Summary
ここでは、長期血管病態促進と構造変化にリンクの設定で高速読み出しとして大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の簡単な分析を可能にする方法のプロトコルについて述べる。
Abstract
糖尿病網膜症は、中年の成人の失明の主要原因です。世界的な糖尿病の罹患率の増加になる糖尿病の血管合併症の予防次の十年の重要な研究分野の一つ。視力低下のリスクがある患者数の増加を管理するには、特殊な目標とされた療法と新規治療薬の開発が必要。ゼブラフィッシュは増加する多因子疾患の代謝プロセスをモデル化するための関連性と発達障害研究の質問のための動物モデルを確立です。最適な可視化とスループットの高い薬剤のスクリーニングのアプローチ、興味の遺伝子をノックアウトする強力な機能を組み合わせるの種の利点を許可します。ここでは、長期的な血管病態促進や血管の損傷にリンクの設定で高速読み出しとして大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の簡単な分析を可能にするプロトコルについて述べる。これは、ゼブラフィッシュの網膜の解剖や組織全体でマウントを介して実現されます。露出した血管の可視化し、大人の網膜血管系の表現緑 EGFP 記者の共焦点顕微鏡を介して達成されます。組織の正しい処理は、良い結果になり、内部の容器破損不変の血管構造の可視化を確保に します。メソッドは、網膜血管の促進と同様、容器のアーキテクチャの変化にリンクのゼブラフィッシュ モデルで利用できます。
Introduction
糖尿病は、機能不全のインスリン分泌やインスリンを分泌する組織の不十分な応答から生じる高血糖によって定義される代謝性疾患です。WHO の推計に 4 億 2200 万大人 2014年1の糖尿病と住んでいた、世界中の糖尿病の有病率は糖尿病で重要な研究分野の一つを作る 20352日まで人口の 8-10% に増加すると予想、次の十年。慢性的な高血糖との生活は、糖尿病網膜症、腎症、多発性神経障害などの長期の微小血管合併症に します。管理とこれらの合併症の予防が困難である場合確かに、糖尿病透析2につながる、末期腎臓病 (ESRD) の最も頻繁な原因になっているし、糖尿病は中年の大人3の失明の主要な原因。
糖尿病性の網膜の微小血管障害の初期の原因が特定のリスク要因 (例えば、高血圧、高脂血症) と同様、慢性的な高血糖、代謝の変化、血管内皮、周皮細胞脱落につながると無細胞性血管袖になる毛細血管回帰。結果網膜虚血、血管新生、増殖糖尿病網膜症 (ラオス)4の開発を促進血管透過性の亢進の原因です。糖尿病網膜症は、糖尿病網膜症の視力を脅かす、白い欧州コホート研究 UKADS 研究5の 12% で確かめた中一般に、糖尿病患者の 37% で検出されました。現在の治療のみさらに合併症を防ぐことができ、既に損傷を完全に復元することができません。による汎網膜光凝固、血糖コントロールに加えて増殖糖尿病網膜症 (ラオス) の標準的な治療法ですが、同様に隣接する健康な組織に影響を与えます。抗 VEGF 介入がレーザー治療6、7、しかし、最終的には、特殊な目標とされた療法に代わるものとして有望な結果を示すし、視力低下のリスクがある患者の数の増加を管理する新しい薬が必要があります。
糖尿病網膜症の確立された動物研究モデルは人間の病態生理学のあらゆる側面を共有しません。科学的な研究の質問の特定の要件に対応する正しい種の活用は、実験のセットアップの最も相当な部品の一つです。ゼブラフィッシュ胚 (動脈分布) 発達障害研究ですでに広く使用されて morpholinos や CRISPR/Cas9 テクニック8を介して特定の遺伝子をノックダウンまたはノックアウトする最適な実用的な背景を提供しています。これらのメソッドは、病気の進行と感受性9の特定のメカニズムに洞察力を生成する大規模なゲノムワイド関連研究 (GWAS) によって識別された遺伝子を調査するゼブラフィッシュで容易に利用することができます。短い世代時間、大量の子孫、簡単と低コスト処理、および成長の分析サポートは、特に代謝性疾患をモデル化するための大きな可能性を与え、ゼブラフィッシュ モデルの妥当性を増加しています。ゼブラフィッシュの生物学的メカニズムの保全は、薬理学的治療開発のための基礎として示されています。たとえば、抗糖尿病薬メトホルミンとコレステロール値下げるシンバスタチンのキャンプ/デキサメタゾンによる高い PEPCK 式と高コレステロール食餌による高コレステロール血症の10モデルの条件を「治療」に示されている,11,12. この前進される代謝メカニズムを包括的な洞察はゼブラフィッシュの糖尿病モデル、実験を通しての数の増加によってさらにサポートされているよう: グルコース溶液中のインキュベーションを交互ストレプトゾトシン アブレーション ベータ細胞のプロドラッグ メトロニダゾール、pdx1 遺伝子ノックダウンやノックアウト、だけでなく、骨格筋の増加するインシュリン抵抗のモデルを介したイネ糖尿病を使用してニトロを介するベータ細胞アブレーション12しますこれらはすでに種の上記の仕様のプロトコルを確立し、効率的にすべてのサンプルの多数のゲノムを操作する能力を示すメカニズムを勉強のゼブラフィッシュの利点。薬理学的介入のためのスクリーンに能力だけでなく、複雑な病気プロセスを運転します。
基本的なゼブラフィッシュ眼の解剖学 (図 1) の一般的な理解は、網膜血管障害のモデルとしてのゼブラフィッシュを利用するために切開に必要です。ゼブラフィッシュ眼強膜13でグローブの外側に六つの外眼筋、4 直筋, と 2 つの斜筋を挿入するには。角膜は、レンズを覆う透明の組織であり目の外殻を形成する強膜に直接続きます。強膜非透過的で、部分的に光反射面、色素が強く。レンズ自体は、人間の同等よりもっとボール形です。酸素を提供する網膜血管内側の神経節細胞層と密接に関連ですが、網膜のネットワークを形成していない網膜は神経細胞の 3 つの核層で構成されています。脈絡膜血管は対照的に、強膜と網膜の間にある、網膜色素上皮 (RPE) に関連付けられます。この毛細血管は、14の網膜の外側の部分に酸素を供給します。
図 1: アダルト ゼブラフィッシュ眼の模式。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Tg(fli:EGFP) 遺伝子導入ゼブラフィッシュ行15の利用による網膜血管系の簡単な可視化を実現できます。血管の内皮細胞に fli プロモーターの制御下で表明した緑色蛍光タンパク質は、レーザー後の手順で顕微鏡による可視化のための基礎です。これは、ゼブラフィッシュの網膜の解剖や組織全体でマウントを介して実現されます。このトランスジェニック モデルは、血管内のラベル付けやホール マウント免疫組織染色の任意のアプリケーションがなくても高速血管の読み出しを提供します。ゼブラフィッシュにおける糖尿病網膜症を分析するには、ステップ バイ ステップと標準化された準備ルーチンはすべての切開で使用ください。次の準備のプロトコルは、他の研究グループの簡単に成人ゼブラフィッシュ眼の露出した血管での血管の変化を評価し、ゼブラフィッシュの網膜の最適化された解剖ルーチンを確立するためのガイダンスを提供オプションを提供します。
Protocol
すべてのプロシージャ、手順など動物の被験者に関連、動物倫理委員会 (Regierungspräsidium カールスルーエ) によって承認されている、ハイデルベルク大学のアニマル ・ ケアのガイドラインに従ってください。
1. 固定液の作製 (4 %pfa/PBS)
- 組織学的組織の整合性の最適な保全を確保するため定着性の新鮮な毎日を準備します。
- 90 mL 二重蒸留水 (ddH2O) で常に室温で攪拌しながら水酸化ナトリウム (NaOH) の 0.2 g を溶かします。
- 4 g パラホルムアルデヒド (PFA) を追加し、ソリューションは高分子の重合を保証するために、少なくとも 5-10 分の完全に明確になるまで混ぜます。
注意: PFA は毒性、取り扱い注意。 - ソリューションのリン酸二水素ナトリウム (NaH2PO4) の 0.84 g を溶解し、測定経由で 7.2 に pH を制御します。
- DdH2O と 100 mL にボリュームを調整し、グレード 3 フィルター ペーパーを通してソリューションをフィルター処理します。
- ストア 4 %pfa/PBS 氷の上。
2. 安楽死溶液の調製
注: 次の手順は、6-8 月の一般的な年齢で ABTL ゼブラフィッシュ野生型株で行われました。
- エチル 3-アミノ安息香酸メタン スルホン酸、また名前付き"tricaine"または MS-222、ゼブラフィッシュ安楽死160.31 mg/mL の濃度を使用します。安楽死ソリューション用の溶剤としてゼブラフィッシュ胚を高めるために使用される 1 の x 卵水を利用します。一般的に、平衡の損失を示すことによって鎮静魚で作業する前に正しい麻酔深度を制御し、反応損失をタップします。
- 卵水 x 10 の 1,000 mL を達成するために 1,000 mL 二重蒸留水 (ddH2O) へのこれらの塩を常に次の順序で攪拌しながら追加: 10 g、食塩 0.3 g、塩化カリウム 0.4 g CaCl2 *6 H2O、1.32 g MgSO4 *6 H2o.
3. ゼブラフィッシュ ティッシュの固定
- 6 ウェルの井戸にサンプルあたり 6 mL 4 %pfa/PBS 溶液を事前に転送します。
- (前回の標準光日サイクルで、例えば、12 h: 12 h 維持されます) 大人のゼブラフィッシュを安楽死させる 2 h 後、tricaine ソリューションにそれらを置くことによって、朝に点灯し、安楽死に達するまで待ちます。次の弁蓋部の動きの停止、最大 10 分かかることができます。
- Tricaine 安楽死ソリューション外の魚をとり、新鮮なペーパー タオルの上に置きます。魚を乾燥させ、蓋の後ろ頭をカットするメスを使用して (図 2 a参照)。作りたての定着剤が含まれて準備中のウェル プレートに直接ヘッドを転送します。
- 4 ° C で魚の頭を含むウェル プレート固定を確保するために、少なくとも 24 時間一晩ストア網膜深層に浸透します。
注: 1 蛍光信号強度の関連する損失することがなく準備する前に 4 ° C、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 48 h の最大値のゼブラフィッシュ ヘッドを格納できます。待ち時間の増加は組織の完全性の損失につながることができます画像品質を削減し、ので避けてください。
4. ゼブラフィッシュ網膜血管系の準備
- 温水 2% の agarose のペトリ皿の三番目までを記入し、寒天がしっかりするまで待ちます。目を解剖するためのワークスペースを作成する 1x PBS で寒天プレートをカバーします。
注: これにより、準備ピンセットや低圧の両方の保全組織、解剖しながら構造上の損傷の可能性を減らすこと。追加エピ照明と解剖顕微鏡の下で罰金のヒント #5 ストレート鉗子を利用したこのワークスペースですべてのそれ以上の準備の手順を行わなければなりません。- 解離性、概要および組織の評価の詳細を指向できるように倍率 6.0 x 4.0 x との間を使用します。
- シャーレに固定サンプルを転送し、カット面 1 つピンセットで頭を保持することで眼窩で眼球下別固定一緒にピンセットを挿入します。ゆっくりと眼の下ピンセットと、視神経をグリップし、慎重に涙開き目 (図 2 b) をデタッチします。
図 2: アダルト ゼブラフィッシュ眼の削除します。眼窩とそのまま視神経(A)でまだ目で角膜の側面図です。戸建目(B)で角膜の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 4 つの直筋と目だけでなく、眼窩に目を接続する残留の眼組織に接続されている 2 つの斜めの外眼筋のいずれかを削除 (図 3および図 4を比較)。
- 半分閉じた状態のピンセットで目を押してこれを達成するため、他のピンセットの構造を掴んで、そっとそれをリッピングとは正反対の動きで。内部容器破損につながる直接眼球を握り、のでこの手法は血管系を維持するために適切に優しいです。
図 3: フォーカスの外眼筋と大人ゼブラフィッシュ目。外眼筋のフォーカス(A)眼のグローブの左の外側の縁に添付ファイル付きの側面図。視神経(B)を左右対称に並ぶ外眼筋と視神経の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 27 G (0.4 × 19 mm) の使い捨て針を使用して、外側の範囲で角膜 (図 4、赤い矢印) を穿刺します。この開口部を通して角膜を持つ両方のピンセットと少しそれを開いて涙します。その後慎重に中央揃えを作成する作業は、それぞれの瞳孔のサイズ約を引き裂きます。
図 4: すべての外眼筋の除去後大人ゼブラフィッシュ眼。眼のクリアの外側の縁と外側のビューは、表示されている(A)グローブします。途中で視神経と視神経の側面図です。光反射強膜は神経 (赤い破線) まわりの全区域をカバーしていない(B)。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 虹彩の上外側の角膜縁で眼の世界 (球輪) の角膜側の圧力を適用されます。これは小さな凹みを作成し、角膜の涙の高さにレンズをプッシュします。レンズの下でピンセットを実行し、(図 5 a) を削除します。
図 5: レンズの取り外しの過程において大人ゼブラフィッシュ目。レンズと角膜のサイドビューは、角膜の涙(A)を介してプッシュ。(B)眼のグローブの横にあるレンズで角膜の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 研究者が直面している視神経逆さまに目を向けます。強膜、角膜が接続されているし、カップ状網膜を保護するために目の電球の繊維状のチュニックの形に注意してください。(図 6)。
- このシェルは、角膜と強膜、成ると視神経 (図 4 b、赤い破線) 周辺を"corneosclera"とスペアが呼び出されます。この中止は、強膜と網膜の間の開口部を作ります一度に針を挿入します。
図 6: 強膜、角膜は、残りの眼内組織から切断で構成される Corneosclera です。角膜側表示半透明の角膜の色素性強膜(A)への継続。側面図は、corneosclera (B)の強膜の一部に焦点を当てた。削除された corneosclera (C)の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- このアクセスを使用すると、両方のピンセットで、慎重に強膜軸にリッピング視神経乳頭周囲の開口部を大きくストライプ。角膜側周囲への移行で、corneosclera をそのまま維持する注意してください (図 6A参照)。
- 1 つピンセットと、他の視神経を掴んで強膜を保持と引き離し、完全目から、corneosclera を削除し、破棄 (図 6)。他の構造への愛着は重要なポイントになりますので、corneosclera、残りの眼内組織を分離する前にすべての接続を断絶しようこの手順はブドウ膜と網膜血管 (図 7) を含む網膜から成るカップ状の構造を提供します。
- 残りのカップに 27 G の針横を押し針の先端の縁と外側の表面を削りながら脈絡膜・網膜色素上皮層の破裂を作成します。アクセス ポイントとして脈絡膜・網膜色素上皮層のグリップを得るストライプに、両方のピンセットでそれをリッピング、アイリスへの接続をそのままに破壊を使用します。
- その後、虹彩下 1 つピンセットを実行し、複合構造の剥離を達成するために廃止された脈絡膜・網膜色素上皮層で引いてテンションを作成しながら外から回路に回る。
注: アイリス外す必要があります、(図 8 b) 血管を可視化しながら蛍光を妨げないように。虹彩が周囲の組織にまだ接続されているので、広範な容器損傷、特に内側の光円 (IOC) につながることができます直接それを削除アイリスをつかみます。脈絡膜層と網膜色素上皮 (RPE) 分けることができるし、アイリス、セカンダリ取り出しやすくするためことができますへの接続を保つことがよく。 - アイリスの部分は削除できません、虹彩を削除する手順、4.9 に同様の方法で大人ゼブラフィッシュ眼の視細胞層 (PL)、内部展示自然な限界点を利用します。
- 破断点 (図 11、黒い矢印) 上記 PL の廃止を誘導するために残りのカップ形網膜の外側を擦りなさい。虹彩への可能な接続をそのままに保ちながら層の上の部分を削除するのにには、作成したアクセスを使用します。その後、虹彩下ピンセットを実行し、複合構造をデタッチする前に述べたように、回路の周りに行きます。
: 1 つべきである注意忍耐 4.9 の全体の手順は難しい、することができますが、このケアは素直瞳孔縁の虹彩をつかんでや脈絡膜/RPE への接続を破壊することによって強制的に開口部よりもより良い血管結果を達成するか視細胞層、それぞれ除去なし。この手順を次従って網膜血管整合性を維持が外側の網膜の層の損傷に導きます。
- その後、虹彩下 1 つピンセットを実行し、複合構造の剥離を達成するために廃止された脈絡膜・網膜色素上皮層で引いてテンションを作成しながら外から回路に回る。
図 7: corneosclera の除去後大人ゼブラフィッシュ眼。側面ビューには、そのままアイリスと視神経(A)と残りの眼内組織が表示されます。フォーカス(B)での虹彩と角膜の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 視神経、網膜にできるだけ近くをカットするのに直線 2.5 mm 刃付けレーザーマイクロダイ セクション春シザーを使用します。これは、組織の良いフラット マウント用となります。
図 8: 切り捨てられた視神経と網膜色素上皮・脈絡膜の除去後大人ゼブラフィッシュ目。視神経のサイドビューは、 (A)の切り捨てられた視神経と網膜を示しています。(B)網膜の最も内側の層の上に直接見てと角膜の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。
5. 網膜血管系の実装
- 1x PBS で 5 分間 2 回切り裂かれた網膜を洗います。網膜を視神経の切り捨て後、転送するには、露出した組織の直接処理を避けるためにマイクロ スプーンの端ラボへらを利用します。
- スライド ガラスに PBS のドロップを配置し、液滴に網膜を転送します。場所で網膜のサイズに応じて 4 枚の花びらや 5 花びらフラット形状を作成するメスのカップ状の構造を削減しながら、組織を維持するピンセットを使用して (図 9を参照)。
- 紙の細かい部分で残った PBS を吸います。網膜に触れないように注意してください。
- メディアをマウントし、coverslip でカバー フラット マウント網膜をコートします。空気の泡は、網膜血管の可視化を歪めることができるフォームを作成しないように気配りします。
- Coverslip の動きを最小限に抑え、クリアのマニキュアを使用してカバーのシールします。
6. 網膜血管の可視化
- 準備と可視化の蛍光信号の損失を介して画像詳細の損失を減らすために可能な限り短い間の時間ギャップを維持します。画質の劣化はゆっくりと準備の後表示 48 h になると直接可視化を達成することはできない場合に、信号の損失を減らすために 4 ° C で準備された網膜血管マウントを格納します。
- 蛍光顕微鏡による網膜血管系のマウントを視覚化またはレーザー走査型共焦点顕微鏡。
注: 蛍光顕微鏡による血管の可視化は、2.0 s、6.0 の x とガンマの利得の露光時間で 2.5 倍の倍率で達成された 1.67 の設定。共焦点の顕微鏡検査のため、Ar レーザー (488 nm/20 mW) 20% の電力で組み合わせで x/0.7 20 TD 488/543/633 励起フィルターを利用した ddH2O 浸漬媒体および 505 560 nm の発光フィルター設定として NA 多液浸対物レンズ。共焦点画像は、網膜のサイズに応じてタイル スキャンを組み合わせる 4 x 4 や 4 x 5、5 × 5 の特異な画像で構成されます。
7 ゼブラフィッシュの網膜の彼セクション
注: ゼブラフィッシュの網膜の彼のセクションの組織に従って準備プロトコル手順 4.5 までとその後手順 7.1 に直接進みます。
- 1x PBS で 5 分間 2 回 (ステップ 4.5) あと除核に目を洗います。その後、70% エタノール (エタノール) に組織を転送します。この時点で準備ができて目はパラフィン包埋まで 4 ° C で保存できます。
- 組織のパラフィン包埋前に脱水する次の方法を洗う: 2 x 15 分 80% エタノール, 2 x 15 分 90% エタノール, 3 x 15 分 96% エタノール, 3 x 15 分 99% エタノール, 2 x 15 分 acetone/99% エタノール (1:2)、アセトンで 3 x 15 分で。パラフィンでの組織を 62 ° C で一晩保ちます。
- 新鮮なパラフィン 62 ° C に熱するし、金型を埋め込むことにそれを注ぐ。直接金型に、任意のセクションの速いペースで、目の向きが正しい制御組織を転送します。その後、追加加熱パラフィンでカバーして金型に埋め込みカセットを適用されます。
- パラフィン ブロック冷却した後、埋め込み型を削除します。10 μ m のセクションにミクロトームでパラフィン ブロックをカットして、それらを完全に平らにするそれらのために十分な長さの水表面上 45 ° C の水浴に浮きます。
- スライド ガラス上のセクションをキャッチし、垂直方向に 45 ° C のオーブンで一晩干す前に余分な水分を除去するために排水
- Deparaffinize に次のスケジュールと HE 染色のセクションがさらにプロセス: キシロール、99% エタノール, 1 x 1 分 96% エタノール, 1 x 1 分 80% エタノール、70% エタノール、ddH2O、マイヤーのヘマトキシリンで 1 x 4 分の 1 × 1 分の 1 x 1 分で 1 x 1 分で 4 x 1 分、ddH2O、0.5% エオシン, 1 x 30 の 1x2min の 1 × 10 分 ddH2O, 1 x 30 s は 80% のエタノール、2 x 30 96% のエタノールで s、99% エタノールで 3 x 1 分 s、キシロール 1 x 1 分。
- キシロールからスライド ガラスを取るし、すぐにメディアのマウントを持つ組織をカバーします。組織を完全に乾燥、上、coverslip の場所し、ステンド グラスの組織をシールのように避けてください。
Representative Results
大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュの網膜血管系の 2 つの典型的な形態例を示す: 一度可視化 (図 9 a) 蛍光顕微鏡と共焦点レーザー走査型顕微鏡 (図 9 b)。明らかに網膜構造は、非常に組織されるパターンを示します。蛍光顕微鏡で視覚化されたとき、強い蛍光がゼブラフィッシュの網膜に見られます。したがって、バック グラウンド蛍光を軽減し、コントラストを高めるは、共焦点スキャンを介してのみ血管層の可視化の使用をお勧めします。高速画像取得や質的データが十分な状況は、蛍光顕微鏡は魅力的な代替手段です。
図 9: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の代表的な写真です。網膜血管系の 2 つの典型的な形態の例を示す: 中央光動脈アーケードの連続に分岐し、5-7 主要血管系へと 。すべてのさらなる血管の各花弁の外側の部分を制限する円周静脈 (CV) にドレインします。2.5 倍の倍率(A)の蛍光顕微鏡による可視化共焦点レーザー顕微鏡複合 5 x 5 の単一のイメージ タイル スキャン(B)による網膜血管の可視化。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
光の動脈は視神経乳頭、網膜に浸透、ほとんどのサンプルで 5-7 主な血管 (図 10 a) へと 。メインの船、アーケードの連続に分岐し、内部ファイバー円 (IOC) 円周静脈 (CV) とも呼ばれるフラット マウントされた網膜の周辺部で視神経を包囲に接続 (図 10 bを参照)。IOC は、眼の世界 (球輪) の内側の縁に動脈の血液を排出する静脈血管です。ゼブラフィッシュの網膜血管は、毛細血管と血管新生の萌芽 (図 10) の分岐の高い血管活動の領域を示しています。この血管の活動は IOC にすぐ近くに大抵あります。同じ目が網膜の異なる領域で両方の高値と安値血管活動を発揮できることに気づくことが重要です (図 10 bと図 10を比較)。一般より多くの無血管領域とマウス17の網膜などに比較すると主枝の間に少ない毛細血管、ゼブラフィッシュの網膜血管を示しています。血管間で異なる場合があります、特異検査はバイアスにつながることができますので、各サンプルの両方の目を分析する必要があります。
図 10: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管可視化の領域を拡大します。主な容器(A)に分岐ファイバー動脈。網膜毛細血管低血管活動写真(B)の下に内側の光円 (IOC) に接続します。IOC (C)に接続する高い血管活動の領域の網膜毛細血管。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
神経層の非常に節約されるアーキテクチャは約 72 時間からゼブラフィッシュに存在既にポスト受精 (hpf) 以降18。アダルト ゼブラフィッシュ網膜インサイド アウト (図 11) から次の層を示しています: 神経節細胞層 (GCL)、内網状層 (IPL)、内部の核層 (INL)、外網状層 (OPL)、核外層 (ONL)、視細胞層 (PL)網膜色素上皮 (RPE)。網膜血管の可視化から血管パラメーターの推定は図 12に示します。内側の網膜血管は、脈絡膜、神経節細胞層 (GCL) (図 13 b、ホワイト ボックス) 沿いに毛細血管が網膜色素上皮 (RPE) に関連付けられます。
図 11: 彼大人ゼブラフィッシュ眼の染色します。(A)レンズを除去した後全体の目の断面の概要です。大人のゼブラフィッシュの網膜の層の目19 (B)。PL (C)自然の限界点を示す (黒矢印)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
低酸素状態における網膜促進のモデルを示し、分岐ポイント数の増加血管新生血管面積のもやし、ゼブラフィッシュ20の intercapillary の距離を減少します。これらの調査結果は、後で糖尿病性網膜症の主要な調査結果は VEGF の発現に強くリンクしている低酸素媒介促進として、ゼブラフィッシュは糖尿病血管合併症21に影響を受けやすいという考えをサポートします。高血糖によるゼブラフィッシュの網膜の変化は、血管の厚みが増加につながるが、22のパターン全体を維持します。交互にブドウ糖液 30 日間浸漬も IPL と INL23の厚さを減少させます。血管の代謝の支持者としてゼブラフィッシュにおけるグルコース代謝物の直接の影響も既に示されていた。その他血管 hyperbranching メチルグリオキサール24と孵化ゼブラフィッシュ胚の体幹の血管系のみられました。現時点では、糖尿病網膜症のすべての重要な基準を提供する動物のモデルはありません。初期の変化が多いが、増殖糖尿病網膜症への進行は25を行方不明します。我々 は低酸素媒介促進または高血糖による変化を今まで見ているだけ、ゼブラフィッシュはまたこの定義に落ちる。現在の調査結果は、ゼブラフィッシュは高血糖による血管の変化を受けやすい動物モデルとして潜在的増殖性糖尿病網膜症への進行を示すかもしれないという考えをサポートします。強度、高血糖を介した効果への露出によって右実験モデルがゼブラフィッシュの網膜の特定の領域に虚血につながるし、増殖糖尿病網膜症の主な基準として促進を促進します。ただし、ゼブラフィッシュは、長期微小血管病態をモデリングの分野で比較的新しいプレーヤーは、ゼブラフィッシュの今後の糖尿病モデルはさらに情報を提供し、他のモデルとその病態を尊重し、その重要性を明らかにします。たとえば、tg(fli:EGFP) ラインに赤い標識赤血球 tg(gata1a:DsRed) ゼブラフィッシュのクロスは将来のゼブラフィッシュ モデルの予測因子として蛇行を示す潜在的な眼内の出血を同時に視覚化する使用ことがラオスへの進行。
網膜の血管は、アーケードの連続に進行する、ので intervascular 距離、分岐ポイントの数および血管面積の評価は、中心光動脈から距離に関連しています。血管評価パラメーターのバイアスを避けるためには、オリエンテーションのポイントが必要です。IOC はこのような構造、関連性の高い直接空間的近接性血管活動の区域はあるので。一貫性のある評価網膜スキャンは IOC に一定の距離を持つ複数の長方形の画像のセクションに分割して必要があります。網膜全体を分析する必要があります、画像は数値的対称的に分散します。ゼブラフィッシュの網膜は、ハイとローの毛細血管密度と領域を示しています、イメージのセクションの等しくない配分は付加的なバイアスにつながることができます。
図 12: 網膜血管可視化の読み出しと血管パラメーターの例提示します。Intervascular 距離 (赤色の二重矢印) 内部の光の近くの測定円 (IOC) (A)の。3 分岐ポイント (赤丸) 付近の IOC (B)。発芽容器(C)を示す拡大エリア (赤箱) ゼブラフィッシュ網膜血管の可視化。血管径測定中心動脈 (白十字) から一定の距離 (白い二重の矢印) (D)。血管密度は容器 (斜めの赤い線) をオーバーレイすることにより網膜領域の割合(E)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Intervascular の距離を測定するには、(図 12 a、白い二重の矢印) の標準として IOC に一定の距離を設定し、IOC に平行架空の横線 (図 12 a、白い水平線) を描画する 1 つ必要があります。この行追加し、数学的平均の容器間の距離 intervascular の距離に相当します。容器を分割し、1 つ以上の血管内腔が起源のポイントから続行するたびに、各イメージ内分岐ポイントがカウントされます。毛細血管との間の横のつながりも含まれます。分析と一貫性を保ってし、カウントし、不要な変動を減らすために全体の実験を通してこれらの規則への分岐ポイントを決定することが重要です。血管発芽図 12に示すようは、網膜の血管系に及ぼす影響を評価する各画像に数えることができる別のパラメーターです。血管新生もやし中心動脈、IOC と網膜の外側の部分の近くにフォーカスのアーケードのような連続をしないでください。特定の血管を評価する向きのポイントは、必要常に設定された距離マーク測定スポット。網膜の内側中心動脈の起源は、主茎血管 (図 12D、クロス白) のような指導を提供します。網膜全体のエリアのパーセンテージとして血管 (図 12E、斜めの赤い線) によって占有される領域は血管密度と直接無血管領域に関連していません。
1 つのサンプルの完全な共焦点スキャンは、小さな毛細血管 hypersprouting の可視化を許可するように複数の高精細画像の構成必要があります。時間とここに費やされるリソースを最適化するため、自動耕耘手順は、すべてのタイルの一般的なスキャンの深さと使用ください。網膜の不均一なマウントは大きく共焦点顕微鏡で血管をスキャンする時間を増やすことができます。1 つは (図 13B、白いボックス) に血管の層が、GCL の部分的な包含をだけスキャンしたい最適なアプローチで必要があります。後短すぎるフラット マウントを達成するためにカットと同様に切り捨て、視神経の余分な長さを残しては、不均一な実装につながります。
図 13: HE 染色と大人のゼブラフィッシュの網膜における蛍光の比較。GCL (A)上記フォーカスした網膜血管系の。網膜血管系 (ホワイト ボックス) 緑 EGFP 信号や強い蛍光((B))を示す網膜の層を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ゼブラフィッシュの網膜血管の適切な準備は、事前研修を必要未熟な dissectors と強く様々 な準備の結果小さなサンプル サイズ、技法の主な制限です。Tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ目の準備は、血管系の状態に高速の洞察力を与える、技術では経験豊富な研究員の網膜あたりの作業時間の約 20 分まだ利用します。解剖顕微鏡の下ですべての網膜血管の準備手順を行う必要があり、dissectors に滞在する必要不注意なステップは、容器破損を引き起こすことができる潜在的に全体の時間を集中しています。切開は、準備から長期の不在が容器の整合性を維持するためのバイナリの可能性を低減、定期的に練習する必要があります。
人間と齧歯動物の組織で検証される抗体の数が少ない、ゼブラフィッシュ使用しているさらに、免疫組織染色 (IHC) による追加読み出しはまだ限られています。実験者 IHC に興味を持って、新しいターゲットを操作するときに特にゼブラフィッシュ特異抗体を検索するお勧めします。また、眼の血管系以外のセルの研究に有用である追加ゼブラフィッシュ記者ラインを使用することをお勧めします。ただし、この戦略は時間がかかる、複数トランスジェニック記者を運ぶ大人ゼブラフィッシュ ラインを生成する数ヶ月かかるので。
それにもかかわらず、ゼブラフィッシュは利点のユニークな配列を引き起こします。彼らは比較的小さく、容易に再現します。彼らが大人の段階に急激に拡大する、その胚創薬スクリーニングに最適です。フィールドを容易に成長しているより多くの文献にアクセスできるなっています。急速なスピードと transgene 蛍光レポーター ラインの豊富さで遺伝子のノックアウトを生成する能力を持つゼブラフィッシュのための選択は、選択した研究の質問によってだけ抑制されます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、ゼブラフィッシュ飼育およびテクニカル サポートのためのカトリン ・ Bennewitz とマレーネ ・ Hausner を感謝したいです。著者は、生物医学と医療技術のマンハイム (DFG INST 91027/9-1) コア施設ライブ細胞イメージング マンハイム中心部での対応をご了承ください。本研究は、ドイツ研究振興協会によって支えられた (国際研究訓練グループ 1874/1"DIAMICOM"プロジェクトの SP5 と SP9;プロジェクト B1 と共同研究センター SFB/TR23 プロジェクト Z5 共同研究センター SFB1118)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Roth | 6771.3 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| CaCl2*6H20 | Roth | 5239.2 | |
| MgSO4*7H20 | Merck | 1.05886.0500 | |
| Paraformaldehyd | Roth | 0335.3 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Roth | 2370.1 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| PBS | Roth | 9143.1 | |
| Agarose | Roth | 2267.3 | |
| Fluoromount-G | Thermo-Fischer | 00-4958-02 | |
| Petri dish | Greiner Bio one | 633180 | |
| Six-well plate | StarLab | CC7682-7506 | |
| Needle | MSG Praxisbedarf | BD 300900 | |
| Micro Tweezer | World Precision Instruments | 14095 | |
| Microdissection Scissor | World Precision Instruments | 501778 | |
| Glass slide | Carl Roth | H872.1 | |
| Coverslip 22mmx22mm | neoLab | 103512222 | |
| Scalpel | MSG Praxisbedarf | FEA111 | |
| Epi-Illumination | Leica | 10446389 | |
| Fluorescence stereomicroscope MZ10 F | Leica | NA | |
| Confocal laser-scanning microscope SP5 DS | Leica | NA | |
| Stereomicroscope M80 | Leica | NA | |
| Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype | NA | NA | see Reference 15 |
| Mayer’s hematoxylin | Dr. K. Hollborn & Söhne | 0088663 | |
| 0.5% eosin | Dr. K. Hollborn & Söhne | NA | |
| 99,9% ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Paraffin | Merck | 1,071,501,000 | |
| Xylol | Roth | 4436.2 | |
| Acetone | Emsure | 606-001-00-8 | |
| Microtome RM 2165 | Leica | NA |
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