Summary
Funções celulares autónomos de genes no cérebro podem ser estudadas através da indução de perda ou ganham de função em esparsas populações de células. Aqui, descrevemos no utero electroporation para entregar recombinase Cre em populações esparsas de desenvolver os neurônios corticais com genes de floxed para causar a perda da função em vivo.
Abstract
Autónoma-célula neuronais funções dos genes podem ser reveladas, causando perda ou ganham de função de um gene em uma população pequena e esparsa de neurônios. Para fazer isso requer gerando um mosaico em que neurônios com perda ou ganho de função de um gene são rodeados por tecido geneticamente imperturbável. Aqui, nós combinamos o sistema de recombinação de Cre-lox com eletroporação no utero para gerar tecido de cérebro de mosaico que pode ser usado para estudar a função celular autónomos de genes nos neurônios. DNA construções (disponível através de repositórios), que codifica para uma etiqueta fluorescente e Cre recombinase, são introduzidos em desenvolver os neurônios corticais que contém genes ladeados com loxP sites nos cérebros de embriões de rato usando utero em eletroporação. Além disso, descrevemos várias adaptações para o método de eletroporação no utero que aumentam a capacidade de sobrevivência e reprodução. Esse método também envolve o estabelecimento de um título para recombinação mediada por Cre em uma população esparsa ou densa de neurônios. Preparações histológicas do tecido cerebral rotulado não exigem (mas pode ser adaptadas para) imuno-histoquímica. As construções utilizadas garantem que fluorescente etiquetado neurônios carreg o gene recombinase Cre. Preparações histológicas permitem a análise morfológica dos neurônios através da imagem latente confocal de mandris dendríticas e axonal e espinhas dendríticas. Porque a perda ou ganho de função pode é feito de tecido mosaico esparsas, esse método permite que o estudo da célula autónomos necessidade e suficiência do gene produtos na vivo.
Introduction
Gerar um mosaico genético é um paradigma clássico experimental para a compreensão da função de um gene de interesse. Para determinar se um gene é necessário para um fenótipo celular, a abordagem mais simples é causar uma perda de função do gene em todo o organismo (por exemplo, nocaute). No entanto, para determinar se um gene é necessário especificamente em um determinado tipo de célula, nocaute do gene em todo o organismo não é uma abordagem válida. Em vez disso, um método é necessário que causará a perda da função de um gene em uma determinada célula enquanto está rodeado por tecido de sua (ou seja, geneticamente imperturbável) — em outras palavras, criando tecidos de mosaico. Se a célula mutante mostra um fenótipo mutante, mas células circundantes de sua não, fazem as funções de gene de forma autónoma a célula. Análise do tecido do mosaico, no qual as células mutantes estão rodeadas por tecido de sua, é ideal para compreender a célula autónomos funções dos genes, especialmente no cérebro onde os neurônios e glia formam uma vasta rede interligada de tecido.
Várias formas de tecido cerebral de mosaico forneceram modelos poderosos para investigar a célula autónomos funções dos genes. Estudos focados em transplante neuronal1, mosaicismo feminino ligado ao X2,3,4, e mosaicismo somático endógena5,6 ter desenhado suas conclusões com base em mosaico tecido cerebral. Exclusão condicional de um gene através do sistema de recombinação de Cre-lox é um método que tira proveito da grande disponibilidade de linhas de rato transgénico. Neste método, os dois sites loxP são introduzidos em ambos os lados de uma sequência necessária de um gene (tais como um exon), deixando ladeado por loxP sites que ambos enfrentam na mesma direção ("floxed"). CRE recombinase excises a sequência entre os sites de loxP7. Mediada por CRE recombinação pode ser conseguida cruzando ratos de floxed para outra linha de rato que expressam a recombinase Cre junto com um marcador fluorescente em um subconjunto de células ("linha de repórter de Cre"). Isto foi demonstrado em uma variedade de maneiras para descobrir as funções de um gene em subconjuntos de células, como neurônios excitatórios ou astrócitos8. Linhas de repórter CRE podem expressar CreERT2 para permitir a recombinação mediada por Cre ser droga-inducible (single-neurônio etiquetando com nocaute inducible Cre-mediada, ou SLICK)9. Em outra estratégia chamada análise de mosaico com dobro de marcadores (MADM)10,11, mediada por Cre interchromosomal recombinação permite um mutante homozigoto ser criado ao lado de tecido heterozigoto. Essas abordagens, uma nova linha de mouses precisa ser produzido cada vez para cada gene candidato ou subtipo de celular que é testado. Alternativamente, Cre recombinase pode ser introduzido pós-natal a iontoforese12 ou por meio de vetores virais (por exemplo, vírus adeno-associado13 ou lentivírus14 carregando celular subtipo específico promotores). Essa estratégia cria forte e pós-natal de rotulagem. Para direcionar o desenvolvimento de neurônios corticais cerebrais escassamente e pré-natal, uma estratégia ideal é no utero electroporation da Cre recombinase com um marcador fluorescente.
Além de combinar recombinação Cre-lox através no utero electroporation para produzir mosaico tecido na vivo, nós introduzimos várias adaptações aos procedimentos de outros protocolos publicados15,16, 17,18,19,20,21. Nós fornecemos informações para melhorar o sucesso em grávidas cronometrado fêmeas reprodutoras. Também descrevem nossas duas estratégias para introduzir esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios no tecido cortical: uma estratégia é titula-se os níveis de um único construto codifica para Cre recombinase e um marcador fluorescente22. Outra estratégia é usar o sistema de "Supernova", projetado especificamente com esses parâmetros em mente23,24. Além disso, oferecemos melhorias na produção de pipetas de microinjeção consistente e simplificações para a cirurgia de eletroporação no útero . Finalmente, nós esboçamos passos críticos em uma preparação histológica simplificado que permite a análise de espinhas dendríticas e mandris dendríticas e axonal, sem coloração adicional ou imuno-histoquímica.
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Protocol
Métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (ACUC) da Universidade de James Madison e cuidado Animal e estão em conformidade e conformidade com todas as orientações institucionais e regulamentares pertinentes.
1. Mouse set-up
- Um jovem de casa (> P60) masculino e feminino floxed homozigotos mouse juntos para configurar um par de obtentor25.
Nota: Um bom controle negativo é configurar um par adicional criador de sua ratos, no qual Cre expressão recombinase não causará um mosaico de26. - Permitir que a fêmea dá à luz e criar sua primeira ninhada com o macho. Mantenha o macho junto com a fêmea para aumentar a sobrevivência da ninhada. Após o desmame da ninhada, por exemplo, no dia pós-natal (P) 21, separe a fêmea e macho.
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Reprodutores de murino
- Configure um acasalamento cronometrado entre o feminino e masculino,25. Use pistas visuais para determinar o ciclo de cio da fêmea27e verifique para plugues vaginais na manhã após o acasalamento25.
- Se for encontrado um plug, separar e pesar a fêmea. Conte o dia como o dia embrionário (E) 0,5.
- Continue pesando a fêmea a cada 3-5 dias para determinar se ela está grávida. As fêmeas grávidas terão um aumento de 10-20% no peso corporal 7-10 dias após a concepção (E0).
Nota: Este passo confirma gravidez mais cedo e mais confiável do que a inspeção visual25. - Se a fêmea não está grávida, repita os passos 1.3.1-1.3.3.
- Uma vez que a gravidez é confirmada, escolha a data da eletroporação no útero . Para atingir a camada II/III cortical piramidal neuronais progenitores, execute eletroporação no E15.5.
2. set-up DNA
- Escolha um único DNA construir esse códigos para Cre recombinase, bem como um marcador fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (GFP)28,29. Como alternativa, use o sistema de "Supernova", descrito em detalhes no anterior publicações23,24. Consulte a lista de materiais por exemplo constrói.
- Amplifica o DNA construct(s) da etapa 2.1 em Escherichia coli usando técnicas microbiológicas padrão30.
- Purifica a construção de DNA com um kit de purificação de plasmídeo livre de endotoxinas seguindo as instruções do fabricante. Eluir a construção com água livre de endotoxinas.
Nota: Escolher um kit de purificação de endotoxinas-livre sobre um kit de purificação padrão é crítico. - Concentre-se o eluato de DNA para 1-3 mg/mL dependendo desejado rotulagem densidade26.
Nota: Um título sempre precisa ser estabelecida quando estiver trabalhando com uma nova construção de DNA, dado que eles têm diferentes comprimentos e promotores. Considere-se injetando uma construção em várias concentrações diferentes e/ou valores para avaliar a expressão. Por exemplo, a injeção de 1 µ l ou 1,5 µ l de 2,0 mg/mL GFP. CRE é capaz de causar esparsa (1 µ l) ou denso (1,5 µ l) rotulagem da camada de neurônios piramidais corticais visual II/III26. - Adicionar 0,4% trypan azul em 1 x salina tamponada fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 H2O, ajustado ao pH 7,4 com HCl) 01:10 para a solução concentrada de DNA.
- Adicione 10 x PBS 01:10 para a solução concentrada de DNA.
- Armazenar a solução concentrada de DNA a 4 ° C. A solução pode ser armazenada indefinidamente.
3. Pipetar set-up
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Usando um extrator de vidro capilar, puxe uma pipeta com um muito longo (10-15 mm) cônica e muito fina ponta, típica de pipetas para injeção de células-tronco embrionárias ou transferência nuclear31.
Nota: Para impedir que detritos contaminando as pipetas, eles devem ser feitos no prazo de 2 dias da cirurgia.- Calibre o puxador de vidro capilar, realizando um teste de rampa, seguindo as instruções do fabricante. Uso o valor resultante do calor para programar um puxando protocolo usando os seguintes parâmetros: calor = (valor do teste de rampa + 15), puxar = 30, vel = 120, tempo = 100, pressão = 200. Inserir o capilar de vidro, fixe com grampos no extrator e ativar o protocolo puxando programado, criando um cone sobre o capilar de vidro.
- Certifique-se de que o comprimento do atarraxamento é entre 10-15 mm, utilizando um microscópio óptico composto (por exemplo, 10 objetivo X)31.
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Quebre volta a pipeta para formar uma dica duro gumes para 20-25 µm de diâmetro.
- Centro de uma limpeza de single-ply tarefa (ver lista de materiais) sobre um 50ml copo e estiramento limpe tenso com uma mão. Com a outra mão, segure e pressione uma pipeta (lado do atarraxamento para baixo) perpendicularmente e totalmente através do centro do wipe, causando uma ruptura na atarraxamento31.
Nota: Empurrando a pipeta totalmente através da limpeza produzirá uma ponta de diâmetro 20-25 µm cerca de 70% do tempo. - Confirme sob um microscópio óptico composto (por exemplo, objetiva de 20x).
Cuidado: Use proteção para os olhos ao quebrar o vidro.
- Centro de uma limpeza de single-ply tarefa (ver lista de materiais) sobre um 50ml copo e estiramento limpe tenso com uma mão. Com a outra mão, segure e pressione uma pipeta (lado do atarraxamento para baixo) perpendicularmente e totalmente através do centro do wipe, causando uma ruptura na atarraxamento31.
- Calibrar uma pipeta por aspiração 1 µ l de 0,4% trypan azul em 1X PBS em um piptte parcialmente preenchido e, em seguida, graduando-se a pipeta com marcações de 1 µ l baseado na altura de 1 µ l em pipeta, usando um marcador de ponta fina resistente ao álcool. Use a pipeta calibrada para formar as outras pipetas antes de descartar. Manter pipetas em um suporte de pipeta, livre de poeira e outras partículas.
4. no Utero eletroporação
- Coloque Graefe pinça, tesoura de íris, Hartman pinça mosquito, esponjas de gaze não-tecidos, pinça com ponta de anel e placas de Petri em uma bandeja de aço inoxidável e embrulhar com papel alumínio. Coloque a bandeja e soro fisiológico a 0,9% 1L (0,9% wt/vol NaCl em água) em autoclave. Autoclave a 121 ° C e 3,5 kPa para 40 min. retirar do autoclave e coloque em uma área cirúrgica desinfectada.
Nota: É fundamental para manter condições estéreis durante a cirurgia. - Aquecer o frasco de salina esterilizada 1L num banho de água pequeno a 38 ° C pelo menos 2 h antes da cirurgia.
- Conecte os eletrodos tipo pinça e o pedal para o gerador (ver lista de materiais). Seguindo as instruções do fabricante, definir o gerador para entregar cinco pulsos de 50 ms de 50 V (com um intervalo de ms 950) quando acionado pelo pedal do pé. Desinfectar os eletrodos tipo pinça e coloque sobre a área cirúrgica desinfectada.
- Faça um cone de nariz anestesia como publicado anteriormente32, mas usar o fim de uma nitrila ou dedo de luva de látex para formar um diafragma que se encaixa firmemente sobre a abertura do cone de nariz. Corte um buraco no diafragma grande o suficiente para caber sobre o focinho do rato.
- Profundamente anesthetize ratos grávidas em E15.5 em uma câmara de indução cheia de isoflurano (2-4%) em oxigênio puro fluindo a 1 L/min. Depois de ~ 1 min, testar o reflexo de braço endireitante (delicadamente incline a câmara de indução e certifique-se de que o mouse não está certo em si). Peso do rato para determinar as dosagens de analgesia administrada mais tarde durante a cirurgia.
- Transferir o mouse para a área cirúrgica e administrar inalado isoflurano (1-2%) em oxigênio puro fluindo a 1 L/min, através de um cone de nariz para manter o rato no plano cirúrgico. Use a pinça para testar o reflexo de pedal (beliscar a pata com cuidado e certifique-se de que o mouse não retornar um reflexo) para verificar anesthetization. Monitorar a frequência respiratória e esforço, procurando, regular respiração profunda (~ 70-100 respirações por minuto), e que as mucosas são húmidas e coloração rosa.
- Aplique bastante pomada oftálmica veterinária sobre os olhos para cobri-los completamente para proteção contra a secagem durante o procedimento.
- Supersaturada de Flex o disco de metal ativador de uma bolsa selada preenchido com solução salina (ver lista de materiais), ativando uma cristalização exotérmica do sal. 2 leigos single-ply toalhetes de tarefa na parte superior da bolsa e coloque o mouse sobre a bolsa para manter a temperatura corporal.
- Massagem creme depilatório na zona abdominal com cotonetes de algodão até pele abdominal se dissolva (aproximadamente 20-40 s) e, em seguida, limpe a pele abdominal. Cuidadosamente limpe qualquer creme restante de resíduo e creme depilatório com cotonetes de algodão e etanol 70%. Coloque um pano cirúrgico estéril fenestrado sobre a área abdominal.
- Utilizando técnica asséptica, puxamos a pele para cima e longe do abdômen com pinça Graefe e fazer uma incisão ventral ~ 2 cm na pele com uma tesoura de íris, garantindo que o músculo subjacente não é cortado.
Nota: Uma alternativa aceitável para fazer uma incisão com tesoura pinça e íris de Graefe é usar um bisturi, como publicado anteriormente17. - Encontrar a linea alba a visualização da linha mediana do reto abdominal. Puxar o músculo e longe o abdômen com pinça Graefe e fazer outra incisão mediana ~ 2 cm lá com uma tesoura de íris, expondo a cavidade abdominal (útero é translúcido e embriões será visíveis por baixo). Certifique-se de que o subjacente de tecido uterino e intestinal não é cortado. Fazer a incisão apenas grande o suficiente (normalmente ~ 2 cm) para puxar e expor o útero confortavelmente.
Nota: Uma alternativa aceitável para fazer uma incisão com tesoura pinça e íris de Graefe é usar um bisturi, como publicado anteriormente17. - Usando uma ponta de micropipeta estéril 10 µ l, dispense o carprofeno (dissolvido em solução salina 0,9% estéril) 4 mg/kg na cavidade abdominal para analgesia.
- Fixe uma pinça mosquito de Hartman na borda esquerda da incisão abdominal reto. Descanse a pinça na placa de Petri virado para a esquerda da incisão, mantendo o lado esquerdo da incisão aberta. Fixe a outra pinça mosquito de Hartman na borda direita da incisão abdominal reto e descansar o fórceps em um prato de Petri virado para a direita da incisão, mantendo o lado direito da incisão aberta. Coloque a compressa de gaze em torno da área da incisão.
- Usando a pinça de anel (sem um parafuso limite anexado), puxe o útero entre quaisquer dois embriões vizinhos sem esmagar ou ferindo qualquer tecido. Comece retirando todos os embriões através da incisão, colocando-os em cima da gaze esponja. Quando arrancar os últimos embriões da cavidade abdominal, certifique-se de não puxar no colo do útero ou ovários. Uma vez expostos, é fundamental para manter o útero úmido com solução salina morna. O útero normalmente contém entre 5 e 8 embriões.
Nota: É possível adicionar penicilina e estreptomicina, para a salina17. - Conectar uma pipeta calibrada para o conjunto do tubo de aspiração (ver lista de materiais) e injete exatamente 1 µ l da solução de DNA preparada no passo 2 através da parede uterina em um ventrículo lateral de cada embrião. Ventrículos laterais aparecem como dois patches sobre o telencéfalo dorsal do embrião (patches são mais escuras do que o tecido do telencéfalo). Use o polegar e o indicador durante microinjeção e eletroporação para manipular os embriões, revelando os ventrículos laterais e permitindo que os embriões a ser empurrada suavemente contra a parede uterina durante a injeção. Confirme o sucesso injeção observando trypan azul de enchimento do ventrículo lateral.
- Colocar o cátodo de eletrodos tipo pinça (ver a lista de materiais) sobre o útero, diretamente sobre o córtex medial e caudal para atingir o córtex visual (direcionamento alternativas áreas do cérebro vai exigir a colocação de eletrodos diferentes)16, 26. Coloque o ânodo sobre o útero, só inferior e anterior da cabeça do embrião.
- Confirme que o ânodo e o cátodo estão tocando o útero em torno do embrião em locais apropriados. Com um pedal, acionar a entrega de cinco pulsos de 50 ms de 50 V (com um intervalo de 950 ms) entre os eletrodos.
Nota: O injetado, carga negativa DNA se moverá em direção ao catodo e será incorporado em células da zona ventricular mais próximas para o cátodo. - Retorne o útero para a cavidade abdominal na mesma orientação que foi encontrado. Utilize soro fisiológico para lubrificar o útero enquanto guiando-o manualmente e extremamente suavemente, tomando cuidado para não deslocar os embriões de sua posição no útero.
- Fechar os músculos abdominais com suturas absorvíveis (ver lista de materiais) usando um simples ponto interrompido, amarrando as extremidades com um nó de cirurgião. Fazer não clip que as extremidades muito perto do nó ou o nó se tornará soltar.
Nota: É fundamental para a sutura dos músculos abdominais tal que as bordas da ferida são completamente fechadas Calem-se, mas sem causar branqueamento do músculo. Knots devem ser apertados, então eles não podem ser soltar. - Feche a camada de pele com suturas absorvíveis (ponto de interrupção simples, cirurgião do nó, como na etapa 4.19). Aplique uma pequena quantidade de cola de tecido para fechar a ferida. Aplique o adesivo de tecido sobre os maçaricos para evitar desapertar. Use uma micropipeta para remover qualquer adesivo de tecido ao redor da ferida que pode ser aspirada pela micropipeta.
- Baixar os níveis de isoflurano para 0,5-1,5%. Uma vez que o tecido adesivo é seca (teste tocando luva ao adesivo), retire do isoflurano e permitir feminino para recuperar-se sozinho em uma gaiola quente. Administrar a buprenorfina intraperitonealmente em 0,03 mg/kg, utilizando uma seringa de 1 mL com um 26G, ½" agulha.
- Continuar a acompanhar o mouse até que o mouse está totalmente recuperado e se comportando normalmente (ou seja, aliciamento, explorando a gaiola, comer ou beber). Uma vez recuperado, lugar feminino de volta à jaula com macho.
Nota: Se todos os passos são seguidos, o mouse normalmente recuperar a consciência dentro de 2 min e imediatamente começar a mover-se sobre a gaiola, não mostrando sinais de desconforto. - Se o mouse exibe sinais de desconforto (por exemplo, curvado, postura, secreções de porfirina)33, administre carprofeno a 0,1 mg/mL em abastecimento de água. Se existirem vários sinais de desconforto, ou se o desconforto persistir por mais de 4 h, apesar da administração de carprofeno, eutanásia imediatamente o mouse ao administrar uma injeção letal intraperitoneal de cetamina (240 mg/kg) - xilazina (48 mg/kg)- cocktail de acepromazina (1,85 mg/kg), utilizando uma seringa de 1 mL com um 26 G, ½" agulha e segue com uma forma secundária aprovada de eutanásia33.
- Para aumentar a sobrevivência de embriões electroporated após o nascimento, manter a gaiola num ambiente calmo a sala, livre de ruídos e vibrações. Enriquece o ambiente com os iglus de plástico, materiais de assentamento e suplementos alimentares, tais como sementes de girassol (ver lista de materiais). Não mover ou perturbar a gaiola, especialmente durante os 3 primeiros dias após o parto.
5. histológica preparação para microscopia de fluorescência
Nota: Este protocolo de histologia é otimizado para a preparação de tecidos de animais mais velhos que dia pós-natal (P) 13 que foram electroporated no utero. Para preparar o tecido de animais mais jovens de pós-natal (P0-P13), recomenda-se seguir todas as etapas (incluindo a perfusão transcardial), embora o cérebro deve ser incorporado no agar antes de preparar seções (etapa 5,9). Tecido ainda pode ser preparado de embriões dentro de 1-2 dias após electroporation, usar métodos descritos anteriormente18,20.
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Prepare a solução de paraformaldeído (PFA).
Nota: É imperativo para preparar PFA fresco, dentro de um dia do experimento.
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico e deve ser tratada em uma coifa com equipamento de protecção adequado.- Tornar-se 50 mL de 4% PFA, calor 40 mL de água a 60 ° C. Adicione 2 g PFA, agitando com vidro haste ou mexendo na barra. Adicione 10 µ l de 10 M NaOH cada 2 min, até que se dissolva PFA.
- Adicionar 5 mL de 10 x PBS e trazer a solução para um volume final de 50 mL com água.
- Depois de trazer solução a 50 mL, ajustar o pH para 7,4 conforme necessário, com solução de HCl. Allow 10m para esfriar e guarde a 4 ° C.
- Eutanásia em rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (240 mg/kg) - xilazina (48 mg/kg) - cocktail de acepromazina (1,85 mg/kg) utilizando uma seringa de 1 mL com um 26G, ½" agulha. Transcardially perfuse 10 ou 20 mL gelada 1X PBS, seguido de 25 ou 40 mL-acabadas e gelada 4% PFA17. Utilizar volumes menores para jovens pós-natal (P0-P13) ratos e volumes mais elevados para os ratos mais velhos (P14 e acima).
- Imediatamente após a perfusão, decapitar a carcaça do mouse entre o osso occipital e a vértebra C1 com grandes tesouras e descascar e descartar a maioria da pele em torno de crânio com uma tesoura de íris, particularmente da pele circundante frontal, parietal e occipital ossos. Manter o crânio e cérebro intacto.
- Coloque o crânio e cérebro em 10 mL 4% PFA em um tubo cónico de 50 mL por 24 h a 4 ° C para fixar o tecido. Em seguida, adicionar 30 mL 1X PBS para tubo cônico para diluir a solução a 1% PFA para armazenamento a 4 ° C.
Nota: Utilize um tubo cónico separado para cada crânio e cérebro pós-fixado. Não Incubar o cérebro em 1% PFA por mais de 2 semanas, ou fluorescência começará a desvanecer-se. - Lugar do cérebro e crânio sobre uma superfície plana com single-ply toalhetes tarefa umedecidos com 1X PBS. Use um par de pinças (ver lista de materiais) para remover qualquer restante de pele ou membrana ao redor do crânio.
- Usando uma pinça, retire primeiro o osso occipital, em seguida, Retire cuidadosamente os ossos parietais, movendo-se a pinça para fora da superfície do cérebro. Retire cuidadosamente qualquer meninges para evitar danos ao córtex.
- Parte de trás da pinça da Cunha sob o cérebro ao longo do crânio para cortar qualquer nervos cranianos e remover o cérebro.
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Para o jovem pós-natal (P0-P13) cérebros
- Faça 25 mL de ágar de 4% por aquecimento 25 mL 1X PBS para 80 ° C. Mexa e dissolver o ágar de 1g com uma barra de vidro haste ou agitação).
- Solução legal a 35 ° C, continuando a mexer. Coloque o cérebro em um recipiente pequeno (por exemplo, a tampa de um tubo cónico de 50 mL) e despeje a solução de ágar sobre cérebro. Permitir que agar para endurecer.
- Fazer um corte coronal manualmente, usando uma lâmina de barbear borda única através do cérebro, aproximadamente 0,5 mm rostral bregma. Fazer outro corte coronal através do cérebro de cerca de 0,5 mm caudal ao córtex visual. Coloca uma piscina de cola de cianoacrilato com o mesmo diâmetro que a extremidade rostral do cérebro no centro do disco espécime micrótomo vibratória. Coloque a extremidade rostral do cérebro em cima da piscina de cola, garantindo que toda a superfície do tecido rostral é ligada para o disco de amostra com cola.
- Montar a bandeja de tampão em micrótomo de vibração e fixe com a alavanca de fixação interna. Insira a lâmina porta-navalha e monte o porta-navalha para micrótomo com parafuso de fixação interno de vibração. Fixe o disco de amostra com cérebro em bandeja de reserva usando o dispositivo de fixação interno. Definir a configuração de velocidade para 5,70 (= 0.285 mm/s) e ajuste da frequência de 5,33 (53,3 Hz).
- Encha a câmara acima do nível do cérebro com PBS 1x e abaixar a lâmina para a PBS. Começa a tirar 100 µm secções coronal através do tecido.
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Se não exigir processamento adicional, como 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração nuclear ou imuno-histoquímica.
- Use um pincel com ponta fino para transferir as seções diretamente do micrótomo vibração numa lâmina de microscópio, montagem de 4-6 seções para cada slide.
- Permitir que as seções secar wicking solução fora com um pincel com ponta fina, tal que as fatias do cérebro já não deriva nos slides.
- Em seguida, coloque uma gota de para montagem (ver lista de materiais) em cada seção do slide.
- Gentilmente colocar uma lamínula 24 x 50 mm na parte superior, garantindo que as bolhas de ar 1) não forma nas secções, 2) as seções não se mexa, e 3) a montagem totalmente abrange a área entre a lâmina e lamela. Permita a montagem curar pelo menos 24 a 48 h.
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A mancha de núcleos com DAPI para exame histológico de lâminas corticais
- Use um pincel com ponta fino para transferir cada seção em uma solução contendo 10 µ g/mL DAPI (ver lista de materiais) diluído em PBS 1x de solução (20 mg/mL DAPI na água).
- Incubar em solução DAPI durante 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, use um pincel com ponta fino para transferir a seção de solução DAPI para 1X PBS e incubar em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a secção dois mais vezes para frescos 1X PBS por 5 min cada. Então, usando um pincel com ponta fino, transferência a seção numa lâmina de microscópio, siga os passos 5.11.2-5.11.4 e prossiga com a etapa 5.13.
- Aqueça um prato de Petri de vidro contendo Valap (partes iguais de vaselina, lanolina e parafina) em um prato quente em uma configuração de fogo baixo até derreter totalmente. Selo expõe arestas de slides escovação Valap derretido.
- Para inspecionar a fluorescência no tecido, use um microscópio óptico ou microscópio confocal (ver lista de materiais) e um filtro definido adequado para visualizar o fluoróforo (por exemplo, DAPI: excitação 325-375 nm, emissão 435-485 nm; GFP: excitação 450-490 nm, emissão 500-550 nm)17. Imagens confocal podem ser tomadas com baixo - (4 X, abertura numérica, at = 0.20), médio-(20 X, at = 0,75) e de alta potência (60 X, at = 1,40) objectivos.
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Representative Results
A única construção GFP. CRE (ver lista de materiais) foi electroporated no E15.5 e visualizado no P14. Dependendo da concentração da construção e do volume de injeção, um resultado esparso ou denso pode ser obtido22,26. Por exemplo, a injeção de 1 µ l de 2 mg/mL GFP. CRE resulta em uma distribuição esparsa de pilhas etiquetadas, alguns dos quais podem ser brilhante (figura 1A) e localizadas na camada II/III (figura 1B). Porque o tecido é de 100 µm de espessura, a maioria dos mandris dendríticas é preservada (Figura 1). Espinhas dendríticas podem ser observadas em ampliações de altas (60 X; A Figura 1). Injeção de 1,5 µ l na mesma concentração resulta em muito densa de rotulagem (Figura 2A) na camada II/III (Figura 2B), que pode ser abaixo do ideal, como é difícil rastrear a fonte de neuritos e espinhas dendríticas (Figura 2). No entanto, ainda é possível a imagem de um neurônio (Figura 2D) e seus processos (Figura 2E), selecionando uma célula brilhante na periferia da área rotulada (Figura 2D).
Finalmente, é possível maximizar o brilho dos neurônios, mantendo uma distribuição esparsa de pilhas etiquetadas. Aqui, a Supernova-GFP (ver lista de materiais) foi electroporated no E15.5 e visualizado no P23. Observe que, com base em observações de tecido cerebral, tiradas em várias idades pós-natal, não parece ser um efeito da idade sobre o brilho de quaisquer construções fluorescentes usado aqui23,24,26. Injeção de 1 µ l de uma mistura contendo 1 mg/mL Sn-GFP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) e resultados de TRE-Cre 10 µ g/mL em uma distribuição esparsa de células principalmente brilhantes (Figura 3A) na camada II/III (Figura 3B). Processos dendríticas e axonal (Figura 3B) e espinhas dendríticas (Figura 3) podem ser visualizadas. Em nossa experiência, alvejando com qualquer uma construção única como GFP. CRE ou com "Supernova" construções reproducibly renderá expressão em pelo menos 75% dos embriões de electroporated.
Figura 1: Dispersos e brilhante expressão depois no utero eletroporação com uma única construção contendo GFP e Cre recombinase. (A) Micrografia de fluorescência baixa ampliação (4x) do córtex cerebral em P23, depois eletroporação no E15.5. (B) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de mancha nuclear DAPI, revelando a laminação cortical (camadas I, II/III, IV e camadas profundas a IV). (C) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de um único neurônio. (D) Micrografia de fluorescência de alta ampliação (60 X) de espinhas dendríticas. Escala de barras = 200 µm (A); 100 µm (B, C); e 5 µm (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Densa e brilhante expressão depois no utero eletroporação com uma única construção contendo GFP e Cre recombinase. (A) Micrografia de fluorescência baixa ampliação (4x) do córtex cerebral no P14, depois eletroporação no E15.5. (B) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de mancha nuclear DAPI, revelando a laminação cortical (camadas I, II/III, IV e camadas profundas a IV). (C) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de neurônios na área de rotulagem mais densa. (D) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de neurônios tomadas na periferia da área de rotulagem mais densa. (E) Micrografia de fluorescência de alta ampliação (60 X) de espinhas dendríticas. Escala de barras = 200 µm (A); 100 µm (B, C, D); e 5 µm (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dispersos e brilhante expressão depois no utero eletroporação com Supernova-GFP constrói contendo GFP e Cre recombinase. (A) Micrografia de fluorescência baixa ampliação (4x) do córtex cerebral no P14, depois eletroporação no E15.5. (B) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de mancha nuclear DAPI, revelando a laminação cortical (camadas I, II/III, IV e camadas profundas a IV). (C) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de um único neurônio. (D) Micrografia de fluorescência de alta ampliação (60 X) de espinhas dendríticas. Escala de barras = 200 µm (A); 100 µm (B, C); e 5 µm (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, apresentamos a combinação de eletroporação no utero com Cre recombinase em camundongos floxed para gerar o tecido cerebral de mosaico. Uma vantagem dessa abordagem é que uma nova linha de rato não precisa ser gerado cada vez um diferente subtipo de celular está a ser alvo: eletroporação no utero pode ser usada para direcionar os neurônios excitatórios, neurônios inibitórios ou glia dependendo do tempo e localização do electroporation15,16,17,18,19,20,21,34. Em nossa abordagem, visando o córtex cerebral é consistente e reproduzível porque utilizamos eletrodos de eletroporação de diâmetro de 5 mm que podem ser colocados sobre uma área grande do telencéfalo desenvolvimento. Para almejar sites alternativos no cérebro (por exemplo, diencéfalo, retina), ou para o direcionamento mais específico das regiões dentro do córtex cerebral, eletrodos projetados explicitamente para essa finalidade e procedimentos podem ser usados15, 16. também fornecemos uma única construção que oferece luminosos rotulação e garante que cada neurônio fluorescente-etiquetadas contém Cre recombinase. Uma desvantagem de usar um único construto para alcançar a rotulagem brilhante é que a população rotulada pode ser muito denso (Figura 2), mas isso pode ser resolvido por imagem células na periferia da área rotulada (Figura 2D). Alternativamente, expressão de uma construção fluorescente pode ser projetado para depender Cre recombinase expressão17, mas os níveis baixos de expressão podem exigir imunocoloração para o marcador fluorescente. Essa limitação é dirigida pelo sistema de Cre-dependente marcador fluorescente expressão (Figura 3A)23,24"Supernova".
Além de combinar a recombinação de Cre-lox com eletroporação no utero , oferecemos várias melhorias para reprodução ideal das fêmeas grávidas cronometrado. É importante manter os ratos em uma sala de espera que é livre de ruídos e vibrações causadas por equipamentos tais como capas de fluxo laminar. Enriquecer o ambiente com os iglus de plástico, material de nidificação e suplementos dietéticos como sementes de girassol (ver lista de materiais). Para além de considerações ambientais, notamos que a primeira ninhada de uma fêmea normalmente tem a menor taxa de sobrevivência. Assim, nosso protocolo sugere esperar até a segunda gravidez da fêmea para executar no utero eletroporação. Enquanto esta estratégia aumenta a sobrevivência da ninhada, ele também tende a aumentar o tamanho da ninhada, que pode alongar o tempo cirúrgico e, assim, diminuir o sucesso da cirurgia. Portanto, se se deparar com um número particularmente grande de embriões (por exemplo, mais do que 8), sugerimos que ignorando a eletroporação em alguns dos embriões, especialmente os embriões mais próximos para os ovários e o útero, onde o tecido é mais propenso a lesões. Além disso, usando a mesma estratégia de enriquecimento ambiental mencionada acima (plásticos iglus, suplementos alimentares, materiais de nidificação) tende a aumentar a sobrevivência após o nascimento de ninhadas. Também é importante notar que o cio pode ocorrer no sexo feminino algumas horas após o parto da primeira ninhada. Neste caso, permitir que a fêmea dar à luz a sua segunda ninhada e, em seguida, separar após o desmame para tentar cronometrado de acasalamento. Ao olhar para plugues vaginais, é boa prática para separar a fêmea, mesmo se não for encontrado um plug, particularmente se a fêmea no cio na noite anterior. Plugues em certas cepas são difíceis de detectar, e concepção pode já ter ocorrido.
Outra área de melhoria é na produção de pipetas de microinjeção adequada para eletroporação no útero . Puxando pipetas para injeção de DNA em ventrículos laterais é um passo crítico. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a criação de pipetas com um tamanho de bico consistente e borda áspera de ponta. Outros métodos incluem volta quebrando a ponta com um bisturi de lâmina15 ou beliscar fora a ponta com fórceps16,17. Observe que se pontas de pipetas são muito pequenas, eles corretamente irão perfurar a parede uterina, mas taxas de fluxo de injeção será muito baixas, alongando o tempo em que a pipeta é apresentada no cérebro embrionário. Se pontas de pipetas são grandes demais, eles podem danificar a parede uterina e cérebro embrionário. Se pontas de pipetas são muito lisas, eles causará um torrão grande a parede uterina e/ou crânio embrionário antes de romper, possivelmente danificando o embrião. Prática, criando um tempo duro para produzir 20-25 µm gorjeta e inspecionar dicas sob um microscópio de luz simples (por exemplo, com um objectivo de X 10) até que um resultado consistente é alcançado. Testar o líquido pode ser pipetado a uma taxa razoável (por exemplo, ~0.5 µ l/s) com um conjunto de tubo aspirador é um outro método para garantir que o tamanho da ponta é dentro de um intervalo aceitável. Porque a pipeta de injeção é calibrada e formou-se, a quantidade exata de DNA entregado ao ventrículo lateral é conhecida. Este é o passo mais importante para alcançar uma dispersão desejada reproducibly para uma ordem de magnitude. Em outras palavras, uma dada concentração deve produzir rótulos dentro de um intervalo específico, por exemplo, neurônios rotulados de 10 a 100.
O passo mais importante do protocolo é o procedimento de eletroporação no útero . Ser extremamente gentil ao expor o útero. Quando arrancar os últimos embriões da cavidade abdominal, certifique-se de não puxar no colo do útero ou ovários. Usar o polegar e o indicador durante microinjeção e eletroporação permite gentil e hábil manipulação de embriões para revelar o ventrículo lateral e permite que os embriões a ser empurrada suavemente contra a parede uterina. Um toque extremamente suave é crítico ao manusear o útero e embriões. Se é difícil conseguir um toque suave, use pinça de anel com um parafuso de limite interno para impedir a pinça de aperto para baixo em um embrião ou o útero, causando danos nos tecidos. Uma consideração adicional é administrar o carprofeno e buprenorfina imediatamente antes da cirurgia, uma prática que aparece fornecer gerenciamento eficaz da dor durante a cirurgia no utero sem afetar a sobrevivência embrionária as taxas35 .
Seguindo o nosso procedimento simplificado histológico, várias etapas são críticas. Depois perfusing cérebros experimentais com fixador, manter o cérebro intacto no crânio para proteger o tecido cerebral de danos durante o pós-fixação. Enquanto é possível armazenar o cérebro em 1% PFA por dias, semanas, observar a fluorescência diminuirá como a solução PFA se polimeriza. 100 µm de corte coronais seções é normalmente é fina o suficiente para permitir a microscopia confocal através de toda a seção preservando muito da morfologia dendrítica e axonal. Se fixação ocorreu corretamente, cérebros de animais mais velhos que P13 podem ser montados na vibração micrótomo simplesmente com cola de cianoacrilato. No entanto, se o cérebro é muito maleável, enquanto sendo cortado por vibração micrótomo, cola para baixo de uma pequena ágar ou agarose bloco atrás do cérebro para impedi-lo de flexão, enquanto ele está sendo seccionado. Se o problema não for resolvido, incorpore o cérebro em ágar para formar um bloco para cortar com o micrótomo vibratório, como sugerido para o mais novo cérebro pós-natal (passo 5.8).
Este método combina o sistema de recombinação de Cre-lox com eletroporação no utero para gerar mosaicos que podem ser usados para estudar a função celular autónomos de genes nos neurônios. Esse método também pode ser configurado para oferecer suporte no utero electroporation do gene edição construções (por exemplo, CRISPR/Cas9)6, ou outros site-specific recombinases (por exemplo, Flp/FRT ou Dre/rox24), que podem ser projetada para produzir o tecido cerebral de mosaico. Uma técnica alternativa promissora que poderia ser usada para produzir tecido de mosaico é viral entrega via injeção intraventricular para ratos neonatal36. Combinada com injeção intraventricular em idades embrionárias como demonstrado aqui e alhures,15,16,17,18,19,20, 21,22,37, vetores virais codificação para Cre recombinase pôde ser entregue antes do nascimento de infectar as células progenitoras floxed na zona ventricular. Uma consideração crítica seria garantir que os vetores virais são diluídos suficientemente para alcançar a excisão esparsa e rotulagem. No entanto, isto também resultaria em menor número de cópias da construção sendo entregue, incluindo marcadores fluorescentes essencial para essas observações (por exemplo, espinhas dendríticas ou arborização)24. Para combater essa armadilha, construções novas, usando a mesma estratégia como as construções de "Supernova" demonstradas aqui podem ser usadas para alcançar esparsas rotulagem sem uma correspondente diminuição do brilho de pilhas etiquetadas24. Outra consideração crítica com entrega viral é garantir construções entregues promotores específicos para população celular sendo estudada (por exemplo, neurônios pyramidal excitatórios). Injeção intraventricular de vetores virais provoca infecção de todo o tecido em torno dos ventrículos, incluindo não só a zona ventricular do telencéfalo dorsal onde corticais e hippocampal neurônios excitatórios são gerados, mas também a medial e lateral ganglionar Eminências onde muitos interneurônios corticais nascem34. Outra característica no utero electroporation comparado a entrega viral das construções é sua janela de tempo relativamente estreita da entrega. Vírus injetados dos ventrículos laterais podem persistir após a cirurgia, continuando a infectar células que revestem a zona ventricular. Em contraste, electroporation ocorre em segundos, visando um conjunto muito mais específico de células. Isto pode ser uma vantagem ou desvantagem para o investigador, dependendo da subpopulação de células a ser estudado.
Nossa abordagem suporta recombinação Cre-lox pela introdução de um único construto ou construtos "Supernova". No caso as construções "Supernova", instamos os investigadores familiarizar-se com as vantagens e limitações da utilização dessa estratégia. Por exemplo, o calendário da exclusão Cre tem demonstrado para ocorrer dentro de 2 dias nos neurônios excitatórios de camada II/III do córtex cerebral24. Assim, é plausível que Cre excisão poderia ocorrer mais a 48 h após electroporation, ao invés de imediatamente a seguir electroporation. Portanto, outras formas de corroborando calendário e localização do Cre excisão (por exemplo, usando uma linha de rato de repórter Cre) devem ser usadas para complementar o uso dessa nova técnica, especialmente em estudos onde a excisão de Cre num prazo pequeno é um crítico consideração. Outra armadilha potencial é que uma pequena percentagem de células sem rótulo em um experimento de "Supernova" poderia expressar Cre recombinase. Por exemplo, na Figura 3, podemos co-electroporated dois plasmídeos: uma alta concentração de CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE e uma baixa concentração de TRE-Cre. Porque o TRE é um promotor com vazamento, Cre recombinase poderia ser expressa em células que receberam o TRE-Cre plasmídeo mas não o plasmídeo loxP-paragem-loxP-EGFP-tTA, apesar de isto ser uma ocorrência rara. Em um experimento onde é essencial que todas as células sem rótulo tem sem qualquer tipo de excisão mediada por Cre, um experimento de "Supernova" pode precisar de ser complementada com um experimento de controle no qual Cre expressão recombinase de fora rotulado neurônios é avaliado através do outro significa (por exemplo, Cre recombinase imuno-histoquímica).
Em resumo, nosso protocolo é facilmente modificado para acomodar essas novas construções, fazendo no utero electroporation um método ainda mais útil e adaptável para a análise de mosaico. Assim, no utero electroporation pode ser combinado com o poder da Recombinação genética de várias maneiras para estudar mosaico cérebro tecido na vivo.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os autores graças ao apoio generoso da James Madison University departamento de biologia e da facilidade de Imaging e James Madison University microscopia de luz. Dr. Mark L. Gabriele para conselhos úteis sobre preparação de jovens pós-natal tecido, e DRS Justin W. Brown e Corey L. Cleland para coordenação generoso de espaço e materiais cirúrgicos. Esta pesquisa foi financiada em parte por uma concessão de pesquisa colaborativa por 4-VA, uma parceria de colaboração para fazer avançar a Commonwealth da Virgínia (G.S.V.) e por uma Virginia Academia de ciência pequeno projeto bolsa de investigação (G.S.V.). Suporte foi generosamente fornecido por uma doação de Betty Jo amoroso Butler 58 para bolsa de pesquisa de graduação (para K.M.B.), uma bolsa de pesquisa do verão de Farrell (para K.M.B.), um James Madison University segundo século Scholarship (para K.M.B.), um James Universidade de Madison do centenário uma bolsa (C.J.H.), uma Universidade de James Madison Lucy Robinson busca 30 bolsa de Memorial (para Z.L.H.) e um James Madison Universidade faculdade de Ciências e matemática da faculdade assistência Grant (para G.S.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
| GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
| Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
| Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
| Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
| Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
| Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
| Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
| P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| 3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
| Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
| Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
| Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
| Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
| General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
| Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
| Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
| Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
| ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
| ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
| Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
| Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
| Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
| Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
| 10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
| Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
| “LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
| Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
| BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
| Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
| Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
| Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
| Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
| Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
| Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
| Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
| Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
| Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
| Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
| Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
| Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
| 4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
| 20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
| 60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |
References
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