonden en de vezelige tuniek van de oog-lamp vormen ter bescherming van het netvlies kop-vormig. (Figuur 6).
- Deze schelp, bestaande uit de cornea en sclera, heet ook "corneosclera" en reserveonderdelen uit het gebied rond de oogzenuw (figuur 4B, rode stippellijn). Invoegen van een naald op deze stopzetting eenmaal aan het maken van een opening tussen de sclera en het netvlies.
Figuur 6: Corneosclera bestaande uit sclera en hoornvlies, die wordt losgekoppeld van het resterende intraoculaire weefsel. Hoornvlies zijaanzicht tonen de voortzetting van het doorschijnende hoornvlies in de gepigmenteerde sclera (A). Laterale weergave gericht op het scleral deel van de corneosclera (B). Schematische voorstelling van de verwijderde corneosclera (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Deze access gebruikt met beide pincet, zorgvuldig rip de sclera axiaal in strepen te verhogen de opening rond de oogzenuw. Wees voorzichtig om de corneosclera intact te houden op de overgang naar de omtrek van het hoornvlies kant (Zie figuur 6A).
- Houd de sclera met een pincet en, door grijpen de oogzenuw met de andere en geheel weg te trekken, de corneosclera uit het oog te verwijderen en verwijderen (Figuur 6). Proberen te verbreken van alle verbindingen vóór het scheiden van de corneosclera en de resterende intraoculaire weefsel, als bijlage aan andere structuren een kritisch punt zullen; deze stap zal zorgen voor een beker-vormige structuur bestaande uit de uvea en netvlies met het netvlies therapieën (Figuur 7).
- Een breuk in de choroidal/RPE laag maken door een 27G naald zijwaarts naar de resterende cup terwijl het schrapen van het buitenoppervlak met de rand van de naald-tip. Gebruik de breuk als een toegangspunt om get a grip op de choroidal/RPE laag en rippen met beide pincet in strepen, maar de verbinding met de iris intact te houden.
- Daarna, stormloop één pincetten onder de iris en gaat rond in een circuit van buitenaf terwijl het creëren van spanning door te trekken op de beëindigde choroidal/RPE laag tot onthechting van de gecombineerde structuur.
Opmerking: De iris moet worden losgekoppeld, zodat het niet hinderen van de fluorescentie terwijl het visualiseren van de schepen (Figuur 8). Grijpen de iris direct om het te verwijderen kan leiden tot uitgebreide schip schade, vooral op de binnenste cirkel van optische (IOC), omdat de iris nog steeds met het omringende weefsel verbonden is. De choroidal laag en de retinale pigment epitheel (RPE) kunnen worden gescheiden en vaak behouden een verbinding met de iris, die voorziet in een eenvoudige secundaire verwijdering. - Als delen van de iris niet kunnen worden verwijderd, gebruik maken van een natuurlijke breekpunt die het volwassen zebrafish oog vertoont binnen de fotoreceptor laag (PL), in een soortgelijke wijze als stap 4.9, voor het verwijderen van de iris.
- Schrapen over de buitenkant van het resterende cup-vormige netvlies ertoe stopzettingen in de PL boven het breekpunt (figuur 11C, zwarte pijl). Gebruik de gemaakte machtiging voor het verwijderen van het bovenste gedeelte van de laag terwijl het mogelijk verband met de iris intact. Daarna lopen de pincet onder de iris en gaan rond in een circuit zoals gezegd om de gecombineerde structuur los te maken.
Opmerking: Een geduld moet uitoefenen als de hele stap 4.9 moeilijk kan zijn, maar deze zorg zal het bereiken van een beter vasculaire resultaat dan ronduit grijpen de iris aan de rand van de leerling of een opening te forceren door het vernietigen van de verbindingen met de choroidal/RPE of fotoreceptor laag zonder hun respectieve verwijdering. Na deze stap zal dus retinale vasculaire integriteit behouden blijft, maar leiden tot schade van de retinale buitenlagen.
- Daarna, stormloop één pincetten onder de iris en gaat rond in een circuit van buitenaf terwijl het creëren van spanning door te trekken op de beëindigde choroidal/RPE laag tot onthechting van de gecombineerde structuur.
Figuur 7: volwassen zebrafish oog na verwijdering van de corneosclera. Laterale weergave toont de resterende intraoculaire weefsel met intact iris en oogzenuw (A). Hoornvlies zijaanzicht met iris in beeld (B). Schematische voorstelling van het oog van de zebravis bij deze stap (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Gebruik een schaar microdissection voorjaar met de snijkant van een rechte 2.5 mm te snijden van de oogzenuw zo dicht mogelijk aan het netvlies; Dit zal zorgen voor een betere flat-montage van het weefsel.
Figuur 8: volwassen zebrafish oog na verwijdering van RPE/vaatvlies en afgekapte oogzenuw. Zijaanzicht van de oogzenuw toont het netvlies met een afgeknotte oogzenuw (A). Hoornvlies zijaanzicht met een directe blik op de meest binnenste laag van het netvlies (B). Schematische voorstelling van het oog van de zebravis bij deze stap (C).Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
5. montage van de retinale therapieën
- Wassen het ontleed netvlies twee keer gedurende 5 minuten in 1 x PBS. Gebruiken om te brengen het netvlies na afkappen van de oogzenuw, een spatel lab met een micro lepel einde om te voorkomen dat rechtstreeks te worden aangeraakt van het blootgestelde weefsel.
- Breng een druppel van PBS op een glasplaatje en breng het netvlies in de druppel. Een pincet gebruiken om te houden van het weefsel in plaats terwijl het snijden van de cup-vormige structuur met een scalpel een plat vier-petal of vijf-petal shape afhankelijk van de grootte van de retinale maken (Zie Figuur 9).
- Zuigen op de overgebleven PBS met een fijn stuk papier. Wees voorzichtig niet te raken van het netvlies.
- Jas het netvlies flat gemonteerde in montage media en dek met een dekglaasje aan. Worden niet maken schuim, attente zoals luchtbellen visualisatie van de retinale schepen kunnen verstoren.
- Minimaliseren van verkeer van het dekglaasje aan en verzegel de cover met duidelijke nagellak.
6. visualisatie van het netvlies therapieën
- Houd het tijdsverschil tussen voorbereiding en visualisatie zo kort mogelijk om afbeelding detail verlies door fluorescentie signaalverlies. Bewaar de mounts bereid retinale therapieën bij 4 ° C tot het verminderen van signaalverlies, als directe visualisatie kan niet worden bereikt, zoals aantasting van beeldkwaliteit langzaam zichtbaar 48u na bereiding wordt.
- Visualiseren van de retinale therapieën mounts via fluorescentie microscopie of laser scanning confocal microscopie.
Opmerking: Vaartuig visualisatie door fluorescentie microscopie werd bereikt bij 2.5 x vergroting met een belichtingstijd van 2.0 s, winst van 6.0 x en gamma instellingen van 1,67. Voor confocale microscopie, een Ar-laser (488 nm/20 mW) op 20% kracht werd gebruikt in combinatie met een TD 488/543/633 excitatie filter, een 20 x / 0.7 nb multi onderdompeling doelstelling met ddH2O als onderdompeling media en emissie filterinstellingen van 505-560 nm. Confocale afbeeldingen bestaan uit 4 x 4, 4 x 5 of 5 x 5 enkelvoud beelden gecombineerd door middel van een tegel-scan afhankelijk van de grootte van het netvlies.
7. hij delen van het netvlies van de zebravis
Opmerking: Voor hij delen van het netvlies zebrafish, bereiden het weefsel zoals beschreven in het protocol tot stap 4,5 en daarna gaat u rechtstreeks naar stap 7.1.
- Het wassen van de enucleated ogen (na stap 4.5) twee keer gedurende 5 minuten in 1 x PBS. Daarna Pipetteer het weefsel in 70% ethanol (EtOH). Op dit punt kunnen bereid ogen worden achtergelaten bij 4 ° C tot paraffine insluiten.
- Het weefsel van de volgende manier aan het uitdrogen alvorens het insluiten van paraffine wassen: 2 x 15 min in 80% ethanol, 2 x 15 min in 90% ethanol, 3 x 15 min in 96% ethanol, 3 x 15 min in 99% ethanol, 2 x 15 min in acetone/99% ethanol (1:2), 3 x 15 min in aceton. Houd het weefsel paraffine bij 62 ° C's nachts.
- Opwarmen van verse paraffine tot 62 ° C en giet het in mallen te embedding. Overdracht van het weefsel in de mallen rechtstreeks en, in een snel tempo, de correcte oriëntatie van de controle van de ogen voor de gewenste sectie. Daarna een insluiten cassette van toepassing op de schimmel en de cover met extra verwarmd paraffine.
- Verwijder de insluiten mallen na paraffineblokken hebben afgekoeld. Snijd de paraffineblokken op een microtoom in 10 µm secties en drijven ze uit op 45 ° C waterbad lang genoeg voor hen om volledig plat op het water.
- Vangen van de secties op een glasplaatje en afvoer verticaal te verwijderen overtollige water voordat ze 's nachts drogen in een oven bij 45 ° C.
- Proces in de secties verder met het volgende schema aan deparaffinize en kleuring: 4 x 1 min in xylol, 1 x 1 min in 99% ethanol, 1 x 1 min in 96% ethanol, 1 x 1 min in 80% ethanol, 1 x 1 min in 70% ethanol, 1 x 1 min in ddH2O, 1 x 4 min in Mayers Haematoxyline , 1 x 10 min in ddH2O, 1x2min in 0,5% eosine, 1 x 30 s in ddH2O, 1 x 30 s in 80% ethanol, 2 x 30 s in 96% ethanol, 3 x 1 min in 99% ethanol, en 1 x 1 min in xylol.
- Neem het glasplaatje uit de xylol en snel dekken het weefsel met de montage van de media. Vermijd om te laten het weefsel volledig uitdrogen, vervolgens een dekglaasje aan plaats op bovenkant en verzegel het gekleurd weefsel.
Representative Results
Hier tonen we twee typische morfologische voorbeelden van de retinale therapieën in volwassen tg(fli:EGFP) zebrafish: eens gevisualiseerd met een fluorescentie Microscoop (figuur 9A) en een keer met een confocale laser scanning microscoop (figuur 9B). De geopenbaarde retinale structuur bevat een zeer georganiseerd patroon. Sterke autofluorescence wordt gezien in het netvlies van de zebravis, wanneer gevisualiseerd met een fluorescentie Microscoop. Dus, is een visualisatie van alleen de vasculaire laag via een confocal scan geadviseerd om achtergrond fluorescentie verminderen en contrast te verhogen. Voor snellere foto verwerving of situaties waar kwalitatieve gegevens volstaan, is de fluorescentie Microscoop een aantrekkelijk alternatief.
Figuur 9: representatieve foto's van volwassen tg(fli:EGFP) zebrafish retinale therapieën. Twee typische voorbeelden van de morfologische van de retinale therapieën worden weergegeven: de centrale optic slagader verspreidt in 5-7 belangrijkste vaartuigen, die vervolgens tak in een opeenvolging van arcades. Alle verdere vaartuigen afwateren in de ze ader (CV), beperking van het buitenste deel van elk bloemblad. Visualisatie via fluorescentie microscopie op 2.5 x vergroting (A). Visualisatie van het netvlies therapieën door confocale laser scanning microscopie via een gecombineerde 5 x 5 één afbeelding tegel scan (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De optische slagader doordringt het netvlies aan het hoofd van de oogzenuw en in de meeste monsters, verspreidt zich in 5-7 belangrijkste vaartuigen (figuur 10A). De belangrijkste vaartuigen vervolgens tak in een opeenvolging van arcades en sluit aan op de binnenste optic cirkel (IOC), ook wel genoemd de ze ader (CV), rondom de optische schijf in de periferie van het platte gemonteerde netvlies (Zie Figuur 10). Het IOC is het veneuze vaartuig die het riool van de arteriële bloed aan de binnenrand van de oogbeschadigingen en/of bol (bulbus oculi). De zebravis retinale therapieën toont ook gebieden van vasculaire hoogactieve met takken van de haarvaten en angiogenic kiemen (Figuur 10 c). Deze vasculaire activiteit is voornamelijk gelegen in in de omgeving van nabijheid van het IOC. Het is belangrijk op te merken dat het dezelfde oog beide hoge en lage vasculaire activiteiten in verschillende regio's van het netvlies kan aantonen (Zie Figuur 10 en Figuur 10 c). In het algemeen, toont het netvlies therapieën van de zebravis meer avasculaire ruimte en minder haarvaten tussen de hoofdtakken als in vergelijking met, bijvoorbeeld, het netvlies van muizen17. Beide ogen van elk monster moeten worden geanalyseerd omdat de therapieën tussen variëren en enkelvoud inspectie tot vertekening leiden kan.
Figuur 10: gebieden van volwassen tg(fli:EGFP) zebrafish retinale therapieën visualisatie uitvergroot. De optische slagader vertakking naar belangrijkste vaartuigen (A). Netvlies haarvaten in een gebied met lage vasculaire activiteit aansluiten op de optische kring (IOC) aan de onderkant van het beeld (B). Netvlies haarvaten in een gebied van vasculaire hoogactieve aansluiten op de IOC- (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Een zeer behouden architectuur van neuronale lagen is al aanwezig in zebrafish van ongeveer 72 h post bevruchting (hpf) vanaf18. Het netvlies volwassen zebrafish toont de volgende lagen van binnen naar buiten (Figuur 11): ganglion cellaag (GCL) Meervormige binnenlaag (IPL), nucleaire binnenlaag (l), Meervormige buitenlaag (OPL), nucleaire buitenlaag (ONL), fotoreceptor laag (PL), en de retinale pigment epitheel (RPE). De schatting van vasculaire parameters van retinale therapieën visualisatie wordt weergegeven in Figuur 12. De innerlijke retinale therapieën ligt op de ganglion cellaag (GCL) (figuur 13B, witte doos) terwijl de choroidal haarvaten zou gepaard gaan met het retinale pigment epitheel (RPE).
Figuur 11: hij kleuring van het oog van de volwassen zebrafish. Transversale overzicht van het hele oog na verwijdering van de lens (A). Netvlies lagen van de volwassen zebrafish eye19 (B). Indicatie (zwarte pijl) van de natuurlijke breekpunt in de PL (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Modellen van hypoxie-geïnduceerde retinale neoangiogenesis tonen verhoogde aantallen vertakkende punten, angiogenic spruiten, vasculaire oppervlakte en intercapillary afstand in zebrafish20daalde. Deze bevindingen ondersteunen de idee dat de zebravis gevoelig voor diabetische microvasculaire complicaties21, is aangezien de belangrijkste bevindingen van later diabetische retinopathie omvatten hypoxie-gemedieerde neoangiogenesis, die sterk is met VEGF expressie verbonden. Hyperglycemie-geïnduceerde veranderingen in de zebravis retina leiden tot verhoogde dikte van de schepen maar handhaven de algemene patronen22. Onderdompeling in glucose oplossingen voor 30 dagen afwisselend vermindert ook de dikte van de IPL en l23. De directe invloed van glucose metabolieten in de zebravis als metabole voorstanders van vasculopathy was ook al te zien. Extra vasculaire hyperbranching werd waargenomen in de kofferbak therapieën van zebravis embryo's na incubatie met methylglyoxal24. Op dit moment bestaat er geen dierlijke model waarin alle belangrijke criteria van diabetische retinopathie. Vroege wijzigingen worden vaak gevonden, maar de progressie naar proliferatieve diabetische retinopathie ontbreekt25. De zebravis valt ook in deze definitie, zoals we hebben alleen hypoxie-gemedieerde neoangiogenesis of hyperglykemie-geïnduceerde veranderingen gezien tot nu toe. De huidige bevindingen ondersteunen het idee dat de zebravis gevoelig voor hyperglycemie-gemedieerde vasculaire veranderingen is en als een dierlijk model kan potentieel Toon een progressie naar proliferatieve diabetische retinopathie. Afhankelijk van de sterkte en de blootstelling aan het effect van hyperglycemie-gemedieerde, kon het juiste experimentele model leiden tot ischemie in bepaalde gebieden van het netvlies zebravis en promoten van neoangiogenesis als de belangrijkste criteria van proliferatieve diabetische retinopathie. Echter zoals de zebravis een relatief nieuwe speler op het gebied is van modellering op lange termijn microvasculaire pathologieën, zal aankomende diabetes modellen in zebrafish verdere informatie verstrekken en verduidelijken van het belang ervan met betrekking tot andere modellen en hun pathologieën. Bijvoorbeeld, kan een in-cross van tg(gata1a:DsRed) zebrafish met rood gemerkte erytrocyten in de lijn van de tg(fli:EGFP) worden gebruikt om te visualiseren gelijktijdig potentiële intraoculaire bloedingen in de toekomst zebrafish modellen tonen van microaneurysms als voorspeller van progressie naar PDR.
Aangezien de retinale therapieën vordert in een opeenvolging van arcades, evaluatie van de intervascular afstand, vertakkende punten aantal en de totale oppervlakte van de vasculaire zijn gerelateerd aan de afstand van de centrale optic slagader. Om te voorkomen dat vooringenomenheid in de beoordeelde vasculaire parameters, is een punt van oriëntatie vereist. Het IOC is een dergelijke structuur en is zeer relevant aangezien vasculaire gebieden in de directe nabijheid van de ruimtelijke liggen. Voor de consistente beoordeling, moet de Retinale scannen worden onderverdeeld in meerdere secties van de rechthoekige afbeelding met een consistente afstand tot het IOC. Het hele netvlies moet worden geanalyseerd en beelden numeriek symmetrisch verdeeld. De zebravis netvlies toont gebieden met hoge en lage capillaire dichtheid en een ongelijke verdeling van de secties van de afbeelding kan leiden tot extra bias.
Figuur 12: voorbeeld van een presentatie van vasculaire parameters als uitlezing van retinale therapieën visualisatie. Meting van intervascular afstand (rode dubbele pijl) in de buurt van de innerlijke optiek cirkel (IOC) (A). Drie vertakkende punten (rode cirkels) nabij het IOC (B). Visualisatie van zebravis retinale therapieën met een grotere ruimte (rode vak) toont een gekiemde vat (C). De diameter van het vaartuig gemeten over een bepaalde afstand (witte dubbele pijl) van de centrale slagader (wit kruis) (D). De dichtheid van de vaartuig is het percentage van de retinale bezet door bedekken van vaartuigen (diagonale rode lijnen) (E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Voor het meten van de intervascular afstand, moet men een zekere afstand ingesteld op het IOC als standaard (figuur 12A, witte dubbele pijl) en tekenen van een denkbeeldige horizontale lijn (figuur 12A, horizontale witte lijn) parallel aan het IOC. De afstand tussen de schepen op deze regel bij elkaar opgeteld en rekenkundig gemiddelde gelijk is aan de intervascular afstand. Vertakkende punten worden binnen elke afbeelding geteld wanneer een vaartuig wordt gesplitst en meer dan één vasculaire lumen voortzetten vanaf het punt van oorsprong. Dit omvat ook horizontale verbindingen tussen haarvaten. Het is belangrijk om te blijven consistent met analyse en beslissen welke vertakkende punten te tellen en het houden van deze regels gedurende het hele experiment om onnodige variatie. Vasculaire kiemen, is zoals aangetoond in figuur 12C, een andere parameter die in elk beeld voor de evaluatie van de invloed op het netvlies therapieën kan worden geteld. Angiogenic spruiten Volg niet de arcade-achtige erfopvolging tussen centrale slagader en IOC en focus in de buurt van de buitenste delen van het netvlies. Om te beoordelen van bepaalde diameters schip, een punt van oriëntatie is altijd nodig waaruit een bepaalde afstand markeert de meting ter plaatse. De centrale slagader oorsprong binnen het netvlies biedt zo'n leidraad voor de hoofdstam vaartuigen (figuur 12D, witte kruis). Het gebied bezet door schepen (figuur 12E, diagonale rode lijnen) als een percentage van de gehele netvlies is de vasculaire dichtheid en niet indirect correleert met de avasculaire gebied.
Een volledig confocal aftasten van één monster moet bestaan uit meerdere high-detail foto's om visualisatie van kleine capillaire hypersprouting. Om te optimaliseren van tijd en middelen besteed aan deze stap, een geautomatiseerde tilling procedure dient met een diepte van algemene scan voor elke tegel. Ongelijke montage van het netvlies kan de tijd om te scannen de therapieën met een confocal microscoop sterk toenemen. In een optimale aanpak die men zou willen alleen scannen de vasculaire laag (figuur 13B, witte vakje), maar een gedeeltelijke opname van de GCL is vaak noodzakelijk.Een overtollige lengte van de oogzenuw verlaten na afkappen, evenals de bezuinigingen op het bereiken van de flat-mount wordt te kort is, kan leiden tot ongelijke montage.
Figuur 13: vergelijking van hij kleuring en autofluorescence in de volwassen zebrafish retina. Netvlies therapieën in focus boven de GCL (A). Netvlies therapieën (witte vak) groene tonen een EGFP signaal en netvlies lagen vertonen sterke autofluorescence (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Zoals de juiste voorbereiding van de zebravis retinale therapieën moet voorafgaande opleiding, de grootte van een kleine steekproef met ongetrainde dissectors en sterk wisselende voorbereiding resultaten zijn een belangrijkste beperking van de techniek. Terwijl de voorbereiding van tg(fli:EGFP) zebrafish ogen snel inzicht in de status van de therapieën geeft, de techniek nog steeds maakt gebruik van ongeveer 20 min van werktijd per netvlies voor een ervaren onderzoeker. Al deze stappen van de voorbereiding voor de retinale therapieën moeten worden uitgevoerd onder een ontleden Microscoop en dissectors moeten blijven geconcentreerd de hele tijd als een zorgeloze stap potentieel vaartuig breuk kan veroorzaken. De dissector moet regelmatig de praktijk zoals langdurige afwezigheid van voorbereiding een dissector de waarschijnlijkheid vermindert van het handhaven van de integriteit van het schip.
Bovendien is extra uitlezing via immunohistochemistry (IHC) nog steeds beperkt, slechts een klein aantal antilichamen gevalideerd op menselijke en knaagdier weefsel werken met zebravissen. Onderzoekers kochten IHC wordt geadviseerd om te zoeken naar zebrafish-specifieke antilichamen, vooral bij het werken met nieuwe doelstellingen. Anderzijds is het raadzaam extra zebrafish verslaggever lijnen die nuttig zijn te onderzoeken van de cellen buiten de therapieën in de ogen te gebruiken. Deze strategie is echter tijdrovend, als het duurt een paar maanden voor het genereren van volwassen zebrafish lijnen waaraan meerdere transgene verslaggevers.
De zebravis vormt echter een unieke waaier van voordelen. Ze zijn relatief klein en gemakkelijk reproduceren. Ze kunnen groeien tot volwassen stadia snel en de embryo's zijn optimaal voor drug screening. Het veld groeit gemakkelijk en meer literatuur is steeds toegankelijk. Met de mogelijkheid om het genereren van gene uitsparingen op een snelle snelheid en een overvloed aan transgenic fluorescentie verslaggever lijnen, is de keuze voor zebrafish alleen gefixeerd door de gekozen onderzoeksvraag.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Katrin Bennewitz en Marlene Hausner voor zebrafish veehouderij en technische bijstand. De auteurs erkennen de steun van de Core faciliteit Live cel Imaging Mannheim op het centrum voor medische biologie en medische technologie Mannheim (DFG-INST. 91027/9-1). Deze studie werd ondersteund door Deutsche Forschungsgemeinschaft (International Research Training groep 1874/1 "DIAMICOM", project SP5 en SP9; Collaboratief onderzoek centrum SFB1118, project B1 en Collaborative Research Centrum SFB/TR23 project Z5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Roth | 6771.3 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| CaCl2*6H20 | Roth | 5239.2 | |
| MgSO4*7H20 | Merck | 1.05886.0500 | |
| Paraformaldehyd | Roth | 0335.3 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Roth | 2370.1 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| PBS | Roth | 9143.1 | |
| Agarose | Roth | 2267.3 | |
| Fluoromount-G | Thermo-Fischer | 00-4958-02 | |
| Petri dish | Greiner Bio one | 633180 | |
| Six-well plate | StarLab | CC7682-7506 | |
| Needle | MSG Praxisbedarf | BD 300900 | |
| Micro Tweezer | World Precision Instruments | 14095 | |
| Microdissection Scissor | World Precision Instruments | 501778 | |
| Glass slide | Carl Roth | H872.1 | |
| Coverslip 22mmx22mm | neoLab | 103512222 | |
| Scalpel | MSG Praxisbedarf | FEA111 | |
| Epi-Illumination | Leica | 10446389 | |
| Fluorescence stereomicroscope MZ10 F | Leica | NA | |
| Confocal laser-scanning microscope SP5 DS | Leica | NA | |
| Stereomicroscope M80 | Leica | NA | |
| Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype | NA | NA | see Reference 15 |
| Mayer’s hematoxylin | Dr. K. Hollborn & Söhne | 0088663 | |
| 0.5% eosin | Dr. K. Hollborn & Söhne | NA | |
| 99,9% ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Paraffin | Merck | 1,071,501,000 | |
| Xylol | Roth | 4436.2 | |
| Acetone | Emsure | 606-001-00-8 | |
| Microtome RM 2165 | Leica | NA |
References
- WHO. Global report on diabetes. , 88 (2016).
- Lim, A. Diabetic nephropathy - complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
- Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
- Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
- Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
- Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
- Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
- Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
- Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
- Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
- Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
- Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
- Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
- Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
- Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).
