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Medicine

एक मछली की आंखों के माध्यम से मधुमेह का अध्ययन: Microdissection, दृश्य, और वयस्क टीजी (fli: EGFP) Zebrafish रेटिना Vasculature का विश्लेषण

Published: December 26, 2017 doi: 10.3791/56674
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Vascular Biology and Tumorangiogenesis, Center for Biomedicine and Medical Technology Mannheim (CBTM), Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2V. Medical Clinic, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

Summary

यहां, हम एक विधि प्रोटोकॉल जो वयस्क टीजी (fli: EGFP) zebrafish रेटिना vasculature का एक आसान विश्लेषण की अनुमति देगा चर्चा के रूप में एक तेजी से पढ़ने के लिए लंबी अवधि के नाड़ी neoangiogenesis और संरचनात्मक परिवर्तन से जुड़े विकृतियों की सेटिंग्स में ।

Abstract

मधुमेह रेटिनोपैथी मध्य आयु वर्ग के वयस्कों के बीच अंधापन का प्रमुख कारण है । दुनिया भर में मधुमेह की बढ़ती व्यापकता मधुमेह microvascular जटिलताओं की रोकथाम अगले दशकों के प्रमुख अनुसंधान क्षेत्रों में से एक कर देगा । विशेष, लक्षित चिकित्सा और उपंयास चिकित्सकीय दवाओं के लिए दृष्टि-हानि के जोखिम में रोगियों की बढ़ती संख्या का प्रबंधन करने की जरूरत है । zebrafish चयापचय multifactorial रोग प्रक्रियाओं मॉडलिंग के लिए बढ़ती प्रासंगिकता के साथ विकासात्मक अनुसंधान सवालों के लिए एक स्थापित पशु मॉडल है । प्रजातियों के लाभ इष्टतम दृश्य और उच्च प्रवाह दवा स्क्रीनिंग दृष्टिकोण, ब्याज की जीन बाहर दस्तक करने के लिए मजबूत क्षमता के साथ संयुक्त के लिए अनुमति देते हैं । यहां, हम एक प्रोटोकॉल जो वयस्क टीजी (fli: EGFP) zebrafish रेटिना vasculature का आसान विश्लेषण की अनुमति देगा का वर्णन एक तेजी से पढ़ने के रूप में लंबी अवधि के नाड़ी neoangiogenesis या पोत क्षति से जुड़े विकृतियों की सेटिंग्स में । यह zebrafish रेटिना और पूरे-ऊतक के बढ़ते के विच्छेदन के माध्यम से प्राप्त की है । उजागर जहाजों के दृश्य तो ग्रीन EGFP रिपोर्टर वयस्क रेटिना vasculature में व्यक्त की फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त की है । ऊतक के सही हैंडलिंग बेहतर परिणाम और कम आंतरिक पोत टूटना करने के लिए अनछुए संवहनी संरचना के दृश्य को आश्वस्त करने के लिए नेतृत्व करेंगे । विधि रेटिना vasculopathy के zebrafish मॉडल में पोत वास्तुकला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से neoangiogenesis में परिवर्तन से जुड़े उपयोग किया जा सकता है ।

Introduction

मधुमेह एक चयापचय रोग hyperglycemia द्वारा परिभाषित किया जाता है, जो बेकार इंसुलिन स्राव या अपर्याप्त ऊतक प्रतिक्रिया स्रावित इंसुलिन से उत्पन्न होता है । डब्ल्यूएचओ का अनुमान है कि ४२२,०००,००० वयस्कों में २०१४1 मधुमेह के साथ रह रहे थे और दुनिया भर में मधुमेह के प्रसार २०३५2तक जनसंख्या के 8-10% करने के लिए वृद्धि करने के लिए उम्मीद है, मधुमेह में प्रमुख अनुसंधान क्षेत्रों में से एक बनाने अगले दशकों । क्रोनिक उच्च रक्त शर्करा के साथ रहते है दीर्घकालिक microvascular जटिलताओं की ओर जाता है, मधुमेह रेटिनोपैथी, नेफ्रोपैथी सहित, और दर्द । इन जटिलताओं के प्रबंधन और रोकथाम मुश्किल है; दरअसल, मधुमेह अंत चरण गुर्दे की बीमारी (ESRD), जो डायलिसिस करने के लिए सुराग के सबसे अक्सर कारण होता जा रहा है2, और मधुमेह मध्यम आयु वर्ग के वयस्कों के बीच दृष्टिहीनता का प्रमुख कारण है3.

मधुमेह आंख में microvascular क्षति के प्रारंभिक कारणों क्रोनिक hyperglycemia, चयापचय परिवर्तन, साथ ही कुछ जोखिम कारकों (जैसे, उच्च रक्तचाप, डिसलिपिडेमिया), संवहनी endothelial रोग, pericyte छोड़ने के लिए अग्रणी हैं, और केशिका प्रतिगमन कि acellular संवहनी आस्तीन में परिणाम है । परिणामस्वरूप रेटिना ischemia neovascularization और वृद्धि हुई संवहनी पारगम्यता के विकास को बढ़ावा देने के कारण है प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी (पीडीआर)4। मधुमेह रेटिनोपैथी आम तौर पर मधुमेह रोगियों का ३७% में पता चला था, जबकि दृष्टि धमकी मधुमेह रेटिनोपैथी UKADS अध्ययन में दिखलाई सफेद यूरोपीय पलटन के 12% में पता लगाया गया था5. वर्तमान उपचार केवल आगे की जटिलताओं को रोका जा सकता है और पूरी तरह से पहले से ही प्रेरित नुकसान बहाल करने में सक्षम नहीं है । Panretinal फोटोकोगुलेशन, glycemic नियंत्रण के अलावा, प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी (पीडीआर) के लिए मानक चिकित्सा है, लेकिन साथ ही आसंन स्वस्थ ऊतक को प्रभावित करता है । विरोधी वीईजीएफ़ हस्तक्षेप लेजर उपचार के लिए विकल्प के रूप में आशाजनक परिणाम दिखाने के6,7, लेकिन अंततः, विशेष, लक्षित चिकित्सा और नई दवाओं के लिए दृष्टि-हानि के जोखिम में रोगियों की बढ़ती संख्या का प्रबंधन करने की जरूरत है ।

डायबिटिक रेटिनोपैथी के स्थापित एनिमल रिसर्च मॉडल्स ह्यूमन pathophysiology के हर पहलू को शेयर नहीं करते । सही प्रजातियों के उपयोग के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान प्रश्न की विशिष्ट आवश्यकताओं का पता प्रयोगात्मक सेटअप का सबसे महत्वपूर्ण भागों में से एक है । zebrafish भ्रूण (ढाणियो rerio) पहले से ही व्यापक रूप से विकासात्मक अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है और morpholinos या CRISPR/Cas9 तकनीक8के माध्यम से पछाड़ना या पीटकर विशिष्ट जीनों के लिए एक इष्टतम व्यावहारिक पृष्ठभूमि प्रदान करता है । इन तरीकों को आसानी से zebrafish में उपयोग किया जा सकता है जीन है, जो बड़े पैमाने पर जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (GWAS), रोग प्रगति और संवेदनशीलता9के विशेष तंत्र में अंतर्दृष्टि सृजन द्वारा की पहचान की जांच करने के लिए । लघु पीढ़ी के समय, वंश की बड़ी मात्रा में, आसान और कम लागत से निपटने, और बढ़ती परख समर्थन zebrafish मॉडल की प्रासंगिकता बढ़ गई है, विशेष रूप से चयापचय रोग मॉडलिंग के लिए अपनी महान क्षमता दी । zebrafish में जैविक तंत्र का संरक्षण औषधीय चिकित्सा विकास के लिए एक आधार के रूप में दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, मधुमेह दवा मेटफार्मिन और कोलेस्ट्रॉल कम simvastatin "इलाज" के लिए शिविर के मॉडलों में शर्तों दिखाया गया है डेक्समेतएसॉनी-प्रेरित उच्च PEPCK अभिव्यक्ति और उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार प्रेरित विटिलिगो10 , 11 , 12. व्यापक के संरक्षण में यह आगे अंतर्दृष्टि चयापचय तंत्र आगे zebrafish मधुमेह मॉडल की बढ़ती संख्या द्वारा समर्थित है, जैसे प्रयोगों के माध्यम से: ग्लूकोज समाधान में बारी मशीन, बीटा कोशिकाओं के Streptozotocin-प्रेरित पृथक, nitroreductase-मध्यस्थता बीटा सेल पृथक दवा metronidazole का उपयोग, monogenic जीन pdx1 या नॉकआउट के माध्यम से मध्यस्थता मधुमेह, साथ ही कंकाल की मांसपेशी में वृद्धि हुई इंसुलिन प्रतिरोध के मॉडल 12. ये पहले से ही स्थापित प्रोटोकॉल, प्रजातियों में से ऊपर उल्लेख विशेष, और कुशलता से नमूनों की एक बड़ी संख्या में जीनोम में हेरफेर करने की क्षमता सभी तंत्र का अध्ययन करने के लिए zebrafish के लाभों को प्रदर्शित जटिल रोग प्रक्रियाओं के साथ ही औषधीय उपायों के लिए स्क्रीन करने की क्षमता ड्राइविंग ।

बुनियादी zebrafish नेत्र शरीर रचना विज्ञान के एक सामान्य समझ (चित्रा 1) रेटिना angiopathy के लिए एक मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग करने के क्रम में विरूपण के लिए आवश्यक है. zebrafish नेत्र छह extraocular मांसपेशियों, चार rectus, और दो परोक्ष मांसपेशियों कि श्वेतपटल13पर दुनिया के बाहर पर डालने है । कॉर्निया पारदर्शी लेंस को कवर ऊतक है और श्वेतपटल है, जो आंखों के बाहरी कवच रूपों में सीधे जारी है । श्वेतपटल गैर पारदर्शी है, एक आंशिक रूप से सतह को दर्शाती प्रकाश है, और दृढ़ता से pigmented है । लेंस ही मानव समकक्ष से अधिक गेंद के आकार का है । रेटिना के तीन परमाणु परतों के होते हैं, जबकि ऑक्सीजन प्रदान रेटिना vasculature निकट भीतरी नाड़ीग्रंथि कोशिका परत के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन एक उप रेटिना नेटवर्क फार्म नहीं है. धमनियां वाहिकाओं, इसके विपरीत, श्वेतपटल और रेटिना के बीच में झूठ और रेटिना pigmented उपकला (RPE) के साथ जुड़े रहे हैं । इस केशिका नेटवर्क रेटिना14के बाहरी हिस्सों को ऑक्सीजन की आपूर्ति ।

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क zebrafish नेत्र का योजनाबद्ध चित्रण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

रेटिना vasculature का सीधा दृश्य ट्रांसजेनिक टीजी (fli: EGFP) zebrafish लाइन15के उपयोग से प्राप्त किया जा सकता है । हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन vasculature के endothelial कोशिकाओं में fli मोटर के नियंत्रण में व्यक्त की बाद के चरणों में एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के माध्यम से दृश्य के लिए आधार है । यह zebrafish रेटिना और पूरे-ऊतक के बढ़ते के विच्छेदन के माध्यम से प्राप्त की है । इस ट्रांसजेनिक मॉडल intravascular लेबलिंग या पूरे माउंट immunohistochemistry के किसी भी आवेदन के बिना एक तेजी से संवहनी readout प्रदान करता है । zebrafish में मधुमेह रेटिनोपैथी का विश्लेषण करने के लिए, कदम से एक कदम और मानकीकृत तैयारी दिनचर्या हर विक्षेत्र द्वारा इस्तेमाल किया जाना चाहिए.निंनलिखित तैयारी प्रोटोकॉल अंय अनुसंधान समूहों को आसानी से वयस्क zebrafish नेत्र के उजागर जहाजों में संवहनी परिवर्तन का मूल्यांकन और मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए zebrafish रेटिना के लिए एक अनुकूलित विच्छेदन दिनचर्या स्थापित प्रदान करता है ।

Protocol

पशु संबंधी विषयों से संबंधित कदमों सहित सभी प्रक्रियाएं, पशु आचार समिति (Regierungspräsidium कार्ल्सृहे) द्वारा अनुमोदित की गई हैं और हीडलबर्ग विश्वविद्यालय के पशु परिचर्या दिशानिर्देशों का पालन करती हैं.

1. निर्धारण की तैयारी (4% पीएफए/

  1. ऊतकीय ऊतक अखंडता के इष्टतम संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए हर दिन निर्धारण ताजा तैयार करते हैं ।
  2. ९० मिलीलीटर डबल आसुत जल (ddH2O) में सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) के ०.२ जी भंग जबकि लगातार कमरे के तापमान पर सरगर्मी ।
  3. जोड़ें 4 जी paraformaldehyde (पीएफए) और हलचल जब तक समाधान के लिए पूरी तरह से स्पष्ट है कम से 5-10 मिनट के लिए अणुओं के depolymerization आश्वासन देता हूं ।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है, देखभाल के साथ संभाल ।
  4. सोडियम dihydrogen फॉस्फेट के ०.८४ जी भंग (2पीओ4) माप के माध्यम से ७.२ पर समाधान और नियंत्रण पीएच में ।
  5. ddH2हे और ग्रेड 3 फिल्टर कागज के माध्यम से समाधान फिल्टर के साथ १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा समायोजित करें ।
  6. स्टोर 4% पीएफए/

2. इच्छामृत्यु समाधान की तैयारी

नोट: निंनलिखित चरणों के साथ किया गया ABTL वंय प्रकार zebrafish तनाव के एक सामांय उंर में 6-8 सोम ।

  1. का प्रयोग करें एथिल 3-aminobenzoate मीथेन sulfonate, भी नाम "tricaine" या MS-२२२, एक एकाग्रता में ०.३१ मिलीग्राम/एमएल के लिए zebrafish इच्छामृत्यु16। उपयोग 1x अंडे का पानी, zebrafish भ्रूण उठाने के लिए इस्तेमाल किया, इच्छामृत्यु समाधान के लिए विलायक के रूप में । आम तौर पर, संतुलन और स्पर्श प्रतिक्रिया हानि की हानि का प्रदर्शन द्वारा बेहोश कर मछली के साथ काम करने से पहले सही संज्ञाहरण गहराई नियंत्रण ।
    1. के लिए १,००० मिलीलीटर 10x अंडे का पानी प्राप्त करने के लिए, इन लवण जोड़ने के लिए १,००० मिलीलीटर डबल आसुत जल (ddH2O) जबकि लगातार निंनलिखित क्रम में सरगर्म: 10 g NaCl, ०.३ g KCl, ०.४ g CaCl2 *6H2o, १.३२ g MgSO4 *6H2हे.

3. Zebrafish ऊतक का निर्धारण

  1. हस्तांतरण 6 मिलीलीटर 4% पीएफए/पहले से छह अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं में एक नमूना प्रति समाधान ।
  2. Euthanize वयस्क zebrafish (पहले एक मानक प्रकाश दिन चक्र पर बनाए रखा, उदा, 12 ज: 12 ज) 2 ज रोशनी के बाद सुबह में, उंहें tricaine समाधान में रखकर और इंतजार जब तक वे इच्छामृत्यु तक पहुंच गया है पर बारी । opercular आंदोलन है, जो 10 मिनट के लिए ले जा सकते है की समाप्ति के बाद ।
  3. tricaine इच्छामृत्यु समाधान के बाहर मछली ले लो और उंहें ताजा कागज तौलिए पर डाल दिया । मछली सूखी और एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए operculum के पीछे सिर काट ( चित्र 2aदेखें) । प्रमुखों को सीधे prepped प्लेटों में स्थानांतरित करें, जिसमें नए सिरे से तैयार किए गए निर्धारण शामिल हैं ।
  4. अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस पर मछली सिर से युक्त प्लेटों की दुकान के लिए ंयूनतम 24 ज को आश्वस्त करने के लिए निर्धारण गहरी रेटिना परतों प्रवेश ।
    नोट: Zebrafish प्रमुखों प्रतिदीप्ति सिग्नल की शक्ति का एक प्रासंगिक नुकसान के बिना तैयारी से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x फास्फेट में ४८ ज की एक अधिकतम के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । वृद्धि हुई विलंबता ऊतक अखंडता और कम तस्वीर की गुणवत्ता के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और इस तरह से बचा जाना चाहिए ।

4. Zebrafish रेटिना Vasculature की तैयारी

  1. गर्म 2% agarose के साथ एक तिहाई करने के लिए एक पेट्री पकवान भरें और जब तक आगर फर्म है रुको । आंखों को टुकड़े करने के लिए कार्यक्षेत्र बनाने के लिए 1x पंजाबियों के साथ आगर प्लेट को कवर करें ।
    नोट: यह तैयारी चिमटी के दोनों संरक्षण और ऊतक पर कम दबाव जबकि विदारक, संरचनात्मक क्षति की संभावना को कम करने की अनुमति देगा । अतिरिक्त महामारी के साथ एक विदारक खुर्दबीन के नीचे ठीक सुझावों के साथ #5 सीधे संदंश का उपयोग इस कार्यक्षेत्र में सभी आगे तैयारी कदम प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
    1. जबकि विदारक, उपयोग के लिए 4.0 x और 6.0 एक्स के बीच आवर्धन दोनों सिंहावलोकन और विस्तार से ऊतक के उंमुख मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. पेट्री डिश में फिक्स्ड नमूना हस्तांतरण और, एक नोचना के साथ कटौती की सतह पर सिर पकड़ कर, एक और टिकी हुई है, कक्षीय गुहा पर गोलक के नीचे एक साथ नोचना डालें । धीरे आंख के नीचे नोचना खुला और ऑप्टिक तंत्रिका पकड़, तो ध्यान से आंसू और आंखें अलग (चित्रा बी) ।

Figure 2
चित्रा 2: वयस्क zebrafish आंख का निष्कासन । कक्षीय गुहा और बरकरार ऑप्टिक तंत्रिका (ए)में अभी भी आंख के साथ Corneal पक्ष देखें । अलग आँख के साथ Corneal ओर देखें (ख). इस कदम पर zebrafish आंख का योजनाबद्ध चित्रण (C)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. चार rectus और दो परोक्ष extraocular की मांसपेशियों है कि अभी भी आंख से जुड़े हुए है के रूप में अच्छी तरह से अवशिष्ट extraocular ऊतक कक्षीय गुहा को आंख से जोड़ने के किसी भी निकालें (तुलना चित्रा 3 और चित्रा 4) ।
    1. एक आधे के माध्यम से आंख वापस पकड़ नोचना बंद कर इस प्राप्त करने और, अंय नोचना के साथ संरचना मनोरंजक, धीरे यह एक diametric आंदोलन के साथ चीर । के बाद से गोलक सीधे आंतरिक पोत टूटना की ओर जाता है मनोरंजक, इस तकनीक को उचित vasculature के संरक्षण कोमल है ।

Figure 3
चित्रा 3: फोकस में extraocular मांसपेशियों के साथ वयस्क zebrafish नेत्र । ध्यान में नेत्र ग्लोब के बाएं बाहरी रिम के लिए एक extraocular मांसपेशी के लगाव के साथ पार्श्व देखें (ए)। extraocular की मांसपेशियों के साथ ऑप्टिक तंत्रिका पक्ष देखें संतुलित ऑप्टिक तंत्रिका पार्श्व (ख)। इस कदम पर zebrafish आंख का योजनाबद्ध चित्रण (C)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. बाहरी सीमा पर कॉर्निया (चित्रा 4c, लाल तीर) पंचर करने के लिए एक 27G (०.४ x 19 मिमी) डिस्पोजेबल सुई का प्रयोग करें. इस खोलने के माध्यम से दोनों चिमटी के साथ कॉर्निया पकड़ और थोड़ा आंसू यह खुला । बाद में ध्यान से एक केंद्रित बनाने के काम लगभग संबंधित पुतली के आकार के आंसू ।

Figure 4
चित्रा 4: सभी extraocular मांसपेशियों को हटाने के बाद वयस्क zebrafish आंख । नेत्र ग्लोब दृश्यमान के साफ बाहरी रिम के साथ पार्श्व देखें (A)।बीच में ऑप्टिक तंत्रिका के साथ ऑप्टिक तंत्रिका पक्ष देखें । प्रकाश को प्रतिबिंबित श्वेतपटल तंत्रिका (लाल डैश्ड रेखा) के आसपास पूरे क्षेत्र को कवर नहीं है (ख)। इस कदम पर zebrafish आंख का योजनाबद्ध चित्रण (C)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. आईरिस के ऊपर बाहरी corneal किनारे पर नेत्र ग्लोब (bulbus oculi) के corneal पक्ष पर दबाव लागू करें । यह एक छोटा सा सेंध पैदा करेगा और corneal आंसू की ऊंचाई के लिए लेंस धक्का । लेंस के नीचे चिमटी को चलाएं और उसे (चित्र 5 ए) निकालें ।

Figure 5
चित्र 5: लेंस हटाने की प्रक्रिया में वयस्क zebrafish नज़र । लेंस के साथ Corneal ओर देखने के Corneal आंसू के माध्यम से धक्का दिया (ए)। नेत्र ग्लोब के बगल में लेंस के साथ Corneal ओर देखें (ख)। इस कदम पर zebrafish आंख का योजनाबद्ध चित्रण (C)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. बारी आंख उल्टा शोधकर्ता का सामना करना पड़ ऑप्टिक तंत्रिका के लिए । ध्यान रहे कि श्वेतपटल और कॉर्निया जुड़े हुए हैं और कप के आकार के रेटिना को सुरक्षित रखने के लिए आंखों के बल्ब के रेशेदार अंगरखा रूप हैं. (चित्र 6) ।
    1. इस खोल, कॉर्निया और श्वेतपटल से मिलकर, यह भी कहा जाता है "corneosclera" और ऑप्टिक तंत्रिका (चित्रा 4B, लाल डैश्ड रेखा) के आसपास के क्षेत्र से बाहर पुर्जों । इस विच्छेदन पर एक सुई डालें एक बार श्वेतपटल और रेटिना के बीच एक खोलने बनाने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: श्वेतपटल और कॉर्निया, जो शेष intraocular ऊतक से काट दिया है से मिलकर Corneosclera । Corneal पक्ष देखने के pigmented श्वेतपटल में पारदर्शी कॉर्निया की निरंतरता दिखा (ए)। पार्श्व दृश्य corneosclera के scleral भाग पर ध्यान केंद्रित (ख)। निकाला corneosclera का योजनाबद्ध चित्रण (C)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. दोनों चिमटी के साथ इस पहुंच का उपयोग करना, ध्यान से श्वेतपटल अक्षीय रूप से पट्टी में चीर को ऑप्टिक तंत्रिका के आसपास खोलने में वृद्धि । corneal ओर परिधि में संक्रमण पर corneosclera बरकरार रखने के लिए सावधान रहें ( चित्र 6Aदेखें) ।
  2. एक नोचना के साथ श्वेतपटल पकड़ो और, दूसरे के साथ ऑप्टिक तंत्रिका हथियाने और दूर खींच, पूरी तरह से आंख से corneosclera हटाने और इसे (चित्रा 6) त्यागें । corneosclera और शेष intraocular ऊतक अलग करने से पहले किसी भी कनेक्शन तोड़ने की कोशिश करो, के रूप में अंय संरचनाओं के लिए लगाव एक महत्वपूर्ण बात होगी; इस कदम uvea और रेटिना vasculature (चित्रा 7) युक्त रेटिना से मिलकर एक कप के आकार का ढांचा प्रदान करेगा.
  3. शेष कप के लिए बग़ल में एक 27G सुई पकड़ जबकि सुई टिप के रिम के साथ बाहरी सतह परिमार्जन द्वारा धमनियां/RPE परत में एक टूटना बनाएं । धमनियां/RPE परत पर एक पकड़ पाने के लिए एक पहुंच बिंदु के रूप में टूटना का उपयोग करें और यह धारियों में दोनों चिमटी के साथ चीर, लेकिन आईरिस बरकरार रखने के लिए कनेक्शन रखें ।
    1. बाद में, आईरिस के तहत एक नोचना चलाने के लिए और बाहर से एक सर्किट में चारों ओर चलते है जबकि बंद धमनियां/RPE परत को संयुक्त संरचना की टुकड़ी को प्राप्त करने में खींच द्वारा तनाव पैदा ।
      नोट: आईरिस डिस्कनेक्ट किया जाना चाहिए, ताकि जहाजों (चित्रा 8B) visualizing करते समय प्रतिदीप्ति बाधा नहीं करने के लिए । आईरिस हथियाने सीधे हटाने के लिए यह व्यापक पोत क्षति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, विशेष रूप से इनर ऑप्टिक सर्कल (आईओसी) में, के बाद से आईरिस अभी भी आसपास के ऊतकों से जुड़ा है । धमनियां परत और रेटिना pigmented उपकला (RPE) अलग किया जा सकता है और अक्सर आईरिस के लिए एक कनेक्शन है, जो एक आसान माध्यमिक हटाने के लिए अनुमति देता है बनाए रखने ।
    2. यदि आईरिस के कुछ हिस्सों को हटाया नहीं जा सकता है, एक प्राकृतिक तोड़ने बिंदु का उपयोग photoreceptor परत (PL) के अंदर वयस्क zebrafish आंख प्रदर्शन, एक इसी तरह के फैशन में ४.९ कदम, आईरिस को दूर करने के लिए ।
    3. शेष कप के आकार का रेटिना के बाहर पर परिमार्जन को तोड़ने बिंदु के ऊपर PL में विच्छेदन प्रेरित (चित्रा 11C, काला तीर) । आईरिस के संभावित कनेक्शन को बरकरार रखते हुए परत के ऊपरी भाग को हटाने के लिए बनाई गई पहुंच का उपयोग करें । बाद में, आईरिस के तहत चिमटी चलाने के लिए और संयुक्त संरचना अलग करने के लिए पहले उल्लेख के रूप में एक सर्किट में चारों ओर चलते हैं ।
      नोट: एक पूरे कदम ४.९ मुश्किल हो सकता है के रूप में धैर्य का प्रयोग करना चाहिए, लेकिन यह ध्यान से एक बेहतर संवहनी परिणाम को प्राप्त करेगा स्पष्ट रूप से पुतली के रिम पर आईरिस कब्जाने या एक खोलने के लिए मजबूर कनेक्शन को नष्ट करने से धमनियां/RPE या उनके संबंधित हटाने के बिना photoreceptor परत । इस कदम के बाद इस प्रकार रेटिना संवहनी अखंडता की रक्षा करेगा, लेकिन बाहरी रेटिना परतों के नुकसान के लिए नेतृत्व.

Figure 7
चित्रा 7: corneosclera के हटाने के बाद वयस्क zebrafish आंख । पार्श्व दृश्य बरकरार आईरिस और ऑप्टिक तंत्रिका के साथ शेष intraocular ऊतक दिखाता है (A)। ध्यान में आइरिस के साथ Corneal साइड व्यू (B). इस कदम पर zebrafish आंख का योजनाबद्ध चित्रण (C)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. एक सीधे २.५ mm काटने बढ़त के साथ एक microdissection स्प्रिंग कैंची का प्रयोग करें के रूप में रेटिना के लिए संभव के रूप में बंद ऑप्टिक तंत्रिका काट; यह एक बेहतर फ्लैट ऊतक के बढ़ते के लिए अनुमति देगा ।

Figure 8
चित्र 8: RPE/रंजित और छोटा ऑप्टिक तंत्रिका को हटाने के बाद वयस्क zebrafish आंख । ऑप्टिक तंत्रिका पक्ष को देखने के एक छोटे से ऑप्टिक तंत्रिका (ए)के साथ रेटिना से पता चलता है । Corneal रेटिना की सबसे भीतरी परत पर एक प्रत्यक्ष देखो के साथ साइड व्यू (B)। इस कदम पर zebrafish आंख का योजनाबद्ध चित्रण (C)।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

5. रेटिना Vasculature के बढ़ते

  1. 1x पंजाबियों में 5 मिनट के लिए दो बार विच्छेदित रेटिना को धो लें । के लिए ऑप्टिक तंत्रिका के जनचेतना के बाद रेटिना हस्तांतरण, एक माइक्रो चंमच के साथ एक प्रयोगशाला रंग का उपयोग करने के लिए उजागर ऊतक के प्रत्यक्ष हैंडलिंग से बचने के लिए अंत ।
  2. एक गिलास स्लाइड पर पंजाबियों की एक बूंद प्लेस और छोटी बूंद में रेटिना हस्तांतरण । एक नोचना का उपयोग करने के लिए जगह में ऊतक रखने के लिए एक स्केलपेल के साथ कप के आकार का संरचना काटने जबकि एक फ्लैट चार पत्ती या पांच पत्ती आकार रेटिना आकार के आधार पर बनाने के लिए ( चित्र 9देखें) ।
  3. कागज का एक टुकड़ा ठीक से बचे हुए पंजाबियों को चूसो । रेटिना को छूने के लिए नहीं सावधान रहना ।
  4. कोट बढ़ते मीडिया में फ्लैट घुड़सवार रेटिना और एक coverslip के साथ कवर । फोम बनाने के लिए नहीं चौकस हो, के रूप में हवा के बुलबुले रेटिना वाहिकाओं के दृश्य को विकृत कर सकते हैं.
  5. coverslip के आंदोलन को कम करने और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर सील ।

6. रेटिना Vasculature का दृश्य

  1. तैयारी और दृश्य प्रतिदीप्ति संकेत हानि के माध्यम से छवि विस्तार नुकसान को कम करने के लिए संभव के रूप में कम के बीच समय अंतराल रखें । की दुकान तैयार रेटिना vasculature 4 डिग्री सेल्सियस पर mounts संकेत हानि को कम करने के लिए, यदि प्रत्यक्ष दृश्य प्राप्त नहीं किया जा सकता है, छवि गुणवत्ता के क्षरण के रूप में धीरे तैयार करने के बाद दिखाई ४८ ज हो जाता है ।
  2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से रेटिना vasculature mounts कल्पना ।
    नोट: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पोत दृश्य २.० एस के एक जोखिम समय के साथ 2.5 x आवर्धन पर हासिल किया गया था, के लाभ 6.0 x और १.६७ के गामा सेटिंग्स । फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए, एक Ar-लेजर (४८८ एनएम/20% बिजली पर एक टीडी 488/543/633 उत्तेजना फ़िल्टर के साथ संयोजन में उपयोग किया गया था, एक 20x/0.7 NA बहु विसर्जन उद्देश्य के साथ ddH2हे विसर्जन मीडिया के रूप में, और 505-560 एनएम के उत्सर्जन फिल्टर सेटिंग्स । फोकल चित्रों 4x4, 4x5, या एक टाइल रेटिना आकार के आधार पर स्कैन के माध्यम से संयुक्त 5x5 एकवचन छवियों से बना रहे हैं ।

7. वह Zebrafish रेटिना के वर्गों

नोट: के लिए वह zebrafish रेटिना के वर्गों, के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित ऊतक तैयार कदम ४.५ जब तक और बाद में ७.१ कदम करने के लिए सीधे छोड़.

  1. 1x पंजाब में 5 मिनट के लिए दो बार enucleated आंखें (४.५ कदम के बाद) धो लो । बाद में, ७०% इथेनॉल (ेतोः) में ऊतक हस्तांतरण । इस बिंदु पर, तैयार आंखें तेल embedding तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. यह तेल embedding से पहले निर्जलित करने के लिए ऊतक निंनलिखित तरह धो लें: ८०% इथेनॉल में 2x15 मिन, ९०% इथेनॉल में 2x15 मिन, ९६% इथेनॉल में 3x15 मिन, ९९% इथेनॉल में 3x15 मिन, 2x15 में एसीटोन मिनट/99% इथेनॉल (1:2), 3x15 में मिन. ६२ डिग्री सेल्सियस पर रात भर में तेल में ऊतक रखो ।
  3. ६२ डिग्री सेल्सियस के लिए ताजा तेल गर्म और यह एंबेडिंग molds में डालना । सीधे मोल्ड में ऊतक हस्तांतरण और, एक तेज गति से, वांछित अनुभाग के लिए आंखों का सही अभिविन्यास नियंत्रण. बाद में, मोल्ड और अतिरिक्त गरम तेल के साथ कवर करने के लिए एक embedding कैसेट लागू होते हैं ।
  4. आयल ब्लॉक्स के ठंडा हो जाने के बाद एंबेडिंग मोल्ड निकालें । 10 µm वर्गों में एक microtome में आयल ब्लॉकों में कटौती और उन्हें पूरी तरह से समतल करने के लिए काफी लंबे समय के लिए पानी की सतह पर एक ४५ ° c पानी स्नान पर उन्हें बाहर फ्लोट ।
  5. एक गिलास स्लाइड पर वर्गों पकड़ो और उन्हें खड़ी नाली ४५ डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रातोंरात उन्हें सुखाने से पहले अतिरिक्त पानी को दूर करने के लिए ।
  6. deparaffinize के लिए निंनलिखित अनुसूची के साथ आगे वर्गों की प्रक्रिया और वह दाग: xylol में 4x1 मिन, ९९% इथेनॉल में 1x1 मिनट, ९६% इथेनॉल में 1x1 मिनट, ८०% इथेनॉल में 1x1 मिनट, ७०% इथेनॉल में 1x1 मिनट, ddH2ओ में 1x1 मिनट, मेयर के hematoxylin में 1x4 मिन , ddH में 1x10 मिन2हे, 1x2min में ०.५% eosin, 1x30 एस में ddH2हे, 1x30 में ८०% इथेनॉल, 2x30 एस में ९६% इथेनॉल, 3x1 में ९९% इथेनॉल, और xylol में 1x1 मिनट ।
  7. xylol के बाहर कांच स्लाइड ले लो और जल्दी से बढ़ते मीडिया के साथ ऊतक कवर । ऊतक पूरी तरह से बाहर सूखी जाने से बचें, तो शीर्ष पर एक coverslip जगह और दाग ऊतक सील ।

Representative Results

यहां हम वयस्क टीजी (fli: EGFP) zebrafish में रेटिना vasculature के दो ठेठ रूपात्मक उदाहरण प्रदर्शित: एक बार एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना (चित्रा 9A) और एक बार एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (चित्रा 9B) के साथ । प्रगट रेटिना संरचना एक उच्च संगठित पैटर्न से पता चलता है । मजबूत autofluorescence zebrafish रेटिना में देखा जाता है, जब एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ visualized. इस प्रकार, एक फोकल स्कैन के माध्यम से केवल संवहनी परत के एक दृश्य के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने और इसके विपरीत वृद्धि की सलाह दी है । तेजी से तस्वीर अधिग्रहण या स्थितियों जहां गुणात्मक डेटा के लिए पर्याप्त हैं, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एक आकर्षक विकल्प है ।

Figure 9
चित्र 9: वयस्क टीजी की प्रतिनिधि तस्वीरें (fli: EGFP) zebrafish रेटिना vasculature. रेटिना vasculature के दो ठेठ रूपात्मक उदाहरण दिखाए जाते हैं: केंद्रीय ऑप्टिक धमनी 5-7 मुख्य जहाजों, जो आर्केड के उत्तराधिकार में तो शाखा में फैलता है । सभी आगे जहाजों circumferential नस में नाली (CV) प्रत्येक पत्ती के बाहरी हिस्से को सीमित । 2.5 x आवर्धन पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन (A)। एक संयुक्त 5x5 एकल छवि टाइल स्कैन के माध्यम से फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा रेटिना vasculature के दृश्य (ख)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ऑप्टिक धमनी ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर रेटिना प्रवेश और, ज्यादातर नमूनों में, 5-7 मुख्य जहाजों में फैलता है (चित्रा 10A) । मुख्य जहाजों तो आर्केड के उत्तराधिकार में शाखा और इनर ऑप्टिक सर्कल (आईओसी) से कनेक्ट, भी circumferential नस (CV) कहा जाता है, फ्लैट घुड़सवार रेटिना की परिधि में ऑप्टिक डिस्क घेरना ( चित्रा 10Bदेखें) । आईओसी शिरापरक पोत है कि नेत्र ग्लोब (bulbus oculi) के भीतर के रिम पर धमनी रक्त नालियों है । zebrafish रेटिना vasculature भी केशिकाओं और angiogenic अंकुरण (चित्रा 10C) की शाखाओं के साथ उच्च संवहनी गतिविधि के क्षेत्रों से पता चलता है. इस संवहनी गतिविधि ज्यादातर आईओसी के पास निकटता में स्थित है । यह सूचना है कि एक ही आंख रेटिना के विभिन्न क्षेत्रों में दोनों उच्च और निम्न संवहनी गतिविधियों को प्रदर्शित कर सकते हैं महत्वपूर्ण है (तुलना चित्रा 10B और चित्रा 10C). सामांय में, zebrafish की रेटिना vasculature अधिक avascular स्थान और मुख्य शाखाओं के बीच में कम केशिकाओं से पता चलता है अगर की तुलना में, उदाहरण के लिए, चूहों के रेटिना17. प्रत्येक नमूने के दोनों आंखों का विश्लेषण किया जाना चाहिए क्योंकि vasculature के बीच में भिंन हो सकते है और एकवचन निरीक्षण पूर्वाग्रह के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

Figure 10
चित्रा 10: वयस्क टीजी के क्षेत्रों बढ़ाया (fli: EGFP) zebrafish रेटिना vasculature दृश्य. ऑप्टिक मुख्य जहाजों में बंटी धमनी (क)। कम संवहनी गतिविधि के एक क्षेत्र में भीतरी ऑप्टिक सर्कल (आईओसी) को जोड़ने के चित्र के तल पर रेटिना केशिकाओं (B)। उच्च संवहनी गतिविधि आईओसी से जोड़ने के एक क्षेत्र में रेटिना केशिकाओं (C)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक उच्च-संरक्षित वास्तुकला के ंयूरॉन परतों पहले से ही मौजूद है zebrafish से लगभग ७२ एच पोस्ट निषेचन (hpf) के बाद18। वयस्क zebrafish रेटिना निम्नलिखित परतों को अंदर से बाहर दिखाता है (चित्र 11): नाड़ीग्रंथि सेल लेयर (GCL), इनर plexiform लेयर (आईपीएल), इनर न्यूक्लियर लेयर (आईएनएल), आउटर plexiform लेयर (OPL), आउटर न्यूक्लियर लेयर (केव), photoreceptor लेयर (पीएल), और रेटिना pigmented उपकला (RPE). रेटिना vasculature दृश्य से संवहनी मापदंडों का आकलन चित्र 12में दिखाया गया है । भीतरी रेटिना vasculature नाड़ीग्रंथि कोशिका परत पर स्थित है (GCL) (चित्रा 13B, सफेद बॉक्स) जबकि धमनियां केशिकाओं के साथ जुड़े होंगे रेटिना pigmented उपकला (RPE).

Figure 11
चित्र 11: वह वयस्क zebrafish आंख के दाग । लेंस को हटाने के बाद पूरी आंख का क्रॉस-सेक्शनल ओवरव्यू (A)। वयस्क zebrafish आंख की रेटिना परतें19 (ख)। संकेत (काला तीर) PL में प्राकृतिक तोड़ने बिंदु के (C)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हाइपोक्सिया-प्रेरित रेटिना neoangiogenesis के मॉडल अंक बंटी की संख्या में वृद्धि दिखाने के लिए, angiogenic अंकुरित, कुल संवहनी क्षेत्र और zebrafish में कम केशिका दूरी20. इन निष्कर्षों zebrafish मधुमेह microvascular जटिलताओं के लिए अतिसंवेदनशील है कि इस विचार का समर्थन21बाद में मधुमेह रेटिनोपैथी के प्रमुख निष्कर्षों के रूप में हाइपोक्सिया मध्यस्थता neoangiogenesis, जो दृढ़ता से वीईजीएफ़ अभिव्यक्ति के लिए जुड़ा हुआ है शामिल हैं. zebrafish रेटिना नेतृत्व में Hyperglycemia-प्रेरित परिवर्तन जहाजों की मोटाई में वृद्धि हुई है, लेकिन समग्र पैटर्न को बनाए रखने के लिए22. 30 दिनों तक ग्लूकोज सॉल्यूशन में अदल-बदल कर विसर्जन करने से आईपीएल की मोटाई भी घट जाती है और23आईएनएल । vasculopathy के चयापचय समर्थकों के रूप में zebrafish में ग्लूकोज चयापचयों का सीधा प्रभाव भी पहले से ही दिखाया गया था । अतिरिक्त संवहनी hyperbranching methylglyoxal24के साथ मशीन के बाद zebrafish भ्रूण के ट्रंक vasculature में मनाया गया । फिलहाल, वहां कोई जानवर मॉडल है जो मधुमेह रेटिनोपैथी के सभी प्रमुख मानदंडों प्रदान करता है । जल्दी परिवर्तन अक्सर पाए जाते हैं, लेकिन प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी करने के लिए प्रगति25लापता है । zebrafish भी इस परिभाषा में गिर जाता है, के रूप में हम केवल या तो हाइपोक्सिया-मध्यस्थता neoangiogenesis या hyperglycemia-प्रेरित परिवर्तन अब तक देखा है । वर्तमान निष्कर्षों zebrafish hyperglycemia-मध्यस्थता संवहनी परिवर्तन करने के लिए अतिसंवेदनशील है कि विचार का समर्थन और एक पशु मॉडल संभावित प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी के लिए एक प्रगति दिखा सकता है के रूप में. शक्ति और hyperglycemia-मध्यस्थता प्रभाव के लिए जोखिम पर निर्भर करता है, सही प्रयोगात्मक मॉडल zebrafish रेटिना के कुछ क्षेत्रों में ischemia के लिए नेतृत्व और प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी के प्रमुख मानदंडों के रूप में neoangiogenesis को बढ़ावा दे सकता है । हालांकि, के रूप में zebrafish लंबी अवधि के microvascular विकृतियों मॉडलिंग के क्षेत्र में एक तुलनात्मक नए खिलाड़ी है, zebrafish में आगामी मधुमेह मॉडल और अधिक जानकारी प्रदान करने और अन्य मॉडलों और उनके विकृतियों के संबंध में इसके महत्व को स्पष्ट करेंगे । उदाहरण के लिए, टीजी (gata1a: DsRed) के एक में-पार zebrafish में लाल लेबल एरिथ्रोसाइट्स के साथ टीजी (fli: EGFP) लाइन के लिए एक साथ एक कारक के रूप में intraocular दिखा भविष्य zebrafish मॉडल में संभावित microaneurysms रक्तस्राव कल्पना किया जा सकता है प्रगती ते पीडीआर.

रेटिना vasculature आर्केड की एक उत्तराधिकार में प्रगति के बाद से, संवहनी दूरी का मूल्यांकन, अंक बंटी की संख्या और कुल संवहनी क्षेत्र केंद्रीय ऑप्टिक धमनी से दूरी से संबंधित हैं. मूल्यांकन संवहनी मापदंडों में पूर्वाग्रह से बचने के लिए, अभिविंयास के एक बिंदु की आवश्यकता है । आईओसी इस तरह के एक संरचना है और संवहनी गतिविधि के क्षेत्रों के बाद से अत्यधिक प्रासंगिक है प्रत्यक्ष स्थानिक निकटता में झूठ । लगातार आकलन के लिए, रेटिना स्कैन आईओसी के लिए एक सुसंगत दूरी के साथ कई आयताकार छवि वर्गों में विभाजित किया जाना चाहिए । पूरे रेटिना का विश्लेषण किया जाना चाहिए और चित्र संख्यात्मक रूप से संतुलित वितरित. zebrafish रेटिना उच्च और कम केशिका घनत्व के साथ क्षेत्रों को दर्शाता है और छवि वर्गों के एक असमान वितरण अतिरिक्त पूर्वाग्रह के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

Figure 12
चित्र 12: रेटिना vasculature विज़ुअलाइज़ेशन के readout के रूप में संवहनी मापदंडों का उदाहरण प्रस्तुति. भीतरी ऑप्टिक सर्कल (आईओसी) के पास संवहनी दूरी (लाल डबल तीर) का मापन (A)। आईओसी (बी)के पास तीन ब्रांचिंग पॉइंट (लाल घेरे) । एक अंकुरित पोत (सी)दिखा एक बढ़े हुए क्षेत्र (लाल बॉक्स) के साथ zebrafish रेटिना vasculature का दृश्य. पोत व्यास एक निश्चित दूरी पर मापा (सफेद डबल तीर) केंद्रीय धमनी (सफेद पार) से (घ)। पोत घनत्व रेटिना जहाजों (तिरछे लाल रेखा) (ई)ओवरले द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र का प्रतिशत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

संवहनी दूरी को मापने के लिए, एक मानक (चित्रा 12A, सफेद दोहरे तीर) के रूप में आईओसी के लिए एक निश्चित दूरी तय करने की जरूरत है और एक काल्पनिक क्षैतिज रेखा (चित्रा 12A, क्षैतिज सफेद लाइन) आईओसी के समानांतर आकर्षित । इस लाइन पर जहाजों के बीच की दूरी को जोड़ा गया है और गणित औसत संवहनी दूरी बराबर होती है । शाखा अंक प्रत्येक छवि के अंदर गिना जाता है जब भी एक पोत विभाजन और एक से अधिक संवहनी लुमेन मूल के बिंदु से जारी है । इसमें केशिकाओं के बीच क्षैतिज कनेक्शन भी शामिल है । यह विश्लेषण के साथ संगत रहने के लिए महत्वपूर्ण है और तय है जो शाखाओं में अंक की गणना करने के लिए और पूरे प्रयोग भर में इन नियमों को रखने के लिए आवश्यक भिंनता को कम । संवहनी अंकुरण, के रूप में चित्रा 12Cमें प्रदर्शन किया, एक और पैरामीटर है कि प्रत्येक छवि में गिना जा सकता है रेटिना vasculature पर प्रभाव का मूल्यांकन है । Angiogenic स्प्राउट्स केंद्रीय धमनी और आईओसी के बीच की आर्केड की तरह उत्तराधिकार का पालन नहीं करते और रेटिना के बाहरी हिस्सों के पास ध्यान केंद्रित करते हैं । कुछ पोत व्यास का आकलन करने के लिए, अभिविंयास के एक बिंदु हमेशा की जरूरत है, जहां से एक निर्धारित दूरी माप स्थान के निशान । रेटिना के अंदर केंद्रीय धमनी की उत्पत्ति मुख्य स्टेम जहाजों (चित्रा 12D, व्हाइट क्रॉस) के लिए इस तरह के मार्गदर्शन प्रदान करता है । पूरे रेटिना क्षेत्र के एक प्रतिशत के रूप में जहाजों (चित्रा 12E, तिरछे लाल लाइनों) द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र संवहनी घनत्व है और परोक्ष रूप से avascular क्षेत्र को संबद्ध ।

एक नमूने का एक पूरा फोकल स्कैन एकाधिक उच्च विस्तार चित्रों से बना होना चाहिए छोटे केशिका hypersprouting के दृश्य की अनुमति है । समय और संसाधनों का इस चरण पर खर्च ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, एक स्वचालित प्रक्रिया तक प्रत्येक टाइल के लिए एक सामान्य स्कैन गहराई के साथ उपयोग किया जाना चाहिए । असमान रेटिना के बढ़ते बहुत समय एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ vasculature स्कैन करने के लिए खर्च में वृद्धि कर सकते हैं । एक इष्टतम दृष्टिकोण में केवल संवहनी परत (चित्रा 13B, सफेद बॉक्स) स्कैन करना चाहते हैं, लेकिन GCL के आंशिक शामिल किए जाने अक्सर आवश्यक है ।जनचेतना के बाद ऑप्टिक तंत्रिका की एक अतिरिक्त लंबाई छोड़ने, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कटौती करने के लिए फ्लैट प्राप्त करने के लिए माउंट भी कम हो रहा है, असमान बढ़ते जा सकता है ।

Figure 13
चित्र 13: वयस्क zebrafish रेटिना में वह दाग और autofluorescence की तुलना । GCL के ऊपर ध्यान में रेटिना vasculature (A)। रेटिना vasculature (सफेद बॉक्स) हरी दिखा रहा है एक EGFP संकेत और रेटिना परतों का प्रदर्शन मजबूत autofluorescence (B). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

zebrafish रेटिना vasculature की उचित तैयारी के रूप में पूर्व प्रशिक्षण की जरूरत है, अप्रशिक्षित विक्षेत्र के साथ एक छोटा सा नमूना आकार और दृढ़ता से अलग तैयारी परिणाम तकनीक की एक मुख्य सीमा है । जबकि टीजी की तैयारी (fli: EGFP) zebrafish आंखें vasculature के राज्य में तेजी से अंतर्दृष्टि देता है, तकनीक अभी भी एक अनुभवी शोधकर्ता के लिए रेटिना प्रति काम समय के 20 मिनट के आसपास का उपयोग करता है । रेटिना vasculature के लिए इन तैयारी चरणों के सभी एक विदारक माइक्रोस्कोप और विच्छेदन के तहत किया जाना चाहिए एक लापरवाह कदम संभावित पोत टूटना प्रेरित कर सकते है के रूप में पूरे समय केंद्रित रहने की जरूरत है । विक्षेत्री नियमित रूप से तैयारी से लंबे समय तक अनुपस्थिति के रूप में अभ्यास करना चाहिए पोत अखंडता को बनाए रखने के एक विक्षेत्र की संभावना कम कर देता है ।

इसके अलावा, immunohistochemistry (आइएचसी) के माध्यम से अतिरिक्त readout अभी भी सीमित है, एंटीबॉडी की एक छोटी संख्या के रूप में मानव और मूषक ऊतक पर मांय zebrafish के साथ काम कर रहे हैं । आइएचसी में रुचि रखने वाले experiments zebrafish-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए खोज करने के लिए सलाह दी जाती है, खासकर जब नए लक्ष्य के साथ काम कर रहे. वैकल्पिक रूप से, यह अतिरिक्त zebrafish रिपोर्टर लाइनों जो आंखों में vasculature से परे कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. यह रणनीति, तथापि, समय लेने वाली है, क्योंकि यह एक कुछ महीने लगते है वयस्क zebrafish लाइनें जो कई ट्रांसजेनिक पत्रकारों ले उत्पंन करते हैं ।

बहरहाल, zebrafish लाभ की एक अनूठी सरणी बन गया है । वे अपेक्षाकृत छोटे और आसानी से पेश कर रहे हैं । वे वयस्क चरणों के लिए जल्दी से विकसित कर सकते है और उनके भ्रूण दवा स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम हैं । क्षेत्र आसानी से बढ़ रहा है और अधिक साहित्य सुलभ होता जा रहा है । एक तेजी से गति और transgene प्रतिदीप्ति रिपोर्टर लाइनों के एक बहुतायत में जीन नॉकआउट उत्पंन करने की क्षमता के साथ, zebrafish के लिए विकल्प ही चुना अनुसंधान प्रश्न से रोका है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक zebrafish पशुपालन और तकनीकी सहायता के लिए Katrin Bennewitz और मार्लिन Hausner का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । लेखक जैव चिकित्सा और चिकित्सा प्रौद्योगिकी मैनहेम (DFG 91027/9-1) के लिए केंद्र में कोर सुविधा लाइव सेल इमेजिंग मैनहेम के समर्थन को स्वीकार करते हैं । इस अध्ययन ड्यूश Forschungsgemeinschaft (अंतर्राष्ट्रीय अनुसंधान प्रशिक्षण समूह 1874/1 "DIAMICOM", परियोजना SP5 और SP9 द्वारा समर्थित किया गया था; सहयोगी अनुसंधान केंद्र SFB1118, परियोजना B1 और सहयोगी अनुसंधान केंद्र SFB/TR23 परियोजना Z5) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaOH Roth 6771.3
KCl Merck 1.04936
CaCl2*6H20 Roth 5239.2
MgSO4*7H20 Merck 1.05886.0500
Paraformaldehyd Roth 0335.3
Sodium dihydrogen phosphate Roth 2370.1
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine) Sigma A5040
PBS Roth 9143.1
Agarose Roth 2267.3
Fluoromount-G Thermo-Fischer 00-4958-02
Petri dish Greiner Bio one 633180
Six-well plate StarLab CC7682-7506
Needle MSG Praxisbedarf BD 300900
Micro Tweezer World Precision Instruments 14095
Microdissection Scissor World Precision Instruments 501778
Glass slide Carl Roth H872.1
Coverslip 22mmx22mm neoLab 103512222
Scalpel MSG Praxisbedarf FEA111
Epi-Illumination Leica 10446389
Fluorescence stereomicroscope MZ10 F Leica NA
Confocal laser-scanning microscope SP5 DS Leica NA
Stereomicroscope M80 Leica NA
Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype NA NA see Reference 15
Mayer’s hematoxylin Dr. K. Hollborn & Söhne 0088663
0.5% eosin Dr. K. Hollborn & Söhne NA
99,9% ethanol Roth 9065.2
Paraffin Merck 1,071,501,000
Xylol Roth 4436.2
Acetone Emsure 606-001-00-8
Microtome RM 2165 Leica NA

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एक मछली की आंखों के माध्यम से मधुमेह का अध्ययन: Microdissection, दृश्य, और वयस्क टीजी (fli: EGFP) Zebrafish रेटिना Vasculature का विश्लेषण
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Wiggenhauser, L. M., Kohl, K.,… More

Wiggenhauser, L. M., Kohl, K., Dietrich, N., Hammes, H. P., Kroll, J. Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature. J. Vis. Exp. (130), e56674, doi:10.3791/56674 (2017).

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