Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Inducerende Cre-lox rekombination i mus hjernebarken gennem In Utero elektroporation

Published: November 17, 2017 doi: 10.3791/56675
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biology, James Madison University
* These authors contributed equally

Summary

Celle-autonome funktioner af gener i hjernen kan studeres ved at inducere tab eller gevinst på funktion i spredte populationer af celler. Her beskriver vi i utero elektroporation for at levere Cre recombinase i sparsomme befolkninger for at udvikle kortikale neuroner med floxed gener til at forårsage tab af funktion in vivo.

Abstract

Celle-selvstændig neuronal funktioner af gener kan blive afsløret ved at forårsage tab eller gevinst på funktionen af et gen i en lille og spredte befolkning af neuroner. For at gøre det kræver, at skabe en mosaik, hvor neuroner med tab eller gevinst på funktionen af et gen er omgivet af genetisk uforstyrrede væv. Her, kombinerer vi Cre-lox rekombination system med i utero elektroporation for at generere mosaik hjernevæv, der kan bruges til at studere funktionen celle-selvstændig af gener i neuroner. DNA konstruktioner (tilgængelig via repositories), der koder for en fluorescerende etiket og Cre recombinase, føres ind i udvikle kortikale neuroner indeholdende gener flankeret med loxP steder i hjernen hos mus embryoner ved hjælp af in utero elektroporation. Derudover beskriver vi forskellige tilpasninger i utero elektroporation metode at øger overlevelsesevne og reproducerbarhed. Denne metode indebærer også etablering af en titer for Cre-medieret rekombination i en sparsom eller tætte befolkning af neuroner. Histologiske præparater af mærket hjernevæv ikke kræver (men kan tilpasses) Immunhistokemi. Konstruktioner anvendes sikre, at fluorescently mærket neuroner bære genet for Cre recombinase. Histologiske præparater tillade morfologisk analyse af neuroner gennem Konfokal billeddannelse af dendritiske og cytoskeletale Dorne og dendritiske pigge. Fordi tab eller gevinst på funktion opnås i sparsomme mosaik væv, tillader denne metode undersøgelse af celle-selvstændig nødvendighed og tilstrækkeligheden af genet produkter i vivo.

Introduction

Generere en genetiske mosaik er en klassisk eksperimentelle paradigme for at forstå funktionen af et gen af interesse. For at afgøre, om et gen er nødvendige for en cellulær fænotype, er den enkleste forårsager tab af funktion af genet i hele organismen (f.eks knockout). Men for at bestemme, hvis et gen der kræves specielt i en bestemt celletype, knockout af genet i hele organismen er ikke en gyldig tilgang. I stedet, en metode der kræves der vil forårsage tab af funktion af et gen i en given celle, mens det er omgivet af vildtype (dvs. genetisk uforstyrrede) væv — med andre ord skabe mosaik væv. Hvis cellen mutant viser en mutant fænotype, men omkringliggende vildtype celler ikke genet funktioner i en celle-selvstændig måde. Analyse af mosaik væv, som muterede celler er omgivet af vildtype væv, er ideel for at forstå celle-autonome funktioner af gener, især i hjernen hvor neuroner og glia danner et stort sammenhængende netværk af væv.

Flere former for mosaik hjernevæv har givet effektive modeller for at undersøge celle-autonome funktioner af gener. Undersøgelser fokuseret på neuronal transplantation1, kvindelige X-linked mosaicisme2,3,4, og endogene somatiske mosaicisme5,6 har trukket deres konklusioner baseret på mosaik hjernevæv. Betinget sletning af et gen gennem Cre-lox rekombination system er en metode, der tager fuld fordel af den store tilgængelighed af Transgene mus linjer. I denne metode introduceres to loxP websteder på begge sider af en påkrævet sekvens af et gen (såsom en exon), forlader det flankeret af loxP steder at begge står over for i den samme retning ("floxed"). CRE recombinase punktafgifter sekvens mellem loxP websteder7. CRE-medieret rekombination kan opnås ved at krydse floxed mus til en anden mus linje at udtrykke Cre recombinase sammen med en fluorescerende markør i en delmængde af celler ("Cre reporter linje"). Det er blevet påvist i en række forskellige måder at afdække funktionerne af et gen i delmængder af celler, som excitatoriske neuroner eller astrocytter8. CRE reporter linjer kan udtrykke CreERT2 for at tillade Cre-medieret rekombination være stof-inducerbar (single-neuron mærkning med inducerbar Cre-medieret knockout, eller SLICK)9. I en anden strategi kaldet mosaik analyse med dobbelt markører (MADM)10,11, tillader Cre-medieret interchromosomal rekombination en homozygot mutant skal oprettes sammen med heterozygous væv. I disse tilgange skal en ny linje af mus fremstilles hver gang for hver kandidat gen eller cellulære undertype, der er testet. Alternativt, Cre recombinase kan indføres efter fødslen, gennem iontophoresis12 eller virale vektorer (fx adeno-associeret virus13 eller lentiviruses14 transporterer cellulære undertype-specifikke initiativtagere). Denne strategi skaber stærke og postnatal mærkning. For at målrette udvikler cerebral kortikale neuroner sparsomt og prænatalt, er en ideel strategi i utero elektroporation af Cre recombinase med en fluorescerende markør.

Ud over kombinerer Cre-lox rekombination gennem i utero elektroporation at producere mosaik væv i vivo, vi introducere flere tilpasninger til procedurer fra andre publicerede protokoller15,16, 17,18,19,20,21. Vi leverer oplysninger til at forbedre succes i avl timed-gravide kvinder. Vi også skitsere vores to strategier til at indføre sparsom og lyse mærkning af neuroner i kortikale væv: én strategi er at titrere niveauer af en enkelt konstruere kodning for Cre recombinase og en fluorescerende markør22. En anden strategi er at bruge "Supernova"-systemet, designet specifikt med disse parametre i betragtning23,24. Derudover tilbyder vi forbedringer på at producere konsekvent mikroinjektion pipetter og forenklinger til i utero elektroporation kirurgi. Endelig vil skitsere vi kritiske trin i et forenklet histologiske præparat, der giver mulighed for analyse af dendritiske pigge og dendritiske og cytoskeletale dorne, uden yderligere farvning eller Immunhistokemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metoder, der beskrives her, er blevet godkendt af Animal Care og brug udvalg (ACUC) fra James Madison University, og er i overensstemmelse og overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer.

1. Mouse Set-up

  1. Hus en ung (> P60) mandlige og kvindelige homozygote floxed mus sammen til at sætte oppe en opdrætter par25.
    Bemærk: En god negative kontrol er at oprette en ekstra opdrætter par vildtype mus, i hvilke Cre recombinase udtryk ikke vil forårsage en mosaik26.
  2. Tillad kvinde at føde og opdrage sit første kuld med mandlige. Holde mandlige sammen med den kvindelige at øge det kuld overlevelse. Efter fravænning kuld, fx på postnatal dag (P) 21, adskille den kvindelige og mandlige.
  3. Murine avl
    1. Oprette en tidsindstillet parring mellem kvindelige og mandlige25. Bruge visuelle signaler til at bestemme estrus cyklussen af de kvindelige27, og tjek for vaginale stik om morgenen efter parring25.
    2. Hvis et stik findes, adskille, og vejer kvindelige. Tæl dag som embryonale dag (E) 0,5.
    3. Fortsat vejer kvindelige hver 3-5 dage for at afgøre, om hun er gravid. Gravide kvinder vil have en 10-20% stigning i kropsvægt 7-10 dage efter undfangelsen (E0).
      Bemærk: Dette trin bekræfter graviditet tidligere og mere pålideligt end visuel inspektion25.
    4. Hvis hunnen ikke er gravid, skal du gentage trin 1.3.1-1.3.3.
  4. Når graviditeten er bekræftet, skal du vælge datoen for i utero elektroporation. For at målrette layer II/III kortikale pyramideformet neuronal progenitorceller, udføre elektroporation på E15.5.

2. DNA set-up

  1. Vælge en enkelt DNA konstruere at koder for Cre recombinase samt en fluorescerende markør, såsom grøn fluorescerende proteiner (NGL)28,29. Alternativt kan du bruge "Supernova" system, beskrevet i detaljer i tidligere publikationer23,24. Se listen over materialer for eksempel konstruerer.
  2. Forstærke DNA construct(s) fra trin 2.1 i E. coli ved hjælp af standard mikrobiologiske teknikker30.
  3. Rense DNA konstruktion med en endotoxin-fri plasmid rensning kit efter fabrikantens anvisninger. Elueres konstruktion med endotoxin-gratis vand.
    Bemærk: Hvis du vælger en endotoxin-fri rensning kit over en standard rensning kit er kritisk.
  4. Koncentrere DNA eluatet til 1-3 mg/mL afhængigt af ønskede mærkning tæthed26.
    Bemærk: En titer altid skal etableres, når du arbejder med en ny DNA konstruktion, eftersom at de har forskellige længder og initiativtagere. Overveje at indsprøjte en konstruktion på flere forskellige koncentrationer og/eller beløb, der skal vurdere udtryk. For eksempel, injektion af 1 µL eller 1,5 µL af 2,0 mg/mL normal god landbrugspraksis. CRE er i stand til at forårsage sparsom (1 µL) eller tæt (1,5 µL) mærkning af layer II/III visuelle kortikale pyramideformet neuroner26.
  5. Tilføje 0,4% trypan blå i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 H2O, indstillet til pH 7,4 med HCl) 1:10 til koncentreret DNA løsningen.
  6. Tilføje 10 x PBS 1:10 til den koncentrerede DNA løsning.
  7. Gemme den koncentrerede DNA løsning ved 4 ° C. Opløsningen kan opbevares på ubestemt tid.

3. pipette Set-up

  1. Ved hjælp af et glas kapillær puller, trække en pipette med en meget lang (10-15 mm)-konus og meget fine spids, typisk af pipetter til embryonale stamceller injektion eller overførsel af cellekerner31.
    Bemærk: For at forhindre snavs fra forurener pipetter, de skal gøres senest 2 dage efter operationen.
    1. Kalibrere glas kapillær puller ved at udføre en rampe test, efter fabrikantens anvisninger. Brug den resulterende værdi i varmen at programmere en trække-protokollen ved hjælp af følgende parametre: varme = (rampe test værdi + 15), træk = 30, vel = 120, tid = 100, tryk = 200. Indsæt glas kapillær, Fastgør til klemmer på puller, og aktivere den programmerede trækker protokol, skabe en tilspidsning på glas kapillær.
    2. Sikre, at den koniske længde er mellem 10-15 mm ved hjælp af en sammensat lysmikroskop (f.eks. 10 X mål)31.
  2. Bryde tilbage pipette til at danne en grove kanter tip til 20-25 µm diameter.
    1. Centrere en single-ply opgave tørre (Se liste over materialer) i en 50 mL baegerglas og stræk tørre stramt med den ene hånd. Med anden hånden, holde og skubbe en pipette (koniske side ned) vinkelret og fuldt ud gennem midten af tørre, forårsager en ren pause i den koniske31.
      Bemærk: Skubbe pipette fuldt ud gennem tørre vil producere en 20-25 µm diameter tip omkring 70% af tiden.
    2. Bekræfte under en sammensatte lysmikroskop (f.eks. 20 x mål).
      Forsigtig: Brug øjenbeskyttelse mens bryde glas.
  3. Kalibrere en pipette af sugning 1 µL af 0,4% trypan blå i 1 x PBS i en delvist udfyldt piptte, så eksamen pipette med 1 µL markeringer baseret på højden af 1 µL i pipette, ved hjælp af en bøde-tippes alkohol-resistente markør. Bruge de kalibrerede pipette til at opgradere de andre pipetter før udsmid. Holde pipetter i en pipette holder fri for støv og andre partikler.

4. in Utero elektroporation

  1. Placer Graefe pincet, iris saks, Hartman myg pincet, ikke-vævede gaze svampe, ring-tippet pincet og petriskåle på en rustfri plade, og wrap med aluminiumsfolie. Placer skuffen og 1 L 0,9% saltvand (0,9% wt/vol NaCl i vand) i autoklave. Autoklavering ved 121 ° C og 3.5 kPa i 40 min. Fjern fra autoklave og sted i en desinficerede kirurgiske område.
    Bemærk: Det er afgørende at opretholde sterile forhold under operationen.
  2. Varm autoklaveres 1 L saltvand flasken i en lille vandbad til 38 ° C mindst 2 h før operationen.
  3. Tilsluttes generatoren pincet-type elektroder og fodpedalen (Se liste over materialer). Efter producentens anvisninger, indstille generator til at levere fem 50 ms pulser af 50 V (med et interval på 950 ms) når udløst af fodpedalen. Desinficere pincet-type elektroder og placere på det desinficerede kirurgiske område.
  4. Gøre en anæstesi næsen kegle som tidligere udgivne32, men brug enden af en nitril eller latex handske finger til at danne en membran, der passer sikkert over næsen kegle åbning. Skær et hul i mellemgulvet, stor nok til at passe over musens snude.
  5. Dybt bedøver gravide mus på E15.5 i en induktion kammer fyldt med isofluran (2-4%) i ren ilt flyder på 1 L/min. Efter ~ 1 min., teste den oprettende refleks (forsigtigt vippe induktion kammer og sørge for at musen ikke lige sig). Veje mus for at fastlægge doseringer af analgesi administreres senere under operationen.
  6. Overføre musen til det kirurgiske område og administrere inhaleret isofluran (1-2%) i ren ilt flyder på 1 L/min via næsen kegle at opretholde mus i kirurgisk fly. Bruge pincet til at teste den pedal refleks (knivspids pote forsigtigt og sikre, at musen ikke returnerer en refleks) at kontrollere anesthetization. Overvåge respirationsfrekvens og indsats, på udkig efter dyb, regelmæssig vejrtrækning (~ 70-100 vejrtrækninger/min), og at slimhinderne er pink i farven og fugtig.
  7. Anvende nok veterinære oftalmologiske salve over øjnene til at dække dem helt til beskyttelse mod tørring under proceduren.
  8. Flex metal aktivator disken i en forseglet pose fyldt med overmættet saltopløsning (Se liste over materialer), aktivering af en eksoterm krystallisering af salt. Lå 2 single-ply opgave klude på toppen af posen, og Anbring musen på pose til at opretholde kropstemperaturen.
  9. Massage depilatory creme på den abdominale område med bomuld svaberprøver indtil abdominal pels opløses (ca 20-40 s) og derefter tørres af abdominal pels. Forsigtigt rense ud alle resterende rest og rigtige spørgsmål creme med 70% ethanol og bomuld svaberprøver. Placer en fenestrated steril kirurgiske drapere over maveregionen.
  10. Ved hjælp af aseptisk teknik, trække huden op og væk fra maven med Graefe pincet, og gøre en ~ 2 cm ventrale midterlinjen snit på huden ved hjælp af iris saks, at sikre, at underliggende muskler ikke er skåret.
    Bemærk: Et acceptabelt alternativ til at gøre et snit med Graefe pincet og iris saks er at bruge en skalpel, som er offentliggjort tidligere17.
  11. Find linea alba at visualisere midterlinjen af rectus abdominis. Træk muskel op og væk fra maven med Graefe pincet, og gøre en anden ~ 2 cm midterlinjen snit der med iris saks, udsætter i bughulen (livmoderen er gennemskinnelig og embryoner kan ses under). Sikre, at underliggende uterus og tarmens væv ikke er skåret. Gør indsnit kun stor nok (typisk ~ 2 cm) til at trække og udsætte livmoderen komfortabelt.
    Bemærk: Et acceptabelt alternativ til at gøre et snit med Graefe pincet og iris saks er at bruge en skalpel, som er offentliggjort tidligere17.
  12. Ved hjælp af en steril 10 µL mikropipette tip, dispensere carprofen (opløst i steril 0,9% saltvand) 4 mg/kg i bughulen for analgesi.
  13. Klemme en Hartman myg pincet på den venstre kant af rectus abdominis indsnit. Hvile pincet på væltede petriskål til venstre for den indsnit, holder den venstre side af snittet åben. Klemme en anden Hartman myg pincet på den højre kant af rectus abdominis indsnit og hvile pincet på en væltet petriskål til højre for den indsnit, holder i højre side af snittet åben. Anbring gaze svamp rundt af snittet.
  14. Brug af ring pincet (uden en tilknyttet grænse skrue), trække på livmoderen mellem de to tilstødende embryoner uden knusning eller sårede alle væv. Begynd at trække ud alle embryoner gennem incisionen, lægge dem på toppen af gaze svamp. Når du trækker ud af sidste embryoner fra bughulen, Sørg for ikke at trække på æggestokke eller livmoderhalsen. Når afsløret, er det afgørende at holde livmoderen fugtig med varmt saltvand. Livmoderen indeholder typisk mellem 5 og 8 embryoner.
    Bemærk: Det er muligt at tilføje penicillin og streptomycin til den saltholdige17.
  15. Tilslut en kalibreret pipette til indsugningsventil tube Forsamling (Se liste over materialer), og injicere præcis 1 µL af den DNA rengøringsopløsning, i trin 2 gennem livmodervæggen til en lateral ventrikel af hvert embryon. Laterale hjertekamrene vises som to pletter på den dorsale telencephalon af embryonet (patches er mørkere end omkringliggende væv af telencephalon). Bruge tommel- og pegefinger under mikroinjektion og elektroporation for at manipulere embryoner, afslører de laterale hjertekamrene og at tillade embryoner skubbes forsigtigt mod livmodervæggen under injektion. Bekræft vellykket injektion ved at observere trypan blå fylde den laterale ventrikel.
  16. Placer katode af pincet-type elektroder (Se liste over materialer) på livmoderen, direkte over den mediale og caudale cortex til at målrette den visuelle cortex (målretning alternative områder af hjernen vil kræve forskellige elektrode placering)16, 26. Placer anoden på livmoderen, bare ringere og forreste Fosters hoved.
  17. Bekræfte, at anode og katode rører livmoderen omkring fosteret på passende steder. Med en fodpedal, udløse levering af fem 50 ms pulser af 50 V (med et interval på 950 ms) på tværs af elektroderne.
    Bemærk: Den injicerede, negativt ladede DNA vil bevæge sig mod katoden og vil blive indarbejdet i ventrikulær zone cellerne tættest på katoden.
  18. Tilbage i livmoderen til bughulen i den samme retning konstateredes det. Brug saltvand til at smøre livmoderen, mens vejledende den manuelt og meget blidt, pas på ikke for at fortrænge embryoner fra deres position i livmoderen.
  19. Luk mavemuskler med resorberbare suturer (Se liste over materialer) ved hjælp af en simpel afbrudt søm, binde enderne med en kirurg knude. Gør ikke klip enderne for tæt på knuden eller knude vil blive løste.
    Bemærk: Det er afgørende at sutur mavemusklerne, så kanterne af såret lukkes helt lukket, men uden forårsager blanchering af musklen. Knob skal være stram, så de ikke kan være løste.
  20. Lukke huden lag med resorberbare suturer (simpel afbrudt stitch, kirurgen knude, som i trin 4.19). Påfør en lille mængde af væv klæbemiddel til at forsegle såret. Anvende væv lim på knob til at forhindre åbne. Bruge en mikropipette til at fjerne enhver væv selvklæbende omkring såret, der kan være indsugning af mikropipette.
  21. Sænke isofluran niveauer til 0,5-1,5%. Når væv limen er tør (test ved at røre ved handske limen), fjerne fra isofluran og tillade kvindelige at inddrive alene i en varm bur. Administrere buprenorphin intraperitoneal på 0,03 mg/kg ved hjælp af en 1 mL sprøjte med en 26G, ½" nål.
  22. Fortsætte med at overvåge musen, indtil musen er fuldt tilbagebetalt og opfører sig normalt (dvs. grooming, udforske bur, spise eller drikke). Når inddrives, placere kvindelige tilbage i buret med mandlige.
    Bemærk: Hvis alle trin er fulgt, vil musen typisk genvinde bevidsthed inden for 2 min og straks begynde at bevæge sig rundt i buret, viser ingen tegn på ubehag.
  23. Hvis musen udviser tegn på ubehag (fx foroverbøjet kropsholdning, porfyrin sekreter)33, administrere carprofen på 0,1 mg/mL i vandforsyningen. Hvis flere tegn på ubehag er til stede, eller hvis gener vedvarer mere end 4 h trods carprofen administration, straks aflive mus ved at administrere en intraperitoneal dødelig indsprøjtning af ketamin (240 mg/kg) - xylazin (48 mg/kg)- Acepromazin (1.85 mg/kg) cocktail ved hjælp af en 1 mL sprøjte med en 26 G, ½" nål, og følg med godkendt sekundære form af eutanasi33.
  24. For at øge electroporated embryoner overlevelse efter fødslen, skal du holde buret i rolige holding værelse, gratis fra lyde og vibrationer. Berige miljø med plast igloer, redebygning materialer og kosttilskud såsom solsikkefrø (Se liste over materialer). Ikke flytte eller forstyrre buret, især i de første 3 dage efter fødsel.

5. histologiske præparat til fluorescens mikroskopi

Bemærk: Denne histologi protokol er optimeret for at forberede væv fra dyr ældre end postnatal dag (P) 13, der blev electroporated in utero. For at forberede væv fra yngre postnatal dyr (P0-P13), anbefales det at følge alle trin (herunder transcardial perfusion), selv om hjernen skal integreres i agar før forberede sektioner (trin 5.9). Væv kan endda være parat fra embryoner inden for 1-2 dage efter elektroporation, ved hjælp af metoder beskrevet tidligere18,20.

  1. Forberede PARAFORMALDEHYD (PFA) løsning.
    Bemærk: Det er bydende nødvendigt at forberede frisk PFA, inden for en dag af eksperimentet.
    Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftigt og bør håndteres i et stinkskab med passende personlige værnemidler.
    1. At gøre 50 mL 4% PFA, varme 40 mL vand til 60 ° C. Der tilsættes 2 g PFA under omrøring med glas stang eller omrøring bar. Tilsæt 10 µL af 10 M NaOH hver 2 min, indtil PFA opløses.
    2. Der tilsættes 5 mL 10 x PBS og bringe løsning til en endelige rumfang paa 50 mL med vand.
    3. Efter at bringe opklaring på 50 mL, Juster pH til 7.4 efter behov med 10 M HCl. Tillad løsning afkøles og opbevares ved 4 ° C.
  2. Aflive mus med en intraperitoneal injektion af ketamin (240 mg/kg) - xylazin (48 mg/kg) - Acepromazin (1.85 mg/kg) cocktail ved hjælp af en 1 mL sprøjte med en 26G, ½" nål. Transcardially perfuse 10 eller 20 mL iskold 1 x PBS, efterfulgt af 25 eller 40 mL frisklavede, iskold 4% PFA17. Bruge mindre mængder for unge postnatale (P0-P13) mus og større mængder til ældre mus (P14 og ovenfor).
  3. Umiddelbart efter perfusion, halshugge mus slagtekroppen mellem nakkeknude og C1 ryghvirvel med store sakse og skræl væk og skille sig af med de fleste af huden omkring kraniet ved hjælp af iris saks, især hud omkringliggende frontal, parietal og occipital knogler. Holde kraniet og hjernen intakt.
  4. Placer kraniet og hjernen i 10 mL 4% PFA i en 50 mL konisk slange i 24 timer ved 4 ° C til post løse væv. Derefter tilsættes 30 mL 1 x PBS til koniske rør til at fortynde løsningen til 1% PFA for opbevaring ved 4 ° C.
    Bemærk: Brug et separat koniske rør for hver kraniet og hjernen skal fastsættes efter. Ikke Inkuber hjernen i 1% PFA i mere end 2 uger, eller fluorescens begynder at falme.
  5. Sted hjernen og kraniet på en flad overflade med single-ply opgave klude fugtet med 1 x PBS. Brug et par pincet (Se liste over materialer) til at fjerne enhver resterende hud eller membran omkring kraniet.
  6. Bruge pincet, skal du først fjerne nakkeknude, så fjern forsigtigt de parietale knogler, flytter pincet ud og væk fra overfladen af hjernen. Fjern forsigtigt alle meninges for at forhindre skader til cortex.
  7. Kile på bagsiden af pincet under hjernen langs kraniet at afskære alle hjernenerver, og fjerne hjernen.
  8. For ung postnatale (P0-P13) hjerne
    1. Gøre 25 mL 4% agar ved opvarmning 25 mL 1 x PBS til 80 ° C. Rør og opløse 1 g agar med et glas stang eller omrøring bar).
    2. Cool løsning til 35 ° C samtidig med at røre. Læg hjernen i en lille beholder (f.eks. fælles landbrugspolitik i en 50 mL konisk tube), og hælde agar løsning over hjernen. Tillad agar til at hærde.
  9. Foretage en koronale cut manuelt ved hjælp af et enkelt-kant barberblad gennem hjernen, ca 0.5 mm rostralt for bregma. Gøre en anden koronale snit gennem hjernen ca 0.5 mm caudale visuelle cortex. Placer en pulje af ren lim med samme diameter som den rostralt slutningen af hjernen på midten af den vibrerende mikrotomen objektpladen. Placere den rostralt slutningen af hjernen på toppen af puljen af lim, at sikre, at hele rostralt overfladen af væv er bundet til objektpladen med lim.
  10. Montere pufferkar på vibrerende mikrotomen og fastgør med indbygget spændearm. Sæt klingen i knivholderen, og montere knivholder på vibrerende mikrotom med indbygget klemskruen. Sikre objektpladen med hjernen på pufferkar ved hjælp af indbyggede klemmer enhed. Indstille hastighedsindstilling til 5,70 (= 0.285 mm/s) og frekvens indstilling til 5.33 (53.3 Hz).
  11. Fyld salen over niveauet af hjernen med 1 x PBS og sænke klingen ind i PBS. Begynde at tage 100 µm koronale sektioner gennem væv.
  12. Hvis ikke kræver yderligere behandling, f.eks. 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nukleare farvning eller Immunhistokemi.
    1. Bruge et fint tippes pensel til at overføre dele direkte fra den vibrerende mikrotomen ind på et objektglas, montering af 4-6 sektioner på hvert dias.
    2. Tillad sektioner til at tørre ved fugtspredende væk løsning med et fint tippes pensel, således at hjernen skiver ikke længere drift på diasene.
    3. Anbring en dråbe af praeparat (Se liste over materialer) på hver sektion på diaset.
    4. Forsigtigt lå en 24 x 50 mm coverslip på toppen, at sikre, at 1) ingen luftbobler form på afsnittene, 2) i afsnit ikke flytte, og 3) praeparat fuldt ud dækker området mellem dias og coverslip. Tillad praeparat hærde i mindst 24-48 timer.
  13. At pletten kerner med DAPI til histologisk undersøgelse af kortikale bladplader
    1. Bruge et fint tippes pensel til at overføre hver sektion i en løsning, der indeholder 10 µg/mL DAPI (Se liste over materialer) fortyndet i 1 x PBS fra stamopløsningen (20 mg/mL DAPI i vand).
    2. Inkuber i DAPI løsning for 5 min ved stuetemperatur og derefter bruge et fint tippes pensel at overføre afsnit fra DAPI løsning til 1 x PBS og inkuberes i 1 x PBS for 5 min ved stuetemperatur. Overføre afsnit to gange mere til frisk 1 x PBS i 5 min. Derefter, ved hjælp af en fint tippes pensel, overførsel afsnittet på et objektglas, Følg trin 5.11.2-5.11.4, og Fortsæt med trin 5.13.
  14. Varme et glas petriskål indeholdende Valap (lige dele Vaseline, lanolin og paraffin) på en varmeplade ved en svag varme indstilling indtil fuldstændig smeltet. Seal udsat kanter af dias ved hjælp af børstning på smeltet Valap.
  15. For at inspicere fluorescens i væv, bruge en lysmikroskop eller Konfokal mikroskop (Se liste over materialer) og et filter sat tilstrækkelig til visning af fluorophore (fx DAPI: excitation 325-375 nm, emission 435-485 nm; Normal god landbrugspraksis: excitation 450-490 nm, emission 500-550 nm)17. Konfokal billeder kan tages med lav - (4 X, numerisk blænde, NA = 0,20), medium-(20 X, NA = 0,75), og high-power (60 X, NA = 1,40) mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Singlen konstruere normal god landbrugspraksis. CRE (Se liste over materialer) var electroporated på E15.5 og visualiseres på P14. Afhængigt af koncentrationen af konstruktionen og mængden af injektion, kan en sparsom eller tætte resultat opnås22,26. For eksempel, injektion af 1 µL af 2 mg/mL normal god landbrugspraksis. CRE resultater i en sparsom fordeling af mærket celler, hvoraf nogle kan være lyse (figur 1A), og lokaliserede i layer II/III (figur 1B). Fordi væv er 100 µm tykt, bevares de fleste af de dendritiske Dorne (figur 1 c). Dendritiske pigge kan observeres ved høje forstørrelser (60 X; Figur 1 d). Injektion af 1,5 µL på den samme fusion resulterer i meget tætte mærkning (figur 2A) i layer II/III (figur 2B), som kan være optimal, da det er vanskeligt at spore kilden til neurites og dendritiske pigge (figur 2 c). Det er dog stadig muligt at en neuron (figur 2D) og dens processer (figur 2E) billedet ved at vælge en lys celle i periferien af området mærket (figur 2D).

Endelig er det muligt at maksimere lysstyrken af neuroner samtidig opretholde en sparsom fordeling af mærket celler. Her, Supernova-normal god landbrugspraksis (Se liste over materialer) var electroporated på E15.5 og visualiseres på P23. Bemærk, at baseret på observationer af hjernevæv taget på forskellige postnatal aldre, synes der ikke at være en effekt af alder på lysstyrken af enhver fluorescerende konstruktioner brugt her23,24,26. Injektion af 1 µL af en blanding indeholdende 1 mg/mL Sn-normal god landbrugspraksis (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) og 10 µg/mL TRE-Cre resultater i en sparsom fordeling af det meste lyse celler (figur 3A) i layer II/III (figur 3B). Dendritiske og cytoskeletale processer (figur 3B) og dendritiske pigge (figur 3 c) kan visualiseres. Vores erfaring, målretning med enten en enkelt konstruktion som normal god landbrugspraksis. CRE eller med "Supernova" konstruktioner vil reproducerbar give udtryk i mindst 75% af electroporated embryoner.

Figure 1
Figur 1: Sparsomme og lyse udtryk efter i utero elektroporation med en enkelt konstruere indeholdende normal god landbrugspraksis og Cre recombinase. (A) lav forstørrelse (4 X) Fluorescens Mikrograf af hjernebarken på P23, efter elektroporation på E15.5. (B) Medium-forstørrelse (20 X) Fluorescens Mikrograf af DAPI nukleare pletten, afslørende kortikale laminering (lag I, II/III, IV og lag dyb-IV). (C) Medium-forstørrelse (20 X) Fluorescens Mikrograf af en enkelt neuron. (D) høj forstørrelse (60 X) Fluorescens Mikrograf af dendritiske pigge. Skalere barer = 200 µm (A); 100 µm (B, C); og 5 µm (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Tunge og lyse udtryk efter i utero elektroporation med en enkelt konstruere indeholdende normal god landbrugspraksis og Cre recombinase. (A) lav forstørrelse (4 X) Fluorescens Mikrograf af hjernebarken på P14, efter elektroporation på E15.5. (B) Medium-forstørrelse (20 X) Fluorescens Mikrograf af DAPI nukleare pletten, afslørende kortikale laminering (lag I, II/III, IV og lag dyb-IV). (C) Medium-forstørrelse (20 X) Fluorescens Mikrograf af neuroner i området i tætteste mærkning. (D) Medium-forstørrelse (20 X) Fluorescens Mikrograf af neuroner taget i periferien af området i tætteste mærkning. (E) høj forstørrelse (60 X) Fluorescens Mikrograf af dendritiske pigge. Skalere barer = 200 µm (A); 100 µm (B, C, D); og 5 µm (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Sparsomme og lyse udtryk efter i utero elektroporation med Supernova-normal god landbrugspraksis konstruktioner indeholdende normal god landbrugspraksis og Cre recombinase. (A) lav forstørrelse (4 X) Fluorescens Mikrograf af hjernebarken på P14, efter elektroporation på E15.5. (B) Medium-forstørrelse (20 X) Fluorescens Mikrograf af DAPI nukleare pletten, afslørende kortikale laminering (lag I, II/III, IV og lag dyb-IV). (C) Medium-forstørrelse (20 X) Fluorescens Mikrograf af en enkelt neuron. (D) høj forstørrelse (60 X) Fluorescens Mikrograf af dendritiske pigge. Skalere barer = 200 µm (A); 100 µm (B, C); og 5 µm (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her introducerer vi kombinationen af i utero elektroporation med Cre recombinase i floxed mus til at generere mosaik hjernevæv. En fordel ved denne tilgang er, at en ny mus linje ikke behøver at blive genereret hver gang en forskellige cellulære subtype er målrettet: i utero elektroporation kan bruges til at målrette excitatoriske neuroner, hæmmende neuroner og glia afhængigt af tidspunktet og placering af elektroporation15,16,17,18,19,20,21,34. I vores tilgang er målretning hjernebarken konsekvent og reproducerbar fordi vi bruger 5 mm diameter elektroporation elektroder, der kan placeres over et stort område af det udviklende telencephalon. For at målrette alternative steder i hjernen (fx diencephalon, nethinde), eller til mere specifikke målretning af områder i hjernebarken, procedurer og elektroder designet udtrykkeligt til dette formål kan være brugt15, 16. vi tilbyder også en enkelt konstruktion, der giver mærkning og garanterer, at hver fluorescently mærket neuron indeholder Cre recombinase. En ulempe ved at bruge en enkelt konstruktion for at opnå mærkning er at mærket befolkningen kan være alt for tætte (figur 2 c), men dette kan løses af imaging celler i periferien af området mærket (figur 2D). Alternativt, udtryk for en fluorescerende konstruktion kan designes til at afhænge af Cre recombinase udtryk17, men lav udtryk niveauer kan kræve immunfarvning for de fluorescerende markør. Denne begrænsning er behandlet af "Supernova" system af Cre-afhængige fluorescerende markør udtryk (figur 3A)23,24.

Ud over kombinerer Cre-lox rekombination med i utero elektroporation, tilbyder vi flere forbedringer til optimale avl af timed-drægtige hundyr. Det er vigtigt at holde mus i en bedrift værelse, der er fri for støj og vibrationer forårsaget af udstyr såsom laminar flow emhætter. Berige miljø med plast igloer, nesting materiale, og kosttilskud som solsikkekerner (Se liste over materialer). Ud over miljøhensyn, har vi bemærket, at det første kuld af en kvindelig typisk har den laveste overlevelsesrate. Således, vores protokol antyder venter indtil den anden graviditet af kvinde til at udføre i utero elektroporation. Mens denne strategi øger overlevelsen af kuldet, det også en tendens til at øge kuldstørrelse, som kan forlænge kirurgisk tid og dermed lavere succes af operationen. Hvis støder på et særligt stort antal embryoner (f.eks. mere end 8), foreslår vi derfor, overspringelse elektroporation på nogle af embryonerne, især embryoner tættest på æggestokke og livmoderhalsen, hvor vævet er mest tilbøjelige til at skade. Desuden ved hjælp af den samme miljøberigelse strategi nævnt ovenfor (plast igloer, nesting materiale, kost kosttilskud) tendens til at øge overlevelsen af kuld efter fødslen. Det er også vigtigt at bemærke, at estrus kan forekomme i kvindelige et par timer efter fødsel af det første kuld. I dette tilfælde tillade kvinde at føde sit andet kuld, så adskille efter fravænning for at forsøge timet parring. Når man ser for vaginal stik, er det god praksis at adskille hunnen, selvom en plug ikke er fundet, især hvis kvinden var i estrus aftenen før. Stik i visse stammer er vanskelige at få øje på, og undfangelsen kan allerede er sket.

En anden er forbedring i at producere tilstrækkelig mikroinjektion pipetter til i utero elektroporation. Trække pipetter til DNA injektion i laterale hjertekamrene er et kritisk skridt. Her give vi en detaljeret protokol for at konfigurere pipetter med en konsekvent tip størrelse og ru tip kant. Andre metoder omfatter bryde tilbage spidsen med en skalpel bladet15 eller klemme fra spids med pincet16,17. Bemærk, at hvis pipette tips er for små, de vil korrekt punktere livmodervæggen men injektion strømningshastigheder bliver for lavt, længere på det tidspunkt, hvor pipetten er indgivet i den embryonale hjerne. Hvis pipette tips er for store, kan de beskadige livmodervæggen og embryonale hjernen. Hvis pipette tips er for glat, vil de forårsage et stort hul i livmodervæggen og/eller embryonale kraniet før bryde igennem, eventuelt skader fosteret. Praksis at skabe en ru pause for at producere en 20-25 µm tip og inspicere tips under en simpel lysmikroskop (f.eks. med en 10 X mål) indtil en ensartet resultat er opnået. Test at væske kan være er pipetted på en rimelig sats (f.eks. ~0.5 µL/s) med en indsugningsventil tube forsamling en anden metode til at sikre, at tip størrelse er inden for et acceptabelt interval. Fordi injektion pipetter er kalibreret og gradueret, er det nøjagtige beløb af DNA leveret til den laterale ventrikel kendt. Dette er den mest afgørende skridt for at opnå en ønsket beskedne reproducerbar til en størrelsesorden. Med andre ord bør en given koncentration give mærkning inden for et bestemt interval, f.eks. 10 til 100 mærket neuroner.

Det vigtigste skridt i protokollen er i utero elektroporation procedure. Være meget blid samtidig udsætter livmoderen. Når du trækker ud af sidste embryoner fra bughulen, Sørg for ikke at trække på æggestokke eller livmoderhalsen. Ved hjælp af tommel- og pegefinger under mikroinjektion og elektroporation tillader blid, behændig manipulation af embryoner til at afsløre den laterale ventrikel og tillader embryoner skubbes forsigtigt mod livmodervæggen. En meget blid berøring er kritisk, når håndtering af livmoderen og embryoner. Hvis det er vanskeligt at opnå en blid berøring, skal du bruge ring pincet med en indbygget grænse skrue til at forhindre pincet fra slå hårdt på et embryo eller i livmoderen, forårsager vævsskader. Et yderligere aspekt er at administrere både carprofen og buprenorphin umiddelbart før operationen, en praksis, der synes at give effektiv smertebehandling under i utero kirurgi uden at påvirke embryonale overlevelse satser35 .

I følge vores histologiske forenklede, er flere trin kritisk. Efter perfusing eksperimentelle hjerner med fiksativ, holde hjernen intakt i kraniet at beskytte hjernevæv fra skader under efter fiksering. Mens det er muligt at gemme hjernen i 1% PFA for dage til uger, Bemærk at fluorescens vil falde som PFA løsning polymeriserer. Udskæring 100 µm koronale sektioner er typisk tynd nok til at tillade konfokalmikroskopi gennem hele sektionen samtidig bevare en stor del af dendritiske og cytoskeletale morfologi. Hvis fiksering opstod ordentligt, kan hjerner af dyr, der er ældre end P13 monteres på den vibrerende mikrotom simpelthen med ren lim. Men hvis hjernen er også bøjelig mens skæres af vibrerende mikrotomen, lim ned en lille agar eller Agarosen blok bag hjernen til at forhindre det fra bøjning, mens det er ved at blive delt. Hvis problemet ikke er løst, skal du integrere hjernen i agar til at danne en blok til at skære med vibrerende mikrotomen, som foreslået for yngre postnatal hjerner (trin 5.8).

Denne metode kombinerer Cre-lox rekombination system med i utero elektroporation med henblik på at generere mosaikker, der kan bruges til at studere funktionen celle-selvstændig af gener i neuroner. Denne metode kan også konfigureres til at understøtte i utero elektroporation af genet redigering konstruktioner (f.eks. CRISPR/Cas9)6, eller andre lokationsspecifikke recombinases (fx Flp/FRT eller Dre/rox24), som kunne alle være designet til at producere mosaik hjernevæv. En lovende alternativ teknik, der kunne bruges til at producere mosaik væv er viral levering via intraventrikulært injektionen at neonatal mus36. Kombineret med intraventrikulært injektion på embryonale aldre som demonstreret her og andetsteds15,16,17,18,19,20, 21,22,37, virale vektorer kodning for Cre recombinase kunne leveres inden fødslen at inficere floxed stamceller på den ventrikulære zone. En kritisk overvejelse ville være at sikre, at de virale vektorer fortyndes tilstrækkeligt for at opnå sparsomme excision og mærkning. Dette medfører dog også lavere kopi numre af konstruktionen bliver leveret, herunder fluorescerende markører afgørende for neuroanatomical observationer (fx dendritiske pigge eller arborization)24. For at imødegå denne faldgrube, nye konstruktioner ved hjælp af den samme strategi som "Supernova" kunne konstruktioner demonstreret her anvendes til at opnå sparsomme mærkning uden et tilsvarende fald i lysstyrke af mærket celler24. En anden kritisk overvejelse med viral levering er at sikre, at leverede konstruktioner har initiativtagere specifikke for cellen befolkningen undersøgt (fx excitatoriske pyramideformet neuroner). Intraventrikulært injektion af virale vektorer forårsager infektion af alle væv omkring hjertekamrene, herunder ikke kun den ventrikulære zone af den dorsale telencephalon hvor kortikale og hippocampus excitatoriske neuroner er genereret, men også medialt og lateral ganglionære eminences hvor mange kortikale interneurons er født34. En anden funktion i i utero elektroporation i forhold til viral levering af konstruktioner er dens relativt smalle tidsvindue for levering. Virus indsprøjtes i de laterale hjertekamrene kan vedvarer efter operationen, fortsætter med at inficere celler foring ventrikulære zone. Derimod opstår elektroporation i sekunder, rettet mod en langt mere specifik sæt af celler. Dette kan være en fordel eller ulempe at investigator, afhængigt af delpopulation af celler til at blive undersøgt.

Vores metode understøtter Cre-lox rekombination af indførelsen af enten en enkelt konstruktion eller "Supernova" konstruktioner. I tilfælde af "Supernova"-konstruktioner opfordrer vi efterforskere at blive fortrolig med de fordele og begrænsninger ved brug af denne strategi. For eksempel, har timingen af Cre sletning vist sig for at forekomme inden for 2 dage i lag II/III excitatoriske neuroner i hjernebarken24. Derfor er det plausibelt at Cre excision kan opstå over den 48 timer efter elektroporation i stedet umiddelbart efter elektroporation. Derfor, andre former for bekræfter timing og placering af Cre excision (f.eks. ved hjælp af en Cre reporter mus linje) bør anvendes som supplement til anvendelsen af denne nye teknik, især i studier hvor Cre excision inden for en lille tidsramme er en kritisk overvejelse. En anden potentiel faldgrube er, at en lille procentdel af umærket celler i en "Supernova" eksperiment kunne udtrykke Cre recombinase. For eksempel, i figur 3, vi co-electroporated to plasmider: en høj koncentration af CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE, og en lav koncentration af TRE-Cre. Fordi TRE er en utæt promotor, kunne Cre recombinase udtrykkes i celler, der har modtaget TRE-Cre plasmid men ikke loxP-stop-loxP-EGFP-tTA plasmid, selvom det ville være en sjælden begivenhed. I et eksperiment, hvor det er afgørende, at alle umærkede celler har ingen som helst Cre-medieret excision, en "Supernova" eksperiment kan skal suppleres med en kontrol eksperiment i som Cre recombinase udtryk uden for mærket neuroner er vurderet gennem andre midler (f.eks. Cre recombinase Immunhistokemi).

Sammenfattende er vores protokol let modificeret til at rumme disse nye konstruktioner, gør i utero elektroporation en endnu mere nyttigt og fleksibel metode til mosaik analyse. Således kan i utero elektroporation kombineres med magt af genetiske rekombination på flere måder at studere mosaik hjernen væv i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne takke generøs støtte fra James Madison University Institut for biologi og James Madison University Light mikroskopi og Imaging facilitet. Dr. Mark L. Gabriele for nyttige råd om unge postnatal væv forberedelse, og Drs. Justin W. Brown og Corey L. Cleland for generøse koordinering af kirurgisk materialer og rum. Denne forskning blev delvis finansieret af kollaborative forskning tilskud af 4-VA, en samarbejdsorienteret partnerskab for at fremme Commonwealth Virginia (G.S.V.), og af Virginia akademi for videnskab lille projekt forskning tilskud (G.S.V.). Støtte er blevet generøst leveret af en Betty Jo kærlig Butler ' 58 Endowment for Undergraduate Research Scholarship (til K.M.B.), en Farrell sommer forskning Scholarship (til K.M.B.), en James Madison University andet århundrede stipendium (til K.M.B.), en James Madison University Centennial stipendium (til C.J.H.), en søgning ' 30 James Madison University Lucy Robinson Mindelegat (til Z.L.H.) og en James Madison University College af videnskab og matematik fakultet støtte Grant (til G.S.V.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641 (2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163 (2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747 (2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
  31. Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232 (2014).
  33. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).

Tags

Neurovidenskab sag 129 udvikling cerebral cortex celle-selvstændig gen levering Cre recombinase loxP i utero elektroporation dendritiske pigge mosaicisme gevinst af funktion tab af funktion
Inducerende Cre-lox rekombination i mus hjernebarken gennem <em>In Utero</em> elektroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bland, K. M., Casey, Z. O.,… More

Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter