Summary
Zelle-autonome Funktionen der Gene im Gehirn können durch Induktion Verlust studiert werden oder der Funktion in geringer Dichte Bevölkerungen der Zellen gewinnen. Hier beschreiben wir in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase in spärlichen Bevölkerung kortikale Neuronen mit Floxed Genen zu entwickeln, Verlust der Funktion in Vivozu liefern.
Abstract
Zelle-autonome neuronale Funktionen der Gene können aufgedeckt werden, indem Sie verursachen Verlust oder Gewinn der Funktion eines Gens in einer kleinen und spärlich Population von Neuronen. Dazu muss erzeugen ein Mosaik in die Neuronen mit Verlust oder Gewinn der Funktion eines Gens von genetisch unbeirrt Gewebe umgeben sind. Hier verbinden wir das Cre-Lox-Rekombinationssystem mit in Utero Elektroporation um Mosaik Hirngewebe zu generieren, die verwendet werden, um die Zelle-autonome Funktion von Genen in Neuronen zu untersuchen. DNA-Konstrukte (erhältlich über Repositories), Codierung für eine fluoreszierende Label und Cre-Rekombinase werden in kortikalen Neuronen mit Genen flankiert mit LoxP-Sites in den Gehirnen von Mäuseembryonen in Utero mit Entwicklung eingebracht Elektroporation. Darüber hinaus beschreiben wir verschiedene Anpassungen, die in Utero Elektroporation-Methode, die Überlebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Diese Methode erfordert auch einen Titer für Cre-vermittelten Rekombination in einer spärlich oder Dichte Bevölkerung der Neuronen. Histologische Präparate von beschrifteten Hirngewebe nicht erforderlich (aber kann angepasst werden) Immunohistochemistry. Die Konstrukte verwendet garantieren, dass das Eindringmittel Neuronen tragen das Gen für Cre-Rekombinase beschriftet. Histologische Präparate können morphologische Analyse von Neuronen durch konfokale Bildgebung der dendritischen und axonalen Lauben und dendritischen Dornen. Weil Verlust oder Gewinn der Funktion im spärlich Mosaik Gewebe erreicht wird, erlaubt diese Methode das Studium der Zelle-autonome Notwendigkeit und Angemessenheit der Gen-Produkte in Vivo.
Introduction
Generierung von einem genetischen Mosaik ist ein klassischen experimentellen Paradigma zum Verständnis der Funktion eines Gens von Interesse. Um festzustellen, ob ein Gen für eine zelluläre Phänotyp notwendig ist, ist der einfachste Ansatz einen Verlust der Funktion des Gens in den Organismus (z.B. Ko) verursacht. Um festzustellen, ob ein Gen gezielt in einem bestimmten Zelltyp benötigt wird, ist jedoch nicht KO des Gens in den Organismus ein gültiger Ansatz. Stattdessen eine Methode ist erforderlich, dadurch wird den Verlust der Funktion eines Gens in einer bestimmten Zelle während von Wildtyp (d. h. genetisch unbeirrt) Gewebe umgeben ist – in anderen Worten, Mosaik Gewebe zu schaffen. Wenn die mutierte Zelle einen mutierten Phänotyp zeigt, aber umgebenden Wildtyp-Zellen nicht, der Genfunktionen Zelle-autonom. Analyse der Mosaik-Gewebe, in dem Wildtyp Gewebe, mutierte Zellen umgeben sind eignet sich für das Verständnis der Zelle-autonome Funktionen der Gene, vor allem im Gehirn, wo Neuronen und Glia eine große Verbundnetz des Gewebes bilden.
Verschiedene Formen von Mosaik Hirngewebe lieferten leistungsstarke Modelle um Zelle-autonome Funktionen der Gene zu untersuchen. Studien konzentrierten sich auf neuronale Transplantation1weiblichen X-chromosomal Mosaikbildung2,3,4, und endogenen somatische Mosaikbildung5,6 haben ihre Schlußfolgerungen basierend auf Mosaik Hirngewebe. Bedingte Löschung eines Gens durch die Cre Lox Rekombinationssystem ist eine Methode, die die große Verfügbarkeit der transgene Mauslinien nutzt. Bei dieser Methode werden zwei LoxP-Standorten eingeführt, auf beiden Seiten einer erforderlichen Sequenz eines Gens (z. B. ein Exon), flankiert von LoxP-Websites, die beide in die gleiche Richtung ("Floxed") stehen lassen. Cre-Rekombinase beschneidet die Reihenfolge zwischen den LoxP-Websites-7. CRE-vermittelten Rekombination kann durch Kreuzung Floxed Mäuse mit einer anderen Mauslinie mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase zusammen mit einem fluoreszierenden Marker in einer Teilmenge von Zellen ("Cre-Reporter-Linie") erreicht werden. Dies wurde in einer Vielzahl von Möglichkeiten, um die Funktionen eines Gens in Teilmengen von Zellen, wie z. B. exzitatorischen Neuronen oder Astrozyten8aufzudecken nachgewiesen. CRE-Reporter Linien CreERT2 Cre-vermittelten Rekombination sein Medikament-induzierbaren (Single Neuron Etikettierung mit induzierbaren Cre-vermittelten Ko oder glatt) ermöglichen ausdrücken können9. In eine andere Strategie als Mosaik-Analyse mit doppelter Marker (MADM)10,11ermöglicht Cre-vermittelten interchromosomal Rekombination eine homozygote Mutante neben heterozygot Gewebe geschaffen werden. In diesen Ansätzen muss eine neue Linie von Mäusen produziert werden jedes Mal für jeden Kandidaten-gen oder zellulären Subtyp, der überprüft wird. Alternativ kann Cre-Rekombinase postnatal durch Iontophorese12 oder durch virale Vektoren (z.B. Adeno-assoziierten Viren13 oder Lentiviren14 mit zellulären Subtyp-spezifische eingeführt werden Promotoren). Diese Strategie schafft starke und postnatale beschriften. Zu dünn und pränatal zerebrale kortikale Neuronen entwickeln, ist eine ideale Strategie in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase mit einem fluoreszierenden Marker.
Neben der Kombination von Cre Lox Rekombination durch in Utero Elektroporation produzieren Mosaik Gewebe in Vivo, mehrere Anpassungen stellen wir Verfahren aus anderen veröffentlichten Protokolle15,16, 17,18,19,20,21. Wir geben Informationen zum Erfolg in der Zucht timed-trächtige Weibchen zu verbessern. Auch beschreiben wir unsere zwei Strategien einzuführen, spärlich und hellen Kennzeichnung von Neuronen im kortikalen Gewebe: eine Strategie ist, die Ebenen von einem einzigen Konstrukt Codierung für Cre-Rekombinase und einem fluoreszierenden Marker22titrieren. Eine weitere Strategie ist das "Supernova"-System, speziell mit diesen Parametern im Geist23,24verwenden. Darüber hinaus bieten wir Verbesserungen auf die Herstellung von konsistenten Mikroinjektion Pipetten und Vereinfachungen, die in Utero Elektroporation Chirurgie. Zu guter Letzt erläutern wir wichtige Schritte in einem vereinfachten histologischen Präparat, das die Analyse von dendritischen Dornen und dendritischen und axonalen Dorne, ohne weitere Färbung oder Immunohistochemistry ermöglicht.
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Protocol
Hier beschriebene Methoden von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) von James Madison University genehmigt worden und sind in Übereinstimmung und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien.
(1) Maus-Setup
- Ein junges Haus (> P60) männliche und weibliche homozygot Floxed Maus zusammen, um einen Züchter paar25einzurichten.
Hinweis: Eine gute Negativkontrolle ist ein paar zusätzliche Züchter von Wildtyp-Mäusen, eingerichtet in denen Cre Rekombinase Ausdruck nicht dazu ein Mosaik-26 führen wird. - Das Weibchen gebären und erhöhen ihren ersten Wurf mit dem Mann zu ermöglichen. Halten Sie das Männchen zusammen mit das Weibchen zu dem Wurf überleben zu erhöhen. Nach dem Absetzen des Wurfes, z.B. bei postnatalen Tag (P) 21, trennen Sie die weiblichen und männlichen.
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Murine Zucht
- Richten Sie eine zeitgesteuerte Paarung zwischen den weiblichen und männlichen25. Verwenden Sie visuelle Hinweise bestimmen die Brunst-Zyklus der weiblichen27sowie für vaginalen Stecker am Morgen nach der Paarung25.
- Wenn ein Stecker befindet, trennen, und das Weibchen wiegen. Die Anzahl der Tag als embryonale Tag (E) 0,5.
- Fahren Sie fort, wiegen das Weibchen alle 3-5 Tage, um festzustellen, ob sie schwanger ist. Trächtige Weibchen haben eine 10-20 % ige Erhöhung des Körpergewichts 7-10 Tage nach der Empfängnis (E0).
Hinweis: Dieser Schritt bestätigt Schwangerschaft früher und zuverlässiger als Sichtprüfung25. - Wenn die Frau nicht schwanger ist, wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.3.
- Sobald die Schwangerschaft bestätigt ist, wählen Sie das Datum von der Elektroporation in Utero . Auf Layer II/III kortikalen pyramidale neuronalen Vorläuferzellen, führen Sie Elektroporation an E15.5.
(2) DNA-Aufbau
- Wählen Sie eine einzelne DNA zu konstruieren, dass Codes für Cre-Rekombinase sowie einen fluoreszierenden Marker, wie grün fluoreszierendes Protein (GFP)28,29. Alternativ verwenden Sie die "Supernova"-System, ausführlich in früheren Publikationen23,24. Sehen Sie Liste der Materialien zum Beispiel konstruiert.
- Die DNA-Construct(s) aus Schritt 2.1 in E. Coli mit mikrobiologischen Standardtechniken30zu verstärken.
- Reinigen Sie die DNA-Konstrukt mit einem Endotoxin-freie Plasmid-Reinigung-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Eluieren Sie Konstrukt mit Endotoxin-freies Wasser.
Hinweis: Auswahl eine Endotoxin-freie Reinigung-Kit über ein standard-Reinigung-Kit ist entscheidend. - Das Eluat DNA, 1-3 mg/mL je nach gewünschten Kennzeichnung Dichte26zu konzentrieren.
Hinweis: Ein Titer muss immer eingerichtet werden, bei der Arbeit mit einer neuen DNA-Konstrukt, angesichts der Tatsache, dass sie unterschiedliche Längen und Promotoren. Betrachten Sie injizieren ein Konstrukt an mehreren verschiedenen Konzentrationen und/oder Mengen Ausdruck zu beurteilen. Z. B. Injektion von 1 µL oder 1,5 µL von 2,0 mg/mL GFP. CRE ist in der Lage, spärlich (1 µL) oder dichten (1,5 µL) verursachen Kennzeichnung von Schicht II/III visuellen kortikalen pyramidale Neuronen26. - Hinzufügen von 0,4 % Trypan blau in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 H2O, angepasst auf pH 7.4 mit HCl) 01:10, die konzentrierte DNA-Lösung.
- 10 X PBS 01:10 die konzentrierte DNA-Projektmappe hinzufügen.
- Lagern Sie die konzentrierte DNA-Lösung bei 4 ° c Die Lösung kann auf unbestimmte Zeit aufbewahrt werden.
3. Pipette Set-up
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Mit ein Glas Kapillare Abzieher, ziehen Sie eine Pipette mit einem sehr langen (10-15 mm) Kegel und sehr feine Spitze, typisch für Pipetten für embryonale Stammzellen Injektion oder Kerntransfer31.
Hinweis: Um Ablagerungen verhindern Kontamination der Pipetten, sollten sie innerhalb von 2 Tagen nach der Operation erfolgen.- Kalibrieren Sie den Glas-Kapillare-Abzieher durch eine Rampe Test, nach den Anweisungen des Herstellers. Nutzung der daraus resultierende Heizwert ein ziehen zu programmieren-Protokoll mit den folgenden Parametern: Wärme = (Rampe Testwert + 15), ziehen = 30, Vel = 120, Zeit = 100, Druck = 200. Legen Sie die Glas-Kapillare, am Puller an Klemmen befestigen und das programmierte ziehende Protokoll, Erstellung einer Verjüngung auf der Glas-Kapillare zu aktivieren.
- Sicherzustellen, dass die Kegel zwischen beträgt 10-15 mm mit einem zusammengesetzten Lichtmikroskop (z.B. 10 X Objektiv)31.
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Zurück zu brechen die Pipette, um eine grobe Kanten Tipp auf 20-25 µm Durchmesser zu bilden.
- Zentrieren Sie eine einlagige Aufgabe wischen (siehe Materialliste) über ein 50 mL Becherglas "und" Dehnen wischen Sie mit einer Hand straff. Festhalten Sie mit der anderen Hand und eine Pipette (Kegel Seite nach unten) senkrecht und vollständig durch das Zentrum der Tücher, verursacht einen klaren Bruch in der Kegel31.
Hinweis: Drücken die Pipette voll und ganz durch das wischen wird ein 20-25 µm Durchmesser Spitze etwa 70 % der Zeit produzieren. - Bestätigen Sie unter einem zusammengesetzten Lichtmikroskop (z. B. 20 X Objektiv).
Achtung: Verwenden Sie Augenschutz beim Einschlagen der Scheibe.
- Zentrieren Sie eine einlagige Aufgabe wischen (siehe Materialliste) über ein 50 mL Becherglas "und" Dehnen wischen Sie mit einer Hand straff. Festhalten Sie mit der anderen Hand und eine Pipette (Kegel Seite nach unten) senkrecht und vollständig durch das Zentrum der Tücher, verursacht einen klaren Bruch in der Kegel31.
- Kalibrieren einer Pipette durch Absaugnadeln 1 µL 0,4 % Trypan blau mit 1 X PBS-Puffer in einem teilweise gefüllten Piptte, dann dem Studium der Pipette mit 1 µL Markierungen basierend auf der Höhe von 1 µL in der Pipette, mit einer feinen Spitze alkoholbeständigen Marker. Verwenden Sie die kalibrierte Pipette die andere Pipetten vor dem Wegwerfen zu absolvieren. Halten Sie Pipetten in einer Pipette Halterung frei von Staub und andere Partikel.
4. in Utero Elektroporation
- Graefe Pinzette, Iris-Schere Hartman Moskito-Zange, Vlies Gaze Schwämme, Ring-bestückte Zange und Petrischalen auf einem Edelstahl-Tablett legen und mit Alufolie umwickeln. Fach und 1 L 0,9 % Kochsalzlösung (0,9 % wt/Vol NaCl in Wasser) im Autoklaven zu platzieren. Autoklaven bei 121 ° C und 3,5 kPa für 40 min. vom Autoklaven und legen Sie in eine desinfizierte OP-Bereich.
Hinweis: Es ist entscheidend für die sterile Bedingungen während der Operation zu erhalten. - Wärmen Sie die autoklaviert Kochsalzlösung 1 L-Flasche in einem kleinen Wasserbad bis 38 ° C mindestens 2 h vor der Operation.
- Die Pinzette-Typ-Elektroden und Fußpedal zum Generator zu verbinden (siehe Materialliste). Nach den Anweisungen des Herstellers, den Generator zu fünf 50 ms Pulse von 50 V (mit einem 950 ms Intervall) Wann liefern festgelegt durch das Fußpedal ausgelöst. Desinfizieren Sie die Pinzette-Typ-Elektroden und setzen auf die desinfizierte OP-Bereich.
- Machen Sie eine Narkose Nase Kegel als zuvor veröffentlichten32, aber verwenden Sie am Ende eines Nitril oder Latex-Handschuh Finger, um eine Membran zu bilden, die sicher über die Bugnase Öffnung passt. Schneiden Sie ein Loch im Zwerchfell groß genug, um über die Maus Schnauze passen.
- Betäuben Sie tief schwangere Mäusen in E15.5 in einer Induktion Kammer gefüllt mit Isofluran (2-4 %) in reinem Sauerstoff bei 1 L/min fließt. Nach ~ 1 min, testen den aufrichtenden Reflex (vorsichtig kippen die Induktion Kammer und sicherzustellen, dass die Maus sich nicht richtig). Wiegen Sie Maus, um später während der Operation verabreicht Analgesie Dosierungen zu bestimmen.
- Übertragen Sie die Maus auf den OP-Bereich und verwalten Sie inhalativen Isofluran (1-2 %) in reinem Sauerstoff fließt bei 1 L/min durch ein Prüfkopf, Maus in chirurgischen Flugzeug zu halten. Pinzette verwenden, um das Pedal Reflex testen (drücken Sie sanft die Pfote und sicherzustellen, dass die Maus keinen Reflex zurückkehrt), Anesthetization zu überprüfen. Atemfrequenz und Mühe, auf der Suche nach Tiefe, regelmäßige Atmung zu überwachen (~ 70-100 Atemzüge/min), und die Schleimhäute in der Farbe rosa und feucht sind.
- Wenden Sie genügend tierärztliche Augenheilkunde Salbe über den Augen, sie ganz zum Schutz vor Austrocknen während des Verfahrens zu decken.
- Flex Metall-Aktivator-Scheibe aus einem versiegelten Beutel gefüllt mit übersättigt Salzlösung (siehe Materialliste), Aktivierung einer exothermen Kristallisation des Salzes. Legen Sie 2 einlagige Aufgabe Tücher auf den Beutel zu, und platzieren Sie den Mauszeiger auf den Beutel, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
- Massieren Sie Enthaarungscreme auf den Bauchbereich mit Wattestäbchen zu, bis Bauch-Fell (ca. 20-40 s) löst, dann wischen Sie Bauch-Fell. Jede verbleibende Rückstände und Enthaarungsmittel Creme mit 70 % Ethanol und Baumwolle Tupfer reinigen Sie vorsichtig. Positionieren Sie ein gefenstert steriles OP-Tuch über den Bauchbereich.
- Aseptischen Technik, ziehen Sie die Haut und vom Bauch mit Graefe Pinzette und machen Sie einen ~ 2 cm ventralen Mittellinie Schnitt auf der Haut mit Iris-Schere, um sicherzustellen, dass die darunter liegenden Muskeln nicht geschnitten wird.
Hinweis: Eine akzeptable Alternative zu machen einen Schnitt mit Graefe Pinzette und Iris-Schere ist mit einem Skalpell wie zuvor17veröffentlicht. - Finden Sie die Linea Alba, die Mittellinie des Rectus Abdominis zu visualisieren. Muskel und vom Bauch mit Graefe Pinzette ziehen, und ein weiteres ~ 2 cm Mittellinie Schnitt es mit Iris-Schere, Freilegung der Bauchhöhle (die Gebärmutter ist lichtdurchlässig und Embryonen werden unter sichtbar). Sicherstellen Sie, dass die zugrunde liegende Gebärmutter und Darm Gewebe nicht geschnitten wird. Machen Sie der Einschnitt nur groß genug (in der Regel ~ 2 cm), herausziehen und setzen die Gebärmutter bequem.
Hinweis: Eine akzeptable Alternative zu machen einen Schnitt mit Graefe Pinzette und Iris-Schere ist mit einem Skalpell wie zuvor17veröffentlicht. - Mit einer sterilen 10 µL Mikropipette Spitze, Carprofen (aufgelöst in steriler 0,9 % Kochsalzlösung) bei 4 mg/kg in die Bauchhöhle für Analgesie zu verzichten.
- Klemmen Sie ein Hartman Moskito Zange am linken Rand der Rectus Abdominis Einschnitt. Rest der Zange auf umgestürzten Petrischale auf der linken Seite des Schnittes, die linke Seite des Schnittes offen zu halten. Klemmen Sie ein weiteres Hartman Moskito Zange am rechten Rand des Rectus Abdominis Schnittes und ruhen Sie die Zange auf einem umgestürzten Petrischale auf der rechten Seite des Schnittes, der rechten Seite des Schnittes offen zu halten. Positionieren Sie Gaze Schwamm, um den Bereich des Schnittes.
- Mit Ring Pinzette (ohne eine angeschlossene Grenze Schraube), ziehen Sie in der Gebärmutter zwischen zwei benachbarten Embryonen ohne Quetschungen oder jedem möglichem Gewebe zu verletzen. Beginnen Sie alle Embryonen durch die Inzision, legte sie auf die Gaze Schwamm herausziehen. Wenn die letzte Embryonen aus der Bauchhöhle herausziehen, darauf achten Sie, nicht auf die Eierstöcke oder Muttermund zu ziehen. Sobald ausgesetzt, ist es wichtig, die Gebärmutter mit warmen Kochsalzlösung feucht zu halten. Die Gebärmutter enthält in der Regel zwischen 5 und 8 Embryonen.
Hinweis: Es ist möglich die saline17Penicillin und Streptomycin hinzu. - Schließen Sie eine kalibrierte Pipette an der Absauganlage Strahler (siehe Materialliste), und Spritzen genau 1 µL DNA-Lösung in Schritt 2 durch die Gebärmutterwand in einer seitlichen Ventrikel jedes Embryos vorbereitet. Lateralen Ventrikel erscheinen als zwei Flecken auf der dorsalen Telencephalon des Embryos (Patches sind dunkler als die umliegenden Gewebe des Telencephalon). Verwenden Sie zwischen Daumen und Zeigefinger während der Mikroinjektion und Elektroporation um zu manipulieren, die Embryonen, enthüllt die lateralen Ventrikel und ermöglicht die Embryonen während der Injektion sanft gegen die Gebärmutterwand gedrückt werden. Bestätigen Sie erfolgreiche Injektion durch die Beobachtung Trypan blau füllen den seitlichen Ventrikel.
- Platzieren die Kathode Pinzette-Art Elektroden (siehe Materialliste) auf die Gebärmutter direkt über den medialen und kaudalen Kortex auf den visuellen Cortex (alternative Bereiche des Gehirns gezielt verschiedene Elektroden Platzierung benötigen)16, 26. Ort der Anode auf die Gebärmutter, nur minderwertig und anterior der Embryo Kopf.
- Bestätigen Sie, dass die Anode und Kathode die Gebärmutter umgibt den Embryo bei den entsprechenden Stellen berühren. Lösen Sie mit einem Fußpedal aus, die Lieferung von fünf 50 ms Impulsen von 50 V (mit einem 950 ms Intervall) zwischen den Elektroden.
Hinweis: Die injizierten, negativ geladene DNA bewegt sich in Richtung der Kathode und werden in ventrikuläre Zone Zellen am nächsten an der Kathode einfließen. - Zurückgeben der Gebärmutter zur Bauchhöhle in der gleichen Ausrichtung wurde festgestellt. Verwenden Sie Kochsalzlösung, um die Gebärmutter zu schmieren, während es manuell und äußerst schonend Führung kümmert sich nicht um Embryonen aus ihrer Position in der Gebärmutter zu verdrängen.
- Schließen Sie die Bauchmuskeln mit resorbierbaren Fäden (siehe Materialliste) verwenden eine einfache unterbrochene Masche, die Enden mit einem Chirurgen der Knoten binden. Tun nicht Clip aus, den die Enden zu nahe an den Knoten oder Knoten werden gelöst.
Hinweis: Es ist wichtig, Naht die Bauchmuskeln geschlossen, so dass die Ränder der Wunde vollständig geschlossen sind, aber ohne blanchieren des Muskels. Knoten sollten dicht sein, damit diese gelöst werden können. - Schließen Sie die Hautschicht mit resorbierbaren Fäden (einfache unterbrochenen Stich, Chirurg der Knoten, wie in Schritt 4.19). Wenden Sie eine kleine Menge des Klebers Gewebe um die Wunde zu verschließen. Gewebe-Kleber auf den Knoten zu lösen. Mithilfe einer Mikropipette entfernen keine Gewebe Kleber rund um die Wunde, die durch die Mikropipette abgesaugt werden kann.
- Geringere Isofluran auf 0,5-1,5 %. Sobald Gewebe Klebstoff ist trocknen (Test durch berühren Handschuh Kleber), entfernen von Isofluran und weibliche allein in einem warmen Käfig zu erholen. Verwalten von Buprenorphin intraperitoneal bei 0,03 mg/kg eine 1 mL Spritze mit einer 26G, ½" Nadel.
- Weiterhin die Maus zu verfolgen, bis die Maus vollständig erholt ist und Verhalten normalerweise (z.B. Pflege, Käfig zu erkunden, Essen oder trinken). Nach der Wiederherstellung setzen Sie wieder in Käfig mit männlich weiblich.
Hinweis: Wenn alle Schritte befolgt werden, die Maus wird in der Regel wieder Bewusstsein innerhalb von 2 min und sofort bewegen über den Käfig, keine Anzeichen von Unbehagen. - Wenn die Maus Anzeichen von Beschwerden (z.B. gebeugt Haltung, Porphyrin Sekrete)33 zeigt, verwalten Sie Carprofen bei 0,1 mg/mL in der Wasserversorgung. Wenn mehrere Anzeichen von Unbehagen vorhanden sind, oder wenn Beschwerden weiterhin für mehr als 4 h trotz Carprofen Verwaltung, sofort einschläfern der Maus durch die Verabreichung einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (240 mg/kg) - Xylazin (48 mg/kg)- Acepromazine (1,85 mg/kg)-Cocktail mit einer 1 mL Spritze mit einer 26 G, ½" Nadel, und mit einer genehmigten sekundären Form von Euthanasie33folgen.
- Um das Überleben der elektroporiert Embryonen nach der Geburt zu erhöhen, halten Sie den Käfig in einem ruhigen Raum, frei von Geräuschen und Vibrationen halten. Bereichern Sie die Umgebung mit Kunststoff-Iglus, Verschachtelung Materialien und Nahrungsergänzungsmittel wie Sonnenblumenkerne (siehe Materialliste). Nicht bewegen Sie oder stören Sie den Käfig, besonders während der ersten 3 Tage nach der Entbindung.
(5) histologische Vorbereitung für Fluoreszenz-Mikroskopie
Hinweis: Diese Histologie-Protokoll ist für die Zubereitung von Gewebe von Tieren, die älter als postnatale Tag (P) 13, die elektroporiert in Uterowurden optimiert. Um Gewebe aus jüngeren postnatale Tiere (P0-P13) vorzubereiten, empfiehlt es sich, alle Schritte (einschließlich Transcardial Perfusion), obwohl das Gehirn in Agar vor der Vorbereitung Abschnitte (Schritt 5.9) eingebettet werden sollte. Gewebe kann sogar bereit aus Embryonen innerhalb von 1-2 Tagen nach Electroporation Methoden zuvor beschriebenen18,20.
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Bereiten Sie Paraformaldehyd (PFA) Lösung.
Hinweis: Es ist zwingend notwendig, um frische PFA innerhalb eines Tages nach dem Experiment vorbereiten.
Achtung: Paraformaldehyd ist giftig und sollte in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden.- Zu 50 mL 4 % PFA, 40 mL Wasser bis 60 ° C. 2 g PFA unter ständigem Rühren mit einem Glasstab Stab- oder Rühren zugeben. Fügen Sie 10 µL 10 M NaOH alle 2 min bis PFA auflöst.
- 5 mL 10 X PBS und Lösung zu einem Endvolumen von 50 mL mit Wasser.
- Passen Sie nach 50 mL Lösung bringen pH-Wert 7,4 nach Bedarf an, mit 10 M HCl. zulassen Lösung zur Kühlung und Lagerung bei 4 ° C.
- Einschläfern Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (240 mg/kg) - Xylazin (48 mg/kg) - Acepromazine (1,85 mg/kg) cocktail Nadel eine 1 mL Spritze mit einer 26G, ½". Transcardially perfundieren 10 oder 20 mL eiskaltes 1 X PBS, gefolgt von 25 oder 40 mL frisch zubereitet, eiskalt 4 % PFA17. Verwenden Sie niedrigere Absatzmengen für junge postnatale (P0-P13) Mäuse und höhere Absatzmengen bei älteren Mäusen (P14 und höher).
- Unmittelbar nach Perfusion Enthaupte Maus Kadaver zwischen Hinterhauptsbein und C1 Wirbel mit großen Scheren und abziehen und entsorgen Sie die meisten der Schädel mit Iris-Schere umgebenden Haut, Haut besonders umliegenden Frontal und Parietal occipital Knochen. Schädel und Gehirn intakt zu halten.
- Legen Sie den Schädel und das Gehirn in 10 mL 4 % PFA in einem 50 mL konische Röhrchen für 24 Stunden bei 4 ° C, Post-Gewebe zu beheben. Fügen Sie dann 30 mL 1 X PBS, konische Rohr, verdünnen Sie die Lösung auf 1 % PFA zur Lagerung bei 4 ° C.
Hinweis: Verwenden Sie eine separate konischem Rohr für jeden Schädel und Gehirn Post-behoben werden. Inkubieren Sie das Gehirn nicht in 1 % PFA für länger als 2 Wochen oder Fluoreszenz zu verblassen beginnt. - Ort des Gehirns und des Schädels auf einer ebenen Fläche mit einlagige Aufgabe Tücher angefeuchtet mit 1 X PBS. Verwenden der Pinzette (siehe Materialliste), restliche Haut oder Membran umgibt den Schädel zu entfernen.
- Mit einer Pinzette, entfernen Sie zunächst das Hinterhauptsbein, dann entfernen Sie vorsichtig das Scheitelbein, verschieben die Pinzette heraus und Weg von der Oberfläche des Gehirns. Entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhaut um Schäden an der Rinde zu vermeiden.
- Keil von der Rückseite der Pinzette unter das Gehirn entlang der Schädel alle Hirnnerven zu durchtrennen, und das Gehirn zu entfernen.
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Für junge postnatale (P0-P13) Gehirn
- Machen Sie 25 mL 4 % Agar durch Erhitzen 25 mL 1 X PBS bis 80 ° C. Umrühren und 1 g Agar mit einem Glasstab Stab- oder Rühren auflösen).
- Coole Lösung auf 35 ° C, während Sie weiterhin rühren. Gehirn in einem kleinen Behälter (z. B. die Kappe einer 50 mL konische Röhre), und mit Agar Lösung übergießen Gehirn. Lassen Sie Agar aushärten.
- Machen Sie einen koronalen Schnitt manuell mit einer Rasierklinge Single-Rand durch das Gehirn, rostral, Bregma ca. 0,5 mm. Machen Sie eine weitere koronalen Schnitt durch das Gehirn ca. 0,5 mm kaudalen zum visuellen Kortex. Stellen Sie einen Pool von Cyanacrylat-Klebstoff mit den gleichen Durchmesser wie die rostral Ende des Gehirns auf die Mitte von der vibrierenden Mikrotom Objektplatte. Legen Sie die rostral Ende des Gehirns auf den Pool von Leim, um sicherzustellen, dass die gesamte rostral Fläche des Gewebes an der Objektplatte mit Leim gebunden ist.
- Pufferwanne auf vibrierenden Mikrotom befestigen und sichern mit eingebauten Klemmhebel. Messerhalter Messer stecken und Messerhalter auf vibrierenden Mikrotom mit integrierter Spannschraube montieren. Objektplatte mit Kopf aufs Pufferwanne mit eingebauter Spannvorrichtung zu sichern. 5.33 (53,3 Hz) Geschwindigkeitseinstellung, 5.70 (= 0.285 mm/s) und Frequenzeinstellung gesetzt.
- Füllen Sie die Kammer über dem Niveau des Gehirns mit 1 X PBS und senken Sie das Sägeblatt in der PBS. Beginnen Sie, die 100 µm koronalen Abschnitte durch das Gewebe.
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Wenn auch ohne Weiterverarbeitung, z. B. 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) nukleare Färbung oder Immunohistochemistry.
- Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel Abschnitte direkt von vibrierenden Mikrotom auf einen Objektträger, 4-6 Teile auf jeder Folie passend zu übertragen.
- In den Abschnitten durch Feuchtigkeitstransport Weg Lösung mit einem feinen Spitzen Pinsel trocknen, so dass die Gehirnscheiben nicht mehr auf den Folien driften zu ermöglichen.
- Legen Sie dann einen Tropfen Eindeckmedium (siehe Materialliste) auf die einzelnen Abschnitte auf der Folie.
- Sanft legen Sie ein 24 x 50 mm-Deckglas darauf, sicherzustellen, dass (1) keine Luftblasen Form auf den Abschnitten (2) die Abschnitte nicht bewegen, und (3) die Eindeckmedium deckt den Bereich zwischen der Folie und dem Deckglas. Lassen Sie Eindeckmedium mindestens 24-48 Stunden aushärten.
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Kerne mit DAPI für histologische Untersuchung der kortikalen Schichten Fleck
- Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel übertragen jeden Abschnitt in eine Lösung mit 10 µg/mL DAPI (siehe Materialliste) mit 1 X PBS-Puffer von Stammlösung (20 mg/mL DAPI im Wasser) verdünnt.
- DAPI-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie, dann verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel Abschnitt von DAPI-Lösung 1 X PBS übertragen und mit 1 X PBS-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie Abschnitt zwei weitere Male auf frische 1 X PBS für 5 min. Dann, mit einem feinen Spitzen Pinsel, Transfer Abschnitt auf einen Objektträger folgen Schritte 5.11.2-5.11.4, und fahren Sie mit Schritt 5.13.
- Erhitzen Sie eine Glas-Petrischale mit Valap (gleiche Teile Vaseline, Lanolin und Paraffin) auf einer heißen Platte bei schwacher Hitze bis Sie vollständig geschmolzen. Dichtung ausgesetzt Kanten der Folien durch Bürsten auf geschmolzenen Valap.
- Um Fluoreszenz im Gewebe zu überprüfen, verwenden Sie ein Lichtmikroskop oder confocal Mikroskop (siehe Materialliste) und einen Filter setzen, ausreichend für die Anzeige der Fluorophor (z. B. DAPI: Erregung 325-375 nm, Emission 435 485 nm; GFP: Erregung 450-490 nm, Emission 500-550 nm)17. Konfokale Aufnahmen mit Low - (4 X, numerische Apertur NA = 0,20), Medium-(20 X, NA = 0,75), und High-Power (60 X, NA = 1.40) Ziele.
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Representative Results
Die einzelnen Konstrukt GFP. CRE (siehe Materialliste) war elektroporiert bei E15.5 und visualisiert auf P14. Abhängig von der Konzentration des Konstrukts und das Volumen der Injektion erhalten Sie ein spärliches oder dichtes Ergebnis22,26. Beispiel: Injektion von 1 µL von 2 mg/mL GFP. CRE-Ergebnisse in eine spärliche Verteilung der markierten Zellen, von die einige helle (Abbildung 1A) und lokalisierte in Layer II/III (Abbildung 1 b) werden können. Da das Gewebe 100 µm dick ist, erhalten die meisten dendritischer Dorne (Abbildung 1). Dendritische Dornen können beobachtet werden, bei hohen Vergrößerungen (60 X; Abbildung 1). Injektion von 1,5 µL bei gleicher Konzentration führt zu sehr dichten Kennzeichnung (Abbildung 2A) in Layer II/III (Abb. 2 b), die kann nicht optimal sein, da es schwer ist zu verfolgen, die Quelle der Neuriten und dendritischen Dornen (Abbildung 2). Allerdings ist es noch möglich, ein Neuron (Abb. 2D) und seine Prozesse (Abb. 2E) Bild durch Auswahl einer hellen Zelle in der Peripherie des markierten Bereichs (Abb. 2D).
Schließlich ist es möglich, die Helligkeit der Neuronen zu maximieren und gleichzeitig eine spärliche Verteilung der markierten Zellen. Supernova-GLP (siehe Materialliste) war hier, elektroporiert am E15.5 und am P23 visualisiert. Anmerkung, die, basierend auf Beobachtungen von Hirngewebe in verschiedenen postnatale Alter genommen, scheint es nicht zu sein, eine Wirkung des Alters auf die Helligkeit einer fluoreszierenden Konstrukte verwendet hier23,24,26. Injektion von 1 µL ein Gemisch mit 1 mg/mL Sn-GLP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) und 10 µg/mL-TRE-Cre-Ergebnisse in einer spärlich Verteilung der meist hellen Zellen (Abbildung 3A) in Schicht II/III (Abb. 3 b). Dendritische und axonalen Prozesse (Abb. 3 b) und dendritischen Dornen (Abbildung 3) können visualisiert werden. Nach unserer Erfahrung targeting mit entweder ein einzelnes Konstrukt wie GFP. CRE oder mit "Supernova" Konstrukte erbringt reproduzierbar Ausdruck in mindestens 75 % der elektroporiert Embryonen.
Abbildung 1: Sparse und helle Ausdruck nach in Utero Elektroporation mit einem einzigen konstruieren mit GFP und Cre-Rekombinase. (A) Low-Vergrößerung (4 X) Fluoreszenz Schliffbild der Großhirnrinde bei P23, nach Electroporation in E15.5. (B) Medium-Vergrößerung (20 X) Fluoreszenz Schliffbild DAPI nuklearen Fleck, enthüllt kortikalen Laminierung ("layers" I, II/III, IV und Ebenen tief, IV). (C) Medium-Vergrößerung (20 X) Fluoreszenz Schliffbild eines einzelnen Neurons. (D) High-Vergrößerung (60 X) Fluoreszenz Schliffbild von dendritischen Dornen. Skalieren von Balken = 200 µm (A); 100 µm (B, C); und 5 µm (D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Dicht und hell Ausdruck nach in Utero Elektroporation mit einem einzigen konstruieren mit GFP und Cre-Rekombinase. (A) Low-Vergrößerung (4 X) Fluoreszenz Schliffbild der Großhirnrinde bei P14, nach Electroporation in E15.5. (B) Medium-Vergrößerung (20 X) Fluoreszenz Schliffbild DAPI nuklearen Fleck, enthüllt kortikalen Laminierung ("layers" I, II/III, IV und Ebenen tief, IV). (C) Medium-Vergrößerung (20 X) Fluoreszenz Schliffbild von Nervenzellen im Bereich der dichteste beschriften. (D) Medium-Vergrößerung (20 X) Fluoreszenz Schliffbild von Neuronen, die an der Peripherie des Bereichs der dichteste Beschriftung übernommen. (E) High-Vergrößerung (60 X) Fluoreszenz Schliffbild von dendritischen Dornen. Skalieren von Balken = 200 µm (A); 100 µm (B, C, D); und 5 µm (E). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Sparse und helle Ausdruck nach in Utero Elektroporation mit Supernova-GFP mit GFP und Cre-Rekombinase konstruiert. (A) Low-Vergrößerung (4 X) Fluoreszenz Schliffbild der Großhirnrinde bei P14, nach Electroporation in E15.5. (B) Medium-Vergrößerung (20 X) Fluoreszenz Schliffbild DAPI nuklearen Fleck, enthüllt kortikalen Laminierung ("layers" I, II/III, IV und Ebenen tief, IV). (C) Medium-Vergrößerung (20 X) Fluoreszenz Schliffbild eines einzelnen Neurons. (D) High-Vergrößerung (60 X) Fluoreszenz Schliffbild von dendritischen Dornen. Skalieren von Balken = 200 µm (A); 100 µm (B, C); und 5 µm (D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier stellen wir die Kombination von in Utero Elektroporation mit Cre-Rekombinase bei Floxed Mäusen, Mosaik Hirngewebe zu generieren. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass eine neue Mauslinie muss nicht jedes Mal generiert werden ein verschiedenen zellulärer Subtyp wird ins Visier genommen werden: in Utero Elektroporation kann verwendet werden, um exzitatorischen Neuronen, hemmende Neuronen oder Gliazellen je nach Ziel und Lage der Elektroporation15,16,17,18,19,20,21,34. In unserem Ansatz ist targeting der Großhirnrinde konsistent und reproduzierbare weil wir mit 5 mm Durchmesser Elektroporation Elektroden, die platziert werden können über eine große Fläche von den Entwicklungsländern Telencephalon. Um alternative Standorte im Gehirn (z.B. Zwischenhirn, Netzhaut) oder für spezifische Ausrichtung der Regionen innerhalb der Großhirnrinde Ziel, Verfahren und Elektroden, die explizit für diesen Zweck konzipiert möglicherweise verwendeten15, 16. Wir bieten auch ein einzelnes Konstrukt, das bietet helle Beschriftung und garantiert, dass jedes Neuron Eindringmittel beschriftet Cre-Rekombinase enthält. Ein Nachteil bei der Verwendung einer einzigen Konstrukt, um helle Kennzeichnung zu erreichen ist, dass die beschriftete Bevölkerung zu dicht (Abbildung 2), aber dies durch bildgebende Zellen an der Peripherie des markierten Bereichs (Bild 2D) gelöst werden kann. Alternativ, Ausdruck eines fluoreszierenden Konstrukts kann entworfen werden, um die Cre-Rekombinase Ausdruck17abhängen, aber geringe Expression Ebenen erfordern Immunostaining für die fluoreszierenden Marker. Diese Einschränkung ist durch das "Supernova" System der Cre-abhängige fluoreszierenden Marker Ausdruck (Abbildung 3A)23,24behoben.
Neben der Kombination von Cre Lox Rekombination mit in Utero Elektroporation, bieten wir einige Verbesserungen für die optimale Zucht von zeitlich-trächtige Weibchen. Es ist wichtig, dass die Mäuse in einem Raum halten, das frei von Geräuschen und Vibrationen verursacht durch Geräte wie Laminar-Flow Hauben. Bereichern Sie die Umwelt mit Kunststoff-Iglus, Material, nisten und Nahrungsergänzungsmittel wie Sonnenblumenkerne (siehe Materialliste). Neben Umweltaspekten haben wir festgestellt, dass die erste Wurf ein Weibchen in der Regel die niedrigste Überlebensrate hat. So schlägt unser Protokoll warten, bis die zweite Schwangerschaft des Weibchens in Utero Elektroporation durchführen. Während diese Strategie das Überleben des Wurfes erhöht, neigt es auch Wurfgröße, die OP-Dauer zu verlängern und senken damit den Erfolg der Operation zu erhöhen. Daher empfiehlt es sich wenn eine besonders große Anzahl von Embryonen (z. B. mehr als 8), überspringen die Elektroporation auf einigen der Embryonen, vor allem Embryonen am nächsten an die Eierstöcke und des Gebärmutterhalses, wo ist das Gewebe besonders anfällig für Verletzungen. Darüber hinaus verwenden die gleiche Umweltanreicherung Strategie erwähnt (Kunststoff Iglus, Verschachtelung Material, diätetische Ergänzungen) neigt dazu, das Überleben der Würfe nach der Geburt zu erhöhen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Brunst in das Weibchen ein paar Stunden nach der Entbindung des ersten Wurfes auftreten kann. In diesem Fall lassen Sie das Weibchen gebären ihren zweiten Wurf, dann nach dem Absetzen um zu versuchen Paarung zeitlich zu trennen. Bei der Suche nach vaginalen Stecker ist es ratsam, das Weibchen zu trennen, auch wenn ein Stecker nicht gefunden wird, vor allem, wenn das Weibchen in Brunst am Vorabend war. Stecker in bestimmte Stämme sind schwer zu erkennen, und Konzeption möglicherweise bereits stattgefunden.
Ein weiterer Bereich der Verbesserung ist in der Herstellung von ausreichenden Mikroinjektion Pipetten für in Utero Elektroporation. Pulling Pipetten für DNA-Injektion in seitlichen Ventrikel ist ein wichtiger Schritt. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für das Einrichten von Pipetten mit einem konsistenten Spitzengröße und grobe Spitze Kante. Andere Methoden sind wieder die Spitze mit einem Skalpell Klinge15 brechen oder Kneifen vor der Spitze mit Zange16,17. Beachten Sie, dass wenn Pipettenspitzen zu klein sind, sie richtig der Gebärmutterwand Punktion werden aber Injektion Volumenströme werden zu niedrig, Verlängerung der Zeit, in der die Pipette im embryonalen Gehirn gestellt wird. Wenn Pipettenspitzen zu groß sind, können sie die Gebärmutterwand und embryonalen Gehirn beschädigen. Wenn Pipettenspitzen zu glatt sind, verursacht sie einen großen Divot in der Gebärmutterwand und/oder embryonalen Schädel, bevor durchbrechen, evtl. Beschädigung des Embryos. Praxis schaffen eine grobe Pause um ein 20-25 µm Tipp zu produzieren und prüfen Tipps unter einem einfachen Lichtmikroskop (z.B. mit einem 10 X-Objektiv) bis ein konsistentes Ergebnis erreicht ist. Prüfung der Flüssigkeit werden kann ist zu einem vernünftigen Preis (z. B. ~0.5 µL/s) mit einer Absauganlage Tube Assembly pipettiert eine andere Methode um sicherzustellen, dass Spitzengröße innerhalb eines akzeptablen Bereichs. Weil die Injektion Pipetten kalibriert und Schloss sind, ist die genaue Menge an DNA geliefert an den seitlichen Ventrikel bekannt. Dies ist der wichtigste Schritt zur Erreichung eines gewünschten Kargheit reproduzierbar auf eine Größenordnung. Das heißt, sollte eine bestimmte Konzentration Ausbeute Kennzeichnung innerhalb eines bestimmten Bereichs, z. B. 10 bis 100 beschriftete Neuronen.
Der wichtigste Schritt in das Protokoll ist in Utero Elektroporation Verfahren. Seien Sie extrem sanft während die Gebärmutter auszusetzen. Wenn die letzte Embryonen aus der Bauchhöhle herausziehen, darauf achten Sie, nicht auf die Eierstöcke oder Muttermund zu ziehen. Mit Daumen und Zeigefinger während Mikroinjektion und Elektroporation ermöglicht sanfte, geschickte Manipulation der Embryonen, die seitlichen Ventrikel zu offenbaren und die Embryonen sanft gegen die Gebärmutterwand gedrückt werden. Eine extrem sanfte Berührung ist entscheidend beim Umgang mit der Gebärmutter und Embryonen. Wenn es schwer zu erzielen eine sanfte Berührung, Ring Zange mit einer eingebauten Grenze Schraube um zu verhindern, dass die Zange schärferes Vorgehen gegen ein Embryo oder der Gebärmutter verursacht Gewebeschäden. Eine weitere Überlegung ist, die Carprofen und Buprenorphin unmittelbar vor der Operation zu verwalten, eine Praxis, die offenbar wirksame Schmerztherapie in Utero intraoperativ ohne embryonalen überleben Preise35 .
Im folgenden unsere vereinfachte histologischen Verfahrens, sind mehrere Schritte entscheidend. Halten Sie nach der Vorrichtung experimentelle Gehirne mit Fixativ das Gehirn intakt in den Schädel auf das Hirngewebe vor Beschädigungen zu schützen, während der Post-Fixierung. Es ist zwar möglich, das Gehirn bei 1 % zu speichern, die PFA für Tage, Wochen, beachten, dass Fluoreszenz verringern wird, da die PFA-Lösung polymerisiert. Slicing 100 µm koronalen Abschnitte ist in der Regel dünn genug, um konfokalen Mikroskopie über den gesamten Bereich zu ermöglichen, wobei ein Großteil der dendritischen und axonalen Morphologie. Wenn Fixierung richtig aufgetreten ist, können Gehirne von Tieren, die älter als P13 auf der vibrierenden Mikrotom einfach mit Cyanacrylat-Klebstoff montiert werden. Jedoch wenn das Gehirn während durch vibrierende Mikrotom geschnitten zu biegsam ist, kleben Sie unten eine kleine Agar oder Agarose Block hinter dem Gehirn, es verbiegen zu verhindern, während es geschnitten wird, ist. Wenn das Problem nicht behoben ist, Betten Sie das Gehirn in Agar bilden einen Block mit vibrierenden Mikrotom, wie für jüngere postnatale Gehirne (Schritt 5,8) schneiden ein.
Diese Methode verbindet das Cre-Lox-Rekombinationssystem mit in Utero Elektroporation um Mosaike zu generieren, die verwendet werden, um die Zelle-autonome Funktion von Genen in Neuronen zu untersuchen. Diese Methode könnte auch konfiguriert werden, um Unterstützung in Utero Elektroporation Gens bearbeiten Konstrukte (z.B. CRISPR/Cas9)6oder andere standortspezifischen Rekombinasen (z.B. Flp/FRT oder Dre/Rox24), die alle sein könnte entwickelt, um Mosaik Hirngewebe zu produzieren. Eine viel versprechende alternative Technik, die verwendet werden könnte, um Mosaik Gewebe produzieren ist viral Lieferung per intraventrikuläre Injektion an neugeborenen Mäusen36. In Kombination mit intraventrikulären Injektion im embryonalen Alter wie hier und anderswo15,16,17,18,19,20, 21,22,37, virale Vektoren Codierung für Cre-Rekombinase übermittelt werden konnten, vor der Geburt, Floxed Vorläuferzellen bei der ventrikulären Zone zu infizieren. Eine kritische Betrachtung wäre, um sicherzustellen, dass die virale Vektoren ausreichend verdünnt werden, um spärlich Exzision und Kennzeichnung zu erreichen. Dies würde jedoch auch in niedrigeren Kopienzahl des Konstrukts übermittelt werden, einschließlich fluoreszierenden Marker für neuroanatomischen Beobachtungen (z.B. dendritische Dornen oder Arborization)24führen. Gegen diese Falle neue Konstrukte verwenden die gleiche Strategie wie hier demonstriert "Supernova"-Konstrukte verwendet werden, um zu erreichen, spärliche Beschriftung ohne einen entsprechenden Rückgang der Helligkeit der markierten Zellen24. Eine weitere kritische Betrachtung mit viralen Lieferung soll sicherstellen, dass gelieferte Konstrukte Promotoren, die spezifisch für die Zell-Population untersucht (z.B. exzitatorischen Neuronen pyramidale) haben. Intraventrikuläre Injektion von viralen Vektoren verursacht Infektion alle Gewebe rund um die Ventrikel, einschließlich nicht nur der ventrikuläre Zone des dorsalen Telencephalon wo kortikale und hippocampale exzitatorische Neuronen erzeugt, sondern auch die Medial und seitliche ganglionic Eminenzen, wo viele kortikale Interneurone34geboren sind. Ein weiteres Merkmal in Utero Elektroporation im Vergleich zur viralen Lieferung von Konstrukten ist seine relativ schmalen Zeitfenster der Lieferung. Nach der Operation weiterhin Zellen entlang der ventrikulären Zone infizieren können Viren injiziert in die seitlichen Ventrikel bestehen. Im Gegensatz dazu tritt Electroporation in Sekunden, Ausrichtung auf eine weitaus bestimmte Gruppe von Zellen. Dies kann ein Vorteil oder Nachteil auf die Ermittler, abhängig von der Subpopulation der zu untersuchenden Zellen sein.
Unser Ansatz unterstützt Cre Lox Rekombination durch Einführung einer einzigen Konstrukt oder "Supernova" Konstrukte. Im Falle der "Supernova"-Konstrukte fordern wir Ermittler mit den Vorteilen und Einschränkungen bei der Verwendung dieser Strategie vertraut zu werden. Zum Beispiel wurde das Timing der Cre Löschung nachgewiesen innerhalb von 2 Tagen in Layer II/III exzitatorischen Neuronen der Hirnrinde24auftreten. So ist es plausibel, dass Cre Exzision über 48 h folgende Elektroporation, anstatt unmittelbar nach der Elektroporation auftreten könnten. Daher sollten andere Formen der erhärten, Zeitpunkt und Ort der Cre Exzision (z. B. mittels einer Cre Reporter Mauslinie) verwendet werden, um den Einsatz dieser neuen Technik, vor allem in Studien zu ergänzen, wo Cre Exzision in einem kleinen Zeitrahmen eine kritische ist berücksichtigt werden. Ein weiterer möglicher Fallstrick ist, dass ein kleiner Prozentsatz der unbeschrifteten Zellen in einem Experiment "Supernova" Cre-Rekombinase ausdrücken könnte. Zum Beispiel in Abbildung 3, wir co-elektroporiert zwei Plasmide: eine hohe Konzentration von CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE und eine niedrige Konzentration von TRE-Cre. Da TRE undichte Förderer ist, könnte Cre-Rekombinase in Zellen, die das TRE-Cre-Plasmid, aber nicht die LoxP-Stop-LoxP-EGFP-tTA-Plasmid, empfing ausgedrückt, obwohl dies selten der Fall wäre. In einem Experiment es wichtig ist, dass alle unmarkierten Zellen haben keine Cre-vermittelten Exzision überhaupt, eine "Supernova" Experiment müssen mit einem Kontrollexperiment ergänzt werden, in denen Cre Rekombinase Ausdruck außerhalb der Neuronen beschriftet, wird bewertet durch andere bedeutet (z. B. Cre-Rekombinase Immunohistochemistry).
Zusammenfassend lässt sich sagen ist unser Protokoll leicht geändert, um diese neue Konstrukte, wodurch in Utero Elektroporation eine noch mehr nützliche und anpassungsfähige Methode für Mosaik-Analyse zu berücksichtigen. So kann in Utero Elektroporation mit der Kraft der genetischen Rekombination in mehrfacher Hinsicht zu Mosaik Gehirn Gewebe in VivoStudie kombiniert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken die großzügige Unterstützung der James Madison University Department of Biology und James Madison Universität Licht Mikroskopie und Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele für hilfreiche Ratschläge zur Vorbereitung junger postnatale Gewebe, und DRS. Justin W. Brown und Corey L. Cleland für großzügige Koordinierung der chirurgischen Materialien und Raum. Diese Forschung wurde teilweise durch ein Collaborative Research Grant durch 4-VA, eine partnerschaftliche Zusammenarbeit zur Förderung der Commonwealth von Virginia (etfolgreich) und durch eine Virginia Akademie der Wissenschaft kleine Projekt Research Grant (etfolgreich) finanziert. Unterstützung hat wurde großzügig zur Verfügung gestellt von einer Betty Jo liebevolle Butler 58 Stiftung für Undergraduate Research Stipendium (K.M.B), ein Sommer-Forschungsstipendium Farrell (auf K.M.B), ein James Madison Universität zweiten Jahrhundert Stipendium (K.M.B), ein James Madison University Centennial Stipendium (C.J.H.), ein James Madison Universität Lucy Robinson Suche 30 Memorial Stipendium (Z.L.H.) und ein James Madison University College von Wissenschaft und Mathematik Fakultät Hilfe gewähren (etfolgreich).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
| GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
| Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
| Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
| Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
| Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
| Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
| Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
| P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| 3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
| Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
| Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
| Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
| Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
| General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
| Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
| Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
| Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
| ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
| ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
| Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
| Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
| Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
| Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
| 10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
| Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
| “LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
| Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
| BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
| Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
| Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
| Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
| Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
| Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
| Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
| Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
| Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
| Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
| Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
| Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
| Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
| 4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
| 20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
| 60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |
References
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