Summary
Burada, Yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara kolay bir analizini neoangiogenesis ve yapısal değişiklikler bağlantılı uzun vadeli vasküler patolojiler ayarlarında bir hızlı okuma olarak sağlayacak bir yöntem protokol tartışmak.
Abstract
Diyabetik retinopati körlüğü orta yaşlı yetişkinler arasında önde gelen nedenidir. Diyabet dünya çapında artan yaygınlığı diyabetik mikrovasküler komplikasyonlar önlenmesi önümüzdeki on yıl anahtar araştırma alanlarından birini yapacak. Özel, hedeflenen tedavisi ve yeni tedavi ilaçlar hastaların görme kaybı riski artan sayıda yönetmek için ihtiyaç vardır. Zebra balığı gelişimsel araştırma soruları artan metabolik multifaktöriyel hastalık süreçlerini modelleme için alaka ile kurulan bir hayvan modelidir. Bu tür avantajları en iyi görselleştirme ve yüksek işlem hacmi uyuşturucu yaklaşımlar, faiz genlerin vurmak için güçlü yetenek ile birlikte eleme için izin verir. Burada, biz kolay yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara analizini neoangiogenesis veya gemi zarara yol bağlı uzun vadeli vasküler patolojiler ayarlarında bir hızlı okuma olarak olanak tanıyan bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu Zebra balığı retina diseksiyon ve bütün-doku montajı elde edilir. Görselleştirme maruz gemilerin sonra Yetişkin retina damarlara ifade yeşil EGFP muhabiri confocal mikroskobu ile elde edilir. Doku doğru işlenmesi için daha iyi sonuçlar ve daha az iç gemi kırılma değiştirilmemiş damar yapısı görselleştirme temin ederim sağlayacaktır. Yöntem gemi mimarisi hem de neoangiogenesis değişikliklere bağlı retina vaskülopati, Zebra balığı modellerinde kullanılabilir.
Introduction
Diabetes mellitus işlevsel olmayan insülin salgılanması veya yetersiz doku yanıt salgılanan insülin kaynaklanan hiperglisemi tarafından tanımlanan bir metabolik hastalıktır. DSÖ tahminleri 422 milyon yetişkin diyabet 20141 ile yaşıyordu ve diyabet dünya çapında yaygınlık diyabet bir anahtar araştırma alanlarında yapım nüfus 20352kadar 8-10 oranında artırması bekleniyor önümüzdeki on yıl. Kronik yüksek kan şekeri ile yaşayan diabetik retinopati, nefropati ve polinöropati gibi uzun vadeli mikrovasküler komplikasyonlara yol açar. Yönetimi ve bu komplikasyonların önlenmesi zordur; Nitekim, diyabet diyaliz2' ye uzanan son aşama böbrek hastalığı (ESRD), en sık nedeni haline geliyor ve şeker hastalığı körlüğü orta yaşlı yetişkin3arasında önde gelen nedenidir.
İlk mikrovasküler hasarı diyabetik gözünde kronik hiperglisemi, metabolik değişiklikler gibi bazı risk faktörleri (örneğin, hipertansiyon, dislipidemi), nedenleri vasküler endotel disfonksiyonu, pericyte çıkarma, önde gelen ve acellular vasküler kollu sonucunda kapiller regresyon. Elde edilen retinal iskemi neovaskülarizasyon ve proliferatif Diyabetik retinopati (PDR)4gelişimi teşvik artan vasküler geçirgenliği nedeni. Diabetik retinopati diabetik retinopati görme tehdit filtrelenmiş beyaz Avrupa kohort UKADS çalışma%512'si olarak tespit ederken, Diyabet hastalarının % 37'genel olarak tespit edilmiştir. Güncel tedavi sadece daha fazla komplikasyonları önlemek ve zaten indüklenen zarar tümüyle geri yüklemek mümkün değildir. Glisemik kontrol, ek olarak Panretinal photocoagulation proliferatif Diyabetik retinopati (PDR) için standart terapi ama bitişik sağlıklı doku de etkiler. Anti-VEGF müdahaleler lazer tedavisi6,7, ama sonunda, özel, hedeflenen terapi alternatif olarak umut verici sonuçlar göstermek ve yeni ilaçlar hastaların görme kaybı riski giderek artan sayıda yönetmek için ihtiyaç vardır.
Diyabetik retinopati kurulan hayvan araştırma modellerinin her yönüyle insan patofizyolojisi paylaşmayın. Bilimsel araştırma soru belirli gereksinimlerini karşılayacak şekilde doğru tür kullanımı deneysel kurulumunun en önemli parçalarından biridir. Zebra balığı embriyo (Danio rerio) zaten yaygın gelişimsel araştırmalarında kullanılan ve en iyi pratik arka plan morpholinos veya CRISPR/Cas9 teknik8üzerinden devirme veya nakavt belirli genler için sağlar. Bu yöntemler belirli mekanizmaları hastalık ilerleme ve duyarlılık9anlayışlar üreten büyük ölçekli genom çapında dernek çalışmaları (GWAS), tarafından tespit edilmiştir genler araştırmak için Zebra balığı içinde kolayca yararlı olabilir. Kısa kuşak zaman, çoluk çocuk, kolay büyük miktarlarda ve düşük maliyetli taşıma ve tahlil destek büyüyen özellikle büyük potansiyel metabolik hastalık modelleme için verilen Zebra balığı modelinin uygunluğunu artmıştır. Zebra balığı biyolojik mekanizmaları korunması farmakolojik tedavi geliştirme için bir temel olarak gösterilmiştir. Örneğin, antidiyabetik ilaç metformin ve kolesterol düşürücü simvastatin "kampı/deksametazon-indüklenen yüksek PEPCK ifade ve yüksek kolesterol diyet kaynaklı hiperkolesterolemi10 modellerinde koşulları tedavi etmek için" gösterilmiştir , 11 , 12. korunmuş metabolik mekanizmalar kapsamlı içine ilerleyen bu fikir daha fazla deneyler yoluyla Zebra balığı diyabet modelleri, artan sayıda gibi desteklenmektedir: kuluçka glikoz çözümlerinde, alternatif Streptozotocin kaynaklı ablasyon beta hücrelerinin prodrug Metronidazol, monogenic diyabet artmış insülin direnci iskelet kas modellerinin yanı sıra pdx1 gen nakavt veya nakavt üzerinden aracılı kullanarak beta hücre nitroreductase-aracılı ablasyon 12. bunlar zaten kurulan iletişim kuralları, türlerin, yukarıda belirtilen özellikleri ve verimli bir şekilde çok sayıda örnekleri tüm genom işleme yeteneği göstermek mekanizmaları eğitim için Zebra balığı avantajları farmakolojik müdahaleler için ekran için karmaşık hastalık işlemleri yanı sıra yetenek sürüş.
Temel Zebra balığı göz anatomisi (şekil 1) genel bir anlayış Zebra balığı retina angiopathy için bir model olarak kullanmak için tetkik için gereklidir. Zebra balığı göz altı Ekstraoküler kaslar, dört rektus ve eklemek iki oblik kaslar sklera13dünya dışındaki vardır. Kornea objektif kapsayan saydam doku ve gözün Dış kabuğunu oluşturan doğrudan sklera, devam ediyor. Sklera saydam olmayan, kısmen Işık yansıtıcı yüzey vardır ve güçlü Pigmentli. Kendini daha insan muadili top şeklinde camdır. Süre sağlayan oksijen retina damarlara iç ganglion hücre katmanı ile yakından ilişkilidir ama subretinal bir ağ oluşturmak değil retina nöronal hücre üç nükleer katmandan oluşur. Choroidal gemiler, buna ek olarak, sklera ve retina arasında yalan ve retina Pigmentli epitel (RPE) ile ilişkilidir. Bu kılcal ağ oksijen retina14dış bölümlerine sağlar.
Şekil 1: Yetişkin Zebra balığı göz şematik tasviri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Retina damarlara doğru sözlü görselleştirme transgenik tg(fli:EGFP) Zebra balığı satır15kullanımı ile elde edilebilir. FLI promotor damarlara endotel hücrelerinde kontrolü altında ifade edilen yeşil floresan mikroskop sonraki adımda tarama bir lazer ile canlandırma için temel proteindir. Bu Zebra balığı retina diseksiyon ve bütün-doku montajı elde edilir. Transgenik bu modeli herhangi bir uygulama damar içi etiketleme veya bütün Dağı immünhistokimya olmadan hızlı vasküler bir okuma sağlar. Zebra balığı diabetik retinopati analiz etmek için bir adım adım ve standart hazırlık rutin her tetkik tarafından kullanılmalıdır.Aşağıdaki hazırlık iletişim kuralı diğer araştırma grupları kolayca yetişkin Zebra balığı göz maruz damarlarının damar değişiklikleri değerlendirin ve Zebra balığı retina için bir en iyi duruma getirilmiş diseksiyon rutin kurmak için bir kılavuz sağlamak için seçeneği sağlar.
Protocol
Adımlar da dahil olmak üzere tüm yordamları hayvan konularıyla ilgili, hayvanları Etik Komitesi (Regierungspräsidium Karlsruhe) tarafından onaylanmış ve Heidelberg Üniversitesi hayvan bakımı yönergeleri izleyin.
1. sabitleştirici hazırlanması (% 4 İngiltere'de yılın/PBS)
- Sabitleştirici taze her gün histolojik doku bütünlüğünün en uygun koruma sağlamak için hazır olun.
- Sodyum hidroksit (NaOH) 0.2 gram oda sıcaklığında sürekli karıştırarak 90 mL Çift Kişilik distile su içinde (GKD2O) geçiyoruz.
- 4 g paraformaldehyde (PFA) ekleyin ve çözüm oluştururlar bozulumu sağlamak için en az 5-10 dk için tamamen temizlenene kadar karıştırın.
Dikkat: PFA toksik, dikkatli. - Çözümde 0.84 gr sodyum dihydrogen fosfat (NaH2PO4) dağıtılması ve pH 7.2 ile ölçüm, kontrol.
- GKD2O ile 100 mL için ses seviyesini ve seviye 3 filtre kağıdı ile çözüme filtre.
- Saklamak % 4 İngiltere'de yılın/PBS buz üzerinde.
2. ötenazi çözüm hazırlanması
Not: Aşağıdaki adımları ABTL vahşi tipi Zebra balığı gerilme ile 6-8 Pzt genel bir yaşta yapıldı.
- Etil 3-aminobenzoate metan Sülfonat, ayrıca "tricaine" veya MS-222, 0.31 mg/mL Zebra balığı ötenazi16için bir konsantrasyon adlı kullanın. Zebra balığı embriyolar, ötenazi çözüm için solvent olarak yükseltmek için kullanılan 1 x yumurta su kullanmaktadır. Genel olarak, denge kaybı göstererek uyuşturulan balık ile çalışmaya başlamadan önce doğru anestezi derinliği kontrol ve reaksiyon kaybı dokun.
- 10 yumurta su x 1000 mL ulaşmak için bu tuzları 1000 mL Çift Kişilik distile su (GKD2O) aşağıdaki sıraya göre sürekli karıştırarak ekleyin: 10 g NaCl, 0.3 g KCl, 0.4 g CaCl2 *6 H2O, 1.32 g MgSO4 *6 H2O.
3. Zebra balığı doku fiksasyonu
- 6 mL % 4 İngiltere'de yılın/PBS çözüm örnek başına önceden altı-şey plakaları kuyu aktarın.
- (Daha önce bir standart ışık günlük döngüsü, örneğin, 12 h 12 h muhafaza) Yetişkin Zebra balığı ötenazi ışıklar tricaine çözümünde yerleştirerek sabah açmak ve onlar ötenazi gelinceye beklemek sonra 2s. Opercular hareketi kesilmesi, hangi 10 dakikaya kadar sürebilir.
- Tricaine ötenazi çözüm çıkmış balık alıp taze kağıt havlu üzerine koy. Kuru balık ve operculum arkasında kafa kesmek için bir neşter kullanın (bkz. şekil 2A). Kafaları taze hazırlanmış sabitleştirici içeren doğrudan hazırlandı iyi kalıplara, aktarın.
- Balık kafası 4 ° C'de içeren iyi plakaları sabitleştirici sağlamak en az 24 Saat gece mağaza derin retina katmanları nüfuz eder.
Not: En fazla 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) ilgili bir kaybı olmadan hazırlanması Floresans sinyal gücü önce 4 ° C'de x 48 h Zebra balığı kafaları depolanabilir. Artan gecikme süresi doku bütünlüğü kaybına yol açabilir ve görüntü kalitesi azalır ve böylece kaçınılmalıdır.
4. Zebra balığı retina damarlara hazırlanması
- Petri kabına ilâ üçüncü ısıtmalı % 2 özel ile doldurun ve agar firma tamamlanana kadar bekleyin. Gözleri incelemek için bir çalışma alanı oluşturmak için 1 x PBS agar plakalı kapsar.
Not: Bu hazırlık cımbız ve düşük basınç her iki korunması doku üzerinde diseksiyon sırasında yapısal hasar olasılığını azaltmak sağlar. #5 düz forseps ek epi-aydınlatma diseksiyon mikroskop altında iyi ipuçları ile kullanarak bu çalışma alanındaki tüm daha fazla hazırlık adımları gerçekleştirilmesi gerekiyor.- Diseksiyon sırasında 6.0 x arasındaki 4.0 x büyütme genel bakış ve doku detay odaklı değerlendirilmesi için izin vermek için kullanın.
- Sabit örnek petri kabına aktarmak ve bir cımbız ile kesme yüzeyi başından tutarak, göz küresi aşağıda başka bir tuş-birlikte cımbız yörünge boşluğu eklemek. Yavaş yavaş cımbız göz altında açın ve optik sinir kavrama o zaman dikkatle gözyaşı ve gözleri (şekil 2B) bağlantısını kesin.
Şekil 2: Yetişkin Zebra balığı göz kaldırılması. Gözlerime hala yörünge kavite ve bozulmamış Optik siniri (A)ile kornea yan görünüm. Müstakil göz (B)ile kornea yan görünüm. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Dört rektus ve hala göz hem de kalan Gözdışı doku göz yörünge kavite bağlama bağlı iki eğik Ekstraoküler kaslar kaldırabilir ( şekil 3 ve şekil 4karşılaştırın).
- Bu yarı-kapalı cımbız gözünden geri tutarak ulaşmak ve yapısı diğer cımbız ile sürükleyici, yumuşak bir diametric hareketi ile rip. Bu yana doğrudan göz küresi sürükleyici iç gemi kırılması yol açar, bu damarlara korumak için uygun bir şekilde yumuşak bir tekniktir.
Şekil 3: Yetişkin Zebra balığı göz Ekstraoküler kaslar odak ile. Yan görünümü oküler dünyanın odak (A)sol dış kenarında bir Ekstraoküler kas eki ile. Optik sinir yan görünüm Ekstraoküler kaslar simetrik olarak Optik siniri (B)kanat ile. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Kornea (şekil 4 c, kırmızı ok) dış mesafeden ponksiyon için 27 G (0,4 x 19 mm) tek kullanımlık iğne kullanın. Bu delikten kornea her iki cımbızla tutup da biraz açık gözyaşı. Daha sonra dikkatli bir şekilde ortalanmış bir gözyaşı ilgili öğrenci yaklaşık boyutu oluşturmak için çalışıyorum.
Şekil 4: Yetişkin Zebra balığı göz tüm Ekstraoküler kaslar çıkarıldıktan sonra. Yanal göz temizlenen dış kenarında manzaralı küre görünür (A).Optik sinir yan görünümü ile optik sinir ortada. Işık yansıtan sklera sinir (kırmızı Kesikli çizgi) bütün çevresini kapsayan (B). (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Gözü yukarıda kornea dış kenarında oküler dünya (bulbus lateralis) kornea tarafındaki basınç uygulayın. Bu küçük bir göçük oluşturur ve lens kornea gözyaşı yüksekliğini itin. Cımbız mercek altında çalıştırmak ve (şekil 5A) çıkarın.
Şekil 5: Yetişkin Zebra balığı göz lens temizleme sürecinde. Kornea yan görünüm lens ile kornea gözyaşı (A)ile itti. Kornea yan görünüm yanında oküler dünya (B)lens ile. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Baş aşağı için araştırmacı karşı karşıya optik sinir göz yummak. Sklera ve kornea bağlı ve fibröz tunik göz ampul Kupası şeklindeki retina korumak için form not. (Şekil 6).
- Kornea ve sklera, oluşan bu kabuk, "corneosclera" ve yedek parça dışarı Optik siniri (şekil 4B, kırmızı Kesikli çizgi) çevresi olarak da adlandırılır. Bir iğne sklera ve retina arasında bir boşluk oluşturmak için bir kez bu kesilmesi ekleyin.
Şekil 6: oluşan sklera ve kalan göz içi dokusundan kesilir kornea Corneosclera. Yarı saydam kornea devamı Pigmentli sklera (A)içine gösterilen kornea yan görünüm. Yan görünümü (B)corneosclera scleral parçası üzerinde duruldu. Kaldırılan corneosclera (C)şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Bu erişim her iki cımbız ile kullanarak, dikkatle sklera eksenel çizgili Optik siniri çevresinde açılış artırmak için içine rip. Kornea yan çevresi geçiş, corneosclera sağlam tutmak için dikkatli olun (bkz. şekil 6A).
- Bir cımbız ile ve diğer optik sinir kapma tarafından sklera tutun ve uzak çekerek, tamamen corneosclera gözünden kaldırmak ve (şekil 6) atmak. Diğer yapılar için ek bir kritik nokta olarak herhangi bir bağlantıları corneosclera ve kalan göz içi doku ayıran önce koparmaya deneyin; Bu adımı uvea ve retina retina damarlara (Şekil 7) içeren oluşan bir fincan şeklindeki yapısı sağlar.
- Bir kopma iğne ucu RIM ile dış yüzey kazıma süre kalan Kupası 27 G iğne yana doğru tutarak choroidal/RPE katmanında oluşturun. Kopma choroidal/RPE katmanda topla ve şeritler her iki cımbız ile rip ama gözü bağlantısı sağlam tutmak için bir erişim noktası olarak kullanın.
- Daha sonra bir cımbız iris altında çalıştırmak ve dekolmanı kombine yapısının ulaşmak için üretilmiyor choroidal/RPE katmanında çekerek gerginlik oluşturulurken dışarıdan bir devre dolaşmak.
Not: İris, gemiler (şekil 8B) görüntülenmesi sırasında Floresans engel değil böylece kesilmelidir. Gözü hala çevreleyen doku bağlı olduğu doğrudan kaldırmak için gözü kapma kapsamlı gemi hasar, özellikle de iç optik Daire (IOC), yol açabilir. Choroidal katman ve retina Pigmentli epitel (RPE) ayrılmış olabilir ve genellikle bir bağlantı için kolay bir ikincil çıkarma olanağı verdiğinden gözü korumak. - İris bölümlerini kaldırılamazsa, doğal bir kırılma noktası yetişkin Zebra balığı göz photoreceptor katman (PL), içinde sergiler gözü kaldırmak için adım 4,9 için benzer bir şekilde kullanmaktadır.
- Discontinuations (şekil 11C, siyah oku) kırılma noktası yukarıda pl ikna etmek için kalan Kupası şeklindeki retinanın dış üzerinde kazı. Oluşturulan erişim katmanı üst kısmındaki iris olası bağlantısı olduğu gibi tutmak kaldırmak için kullanın. Daha sonra cımbız iris altında çalıştırmak ve kombine yapısı ayırmak için daha önce belirtildiği gibi bir devre dolaşmak.
Not: Bir sabır gibi tüm adım 4,9-ebilmek var olmak zor, ama bu bakım delikanlı Iris adlı öğrencinin RIM kapma veya choroidal/RPE bağlantıları yok ederek bir açılış zorlayarak daha bir daha iyi damar sonuca ulaşmak için çalışılmalı veya onların anılan sıraya göre kaldırma olmadan photoreceptor katman. Bu adımı takip böylece retinal damar bütünlüğünün korunması, ancak dış retina katmanları zarar neden.
- Daha sonra bir cımbız iris altında çalıştırmak ve dekolmanı kombine yapısının ulaşmak için üretilmiyor choroidal/RPE katmanında çekerek gerginlik oluşturulurken dışarıdan bir devre dolaşmak.
Şekil 7: Yetişkin Zebra balığı göz corneosclera çıkarıldıktan sonra. Lateral görünüm kalan göz içi dokusu bozulmamış iris ve optik sinir (A)ile gösterir. Odak (B)iris ile kornea yan görünüm. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Mikrodiseksiyon bahar makas bir düz 2.5 mm kesme kenarı ile retina olabildiğince yakın olarak Optik siniri kesmek için kullanın; Bu bir daha iyi düz montaj için dokunun sağlayacaktır.
Şekil 8: Yetişkin Zebra balığı göz RPE/koroid ve kesilmiş optik sinir çıkarıldıktan sonra. Optik sinir yan görünüm retina kesilmiş bir Optik siniri (A)ile gösterir. Kornea yan görünüm retina (B)en iç tabakası üzerine doğrudan bir bakışla. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi.Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
5. retina damarlara montajı
- 5 dakika içinde 1 x PBS için iki kez disseke retina yıkayın. Retina Optik siniri kesme sonra aktarmak için bir laboratuvar spatula doğrudan maruz kalan doku kullanımı önlemek için bir mikro kaşık ucu ile kullanmaktadır.
- PBS bir damla bir cam slayt üzerine yerleştirin ve retina damlacık aktarın. Doku Kupası şeklindeki yapısı düz dört-petal veya beş-petal şekil retina boyutuna bağlı olarak oluşturmak için bir neşter ile kesim sırasında tutmak için bir cımbız kullanın (bkz. Şekil 9).
- İyi bir kağıt parçası ile kalan PBS emmek. Retina dokunmamaya dikkat et.
- Montaj medya ve bir coverslip ile kapak düz monte retinada kat. Hava kabarcıkları retina damarları görselleştirme deforme edebilirsiniz gibi köpük, yaratmak için değil dikkatli olun.
- Coverslip hareketinin en aza indirmek ve açık oje ile kapak mühür.
6. retina damarlara görselleştirme
- Zaman aralığı arasındaki hazırlık ve görselleştirme resim detay kaybı ile floresan sinyal kaybı azaltmak mümkün olduğunca kısa tutmak. 4 ° C'de doğrudan görselleştirme elde edilemez, fotoğraf kalitesinde bozulma görünür 48 h hazırlık sonra yavaş yavaş olduğunda sinyal kaybı, azaltmak için hazırlanan retina damarlara bağlar saklar.
- Floresans mikroskobu ile retina damarlara bağlar görselleştirmek veya tarama confocal mikroskobu lazer.
Not: 2.5 x büyütme 2.0 s, 6.0 x ve gama ve kazanç bir çekim hızı ile gemi görselleştirme Floresans mikroskobu tarafından elde edildi 1.67 ayarlar. Confocal mikroskopi için bir Ar-lazer (488 nm/20 mW) % 20 güç bir TD 488/543/633 uyarma filtre, bir 20 x / 0.7 birlikte kullanılmıştır NA çok daldırma amacı ile GKD2O daldırma medya ve emisyon filtre ayarları 505-560 nm olarak. Confocal resimler retina boyutuna bağlı olarak bir kiremit tarama ile birlikte 4 x 4, 4 x 5 veya 5 x 5 tekil görüntü oluşur.
7. O bölümler Zebra balığı retina
Not: Zebra balığı retina o bölümlerini için doku iletişim kuralında adım kadar 4.5 açıklandığı şekilde hazırlayın ve daha sonra doğrudan adıma 7.1 atlayın.
- 5 dakika içinde 1 x PBS için iki kez (sonra adım 4.5) enucleated gözleri yıkayın. Daha sonra doku % 70 etanol (alkol) aktarın. Bu noktada, hazırlanan gözleri 4 ° C'de parafin katıştırma kadar saklanabilir.
- Doku parafin katıştırma önce kurutmak için aşağıdaki şekilde yıkamak: 2 x 15 dk %80 etanol, 2 x 15 dk % 90 etanol, 3 x 15 dk % 96 etanol, 3 x 15 dk % 99 etanol, 2 x 15 dk acetone/99% etanol (1:2), 3 x 15 dk aseton içinde içinde içinde içinde içinde içinde. Doku içinde parafin 62 ° C'de gecede tutun.
- Taze parafin 62 ° c kadar ısı ve kalıpları katıştırma içine dökün. Doku doğrudan kalıpları içine ve hızı, gözleri denetimi doğru yönünü hızlı istediğiniz bölüm için de aktarın. Daha sonra gömme bir kaset kalıp ve ek ısıtmalı parafin ile kapak için geçerlidir.
- Parafin blok soğutmalı sonra gömme kalıpları kaldırın. Parafin blok bir microtome 10 µm bölümler halinde kesin ve onları 45 ° C su banyosu onları tamamen düzleştirmek yeterince su yüzeyi üzerinde yüzer.
- Bir cam slayt bölümlerde yakalamak ve onları dikey olarak aşırı su onları gecede kurutma önce 45 ° C'de bir fırında kaldırmak için drenaj
- Bölümleri daha da deparaffinize için aşağıdaki zamanlamayı ve o leke ile işlem: 4 x 1 min xylol, 1 x 1 min % 99 etanol, 1 x 1 min % 96 etanol, 1 x 1 dk %80 etanol, 1 x 1 min % 70 etanol, GKD2O, Mayer'ın Hematoksilen dk 1 x 4 1 x 1 dk içinde içinde içinde içinde içinde , 1 x 10 dk GKD2O, 1x2min % 0.5 Eozin, 1 x 30 içinde GKD2O, 1 x 30 s s % 80 etanol, 2 x 30 s % 96 etanol içinde % 99 etanol, 3 x 1 min ve 1 x 1 dk içinde xylol.
- Cam slayt xylol dışarı almak ve hızlı bir şekilde ortam takma ile doku kapsar. Tamamen kurumasına, sonra bir coverslip üstüne yerleştirin ve lekeli doku mühür dokusu izin kaçının.
Representative Results
Burada biz yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara iki tipik morfolojik örnek göstermek: mikroskop (şekil 9B) tarama confocal lazer ile floresan mikroskop (Þekil 9A) ve bir kez bir kez görüntülenmiştir. Ortaya retina yapısı son derece organize desen gösterir. Güçlü autofluorescence floresan mikroskop ile görüntülenmiştir Zebra balığı retinada görülür. Böylece, bir görsel öğe sadece confocal bir tarama yolu ile damar tabakanın arka plan Floresans azaltmak ve kontrastı arttırmak için tavsiye edilir. Daha hızlı resim edinme veya nitel veri yeterli olduğu durumlarda, floresan mikroskop cazip bir alternatif içindir.
Şekil 9: Yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara temsilcisi resimleri. Retina damarlara iki tipik morfolojik örnek gösterilir: santral optik arter bir arkaya pasajlar şube 5-7 ana damarlarının içine yayılır. Tüm diğer gemileri her petal dış kısmı sınırlama Çevresel damar içine (CV) drenaj. 2. 5 x büyütme (A), görselleştirme Floresans mikroskobu ile. Confocal lazer mikroskobu ile kombine 5 x 5 tek görüntü kiremit (B)tarama tarama retina damarlara görselleştirme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Optik arter optik sinir başı retina nüfuz eder ve çoğu örnekleri, 5-7 ana gemiler (şekil 10A) yayılır. Ana gemiler sonra şube bir arkaya pasajlar ve optik disk düz bağlı retina çevre çevreleyen Çevresel damar (CV) olarak da adlandırılan iç optik Daire (IOC), bağlanmak (bkz. şekil 10B). IOC, oküler dünya (bulbus lateralis) iç kenarında arteryel kan akıtır Venöz damar var. Zebra balığı retina damarlara da kılcal damarlar ve çimlenme (şekil 10C) anjiogenik dallanma ile yüksek vasküler faaliyet alanları gösterir. Bu damar faaliyet çoğunlukla IOC yakın bir mesafede yer alır. Aynı göz retina değişik bölgelerinde yüksek ve düşük vasküler her iki faaliyetleri kanıtlamanın fark önemlidir ( şekil 10B ve şekil 10Ckarşılaştırın). Genel olarak, Zebra balığı retina damarlara daha fazla avasküler yer ve eğer örneğin, fareler17retina için karşılaştırmak ana dalları arasında daha az kılcal gösterir. Her iki gözde her örneğinin damarlara arasında değişiklik gösterebilir ve tekil muayene sapmaya yol açabilir Çünkü analiz edilmelidir.
Şekil 10: Yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara görselleştirme alanlarında büyütülmüş. Ana gemiler (A)dallanma optik arter. Retina kılcal düşük vasküler etkinlik resim (B)alt kısmında iç optik Daire (IOC) için bağlanma sahip bir bölgede. Retina kılcal bir alanda yüksek vasküler faaliyet için IOC (C)bağlanma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Son derece korunmuş mimarisi nöronal katmanların zaten yaklaşık 72 saat içinde Zebra balığı var fertilizasyon (hpf) itibaren18mesaj. Yetişkin Zebra balığı retina Inside out (Şekil 11) aşağıdaki katmanları gösterir: ganglion hücre Katmanı (un), iç Pleksiform tabaka (IPL), iç nükleer tabaka (INL), dış Pleksiform tabaka (OPL), dış nükleer tabaka (yalnız), photoreceptor katman (PL), ve retina Pigmentli epitel (RPE). Retina damarlara görselleştirme vasküler parametreleri tahmini şekil 12' gösterilir. İç retina damarlara choroidal süre ganglion hücre Katmanı (un) (şekil 13B, beyaz kutu) üzerinde yer alan kılcal retina Pigmentli epitel (RPE) ile ilişkili.
Şekil 11: O yetişkin Zebra balığı göz boyama. (A)objektif çıkarıldıktan sonra bütün göz kesitsel bakış. Yetişkin Zebra balığı retina katmanları19 (B)göz. Göstergesi (siyah ok) PL (C)olarak doğal bir kırılma noktasıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Retina neoangiogenesis hipoksi indüklenen modellerinin dallanma noktaları, artan sayıda anjiogenik filizlenir, toplam vasküler alan ve intercapillary mesafe Zebra balığı20azalma gösterir. Bu bulgular önemli bulgular Diyabetik retinopati daha sonra kuvvetle VEGF ifadeye bağlı hipoksi-aracılı neoangiogenesis dahil gibi Zebra balığı diyabetik mikrovasküler komplikasyonlar21' e, duyarlı fikir destekler. Zebra balığı retina değişiklikleri hiperglisemi kaynaklı gemilerin artan kalınlık için yol ama22biçimlenme genel korumak. Glikoz çözümlerinde daldırma 30 gün için alternatif de IPL ve INL23kalınlığı azalır. Zebra balığı içinde glikoz metabolitleri vaskülopati metabolik savunucuları olarak doğrudan etkisi de zaten gösterildi. Ek vasküler hyperbranching Zebra balığı embriyo gövde Pres'teki methylglyoxal24ile kuluçka sonra gözlendi. Şu anda, diabetik retinopati tüm anahtar kriterleri sağlayan hiçbir hayvan modeli vardır. Erken değişiklikleri genellikle bulunur, ama ilerleme proliferatif Diyabetik retinopati için25eksik. Sadece hipoksi-aracılı neoangiogenesis ya da hiperglisemi kaynaklı değişiklikler şu ana kadar gördüğümüz gibi Zebra balığı da bu tanım düşüyor. Mevcut bulgular Zebra balığı hiperglisemi aracılı vasküler değişikliklere açıktır ve bir hayvan modeli olarak potansiyel proliferatif Diyabetik retinopati bir ilerleme gösterebilir fikri destekler. Gücü ve hiperglisemi aracılı etkisi maruz bağlı olarak, şu deneysel model iskemi bazı alanlarda Zebra balığı retinanın yol ve neoangiogenesis proliferatif Diyabetik retinopati anahtar ölçüt olarak teşvik. Ancak, Zebra balığı uzun vadeli mikrovasküler patolojiler modelleme alanında nispeten yeni bir oyuncu olarak, Zebra balığı modellerinde yaklaşan diyabet daha fazla bilgi sağlamak ve diğer modelleri ve onların patolojiler önemini açıklamak. Örneğin, haç tg(gata1a:DsRed) Zebra balığı kırmızı etiketli eritrositler tg(fli:EGFP) hattı ile'bir içinde aynı anda potansiyel göz içi kanamaları gelecekte microaneurysms bir tahmin gösterilen Zebra balığı modelleri görmenize için kullanılabilir PDR ilerleme.
Retina damarlara bir arkaya pasajlar ilerledikçe beri intervascular mesafe, dallanma noktaları sayısı ve toplam vasküler alan ilgili uzaklık Merkez optik arterin. Biçilen vasküler parametreleri içinde önyargı önlemek için bir nokta yönünün gereklidir. IOC böyle bir yapıdır ve vasküler faaliyet alanları içinde kayma yakındır yalan bu yana son derece uygundur. Tutarlı bir değerlendirmeye, retina taraması IOC için tutarlı bir mesafe ile birden fazla dikdörtgen görüntü bölümlere bölünmüş olmalıdır. Görüntüleri sayısal olarak simetrik olarak dağıtılan ve tüm retina analiz edilmelidir. Zebra balığı retina alanları ile yüksek ve düşük kapiller yoğunluk gösterir ve görüntü bölümleri eşitsiz dağılımı ek sapmaya yol açabilir.
Şekil 12: vasküler parametreleri örnek sunuyu okuma retina damarlara görselleştirme olarak. Ölçüm iç optik yakınındaki intervascular mesafe (kırmızı çift ok) (IOC) (A)daire içine alın. Üç dallanma noktaları (kırmızı daireler) IOC (B)yakın. Çimlenme gemi (C)gösterilen görselleştirme Zebra balığı retina damarlara büyütülmüş bir alan (kırmızı bir kutu). Damar çapı ölçülen üzerinde belirli bir uzaklıkta (beyaz çift ok) santral arter (beyaz haç) (D). Gemi yoğunluğudur retina alan kaplar (çapraz kırmızı çizgiler) overlaying tarafından işgal yüzdesi (E). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
İntervascular mesafe ölçmek için bir belli bir mesafe için IOC (şekil 12A, beyaz çift ok) standart olarak ayarla ve hayali bir yatay çizgi (şekil 12A, yatay beyaz çizgi) IOC paralel çizmek gerekiyor. Yukarıya ekledi ve arithmetically ortalama olarak bu satırdaki gemiler arasındaki mesafe intervascular mesafe eşittir. Dallanma noktaları içindeki her resmin her bir gemi böler ve birden fazla vasküler Lümen devam başlangıç noktası sayılır. Bu da kılcal damarlar arasındaki yatay bağlantıları içerir. Analizi ile tutarlı kalmak ve saymak ve bu kurallar gereksiz varyasyon azaltmak için bütün deneyin boyunca tutmak için hangi dallanma noktaları karar vermek önemlidir. Vasküler çimlenme, şekil 12 ciçinde gösterildiği gibi retina damarlara etkisi değerlendirmek için her görüntüden sayılır başka bir parametresi olarak belirtilir. Anjiogenik lahanası arcade benzeri veraset santral arter ve IOC ve odak retinanın dış parçalarını yakınındaki arasında takip etmez. Bazı damar çapı değerlendirmek için yönlendirme amacı her zaman hangi gereklidir ayarlanan uzaklık ölçümü spot işaretler. Santral arter'ın kökeni retina içinde ana kök tekneler (şekil 12 d, çapraz beyaz) için tür rehberlik sağlar. Alan bütün retina alanı yüzdesi olarak (şekil 12E, çapraz kırmızı çizgiler) gemiler tarafından işgal damar yoğunluğu ve dolaylı olarak avasküler bölgesine karşılıklı olarak ilişkilendirir.
Bir örnek tam bir confocal tarama görselleştirme küçük kılcal hypersprouting izin vermek için birden çok yüksek detay resimlerini oluşan. Zaman ve kaynak bu basamakta harcanan en iyi duruma getirmek için bir otomatik tilling işlemi her döşeme için bir genel tarama derinliği ile kullanılmalıdır. Retina düzensiz montaj Pres'teki confocal mikroskopla taramak için harcanan zamanı önemli ölçüde artırır. Biri sadece vasküler Katmanı (şekil 13B, beyaz kutu) ama un kısmi dahil inceden inceye gözden geçirmek ister misiniz bir en uygun yaklaşım genellikle gereklidir.Kesme, hem de çok kısa olması düz montaj ulaşmak için kesim sonra Optik siniri aşırı bir uzunluğu bırakarak düzensiz montaj için yol açabilir.
Şekil 13: karşılaştırma o boyama ve yetişkin Zebra balığı retina autofluorescence. Retina damarlara Focus un (A)yukarıda. Retina damarlara (beyaz kutu) gösterilen yeşil bir EGFP sinyal ve retina sergileri güçlü autofluorescence (B)Katmanlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Zebra balığı retina damarlara doğru hazırlanması önceden eğitim ihtiyacı olduğu bir küçük örnek boyutu eğitimsiz dissectors ve şiddetle değişen hazırlama sonuçları ile teknik ana bir sınırlama vardır. Tg(fli:EGFP) Zebra balığı gözleri hazırlanması damarlara durumunu hızlı fikir verir iken, tekniği için deneyimli bir araştırmacı yaklaşık 20 dk çalışma süresinin her retina hala kullanır. Tüm bu hazırlık adımları için retina damarlara diseksiyon mikroskop altında yapılması gerekiyor ve dikkatsiz bir adım potansiyel olarak gemi kırılması neden olabilir gibi dissectors ihtiyaç kalmak her zaman konsantre. Uzun süreli hazırlık yokluğu gemi bütünlüğünü korumak bir tetkik'ın olasılığı indirgeyerek tetkik düzenli olarak çalışmalısın.
Az sayıda insan ve kemirgen doku üzerinde doğrulanmış antikorlar Zebra balığı ile çalışıyoruz gibi Ayrıca, immünhistokimya (IHC) üzerinden ek okuma hala sınırlıdır. Denemecileri IHC içinde baktılar Zebra balığı özel antikorlar için özellikle yeni hedefler ile çalışırken aramak için tavsiye edilir. Alternatif olarak, bu hücreleri Pres'teki gözüne ötesinde çalışmak yararlı olan ek Zebra balığı muhabir çizgiler kullanmak için tavsiye edilir. Bu strateji, ancak, birden çok transgenik gazetecilere taşımak yetişkin Zebra balığı satırları oluşturmak için birkaç ay gerektiği zaman alıcı, bu.
Yine de, Zebra balığı avantajları eşsiz bir dizi teşkil etmektedir. Onlar nispeten küçük ve kolayca yeniden. Onlar yetişkin aşamaları için hızlı bir şekilde büyüyebilir ve onların embriyo uyuşturucu tarama için en iyi durumda. Alan kolayca büyüyor ve daha fazla edebiyat erişilebilir hale gelmektedir. Gen knockouts hızlı hızlı ve transgene Floresans muhabir satırları bir bolluk oluşturma yeteneği ile Zebra balığı için seçim yalnızca seçilen araştırma soru tarafından kontrol altında.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Katrin Bennewitz ve Marlene Hausner Zebra balığı yetiştiriciliği ve teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar çekirdek tesis canlı hücre Imaging Mannheim adlı Merkezi Biyomedikal ve tıbbi teknoloji Mannheim (DFG INST 91027/9-1) için destek kabul etmiş oluyorsunuz. Bu çalışmada Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklenmiştir (proje Uluslararası Araştırma eğitim grup 1874/1 "DIAMICOM", SP5 ve SP9; Ortak Araştırma Merkezi SFB1118, proje B1 ve ortak araştırma merkezi SFB/TR23 proje Z5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Roth | 6771.3 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| CaCl2*6H20 | Roth | 5239.2 | |
| MgSO4*7H20 | Merck | 1.05886.0500 | |
| Paraformaldehyd | Roth | 0335.3 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Roth | 2370.1 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| PBS | Roth | 9143.1 | |
| Agarose | Roth | 2267.3 | |
| Fluoromount-G | Thermo-Fischer | 00-4958-02 | |
| Petri dish | Greiner Bio one | 633180 | |
| Six-well plate | StarLab | CC7682-7506 | |
| Needle | MSG Praxisbedarf | BD 300900 | |
| Micro Tweezer | World Precision Instruments | 14095 | |
| Microdissection Scissor | World Precision Instruments | 501778 | |
| Glass slide | Carl Roth | H872.1 | |
| Coverslip 22mmx22mm | neoLab | 103512222 | |
| Scalpel | MSG Praxisbedarf | FEA111 | |
| Epi-Illumination | Leica | 10446389 | |
| Fluorescence stereomicroscope MZ10 F | Leica | NA | |
| Confocal laser-scanning microscope SP5 DS | Leica | NA | |
| Stereomicroscope M80 | Leica | NA | |
| Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype | NA | NA | see Reference 15 |
| Mayer’s hematoxylin | Dr. K. Hollborn & Söhne | 0088663 | |
| 0.5% eosin | Dr. K. Hollborn & Söhne | NA | |
| 99,9% ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Paraffin | Merck | 1,071,501,000 | |
| Xylol | Roth | 4436.2 | |
| Acetone | Emsure | 606-001-00-8 | |
| Microtome RM 2165 | Leica | NA |
References
- WHO. Global report on diabetes. , 88 (2016).
- Lim, A. Diabetic nephropathy - complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
- Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
- Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
- Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
- Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
- Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
- Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
- Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
- Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
- Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
- Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
- Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
- Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
- Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).
