Summary
Här diskuterar vi ett metod-protokoll vilket gör att en enkel analys av den vuxna tg(fli:EGFP) zebrafiskar retinala blodkärlen som en snabb avläsning i inställningar långsiktiga vaskulär asbestrelaterade neoangiogenesis och strukturella förändringar.
Abstract
Diabetesretinopati är den ledande orsaken till blindhet bland medelålders vuxna. Den ökande förekomsten av diabetes i världen kommer att göra förebyggande av mikrovaskulära diabeteskomplikationer en av de viktigaste forskningsområden av de nästa årtiondena. Specialiserad, riktad terapi och nya terapeutiska läkemedel behövs för att hantera det ökande antalet patienter med risk för synförlust. Zebrafiskar är en etablerad djurmodell för utvecklingstoxicitet forskningsfrågor med ökande betydelse för modellering metabola multifaktoriell sjukdomsprocesser. Fördelarna med arterna som möjliggör optimal visualisering och hög genomströmning drug screening metoder, kombinerat med stark förmåga att slå ut gener av intresse. Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör enkel analys av den vuxna tg(fli:EGFP) zebrafiskar retinala blodkärlen som en snabb avläsning i inställningar långsiktiga vaskulär asbestrelaterade skador neoangiogenesis eller fartyget. Detta uppnås via dissektion av zebrafisk näthinnan och hela-montering av vävnad. Visualisering av exponerade fartygen uppnås då via konfokalmikroskopi av gröna andra reporter uttryckt i den vuxna retinala blodkärlen. Korrekt hantering av vävnaden kommer att leda till bättre resultat och mindre inre fartyg brott till försäkra visualisering av oförändrat vaskulär struktur. Metoden kan utnyttjas i zebrafiskar modeller av retinal vaskulopati kopplat till förändringar i det fartyget arkitektur samt neoangiogenesis.
Introduction
Diabetes mellitus är en ämnesomsättningssjukdom som definieras av hyperglykemi som följd av dysfunktionella insulinutsöndringen eller otillräcklig vävnaden svar till utsöndras insulin. WHO uppskattar att 422 miljoner vuxna levde med diabetes mellitus i 20141 och prevalensen av diabetes i världen väntas öka till 8-10% av befolkningen fram till 20352, vilket gör diabetes en av de viktigaste forskningsområden i den kommande decennierna. Att leva med kroniskt högt blodsocker leder till långsiktiga mikrovaskulära komplikationer, inklusive diabetisk retinopati, nefropati och polyneuropati. För hantering och förebyggande av dessa komplikationer är svårt; faktiskt, diabetes blir mest frekventerar orsakar för slutstadiet njursjukdom (ESRD), som leder till dialys2, och diabetes är den ledande orsaken till blindhet bland medelålders vuxna3.
De ursprungliga orsakerna till mikrovaskulära skador i diabetiker ögat är kronisk hyperglykemi, metabola förändringar, samt vissa riskfaktorer (t.ex., hypertoni, dyslipidemi), leder till vaskulära endotel dysfunktion, pericyt avhopp, och Kapillär regression som resulterar i acellulärt vaskulär ärmar. Den resulterande retinal ischemi är orsaken till kärlnybildning och ökad vaskulär permeabilitet främjande av proliferativ diabetesretinopati (PDR)4. Diabetesretinopati upptäcktes generellt hos 37% av patienter med diabetes, medan synhotande diabetesretinopati konstaterades i 12% av skärmad vita europeiska kohorten i UKADS studie5. Den nuvarande behandlingen kan endast förhindra ytterligare komplikationer och är inte helt återställa den redan inducerad skadan. Panretinal fotokoagulation, förutom glykemisk kontroll, är den standard terapin för proliferativ diabetesretinopati (PDR) men påverkar intilliggande frisk vävnad samt. Anti-VEGF interventioner visar lovande resultat som alternativ till laser behandling6,7, men i slutändan, specialiserade, riktad terapi och nya läkemedel behövs för att hantera det ökande antalet patienter med risk för synförlust.
De etablerade djurförsök modellerna av diabetesretinopati delar inte varje aspekt av mänskligt patofysiologi. Utnyttjande av de rätta arterna att ta itu med särskilda krav på den vetenskapliga frågeställningen är en av de mest betydande delarna av den experimentella setup. Zebrafiskar embryot (Danio rerio) används redan i stor utsträckning i utvecklings forskning och ger en optimal praktisk bakgrund till knockdown eller knockout specifika gener via morpholinos eller den CRISPR/Cas9 teknik8. Dessa metoder kan enkelt användas i zebrafiskar att undersöka gener, som identifierades av storskaliga genome-wide associationsstudier (GWAS), generera insikter i särskilda mekanismer för sjukdomsprogression och känslighet9. Kort generationsväxling tid, stora mängder avkomma, lätt och billig hantering och växande assay stöd har ökat relevansen av zebrafisk modellen, särskilt med tanke på dess stora potential för modellering ämnesomsättningssjukdom. Bevarande av biologiska mekanismer i zebrafiskar har visat som en grund för farmakologisk terapi utveckling. Till exempel har den antidiabetiska läkemedlet metformin och kolesterolsänkande simvastatin visats att ”behandla” tillstånd i modeller av cAMP/dexametason-inducerad hög PEPCK uttryck och hög kolesterolhalt kost-inducerad hyperkolesterolemi10 , 11 , 12. Detta framryckande inblick i övergripande bevarade metabola mekanismer stöds dessutom av det växande antalet zebrafiskar diabetes modeller, genom experiment såsom: alternerande inkubation i glukos lösningar, Streptozotocin-inducerad ablation av betacellerna, nitroreductase-medierad betacellen ablation med hjälp av prodrug metronidazol, monogena diabetes medieras via pdx1 gen knockdown eller knockout, samt modeller för ökad insulinresistens i skelettmuskel 12. dessa redan etablerade protokoll, ovan nämnda detaljerna av arten, och förmågan att effektivt manipulera genomet i ett stort antal prover alla demonstrera fördelarna med zebrafiskar för att studera mekanismerna Kör komplexa sjukdomsprocesser samt förmågan till skärmen för farmakologiska interventioner.
En allmän förståelse av grundläggande zebrafiskar ögat anatomi (figur 1) är nödvändigt för DISSEKTOR för att utnyttja zebrafiskar som modell för retinal angiopati. Zebrafiskar ögat har sex extraocular muskler, fyra rectus och två sneda muskler som infogar på utsidan av världen vid sklera13. Hornhinnan är den transparenta vävnad som täcker linsen och fortsätter direkt in i sklera, som bildar det yttre skalet av ögat. Sklera är icke-transparenta, har en delvis ljus reflekterande yta och är starkt pigmenterad. Objektivet i sig är mer klotformad än den mänskliga motsvarigheten. Näthinnan består av tre kärnvapen lager av neuronala celler medan den som tillhandahåller syre retinala blodkärlen är nära förknippad med det inre ganglion celllagrar men utgör inte en subretinal nätverk. Koroidala kärl, däremot ligga mellan sklera och näthinnan och är associerade med retinal pigmenterade epitel (RPE). Detta kapillära nätverk levererar syre till de yttre delarna av näthinnan14.
Figur 1: Schematisk skildring av vuxen zebrafiskar ögat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Enkel visualisering av den retinala blodkärlen kan uppnås genom användning av transgena tg(fli:EGFP) zebrafiskar linje15. Grönt fluorescerande protein uttryckt under kontroll av den fli promotor i endotelceller i kärlsystemet är grunden för visualisering via en laser skanning Mikroskop i senare steg. Detta uppnås via dissektion av zebrafisk näthinnan och hela-montering av vävnad. Denna transgena modell ger en snabb vaskulär avläsning utan någon tillämpning av intravaskulär märkning eller hela-mount immunohistokemi. För att analysera diabetesretinopati i zebrafiskar, bör en steg för steg och standardiserade förberedelse rutin användas av varje DISSEKTOR.Följande förberedelser protokoll ger andra forskargrupper möjlighet att enkelt utvärdera vaskulära förändringar i utsatta fartyg som vuxen zebrafiskar ögat och ger vägledning för att skapa en optimerad dissektion rutin för zebrafiskar näthinnan.
Protocol
Alla förfaranden, inbegripet åtgärder relaterade till animaliska ämnen, har godkänts av djur etikkommittén (Regierungspräsidium Karlsruhe) och följ riktlinjerna för djurens vård av Heidelbergs universitet.
1. beredning av fixativ (4% PFA/PBS)
- Förbereda fixativ färsk varje dag att säkerställa optimal bevarandet av histologiska vävnad integritet.
- Lös upp 0,2 g natriumhydroxid (NaOH) i 90 mL dubbel destillerat vatten (ddH2O) under konstant omrörning i rumstemperatur.
- Tillsätt 4 g PARAFORMALDEHYD (PFA) och rör tills lösningen är helt klar för minst 5-10 min att försäkra depolymerization av makromolekyler.
Försiktighet: PFA är giftiga, hantera med försiktighet. - Lös upp 0,84 g natriumdivätefosfat (NaH2PO4) i lösningen och styra pH på 7,2 via mätning.
- Justera volymen med ddH2O till 100 mL och filtrera lösningen genom grad 3 filterpapper.
- Lagra 4% PFA/PBS på is.
2. beredning av dödshjälp lösning
Obs: Följande steg var gjort med ABTL vildtyp zebrafiskar stam vid en allmän ålder av 6-8 mån.
- Använd etyl 3-aminobensoat metan sulfonat, också heter ”tricaine” eller MS-222, i en koncentration av 0,31 mg/mL för zebrafiskar dödshjälp16. Utnyttja 1 x ägg vatten, används för att höja zebrafiskar embryon, som lösningsmedel för dödshjälp lösningen. Generellt styra rätt anestesi djupet innan du arbetar med sederad fisk genom att Visa förlust av balans och touch reaktion förlust.
- För att uppnå 1000 mL 10 x ägg vatten, tillsätt dessa salter 1000 mL dubbel destillerat vatten (ddH2O) under konstant omrörning i följande ordning: 10 g NaCl, 0,3 g kaliumklorid, 0,4 g CaCl2 *6 H2O, 1,32 g MgSO4 *6 H2O.
3. fixering av zebrafisk vävnad
- Överföra 6 mL 4% PFA/PBS lösning per prov i brunnar av sex brunnar i förväg.
- Avliva den vuxna zebrafiskar (tidigare underhålls på en standard ljus-dagarscykel, t.ex., 12 h: 12 h) 2 h efter ljus på morgonen, genom att placera dem i den tricaine lösningen och vänta tills de har nått dödshjälp. Efter upphörande av opercular rörelse, som kan ta upp till 10 min.
- Ta fisken ut ur tricaine dödshjälp lösningen och sätta dem på färska hushållspapper. Torka fisken och använda en skalpell skära huvuden bakom operculum (se figur 2A). Överföra huvuden direkt i de preppad plattor, som innehåller den nylagade fixativ.
- Butiken de plattor som innehåller fisk huvuden vid 4 ° C över natten för minst 24 h att försäkra fixeringsvätskan tränger djupare retinala lagren.
Obs: Zebrafiskar huvuden kan förvaras i högst 48 h i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C före beredning utan relevanta förlust av fluorescens signalstyrka. Ökad latens kan leda till förlust av vävnad integritet minskat bildkvalitet, och ska därför undvikas.
4. beredning av den zebrafiskar Retinal vaskulatur
- Fyll en petriskål upp till en tredjedel med uppvärmd 2% agaros och vänta tills agar är fast. Täcka agarplattan med 1 x PBS att skapa en arbetsyta för att dissekera ögonen.
Obs: Detta gör att båda bevarandet av förberedelse pincett och lågt tryck på vävnad medan dissekera, minskar sannolikheten för strukturella skador. Alla ytterligare förberedelsesteg bör utföras i den här arbetsytan utnyttja #5 raka pincetten med fina tips i dissekera Mikroskop med ytterligare epi-belysning.- Samtidigt dissekera, använda förstoring mellan 4,0 x och 6,0 x för både översikt och detalj-orienterad bedömning av vävnaden.
- Överföra fast provet i petriskål och, genom att hålla huvudet på snittytan med en pincett, infoga en annan nålas ihop tweezer nedanför ögongloben vid omloppsbanor kaviteten. Långsamt öppna denna pincett under ögat och grepp synnerven, och sedan försiktigt riva och lossa ögonen (figur 2B).
Figur 2: avlägsnande av vuxen zebrafiskar ögat. Hornhinnans side se med ögat fortfarande i omloppsbanor kaviteten och intakt synnerven (A). Hornhinnans sidovy med fristående öga (B). Schematiska skildring av zebrafisk ögat på detta steg (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Ta bort någon av de fyra rectus och två sneda extraocular muskler som fortfarande är anslutna till den öga samt kvarstående extraocular vävnad ansluta ögat till omloppsbanor kaviteten (jämför figur 3 och figur 4).
- Uppnå detta genom att hålla tillbaka ögat genom en halvslutna pincett och gripande strukturen med den andra pincett, mjukt slita den med en diametriska rörelse. Eftersom gripande ögongloben direkt leder till inre fartyget går sönder, är denna teknik lämpligt skonsam att bevara kärlsystemet.
Figur 3: vuxen zebrafiskar ögat med extraocular muskler i fokus. Lateral bild med fastsättning av en extraocular muskler till den vänstra yttre kanten av okulär världen i fokus (A). Synnerven sidovy med extraocular muskler symmetriskt flankerande synnerven (B). Schematiska skildring av zebrafisk ögat på detta steg (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Använd en 27G (0,4 x 19 mm) engångsnål punktera hornhinnan (figur 4 c, röd pil) på yttre området. Genom denna öppning håller hornhinnan med båda pincett och något Riv den. Därefter noggrant arbete med att skapa en centrerad Riva ungefär storleken av respektive eleven.
Figur 4: vuxen zebrafiskar öga efter avlägsnande av alla extraocular muskler. Lateral bild med den rensade yttre kanten av okulära globe synliga (A).Synnerven sidovy med synnerven i mitten. Ljusreflekterande sklera inte täcker hela området runt nerven (röd streckad linje) (B). Schematiska skildring av zebrafisk ögat på detta steg (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Applicera tryck på hornhinnans sida av okulär världen (bulbus oculi) på hornhinnans ytterkanten ovan iris. Detta kommer att skapa en liten buckla och driva objektivet till höjden av hornhinnans Revan. Kör pincetten under linsen och ta bort det (figur 5A).
Figur 5: vuxen zebrafiskar öga håller på lins borttagning. Hornhinnans sidovy med objektivet drev igenom hornhinnan tår (A). Hornhinnans sida vy med linsen bredvid okulär världen (B). Schematiska skildring av zebrafisk ögat på detta steg (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Stäng ögat upp och ner att synnerven inför forskaren. Notera att sklera och hornhinnan är anslutna och bilda den fibrösa Tunikan i ögat glödlampan för att skydda näthinnan skålformade. (Figur 6).
- Detta skal, bestående av hornhinnan och sklera, kallas också ”corneosclera” och reservdelar ut området kring synnerven (figur 4B, röd streckad linje). Sätt en nål vid denna utsättning en gång skapa en öppning mellan sklera och näthinnan.
Figur 6: Corneosclera bestående av sklera och hornhinnan, som är frånkopplad från den kvarvarande intraokulär vävnaden. Hornhinnans sidovy visar fortsatt genomskinliga hornhinnan pigmenterade sklera (A). Lateral bild fokuserade på skleral delen av corneosclera (B). Schematisk beskrivning av de borttagna corneosclera (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Använder denna tillgång med båda pincett, noggrant rip sklera axiellt i ränder att öka öppningen runt synnerven. Var noga med att hålla corneosclera intakt på övergången till hornhinnans sida omkrets (se figur 6A).
- Håll sklera med en pincett och, genom att gripa synnerven med den andra och dra bort, helt ta bort corneosclera från ögat och kasta det (figur 6). Försök att bryta alla anslutningar innan separera corneosclera och den kvarvarande intraokulär vävnaden, som bilaga till andra strukturer kommer att vara en kritisk punkt; Detta steg kommer att ge en skålformade struktur bestående av Uveaen och näthinnan som innehåller den retinala blodkärlen (figur 7).
- Skapa en bristning i koroidal/RPE lagret genom att hålla en 27G-nål i sidled till den återstående koppen medan skrapning utsida med kanten av nålens spets. Använda bristning som en åtkomstpunkt för att få grepp om koroidal/RPE lagret och rippa den med både pincett i ränder, men behålla anslutningen till iris intakt.
- Efteråt kör en pincett under iris och gå runt i en krets från utsidan medan du skapar spänning genom att dra på det avvecklade koroidal/RPE lagret att uppnå avlossning av kombinerade struktur.
Obs: Iris måste kopplas bort, för att inte hindra fluorescensen medan visualisera kärlen (figur 8B). Högintressant iris direkt för att ta bort det kan leda till omfattande kärlskada, särskilt på den inre fiberoptiska cirkeln (IOC), eftersom iris är fortfarande ansluten till omgivande vävnad. Koroidal lagret och retinal pigmenterade epitel (RPE) kan separeras och ofta behålla en anslutning till iris, som möjliggör en enkel sekundära borttagning. - Om delar av iris inte kan tas bort, använda en naturlig brytpunkt som vuxen zebrafiskar ögat uppvisar inuti ljusmätare lagret (PL), på ett liknande sätt till steg 4,9, ta bort iris.
- Skrapa över utsidan av återstående skålformade näthinnan att inducera behandlingsavbrott i PL ovanför brytpunkten (figur 11C, svart pil). Tillgång skapade till att ta bort den övre delen av lagret samtidigt som möjligt anslutningen till iris intakt. Efteråt kör pincetten under iris och gå runt i en krets som tidigare nämnts för att lösgöra kombinerade struktur.
Obs: Man bör utöva tålamod som steget hela 4,9 kan vara svårt, men denna vård kommer att uppnå ett bättre vaskulär utfall än rakt högintressant iris vid kanten av eleven eller tvinga en öppning genom att förstöra anslutningar till koroidal/RPE eller ljusmätare lager utan deras respektive borttagning. Efter detta steg kommer således bevara retinal vaskulär integritet, men leda till skador på de yttre retinala lagren.
- Efteråt kör en pincett under iris och gå runt i en krets från utsidan medan du skapar spänning genom att dra på det avvecklade koroidal/RPE lagret att uppnå avlossning av kombinerade struktur.
Figur 7: vuxen zebrafiskar öga efter avlägsnande av corneosclera. Lateral bild visar de kvarvarande intraokulär vävnaden med intakt iris och synnerven (A). Hornhinnans sida vy med iris i fokus (B). Schematiska skildring av zebrafisk ögat på detta steg (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Använd en sax med lokalt i våren med en rak 2,5 mm egg för att skära synnerven så nära som möjligt på näthinnan; Detta kommer att möjliggöra en bättre platt-montering av vävnaden.
Figur 8: vuxen zebrafiskar öga efter borttagning av RPE/åderhinnan och trunkerade synnerven. Synnerven visar sida näthinnan med en stympad synnerven (A). Hornhinnans sida vy med en direkt titt på det mest inre lagret av näthinnan (B). Schematiska skildring av zebrafisk ögat på detta steg (C).Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
5. montering av den retinala vaskulatur
- Tvätta dissekerade näthinnan två gånger i 5 minuter i 1 x PBS. För att överföra näthinnan efter trunkering av synnerven, utnyttja en lab spatel med micro sked ände att undvika direkt hantering av den exponerade vävnaden.
- Placera en droppe PBS på en glasskiva och överför näthinnan till droplet-programmet. Använd en pincett för att hålla vävnaden på plats samtidigt minska den skålformade strukturen med en skalpell för att skapa en platt fyra-kronblad eller fem-kronblad form beroende retinal storlek (se diagram 9).
- Suga upp den överblivna PBS med ett fint papper. Vara noga med att inte vidröra näthinnan.
- Coat platt-monterad näthinnan i montering media och täck med ett täckglas. Vara uppmärksam att inte skapa skum, som luftbubblor kan snedvrida visualisering av de retinala kärl.
- Minimera rörelse av täckglaset och försegla locket med genomskinligt nagellack.
6. visualisering av den retinala vaskulatur
- Håll tiden klyftan mellan förberedelse och visualisering så korta som möjligt för att minska bilden detalj förlust genom fluorescens signalförlust. Lagra de förberedda retinal vaskulatur fästena vid 4 ° C att minska signalförlust, om direkt visualisering inte kan uppnås, eftersom nedbrytningen av bildkvalitet långsamt blir synliga 48 h efter beredning.
- Visualisera de retinala blodkärlen fästena via fluorescensmikroskopi eller laser scanning konfokalmikroskopi.
Obs: Fartyget visualisering av fluorescensmikroskopi uppnåddes på 2,5 x förstoring med en exponeringstid av 2.0 s, vinst på 6,0 x och gamma inställningar av 1,67. För konfokalmikroskopi, utnyttjades en Ar-laser (488 nm/20 mW) på 20% effekt i kombination med en TD 488/543/633 excitationsfilter, en 20 x / 0.7 NA flera nedsänkning mål med ddH2O som nedsänkning media och utsläpp filterinställningar 505-560 nm. Confocal bilder består av 4 x 4, 4 x 5 eller 5 x 5 singular bilder kombineras genom en kakel genomsökning beroende retinal storlek.
7. han avsnitt Sebrafisken näthinnan
Obs: För han avsnitt Sebrafisken näthinnan, förbereda vävnaden som beskrivs i protokollet tills steg 4,5 och därefter hoppa direkt till steg 7,1.
- Tvätta utan ögon (efter steg 4,5) två gånger i 5 minuter i 1 x PBS. Efteråt, överföra vävnaden i 70% etanol (EtOH). Vid denna punkt, kan beredda ögon lagras vid 4 ° C tills paraffinet inbäddning.
- Tvätta vävnaden på följande sätt att torka det innan paraffin inbäddning: 2 x 15 min i 80% etanol, 2 x 15 min i 90% etanol, 3 x 15 min i 96% etanol, 3 x 15 min i 99% etanol, 2 x 15 min i acetone/99% etanol (1:2), 3 x 15 min i aceton. Hålla vävnaden i paraffin vid 62 ° C över natten.
- Värm upp färska paraffin till 62 ° C och häll det i inbäddning formar. Överföra vävnaden i formarna direkt och, i snabb takt, kontroll rätt orientering av ögonen för önskat avsnitt. Därefter gäller en inbäddning kassett till mögel och täck med ytterligare uppvärmda paraffin.
- Ta bort inbäddning formarna när paraffinblock har svalnat. Skär de paraffinblock på en mikrotom i 10 µm sektioner och flyta ut dem på 45 ° C vattenbad på vattenytan länge nog för dem att platta helt.
- Fånga avsnitten på en glasskiva och tömma dem vertikalt för att ta bort överflödigt vatten innan torkning dem över natten i en ugn vid 45 ° C.
- Processen i avsnitt ytterligare med följande schema till deparaffinize och han fläcken: 4 x 1 min i xylol, 1 x 1 min i 99% etanol, 1 x 1 min i 96% etanol, 1 x 1 min i 80% etanol, 1 x 1 min i 70% etanol, 1 x 1 min i ddH2O, 1 x 4 min i Mayers hematoxylin , 1 x 10 min i ddH2O, 1x2min i 0,5% eosin, 1 x 30 s i ddH2O, 1 x 30 s i 80% etanol, 2 x 30 s i 96% etanol, 3 x 1 min i 99% etanol, och 1 x 1 min i xylol.
- Ta glas bilden ur xylol och snabbt täcka vävnaden med montering media. Undvika för att låta vävnaden torka ut helt, sedan placera ett täckglas på toppen och försegla den färgade vävnaden.
Representative Results
Här visar vi två typiska morfologiska exempel på den retinala blodkärlen i vuxen tg(fli:EGFP) zebrafiskar: en gång visualiseras med fluorescens Mikroskop (figur 9A) och en gång med en confocal laser skanning Mikroskop (bild 9B). Avslöjade visar retinal ett högt organiserade mönster. Stark autofluorescens ses i zebrafiskar näthinnan, när visualiseras med fluorescens Mikroskop. Således, en visualisering av endast vaskulär lager via en confocal genomsökning rekommenderas att minska bakgrunden fluorescens och öka kontrast. För snabbare bild förvärv eller situationer där kvalitativa data är tillräckligt, är fluorescens Mikroskop ett attraktivt alternativ.
Figur 9: representativa bilder av vuxen tg(fli:EGFP) zebrafiskar retinal vaskulatur. Två typiska morfologiska exempel på den retinala blodkärlen visas: den centrala fiberoptiska artären sprider sig i 5-7 största fartyg, som sedan förgrenar i en följd av arkader. Alla ytterligare fartyg rinna in i omkretsriktningen venen (CV) begränsa den yttre delen av varje kronblad. Visualisering via fluorescensmikroskopi vid 2,5 x förstoring (A). Visualisering av den retinala blodkärlen av confocal microscopy genom en kombinerad 5 x 5 enda bild kakel scan (B)för laserscanning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den fiberoptiska artären penetrerar näthinnan i synnervspapillen och, i de flesta prover, sprider sig i 5-7 viktigaste fartyg (figur 10A). De huvudsakliga fartyg sedan filial till en följd av arkader och ansluta till den inre fiberoptiska cirkeln (IOC), även kallad den perifera ven (CV), omger den optiska skivan i peripheryen av platta monterad näthinnan (se figur 10B). IOK är det venösa kärl som dränerar det arteriellt blodet vid den inre kanten av okulär världen (bulbus oculi). Den zebrafiskar retinal vaskulatur visar också hög vaskulära verksamhet med förgrening av kapillärer och angiogena groning (figur 10C). Denna vaskulära verksamhet ligger mestadels i nära närhet till IOK. Det är viktigt att notera att samma öga kan visa både höga och låga vaskulära verksamhet i olika regioner av näthinnan (jämför figur 10B och figur 10C). Den retinala blodkärlen av zebrafiskar visar i allmänhet mer avaskulär utrymme och färre kapillärerna mellan de viktigaste grenarna om jämfört med, till exempel näthinnan möss17. Båda ögonen av varje prov bör analyseras eftersom vaskulatur kan variera mellan och singular inspektion kan leda till bias.
Figur 10: förstorade områden av vuxen tg(fli:EGFP) zebrafiskar retinal vaskulatur visualisering. Den fiberoptiska artär förgrening till nationella fartyg (A). Retinal kapillärerna i ett område med låg vaskulär aktivitet som ansluter till den inre fiberoptiska cirkeln (IOC) längst ned i bilden (B). Retinal kapillärerna i ett område med hög vaskulär aktivitet ansluta till IOC (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En mycket bevarad arkitektur av neuronala lager finns redan i zebrafiskar från cirka 72 h efter befruktning (hpf) och framåt18. Adult zebrafiskar näthinnan visar följande lager från inifrån och ut (figur 11): ganglion celllagrar (GCL), inre plexiform lagret (IPL), inre nukleära lagret (INL), yttre plexiform lagret (OPL), yttre nukleära lagret (v), ljusmätare lager (PL), och retinal pigmenterade epitel (RPE). Uppskattning av vaskulär parametrar från retinala blodkärlen visualisering visas i figur 12. Den inre retinala blodkärlen ligger på det ganglion celllagrar (GCL) (figur 13B, vit ruta) medan den koroidala kapillärer skulle vara associerad med retinal pigmenterade epitel (RPE).
Figur 11: han färgning av vuxen zebrafiskar ögat. Tvärsnittsdata översikt över hela ögat efter avlägsnande av linsen (A). Näthinnans skikt av den vuxna zebrafiskar eye19 (B). Indikation (svart pil) av naturliga brytpunkten i PL (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Modeller av hypoxi-inducerad retinal neoangiogenesis visar ökade antalet förgrenade punkter, angiogena brysselkål, vaskulär totalyta och minskade intercapillary avstånd i zebrafiskar20. Dessa fynd stöder tanken att zebrafiskar är mottagliga för mikrovaskulära diabeteskomplikationer21, som de viktigaste resultaten av senare diabetesretinopati omfattar hypoxi-medierad neoangiogenesis, som är starkt kopplad till VEGF uttryck. Hyperglykemi-inducerade förändringar i näthinnan zebrafiskar leda till ökad tjocklek av fartyg men bibehålla den övergripande mönstring22. Alternerande nedsänkning i glukos lösningar för 30 dagar minskar också tjockleken av IPL och INL23. Direkt påverkan av glukos metaboliter i zebrafiskar som metabola förespråkare av vaskulopati visades också redan. Ytterligare vaskulär hyperbranching observerades i den stammen vaskulatur zebrafiskar embryon efter inkubation med methylglyoxal24. För tillfället finns det inga djurmodeller som ger alla de centrala kriterierna av diabetesretinopati. Tidiga förändringar finns ofta, men progression till proliferativ diabetesretinopati saknas25. Zebrafiskar också nedgångar in i denna definition, som vi bara sett antingen hypoxi-medierad neoangiogenesis eller hyperglykemi-inducerad ändringar förrän nu. De aktuella resultaten stöder tanken att zebrafiskar är mottagliga för hyperglykemi-medierad vaskulär förändringar och som en djurmodell kan potentiellt Visa en progression till proliferativ diabetesretinopati. Beroende på styrka och exponering för hyperglykemi-medierade effekten, kunde rätt experimentella modellen leda till ischemi i vissa områden av zebrafisk näthinnan och främja neoangiogenesis som de centrala kriterierna av proliferativ diabetesretinopati. Dock zebrafiskar är comparably ny spelare inom modellering långsiktiga mikrovaskulära patologier, kommer att kommande diabetes modeller i zebrafiskar tillhandahålla ytterligare information och klargöra dess betydelse med avseende på andra modeller och deras sjukdomar. Exempelvis kunde en i-cross av tg(gata1a:DsRed) zebrafiskar med red-märkta erytrocyter i raden tg(fli:EGFP) användas för att samtidigt visualisera potentiella intraokulära blödningar i framtiden zebrafiskar modeller visar microaneurysms som en prediktor för progression till PDR.
Eftersom den retinala blodkärlen fortskrider in i en följd av arkader, utvärdering av intervascular avståndet, antal förgrenade punkter och det sammanlagda vaskulära området avser avståndet från centrala fiberoptiska artär. För att undvika bias i parametrarna för bedömda vaskulär, krävs en punkt av orientering. IOK är sådan struktur och är mycket relevant eftersom vaskulär verksamhetsområden ligga i direkt rumslig närhet. För konsekvent bedömning, bör retinal genomsökningen delas in i flera rektangulära bilden avsnitt med ett konsekvent avstånd till IOK. Hela näthinnan bör analyseras och bilder numeriskt symmetriskt fördelade. Zebrafiskar näthinnan visar områden med hög och låg kapillär täthet och en ojämlik fördelning av bilden sektioner kan leda till ytterligare bias.
Figur 12: exempel presentation av vaskulär parametrar som avläsningen av retinal vaskulatur visualisering. Mätning av intervascular avstånd (röd dubbelpil) nära den inre optic cirkel (IOC) (A). Tre förgrening punkter (röda cirklar) nära IOC (B). Visualisering av zebrafisk retinala kärl med ett utvidgat område (röd ruta) visar ett spirande fartyg (C). Fartyg diameter mätt över ett visst avstånd (vit dubbelpil) från centrala artär (vitt kors) (D). Fartyg densitet är procentandelen av retinal areal som upptas av överliggande fartyg (diagonal röda linjer) (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att mäta intervascular avståndet, måste man ange ett visst avstånd till IOCEN som standard (figur 12A, vit dubbelpil) och rita en vågrät linje (figur 12A, vågrät vit linje) parallellt med IOK. Avståndet mellan fartygen på den här raden summeras och ett aritmetiskt medelvärde motsvarar intervascular avståndet. Förgrenade punkter räknas inuti varje bild när ett fartyg splittringar och mer än en vaskulär lumen fortsätta från punkten av ursprung. Detta omfattar även horisontella anslutningar mellan kapillärer. Det är viktigt att vara konsekvent med analysen och besluta vilka förgrenade punkter att räkna och hålla dessa regler under hela försöket att minska onödiga variation. Vaskulär groning, är som visas i figur 12 c, en annan parameter som kan räknas i varje bild för att utvärdera påverkan på den retinala blodkärlen. Angiogena groddar följer inte arkad-liknande tronföljden mellan centrala artär och IOC och fokus nära de yttre delarna av näthinnan. För att bedöma vissa fartyg diametrar, behövs alltid en punkt av orientering som ett visst avstånd markerar mätningen plats. Den centrala artär ursprung innanför näthinnan ger sådan vägledning för huvudstam fartyg (figur 12D, vita kors). Den areal som upptas av fartyg (figur 12E, diagonal röda linjer) som en procentandel av den hela näthinnan är vaskulär täthet och korrelerar indirekt till området avaskulär.
En fullständig confocal genomsökning av ett prov bör vara sammansatt av flera detaljerade bilder att tillåta visualisering av små kapillär hypersprouting. För att optimera tid och resurser spenderas på detta steg, bör en automatiserad tilling förfarande användas med en allmän genomsökning djup för varje kakel. Ojämn montering av näthinnan kan kraftigt öka den tid som spenderas för att skanna kärlsystemet med en confocal Mikroskop. I en optimal strategi som man skulle vilja bara Skanna den vaskulära lager (figur 13B, vit ruta), men partiell integration av GCL är ofta nödvändigt.Lämnar en överflödig längd av synnerven efter trunkering, liksom nedskärningarna att uppnå platt-fästet är för kort, kan leda till ojämn montering.
Figur 13: jämförelse av han färgning och autofluorescens i vuxen zebrafiskar näthinnan. Retinala blodkärlen i fokus ovanför GCL (A). Retinal vaskulatur (vit ruta) visar gröna en andra signal och retinal lager uppvisar stark autofluorescens (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som korrekt beredning av den zebrafiskar retinal vaskulatur behöver utbildning, en liten provstorlek med otränade analysera och starkt varierande förberedelse resultat är en största begränsningen av tekniken. Även utarbetandet av tg(fli:EGFP) zebrafiskar ögon ger snabb inblick i delstaten i kärlsystemet, använder tekniken fortfarande ca 20 min av arbetstid per näthinnan för en erfaren forskare. Alla dessa förberedelser för den retinala blodkärlen måste utföras under en dissekera Mikroskop och analysera behöver bo koncentrerad hela tiden eftersom en slarvig steg kan eventuellt framkalla fartyget går sönder. DISSEKTOR bör öva regelbundet eftersom långvarig frånvaro från förberedelse minskar en DISSEKTOR sannolikheten för att bibehålla fartygets integritet.
Dessutom är ytterligare avläsning via immunhistokemi (IHC) fortfarande begränsad, eftersom endast ett litet antal antikroppar valideras på mänskliga och gnagare vävnad arbetar med zebrafiskar. Praktiker som är intresserade av IHC rekommenderas att söka efter zebrafisk-specifika antikroppar, särskilt vid arbete med nya mål. Alternativt är det rekommenderat att använda ytterligare zebrafiskar reporter linjer som är användbara för att studera celler utanför blodkärlen i ögat. Denna strategi är dock tidskrävande, eftersom det tar några månader att generera vuxen zebrafiskar linjer som bär flera transgena reportrar.
Dock utgör zebrafiskar en unik uppsättning fördelar. De är relativt små och reproducera lätt. De kan växa till vuxen steg snabbt och deras embryon är optimala för drogkontroll. Området växer lätt och mer litteratur blir tillgänglig. Med förmågan att generera gen knockouts med en snabb hastighet och ett överflöd av transgenens fluorescens reporter linjer, är valet för zebrafiskar endast fastspända med valda forskningsfrågan.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Katrin Bennewitz och Marlene Hausner för zebrafiskar djurhållning och tekniskt stöd. Författarna erkänner stöd av den Core Facility Live Cell Imaging Mannheim i centrum för biomedicin och medicinsk teknik Mannheim (DFG INST 91027/9-1). Denna studie stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschafts (internationella forskning utbildning grupp 1874/1 ”DIAMICOM”, projektet SP5 och SP9; Collaborative Research Centre SFB1118, projektet B1 och Collaborative Research Centre SFB/TR23 projektet Z5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Roth | 6771.3 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| CaCl2*6H20 | Roth | 5239.2 | |
| MgSO4*7H20 | Merck | 1.05886.0500 | |
| Paraformaldehyd | Roth | 0335.3 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Roth | 2370.1 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| PBS | Roth | 9143.1 | |
| Agarose | Roth | 2267.3 | |
| Fluoromount-G | Thermo-Fischer | 00-4958-02 | |
| Petri dish | Greiner Bio one | 633180 | |
| Six-well plate | StarLab | CC7682-7506 | |
| Needle | MSG Praxisbedarf | BD 300900 | |
| Micro Tweezer | World Precision Instruments | 14095 | |
| Microdissection Scissor | World Precision Instruments | 501778 | |
| Glass slide | Carl Roth | H872.1 | |
| Coverslip 22mmx22mm | neoLab | 103512222 | |
| Scalpel | MSG Praxisbedarf | FEA111 | |
| Epi-Illumination | Leica | 10446389 | |
| Fluorescence stereomicroscope MZ10 F | Leica | NA | |
| Confocal laser-scanning microscope SP5 DS | Leica | NA | |
| Stereomicroscope M80 | Leica | NA | |
| Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype | NA | NA | see Reference 15 |
| Mayer’s hematoxylin | Dr. K. Hollborn & Söhne | 0088663 | |
| 0.5% eosin | Dr. K. Hollborn & Söhne | NA | |
| 99,9% ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Paraffin | Merck | 1,071,501,000 | |
| Xylol | Roth | 4436.2 | |
| Acetone | Emsure | 606-001-00-8 | |
| Microtome RM 2165 | Leica | NA |
References
- WHO. Global report on diabetes. , 88 (2016).
- Lim, A. Diabetic nephropathy - complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
- Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
- Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
- Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
- Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
- Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
- Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
- Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
- Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
- Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
- Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
- Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
- Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
- Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).
