Summary
Her diskuterer vi en metode-protokoll som tillater en enkel analyse av voksen tg(fli:EGFP) sebrafisk retinal blodkar som en rask lese-out i innstillingene av langsiktig vascular sykdommer knyttet til neoangiogenesis og strukturelle endringer.
Abstract
Diabetisk retinopati er den ledende årsaken til blindhet blant middelaldrende voksne. Økende utbredelsen av diabetes over hele verden vil gjøre forebygging av diabetiker mikrovaskulær komplikasjoner en av nøkkelen forskning innen de neste tiårene. Spesialisert, målrettet terapi og romanen terapeutiske narkotika for å håndtere det økende antallet pasienter i fare for synstap. Sebrafisk er en etablert dyremodell utviklingsmessige forskning spørsmål med økende relevans for modellering metabolsk multifaktoriell sykdom prosesser. Fordelene med de tillate optimal visualisering og høy gjennomstrømning narkotikarelaterte screening tilnærminger, kombinert med sterke evne å slå ut gener rundt. Her beskriver vi en protokoll som tillater enkel analyse av voksen tg(fli:EGFP) sebrafisk retinal blodkar som en rask lese-out i innstillingene av langsiktig vascular sykdommer knyttet til neoangiogenesis eller fartøy skade. Dette oppnås via Disseksjon av sebrafisk netthinnen og hele-montering av vev. Visualisering av eksponert fartøyene oppnås deretter via AC confocal mikroskopi av grønne EGFP reporteren uttrykt i den voksne retinal blodkar. Riktig håndtering av vev vil føre til bedre resultater og mindre interne fartøyet brekkasje å sikre visualisering av uendret Vaskulær struktur. Metoden kan benyttes i sebrafisk modeller av netthinnen vasculopathy knyttet til endringer i fartøyet arkitektur samt neoangiogenesis.
Introduction
Diabetes mellitus er en metabolsk sykdom definert av hyperglykemi dysfunksjonelle insulinsekresjon eller utilstrekkelig vev svar utskilles insulin. WHO anslår at 422 millioner voksne bodde med diabetes mellitus i 20141 og utbredelsen av diabetes over hele verden er ventet å øke 8-10% av befolkningen til 20352, gjør diabetes ett av feltene nøkkelen forskning i den neste tiår. Leve med kronisk høyt blodsukker fører til langsiktig mikrovaskulær komplikasjoner, inkludert diabetisk retinopati, nephropathy og Polynevropati. Behandling og forebygging av disse komplikasjonene er vanskelig; Faktisk, diabetes er blitt den hyppigste årsaken til end-stage renal disease (ESRD), som fører til dialyse2, og diabetes er den ledende årsaken til blindhet blant middelaldrende voksne3.
De opprinnelige årsakene til mikrovaskulær skade i diabetiker øyet er kronisk hyperglykemi, metabolske forandringer, samt visse risikofaktorer (f.eks, hypertensjon, dyslipidemi) fører til vaskulær endotelial dysfunksjon, pericyte frafall, og kapillær regresjon som resulterer i acellular vaskulær ermer. Den resulterende retinal iskemi er årsaken til neovascularization og økt vaskulær permeabilitet fremme utviklingen av proliferativ diabetisk retinopati (PDR)4. Diabetisk retinopati fant generelt i 37% av diabetespasienter, mens sight-truende diabetisk retinopati ble konstatert i 12% av vist hvit europeiske kohorten i UKADS studie5. Den nåværende behandlingen kan bare hindre ytterligere komplikasjoner og er ikke fullt gjenopprette allerede indusert skaden. Panretinal photocoagulation, i tillegg til glykemisk kontroll, er standard terapi for proliferativ diabetisk retinopati (PDR), men påvirker den nærliggende sunt vev også. Anti-VEGF intervensjoner viser lovende resultater som alternativer til laser behandling6,7, men til slutt, spesialiserte, målrettet terapi og nye stoffer er nødvendig for å håndtere det økende antallet pasienter i fare for synstap.
Etablerte Forsøksdyrutvalget modeller av diabetisk retinopati deler ikke alle aspekter av menneskelig patofysiologi. Utnyttelse av det korrekte Art å løse bestemte krav fra det vitenskapelige spørsmålet er en av de mest betydelige delene av eksperimentelle. Sebrafisk embryoet (Danio rerio) er allerede mye brukt i utviklingsmessige forskning og gir en optimal praktisk bakgrunn å pusse eller knockout bestemte gener via morpholinos eller CRISPR/Cas9 teknikk8. Disse metodene kan enkelt brukes i sebrafisk å undersøke genene, som ble identifisert av storskala genomet hele association studier (GWAS), genererer innsikt i bestemte mekanismer av sykdomsprogresjon og mottakelighet9. Kort generasjonsskifte tid, store mengder avkom, lett og rimelig håndtering og voksende analysen støtte har økt relevansen av sebrafisk modell, spesielt på grunn av sin store potensial for modellering metabolsk sykdom. Bevaring av biologiske mekanismer i sebrafisk har vist som grunnlag for utvikling av farmakologisk behandling. For eksempel har antidiabetika stoff metformin og kolesterolsenkende simvastatin vist å "behandle" forhold i modeller av leiren/deksametason-indusert høy PEPCK uttrykk og høy-kolesterol diett-indusert hyperkolesterolemi10 , 11 , 12. dette fremmarsj innsikt i overordnet bevarte metabolske mekanismer støttes videre av det økende antallet sebrafisk diabetes modeller, gjennom eksperimenter som: vekslende inkubasjon i glukose løsninger, Streptozotocin-indusert ablasjon beta celler, nitroreductase-mediert beta-celle ablasjon bruker prodrug metronidazole, monogenic diabetes formidlet via pdx1 gene knockdown eller knockout, samt modeller av økt insulinresistens i skjelettlidelser muskel 12. dette allerede etablert protokoller, ovennevnte detaljene av arter, og muligheten til å effektivt manipulere genomet i et stort antall prøver alle demonstrere fordelene sebrafisk for å studere mekanismer kjører komplekse sykdom prosesser samt evnen til skjermen for farmakologiske intervensjoner.
En generell forståelse av grunnleggende sebrafisk øye anatomien (figur 1) er nødvendig for dissector for å utnytte sebrafisk som en modell for retinal angiopathy. Sebrafisk øyet har seks extraocular muskler, fire rectus og to skrå muskler setter på utsiden av verden på sclera13. Hornhinnen gjennomsiktig vevet dekker objektivet og fortsetter direkte i sklera, som danner den ytre skallet av øyet. Sclera er ikke-transparent, har en delvis lys reflekterende overflate og er sterkt pigmentert. Selve linsen er mer ball-formet enn den menneskelige motparten. Netthinnen består av tre kjernefysiske lag neuronal celler mens er oksygen-gir retinal blodkar er nært forbundet med indre ganglion celle laget, men ikke utgjør et subretinal nettverk. Choroidal fartøy, derimot ligger mellom sclera og netthinnen og er forbundet med retinal pigmentert epitel (RPE). Denne capillary nettverket leverer oksygen til de ytre delene av netthinnen14.
Figur 1: skjematisk fremstilling av voksen sebrafisk øyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Grei visualisering av netthinnen blodkar kan oppnås ved bruk av transgene tg(fli:EGFP) sebrafisk linje15. Grønne fluorescerende protein uttrykt under kontroll av den fli utbyggeren i endotelceller av er blodkar er grunnlaget for visualisering via en laserskanning mikroskopet i senere trinn. Dette oppnås via Disseksjon av sebrafisk netthinnen og hele-montering av vev. Denne transgene modellen gir en rask vaskulær avlesning uten noe program for intravascular merking eller hele-mount immunohistochemistry. Analysere diabetisk retinopati i sebrafisk, skal en trinnvis og standardisert forberedelse rutine brukes av alle dissector.Følgende forberedelser protokollen gir andre forskningsgrupper muligheten til å enkelt vurdere vaskulære endringene i utsatte fartøyer av voksen sebrafisk øyet og gi veiledning til å etablere en optimalisert disseksjon rutine for sebrafisk netthinnen.
Protocol
Alle prosedyrer, inkludert trinnene gjelder dyr fag og er godkjent av dyr etikk (Regierungspräsidium Karlsruhe) følger retningslinjene dyr omsorg Heidelberg University.
1. utarbeidelse av bindemiddel (4% PFA/PBS)
- Forberede etappe, den stabiliserende fersk hver dag å sikre optimal bevaring av histologiske vev integritet.
- Oppløse 0.2 g natriumhydroksid (NaOH) i 90 mL dobbel destillert vann (ddH2O) mens hele tiden rører ved romtemperatur.
- Legg 4 g paraformaldehyde (PFA) og rør til løsningen er helt klart i minst 5-10 min å sikre depolymerization av makromolekyler.
Forsiktig: PFA er giftig, håndteres med forsiktighet. - Oppløse 0.84 g av natrium dihydrogen fosfat (NaH2PO4) i løsningen og kontrollere pH på 7,2 via måling.
- Juster volumet til 100 mL med ddH2O og filtrere løsningen gjennom klasse 3 filter papir.
- Lagre 4% PFA/PBS på is.
2. forberedelse Euthanasia løsning
Merk: Følgende ble gjort med ABTL vill-type sebrafisk belastning i en generell alder av 6-8 man.
- Bruk ethyl 3-aminobenzoate metan sulfonate, også kalt "tricaine" eller MS-222, i en konsentrasjon av 0.31 mg/mL sebrafisk euthanasia16. Bruke 1 x egg vann, brukes til å heve sebrafisk embryoer, som løsningsmiddel for euthanasia løsningen. Vanligvis kontrollere riktig anestesi dybden før du arbeider med bedøvet fisk ved å demonstrere tap av likevekt og touch reaksjon tap.
- For å oppnå 1000 mL 10 x egg vann, legge disse salter til 1000 mL dobbel destillert vann (ddH2O) mens stadig røring i følgende rekkefølge: 10 g NaCl, 0,3 g KCl, 0.4 g CaCl2 *6 H2O, 1.32 g MgSO4 *6 H2O.
3. fiksering av sebrafisk vev
- Overføre 6 mL 4% PFA/PBS løsning per prøve i brønnene for seks brønnslisser plater på forhånd.
- Euthanize voksen sebrafisk (tidligere vedlikeholdes på en standard lys-dagers syklus, f.eks12 h: 12t) 2t etter lysene slår på i morgen, ved å plassere dem i tricaine løsningen og vente til de har nådd euthanasia. Etter opphør av opercular bevegelse, som kan ta opptil 10 min.
- Ta fisken ut av tricaine euthanasia løsningen og sette dem på fersk papirhåndklær. Tørk fisken og bruke skalpell for å kutte hodet bak bløtdyr (se figur 2A). Overføre hodene direkte inn prepped godt platene, som inneholder den nylagde bindemiddel.
- Store godt platene som inneholder fisk hodene på 4 ° C over natten for minst 24 timer å sikre bindemiddel trenger de dypere retinal lag.
Merk: Sebrafisk hoder kan lagres i opptil 48 timer i 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) i 4 ° C før forberedelse uten relevante tap fluorescens signalstyrke. Økt ventetid kan føre til tap av vev integritet og redusert bildekvalitet, og dermed bør unngås.
4. forberedelse av sebrafisk Retinal blodkar
- Fylle en Petriskål opp til en tredjedel med oppvarmet 2% agarose, og vent til agar er fast. Dekk agar platen med 1 x PBS å opprette et arbeidsområde for å analysere øynene.
Merk: Dette vil tillate begge bevaring av forberedelse pinsett og lavt trykk på vev mens dissekere, redusere sannsynligheten for strukturell skade. Alle ytterligere forberedelsene skal utføres i arbeidsområdet bruker #5 rett tang med fine tips under dissecting mikroskop med ekstra epi-belysning.- Mens dissekere, bruke forstørrelsen mellom 4.0 x og 6.0 x for både oversikt og detaljorientert vurdering av vev.
- Overføre fast prøven i Petriskål og holder hodet på kutt overflaten med en tweezer, før en annen festet sammen tweezer under øyeeplet på orbital hulrom. Langsomt åpne tweezer under øyet og grep synsnerven, så nøye rive og ta øynene (figur 2B).
Figur 2: fjerning av voksen sebrafisk øyet. Hornhinnen sidevisning med øynene fortsatt i orbital hulrom og intakt synsnerven (A). Hornhinnen sidevisning med frittstående øye (B). Skjematisk fremstilling av sebrafisk øyet på dette trinnet (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Fjern de fire rectus og to skrå extraocular muskler er fortsatt tilkoblet i øyet, samt gjenværende extraocular vev koble øyet orbital hulrommet (sammenligne Figur 3 og Figur 4).
- Oppnå dette ved å holde tilbake øyet gjennom en halv-lukkede tweezer og gripende strukturen med de andre tweezer, sakte rive det av med en mål bevegelse. Siden gripende øyeeplet direkte fører til interne fartøyet brekkasje, er denne teknikken riktig lett å bevare er blodkar.
Figur 3: voksen sebrafisk øye med extraocular musklene i fokus. Lateral visning med vedlegg av en extraocular muskelen til venstre ytre felgen av okulære verden i fokus (A). Synsnerven sidevisning med extraocular muskler symmetrisk flankert synsnerven (B). Skjematisk fremstilling av sebrafisk øyet på dette trinnet (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruk en 27G (0,4 x 19 mm) disponibel nål for å punktere hornhinnen (figur 4C, rød pil) på ytre området. Gjennom denne åpningen holder hornhinnen med både pinsett og litt rive det åpne. Etterpå nøye arbeidet med å skape en midtstilt rive omtrent på størrelse med respektive Eleven.
Figur 4: voksen sebrafisk øye etter fjerning av alle extraocular musklene. Lateral visning med ryddet ytre kanten av okulær globe synlig (A).Synsnerven sidevisning med synsnerven i midten. Lys-reflekterende sclera ikke dekker hele området rundt nerve (rød stiplet linje) (B). Skjematisk fremstilling av sebrafisk øyet på dette trinnet (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruk Trykk på hornhinnen side av okulære verden (bulbus oculi) på ytre hornhinnen over iris. Dette oppretter en liten bulk og presse linsen til høyden på hornhinnen tåre. Kjør pinsett under objektivet og fjerne den (figur 5A).
Figur 5: voksen sebrafisk øye under linsen fjerning. Hornhinnen sidevisning med objektivet presset gjennom hornhinnen rive (A). Hornhinnen sidevisning med linsen ved okulær verden (B). Skjematisk fremstilling av sebrafisk øyet på dette trinnet (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Slå øyet opp ned til den optiske nerven overfor forskeren. Merk at sclera og hornhinnen er koblet og danne fibrøs tunika av øyet pære for å beskytte kopp netthinnen. (Figur 6).
- Dette skallet, som består av hornhinnen og sclera, kalles også "corneosclera" og deler ut området rundt synsnerven (figur 4B, rød stiplet linje). Sett inn en nål på denne seponering når skape en åpning mellom sclera og netthinnen.
Figur 6: Corneosclera bestående av sclera og hornhinnen, som er koblet fra gjenværende intraokulært vevet. Hornhinnen sidevisning viser videreføring av gjennomskinnelig hornhinnen i pigmentert sclera (A). Lateral Vis fokusert på Innbukking del av corneosclera (B). Skjematisk fremstilling av det fjernet corneosclera (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruker denne tilgangen med både pinsett, nøye rippe sclera aksialt i striper øke åpningen rundt synsnerven. Pass på å holde corneosclera intakt på overgangen til hornhinnen siden omkretsen (se figur 6A).
- Hold sclera med en tweezer og, ved å flytte den optiske nerven med hverandre og trekke unna, helt fjerne corneosclera fra øyet og kaste den (figur 6). Prøv å bryte alle tilkoblinger før skille corneosclera og de resterende intraokulært vev, som vedlegg til andre strukturer blir et kritisk punkt; Dette trinnet vil gi en cup-formet struktur som består av uvea og netthinnen som inneholder er netthinnen blodkar (figur 7).
- Opprette et brudd i choroidal/RPE laget ved å holde en 27G strikkes sidelengs til gjenværende cup mens skraping ytre overflaten med kanten av pinne-spissen. Bruk brudd som et tilgangspunkt å få tak på choroidal/RPE laget og rive den med begge pinsett i striper, men beholder koblingen til iris.
- Etterpå, kjøre en tweezer under iris og går i en krets utenfra mens skaper spenning ved å trekke på nedlagte choroidal/RPE laget å oppnå avdeling av kombinerte strukturen.
Merk: Iris må være koblet fra, slik at den ikke hindrer fluorescens mens visualisere fartøyene (figur 8B). Flytte iris for å fjerne det kan føre til omfattende fartøyet skade, spesielt på den indre fiberoptiske sirkelen (IOC), siden iris er fremdeles koblet til de omkringliggende vev. Choroidal laget og retinal pigmentert epitel (RPE) kan deles og ofte Behold forbindelsen til iris, som tillater en enkel sekundære fjerning. - Hvis deler av iris ikke kan fjernes, kan du bruke en naturlig bristepunktet voksen sebrafisk øyet utstillinger innenfor det photoreceptor laget (PL), på en lignende måte til trinn 4.9, fjerne iris.
- Skrape over utsiden av gjenværende kopp netthinnen å indusere discontinuations i PL over bristepunktet (figur 11C, svarte pilen). Bruker du opprettet tilgang fjerne øvre del av laget samtidig mulig tilkobling til iris intakt. Etterpå kjøre pinsett under iris og gå rundt i en krets som nevnt før koble sammen strukturen.
Merk: Man bør utvise tålmodighet som hele trinnet 4,9 kan være vanskelig, men denne omsorg vil oppnå et bedre vaskulær resultat enn oversiktlig fanget iris ved kanten av eleven eller tvinge en åpning ved å ødelegge tilkoblinger til choroidal/RPE eller photoreceptor lag uten deres respektive fjerning. Etter dette trinnet vil dermed bevare netthinnen vaskulær integritet, men skades av ytre retinal lag.
- Etterpå, kjøre en tweezer under iris og går i en krets utenfra mens skaper spenning ved å trekke på nedlagte choroidal/RPE laget å oppnå avdeling av kombinerte strukturen.
Figur 7: voksen sebrafisk øye etter fjerning av corneosclera. Lateral viser gjenværende intraokulært vevet med intakt iris og synsnerven (A). Hornhinnen sidevisning med iris i fokus (B). Skjematisk fremstilling av sebrafisk øyet på dette trinnet (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruk en microdissection våren saks med en rett 2,5 cutting edge for å klippe synsnerven så nær som mulig til netthinnen; Dette vil tillate en bedre flat-montering av vev.
Figur 8: voksen sebrafisk øye etter fjerning av RPE/akkord og avkortede synsnerven. Synsnerven viser side netthinnen med en avkortet synsnerven (A). Hornhinnen sidevisning med et direkte på det mest innerste laget av netthinnen (B). Skjematisk fremstilling av sebrafisk øyet på dette trinnet (C).Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. montering av netthinnen blodkar
- Vask dissekert netthinnen to ganger i 5 minutter i 1 x PBS. For å overføre netthinnen etter trunkering av synsnerven, utnytte en lab slikkepott med en mikro skjeen slutt direkte håndtering av eksponert vev.
- Plasser en dråpe PBS på et glass lysbilde og overføre netthinnen i slippverktøyet. Bruk en tweezer for å holde vevet i stedet mens kutte kopp strukturen med skalpell å opprette en flat fire-bladet eller fem-petal figur avhengig retinal (se figur 9).
- Suge opp leftover PBS med en fin stykke papir. Være forsiktig med å ta netthinnen.
- Coat flat-montert netthinnen i monterer medier og dekk med en dekkglassvæske. Være oppmerksomme ikke å lage skum, som luftbobler kan forvrenge visualisering av netthinnen fartøyene.
- Minimere bevegelse av dekkglassvæske og forsegle dekselet med klart neglelakk.
6. visualisering av netthinnen blodkar
- Hold den tid gapet mellom Creation og visualisering så kort som mulig å redusere bilde detalj tap gjennom fluorescens signaltap. Lagre forberedt retinal blodkar mounts på 4 ° C å redusere signaltap, hvis direkte visualisering ikke kan oppnås, degradering av bildekvalitet langsomt blir synlig 48 timer etter forberedelse.
- Visualisere retinal blodkar mounts via fluorescens mikroskopi eller laser skanning AC confocal mikroskopi.
Merk: Fartøyet visualisering av fluorescens mikroskopi ble oppnådd på 2,5 x forstørrelse med en eksponeringstid 2.0 s, gevinst på 6.0 x og gamma innstillingene for 1,67. For AC confocal mikroskopi, en Ar-laser (488 nm/20 mW) på 20% strøm ble utnyttet i kombinasjon med en TD 488/543/633 eksitasjon filter, en 20 x / 0,7 NA multi nedsenking mål med ddH2O nedsenking media og utslipp filterinnstillingene for 505-560 nm. AC confocal bilder består av 4 x 4, 4 x 5 eller 5 x 5 entall bilder kombinert gjennom en flis skanning avhengig netthinnen.
7. han deler av sebrafisk netthinnen
Merk: Han deler av sebrafisk netthinnen, forberede vevet som beskrevet i protokollen trinn 4.5 og etterpå går direkte til trinn 7.1.
- Vask enucleated øynene (etter trinn 4.5) to ganger i 5 minutter i 1 x PBS. Etterpå overføre vevet til 70% etanol (EtOH). På dette punktet, kan utarbeidet øyne lagres på 4 ° C før parafinen innebygging.
- Vask vev på følgende måte å tørke den før parafinen innebygging: 2 x 15 min med 80% etanol, 2 x 15 min med 90% etanol, 3 x 15 min med 96% etanol, 3 x 15 min i 99% etanol, 2 x 15 min med acetone/99% etanol (1:2), 3 x 15 min med aceton. Hold vevet i parafin på 62 ° C over natten.
- Varm opp frisk parafin til 62 ° C og hell den i innebygging muggsopp. Overføre vevet i formene direkte og en rask tempo, kontroll riktig retning av øynene for delen. Etterpå bruk en innebygging kassett til mold og dekke med flere oppvarmet parafin.
- Fjerne innebygging formene etter at parafin blokker har avkjølt. Skjær parafinblokkene på en mikrotom i 10 µm seksjoner og flyte dem ut på en 45 ° C vannbad på vannflaten lenge nok for dem å flate helt.
- Fange delene på et glass lysbilde og avløp dem vertikalt for å fjerne overflødig vann før tørking dem over natten i en ovn ved 45 ° C.
- Prosessen delene videre med følgende tidsplan til deparaffinize og han flekken: 4 x 1 min i xylol, 1 x 1 min i 99% etanol, 1 x 1 min i 96% etanol, 1 x 1 min i 80% etanol, 1 x 1 min med 70% etanol, 1 x 1 min i ddH2O, 1 x 4 min i Mayer hematoxylin , 1 x 10 minutter i ddH2O, 1x2min i 0,5% eosin, 1 x 30 s i ddH2O, 1 x 30 s i 80% etanol, 2 x 30 s i 96% etanol, 3 x 1 min i 99% etanol, og 1 x 1 min i xylol.
- Ta av objektglass av xylol og raskt dekke vevet med montering media. Unngå for å la vevet tørke helt ut, plassere en dekkglassvæske på toppen og forsegle farget vevet.
Representative Results
Her viser vi to typiske morfologiske eksempler på netthinnen blodkar i voksen tg(fli:EGFP) sebrafisk: Når visualisert fluorescens mikroskop (figur 9A) og en gang med en AC confocal laserskanning mikroskopet (figur 9B). Avdekket retinal strukturen viser et svært organisert mønster. Sterk autofluorescence er sett i sebrafisk netthinnen, når visualisert med fluorescens mikroskop. Dermed anbefales en visualisering av bare vaskulær laget via en AC confocal scan å redusere bakgrunnen fluorescens og øke kontrasten. For raskere bilde oppkjøpet eller situasjoner der kvalitative data er nok, er fluorescens mikroskopet et attraktivt alternativ.
Figur 9: representant bilder av voksen tg(fli:EGFP) sebrafisk retinal blodkar. To typiske morfologiske eksempler på netthinnen blodkar vises: sentrale fiberoptisk arterien sprenges inn i 5-7 største skip, som deretter forgrening til en rekke arkader. Alle ytterligere fartøy renne i omkrets venen (CV) begrense av hvert kronblad. Visualisering via fluorescens mikroskopi på 2.5 x forstørrelse (A). Visualisering av er netthinnen blodkar ved bruk av AC confocal laser mikroskopi gjennom en kombinert 5 x 5 enkeltbilde flis skanning (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fiberoptisk arterien trenger netthinnen ved synsnerven, og i de fleste prøver, sprenges inn i 5-7 viktigste fartøy (figur 10A). Viktigste fartøyene deretter armen i en rekke arkader og koble til indre fiberoptisk sirkelen (IOC), også kalt omkrets venen (CV), omringe fiberoptisk platen i utkanten av flat montert netthinnen (se figur 10B). IOC er venøs fartøyet som drenerer arteriell blod på av okulære verden (bulbus oculi). Sebrafisk retinal blodkar viser også områder med høy vaskulær aktivitet med forgrening av kapillærene og angiogenic spirende (figur 10C). Denne vaskulær aktiviteten ligger hovedsakelig i nærheten til IOC. Det er viktig å merke at samme øyet kan vise både høyt og lavt vaskulær aktiviteter i ulike regioner av netthinnen (sammenligne figur 10B og figur 10C). Generelt, viser er netthinnen blodkar av sebrafisk mer avascular plass og færre kapillærer mellom de viktigste grenene hvis sammenlignet, for eksempel netthinnen mus17. Begge øynene til hvert utvalg bør analyseres fordi er blodkar kan variere mellom og entall inspeksjon kan føre til skjevhet.
Figur 10: forstørret områder av voksen tg(fli:EGFP) sebrafisk retinal blodkar visualisering. Fiberoptisk arterien forgreninger inn i hoved fartøy (A). Netthinnen kapillærene i et område med lav vaskulær aktivitet kobler til den indre fiberoptiske sirkelen (IOC) nederst på bildet (B). Netthinnen kapillærene i et område med høy vaskulær aktivitet koble til IOC (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En svært bevart arkitektur neuronal lag finnes allerede i sebrafisk fra omtrent 72 h legge befruktning (hpf) og utover18. Voksen sebrafisk netthinnen viser følgende lag fra innsiden og ut (Figur 11): ganglion celle lag (GCL), indre plexiform lag (IPL), indre kjernefysiske laget (INL), ytre plexiform lag (OPL), ytre kjernefysiske lag (bare), photoreceptor lag (PL), og retinal pigmentert epitel (RPE). Estimering av vaskulær parameterne fra netthinnen blodkar visualisering er vist i Figur 12. Den indre retinal blodkar ligger på ganglion celle lag (GCL) (figur 13B, hvit boks) før den choroidal kapillærer ville bli assosiert med retinal pigmentert epitel (RPE).
Figur 11: han flekker av voksen sebrafisk øyet. Tverrsnittsstudier oversikt over hele øyet etter fjerning av objektivet (A). Netthinnen lag av voksen sebrafisk øye19 (B). Indikasjon (svart pil) på naturlige bristepunktet i PL (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Modeller av hypoksi-indusert retinal neoangiogenesis viser økte antall forgrening poeng, angiogenic spirer, vaskulære areal og redusert intercapillary avstand i sebrafisk20. Disse resultatene støtter ideen om at sebrafisk er utsatt for diabetiker mikrovaskulær komplikasjoner21, som Hovedfunnene i senere diabetisk retinopati hypoksi-mediert neoangiogenesis, som er sterkt knyttet til VEGF uttrykk. Hyperglykemi-induserte endringer i sebrafisk netthinnen føre til økt tykkelse av fartøyene, men opprettholde totalt mønstre22. Vekslende nedsenking i glukose løsninger for 30 dager også minsker tykkelsen av IPL og INL23. Direkte påvirkning av glukose metabolitter i sebrafisk som metabolsk dreide seg om vasculopathy ble også allerede vist. Flere vaskulær hyperbranching ble observert i bagasjerommet blodkar av sebrafisk embryo etter inkubasjon med methylglyoxal24. For øyeblikket finnes det ingen dyr modell som gir alle de viktigste kriteriene for diabetisk retinopati. Tidlig endringer er ofte grunnlegge, men fremdriften til proliferativ diabetisk retinopati mangler25. Sebrafisk faller også i denne definisjonen som vi har bare sett hypoksi-mediert neoangiogenesis eller hyperglykemi-induserte endringer før nå. Gjeldende resultatene støtter ideen om at sebrafisk er utsatt for hyperglykemi-mediert vaskulære endringene og som en dyremodell kan potensielt vise fremdrift til proliferativ diabetisk retinopati. Avhengig av styrke og eksponering for hyperglykemi-mediert effekten, kan rett eksperimentelle modellen føre til iskemi i visse områder av sebrafisk netthinnen og fremme neoangiogenesis som de viktigste kriteriene for proliferativ diabetisk retinopati. Men som sebrafisk er en relativt ny spiller innen modellering langsiktige mikrovaskulær patologi, vil kommende diabetes modeller i sebrafisk gi ytterligere informasjon og avklare sin betydning i forhold til andre modeller og deres patologi. For eksempel kan en på tvers av tg(gata1a:DsRed) sebrafisk med rød-merket erytrocytter i tg(fli:EGFP) linje brukes samtidig visualisere potensielle intraokulært bleedings i fremtiden sebrafisk modeller viser microaneurysms som en prediktor for progresjon til PDR.
Siden er netthinnen blodkar utvikler seg til en rekke arkader, evaluering av intervascular avstand, forgrening poengsummen og det totale vaskulære området er relatert til avstanden fra sentrale fiberoptisk arterien. For å unngå skjevhet i vurdert vaskulær parameterne, kreves det et punkt av orientering. IOC er slik struktur og svært relevante siden virksomhetsområder vaskulær ligger i romlig nærheten. For konsekvent vurdering, skal netthinnen skanningen deles inn i flere rektangulært bildedeler med en konstant avstand til IOC. Hele netthinnen bør bli analysert og bilder numerisk symmetrisk distribuert. Sebrafisk netthinnen viser områder med høy og lav kapillær tetthet og en ulik fordeling av bildet kan føre til ytterligere bias.
Figur 12: eksempel presentasjon av vaskulær parametere som avlesning av netthinnen blodkar visualisering. Måling av intervascular avstand (rød dobbeltpil) nær indre optisk sirkel (IOC) (A). Tre branching punkt (røde sirkler) i nærheten av IOC (B). Visualisering av sebrafisk retinal blodkar med et forstørret område (rød boks) viser en spirende fartøy (C). Fartøyet diameter målt over en viss avstand (hvit dobbeltpil) fra sentral-arterien (hvite kors) (D). Fartøyet tetthet er prosentandelen av netthinnen område okkupert av overliggende fartøy (diagonalt røde linjer) (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å måle intervascular avstanden, må angi en viss avstand til IOC som standard (figur 12A, hvit dobbeltpil) og trekke en imaginær vannrett linje (tallet 12A, vannrett hvit strek) parallell til IOC. Avstanden mellom fartøyene på denne linjen lagt opp og aritmetisk gjennomsnitt lik intervascular avstand. Forgrening poeng telles i hvert bilde når et fartøy deler og flere vaskulær lumen fortsette fra nullpunktet. Dette omfatter også vannrett forbindelser mellom kapillærer. Det er viktig å samsvar med analyse og avgjøre hvilke forgrening poeng å telle og holde disse reglene gjennom hele eksperimentet å redusere unødvendige variasjon. Vaskulær spirende, er som vist i figur 12C, en parameter som kan telles på hvert bilde for å evaluere innflytelse på netthinnen blodkar. Angiogenic spirer følger ikke arkade-lignende Arvefølgen mellom sentral-arterien og IOC og fokus i de ytre delene av netthinnen. For å vurdere visse fartøy diameter, et punkt av orientering er alltid nødvendig som en angitt avstand markerer målingen spot. Sentral-arterien opprinnelse i netthinnen tilbyr slike for største stammen fartøyene (Figur 12, hvite kors). Området okkupert av fartøy (figur 12e, ruter, diagonale røde linjer) som en prosent av hele retinal området er vaskulær tetthet og korrelerer indirekte til avascular området.
En fullstendig AC confocal skanning av ett utvalg bør bestå av flere høydetaljert bilder å tillate visualisering av små kapillært hypersprouting. For å optimalisere tiden og ressursene på dette trinnet, skal en automatisert tilling prosedyre brukes med en generell skanning dybde for hver brikke. Ujevn montering av netthinnen kan øke tiden for å skanne er blodkar med AC confocal mikroskop. Optimale tilnærming man ønsker å bare skanne vaskulær lag (figur 13B, hvit boks), men delvis inkludering av GCL er ofte nødvendig.Forlate en overflødig lengden av synsnerven etter trunkering, samt kutt å oppnå flat-mount er for kort, kan føre til ujevn montering.
Figur 13: sammenligning av han flekker og autofluorescence i voksen sebrafisk netthinnen. Netthinnen blodkar i fokus over GCL (A). Netthinnen blodkar (hvit boks) viser grønn et EGFP signal og retinal lag stille sterke autofluorescence (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Riktig utarbeidelse av sebrafisk retinal blodkar trenger tidligere opplæring, en liten utvalgsstørrelsen utrente dissectors og sterkt varierende forberedelse resultater er en viktigste begrensningen av teknikken. Mens utarbeidelsen av tg(fli:EGFP) sebrafisk øyne gir rask innsikt i delstaten er blodkar, benytter teknikken fortsatt rundt 20 min arbeidet tid per netthinnen for en erfaren forsker. Alle disse forberedelsene for er netthinnen blodkar må utføres under dissecting mikroskop og dissectors måtte bo konsentrert hele tiden som en uforsiktig trinn kan potensielt indusere fartøyet brekkasje. Dissector skal øve regelmessig som lengre fravær fra forberedelse reduserer en dissector sannsynligheten for opprettholde fartøyet integritet.
Videre er mer avlesning via immunohistochemistry (IHC) fortsatt begrenset, som bare et lite antall antistoffer godkjent på menneskelige og gnager vev arbeider med sebrafisk. Forskere interessert i IHC rådes til å søke etter sebrafisk-spesifikke antistoffer, spesielt når du arbeider med nye mål. Alternativt, det anbefales å bruke ekstra sebrafisk reporter linjer som er nyttig å studere celler utenfor blodkar i øyet. Denne strategien er imidlertid tidkrevende, som det tar noen måneder generere voksen sebrafisk linjer som bærer flere transgene journalister.
Likevel, sebrafisk utgjør et unikt utvalg av fordeler. De er relativt liten og reprodusere lett. De kan vokse til voksen stadier raskt og deres embryoer er optimale for narkotikarelaterte screening. Feltet vokser lett og flere litteratur blir tilgjengelig. Muligheten til å generere genet fortrenging på en rask hastighet og en overflod av transgene fluorescens reporter linjer, er valget for sebrafisk bare hemmet av valgte problemstillingen.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Katrin Bennewitz og Marlene Hausner for sebrafisk husbandry og teknisk assistanse. Forfatterne bekrefter støtte fra den kjernen anlegget Live celle Imaging Mannheim i sentrum for biomedisin og medisinsk teknologi Mannheim (DFG INST 91027/9-1). Denne studien ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (International forskning trening gruppe 1874/1 "DIAMICOM", prosjektet SP5 og SP9; Collaborative Research Centre SFB1118, prosjekt B1 og samarbeidende Research Centre SFB/TR23 prosjektet Z5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Roth | 6771.3 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| CaCl2*6H20 | Roth | 5239.2 | |
| MgSO4*7H20 | Merck | 1.05886.0500 | |
| Paraformaldehyd | Roth | 0335.3 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Roth | 2370.1 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| PBS | Roth | 9143.1 | |
| Agarose | Roth | 2267.3 | |
| Fluoromount-G | Thermo-Fischer | 00-4958-02 | |
| Petri dish | Greiner Bio one | 633180 | |
| Six-well plate | StarLab | CC7682-7506 | |
| Needle | MSG Praxisbedarf | BD 300900 | |
| Micro Tweezer | World Precision Instruments | 14095 | |
| Microdissection Scissor | World Precision Instruments | 501778 | |
| Glass slide | Carl Roth | H872.1 | |
| Coverslip 22mmx22mm | neoLab | 103512222 | |
| Scalpel | MSG Praxisbedarf | FEA111 | |
| Epi-Illumination | Leica | 10446389 | |
| Fluorescence stereomicroscope MZ10 F | Leica | NA | |
| Confocal laser-scanning microscope SP5 DS | Leica | NA | |
| Stereomicroscope M80 | Leica | NA | |
| Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype | NA | NA | see Reference 15 |
| Mayer’s hematoxylin | Dr. K. Hollborn & Söhne | 0088663 | |
| 0.5% eosin | Dr. K. Hollborn & Söhne | NA | |
| 99,9% ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Paraffin | Merck | 1,071,501,000 | |
| Xylol | Roth | 4436.2 | |
| Acetone | Emsure | 606-001-00-8 | |
| Microtome RM 2165 | Leica | NA |
References
- WHO. Global report on diabetes. , 88 (2016).
- Lim, A. Diabetic nephropathy - complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
- Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
- Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
- Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
- Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
- Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
- Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
- Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
- Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
- Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
- Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
- Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
- Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
- Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).
