Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Published: November 17, 2017 doi: 10.3791/56675
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biology, James Madison University
* These authors contributed equally

Summary

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

Abstract

Genlerin hücre özerk nöronal işlevleri kaybına neden tarafından ortaya ya da küçük ve seyrek nüfus nöronların bir genin fonksiyonunun kazanmak. Bunu yapmak için hangi genetik olarak soğukkanlı doku tarafından nöronlar kaybı veya kilo alma işlevinin bir gen ile çevrili olan bir mozaik oluşturma gerektirir. Burada, biz Cre-lox rekombinasyon sistemi ile rahim içinde elektroporasyon nöronlar genlerin hücre özerk işlev eğitim için kullanılan mozaik beyin doku oluşturmak için birleştirmek. DNA yapıları (depoları ile kullanılabilir) bir floresan etiket ve Cre recombinase, kodlama, kortikal nöronlar içinde utero kullanarak fare embriyo beynindeki loxP siteleri ile çevrili genleri içeren gelişmekte içine tanıtıldı elektroporasyon. Ayrıca, biz survivability ve tekrarlanabilirlik artırmak çeşitli uyarlamalar rahim içinde elektroporasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda bir titresi Cre-aracılı rekombinasyon nöronların seyrek veya yoğun nüfus için oluşturma içerir. Etiketli beyin dokusu histolojik hazırlıkları gerektirmez (ancak için adapte edilebilir) immünhistokimya. Kullanılan yapıları bu fluorescently Cre recombinase için gen nöronlar taşımak etiketli garanti. Histolojik hazırlıklar nöronların confocal görüntüleme dendritik ve aksonal arbors ve dendritik spines ile morfolojik analiz sağlar. Seyrek mozaik doku kaybı veya kilo alma işlevinin elde çünkü bu yöntem hücre özerk gerekliliği, çalışma ve gen ürünleri içinde vivoyeterliliği izin verir.

Introduction

Genetik bir mozaik üreten ilgi bir gen işlevini anlamak için deneysel bir klasik örnektir. Bir gen bir hücresel fenotip için gerekli olup olmadığını belirlemek için en basit yaklaşım organizma (örneğin nakavt) boyunca gen fonksiyon kaybına neden oluyor. Ancak, bir gen özellikle belirli bir hücre türü içinde gerekli belirlemek için nakavt gen organizma boyunca geçerli bir yaklaşım değildir. Bunun yerine, bir yöntem gereklidir bu-ecek neden bir gen fonksiyon kaybı belirli bir hücrenin wildtype (Yani genetik olarak soğukkanlı) doku tarafından çevrili iken — başka bir deyişle, mozaik doku oluşturma. Eğer bir mutant fenotip mutant hücre gösterir ama çevreleyen wildtype hücreleri hücre özerk bir şekilde gen fonksiyonları yok. Analiz mozaik doku, mutasyona uğramış hücreler wildtype doku ile çevrili olan genlerin, özellikle nerede neurons ve glia dokusunun geniş bir birbirine bağlı ağ oluşturmak beyin hücre özerk işlevleri anlamak için idealdir.

Mozaik beyin dokusunun birkaç form genlerin hücre özerk fonksiyonlarını araştırmak için güçlü modeller hazırladık. Çalışmalar nöronal nakli1' de, kadın X'e mozaizm2,3,4, odaklı ve endojen somatik mozaizm5,6 çizilmiş onların sonuçlar mozaik üzerinde dayalı beyin dokusu. Bir genin Cre-lox rekombinasyon sistemi aracılığıyla koşullu silme transgenik fare satırları büyük kullanılabilirliğini yararlanır bir yöntemdir. Bu yöntemde, iki loxP site gideriş o ("floxed") aynı yönde iki yüz loxP siteleri tarafından çevrili bir gen (örneğin bir exon), gerekli bir dizi her iki tarafında tanıtılmaktadır. CRE recombinase loxP siteleri7arasında sıra excises. CRE-aracılı rekombinasyon geçiş floxed fareler Cre recombinase ile birlikte bir alt hücre ("Cre muhabir çizgi") floresan işaretleyicisinde ifade başka bir fare çizgi için elde edilebilir. Bu işlevleri eksitatör nöronlar veya astrocytes8gibi hücrenin alt kümeleri içinde bir gen ortaya çıkarmak için yol çeşitli göstermiştir. CRE muhabir satırları Cre-aracılı rekombinasyon uyuşturucu indüklenebilir (tek-nöron indüklenebilir Cre-aracılı nakavt veya KAYGAN ile etiketleme) olmak izin vermek için CreERT2 ifade9. Mozaik analiz çift işaretleri (MADM)10,11ile adı verilen başka bir strateji, heterozigoz dokusu ile birlikte oluşturulacak homozigoz mutant interchromosomal rekombinasyon Cre-aracılı sağlar. Bu yaklaşımlar, farelerin yeni bir satır her aday gen ya da mercek altına alındı hücresel alt türü için her zaman üretilmesi gerekiyor. Alternatif olarak, Cre recombinase postnatally İyontoforez12 veya viral vektörler (hücresel alt türü özel taşıyanörneğin adeno ilişkili virüs13 ya da lentiviruses14 aracılığıyla tanıttı olabilir Organizatör). Bu strateji etiketleme güçlü ve postnatal oluşturur. Seyrek ve prenatally serebral kortikal nöronlar geliştirme hedeflemek için bir ideal Cre recombinase floresan bir marker ile rahim içinde elektroporasyon stratejisidir.

CRE-lox rekombinasyon üretmek için rahim içinde elektroporasyon ile birleştirerek yanı sıra doku vivo içindeMozaik, biz diğer yayımlanmış protokolleri15,16yordamları için çeşitli uyarlamalar tanıtmak, 17,18,19,20,21. Üreme zaman aşımına uğradı-hamile kadın başarısında geliştirmek için bilgi veriyoruz. Biz de seyrek ve parlak kortikal doku nöronlarda etiketlerine göre tanıtmak bizim iki strateji anahat: bir strateji bir tek yapı Cre recombinase ve floresan marker22için kodlama düzeyleri titre etmektir. Bu parametreler zihin23,24ile özel tasarlanmış "Süpernova" sistemini kullanmak için başka bir stratejidir. Ayrıca, biz tutarlı mikroenjeksiyon Pipetler ve basitleştirmeler rahim içinde elektroporasyon cerrahi üretmek geliştirmeleri sunar. Son olarak, biz daha fazla boyama ve immünhistokimya dendritik spines ve dendritik ve aksonal arbors, analizini verir basitleştirilmiş bir histolojik hazırlık kritik adımlar verilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Yöntem tanımlamak burada hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC), James Madison Üniversitesi tarafından onaylanmıştır ve uygun olarak ve tüm ilgili yasal ve kurumsal yönergeleri ile uyum vardır.

1. fare kurulum

  1. Genç bir ev (> P60) birlikte bir damızlık çifti25ayarlamak için homozigoz floxed erkek ve dişi fare.
    Not: İyi bir negatif kontrol wildtype fareler, hangi Cre recombinase ifade bir mozaik26neden olmaz bir ek damızlık çifti ayarlamaktır.
  2. Kadın doğum ve onun ilk çöp erkek ile yükseltmek izin. Erkek dişi çöp'ın hayatta kalma artırmak için birlikte tutun. Sütten kesme sonra çöp, örneğin doğum sonrası gün (P) 21, kadın ve erkek ayrı.
  3. Fare ıslahı
    1. Kadın ve erkek25arasında zamanlanmış çiftleşme kadar ayarlayın. Görsel yardımlar estrus kadın27belirlemek ve vajinal fişler için25çiftleşme sonra sabah kontrol için kullanın.
    2. Bir fiş bulunursa, ayrı ve dişi tartın. Embriyonik gün (E) 0.5 olarak gün saymak.
    3. Kadın hamile olup olmadığını belirlemek için her 3-5 günde ağırlığında devam edin. Hamile kadın 7-10 gün sonra gebe (E0) vücut ağırlığının % 10-20 artış olacaktır.
      Not: Bu adım gebelik daha önce görsel muayene25daha güvenilir bir şekilde doğrular.
    4. Kadın hamile değilse, 1.3.1-1.3.3 kadar olan adımları tekrarlayın.
  4. Gebelik onayladıktan sonra rahim içinde elektroporasyon tarihi seçin. Katman II/III kortikal piramit nöronal ataları hedeflemek için E15.5 adlı elektroporasyon gerçekleştirin.

2. DNA set-up

  1. Tek bir DNA Cre recombinase yanı sıra yeşil flüoresan protein (GFP)28,29gibi floresan bir marker için bu kodları oluşturmak seçin. Alternatif olarak, ayrıntılı önceki yayınları23,24olarak tanımlanan "Süpernova" sistemini kullanın. Bkz: Örneğin malzeme listesi oluşturur.
  2. DNA construct(s) adım 2.1 E. coli standart Mikrobiyolojik teknikleri30kullanarak yükseltmek.
  3. DNA yapısı üreticinin yönergeleri izleyerek bir plazmid endotoksin ücretsiz arıtma kiti ile arındırmak. Endotoksin ücretsiz su sahip yapı elute.
    Not: bir arıtma endotoksin-Alerjik kiti bir standart arıtma aparatı seçimi önemlidir.
  4. 1-3 mg/ml bağlı olarak istenilen etiketleme yoğunluğu26DNA eluate konsantre ol.
    Not: Bir titresi her zaman farklı uzunlukta ve Organizatör ellerinde verilen bu yeni bir DNA yapı ile çalışırken kurulması gerekiyor. Birkaç farklı konsantrasyonları ve/veya tutarları ifade değerlendirmek için bir yapı enjekte göz önünde bulundurun. Örneğin, enjeksiyon 1 µL veya 2.0 mg/ml GFP 1,5 µL. CRE seyrek (1 µL) veya yoğun (1,5 µL) neden mümkün Katman II/III görsel kortikal piramidal nöronların26etiketleme.
  5. % 0,4 eklemek trypan mavi 1 fosfat tamponlu tuz (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 H2O, pH 7.4 HCl ile düzeltilmiş) x 1:10 konsantre DNA çözüm için.
  6. 10 x PBS 1:10 konsantre DNA ekleyin.
  7. Konsantre DNA çözüm 4 ° C'de depolayın Çözüm süresiz olarak depolanabilir.

3. pipet Set-up

  1. Bir cam kapiller çektirmenin kullanarak çek ile çok uzun bir pipet (10-15 mm) konik ve çok ince uç, Pipetler embriyonik kök hücre enjeksiyon veya nükleer transfer31için tipik.
    Not: Pipetler kirletici enkaz önlemek için hepsi ameliyat 2 gün içinde yapılmalıdır.
    1. Cam kapiller çektirme üreticinin yönergelerini izleyerek bir rampa test gerçekleştirerek kalibre. Bir program elde edilen ısı değeri iletişim kuralı aşağıdaki parametreleri kullanarak kullanım: ısı = (rampa test değeri + 15), Çek = 30, vel = 120, saat = 100, basınç = 200. Cam kılcal Ekle, kelepçeler için çekici üzerinde bağlayın ve programlanmış çekerek iletişim kuralı, bir ucu cam kılcal oluşturma, etkinleştirme.
    2. Konik uzunluğu arasında olduğundan emin olun 10-15 mm bir bileşik ışık mikroskobu (örneğin 10 X amaç)31kullanarak.
  2. Geri kaba kenarlı bahşiş 20-25 µm çapı oluşturmak için pipet kır.
    1. Bir tek katlı görev silme Merkezi (malzeme listesine bakınız) 50 mL kabı ve streç ile bir yandan gergin silin. Diğer elinizle tutun ve bir pipet (konik tarafı aşağı) dik ve tamamen temiz bir mola konik31' neden silme, Merkezi aracılığıyla itin.
      Not: pipet tamamen silme üzerinden iterek 20-25 µm çapı uç zaman yaklaşık % 70 üretecek.
    2. Bir bileşik ışık mikroskobunda (örneğin 20 x amaç) onaylayın.
      Dikkat: cam kırılma göz koruma kullanın.
  3. Bir pipet %0,4 trypan 1 x PBS mavi alıyorum 1 µL tarafından kısmen dolu bir piptte kalibre, sonra ince uçlu bir alkol dayanıklı işaretçisi kullanarak pipet, 1 µL yüksekliğini pipet 1 µL işaretler ile mezun dayalı. Diğer Pipetler atılmadan önce mezun olmak için kalibre edilmiş pipet kullanın. Pipetler bir pipet tutucu toz ve diğer parçacıklar ücretsiz tutun.

4. rahim içinde elektroporasyon

  1. Graefe forseps, Iris makas, Hartman sivrisinek forseps, dokuma olmayan gazlı bez sünger, yüzük uçlu forseps ve Petri yemekler paslanmaz çelik tepsiye yerleştirin ve alüminyum folyo ile sarın. Tepsi ve 1 L % 0,9 serum (% 0,9 wt/vol suda NaCl) otoklav içinde yerleştirin. Otoklav 121 ° c ve 40 dakika süreyle 3,5 kPa otoklav kaldır ve dezenfekte cerrahi alanına yerleştirmek.
    Not: Steril koşullar ameliyat sırasında korumak için önemlidir.
  2. 38 ° C en az 2 h ameliyattan önce bir küçük su banyosu autoclaved 1 L serum fizyolojik şişeye sıcak.
  3. Cımbız tipi elektrotlar ve ayak pedalı jeneratöre bağlayın (malzeme listesine bakınız). Üreticinin yönergelerine ayarla jeneratör 50 V (950 ms aralığı ile) beş 50 ms darbeleri ne zaman teslim etmek için ayak pedalı tarafından tetiklenir. Cımbız tipi elektrotlar dezenfekte ve dezenfekte cerrahi alan üzerine yerleştirin.
  4. Bir anestezi burun konisi önceden yayınlanmış32olarak yapmak, ama Nitril veya lateks eldiven parmak ucunu burun konisi açılış üzerinden güvenli bir şekilde uyan bir diyafram oluşturmak için kullanın. Fare burnu sığmayacak büyük diyafram bir delik.
  5. Derin E15.5 isoflurane (% 2-4) ile dolu bir indüksiyon odasında, hamile fareler 1 L/dak akan saf oksijen anestezi. ~ 1 dakika sonra iyileştiren refleks testi (yavaşça indüksiyon odası eğilme ve fare kendisi doğru değil emin olun). Daha sonra ameliyat sırasında yönetilen analjezi dozlarda belirlemek için fare tartın.
  6. Fare cerrahi bölgesine aktarmak ve inhale isoflurane (% 1-2) 1 L/dk fare cerrahi düzlemde korumak için bir burun konisi üzerinden akan saf oksijen yönetmek. Forseps pedal refleks sınamak için kullanın (pençe yavaşça pinch ve fare bir refleks döndürmez sağlamak) anesthetization doğrulamak için. Monitör solunum hızı ve çaba, derin ve düzenli nefes için arıyorsunuz (~ 70-100 nefes/dak), ve müköz membranlarda pembe renkli ve nemli.
  7. Onları tamamen kurutma işlemi sırasında karşı koruma için karşılamak için gözlerinin üzerine yeterli veteriner oftalmik merhem uygulamak.
  8. Esnek metal harekete geçirmek disk mühürlü bir kese dolu ile doygun tuz solüsyonu (malzeme listesine bakınız), tuz ekzotermik bir kristalleşme etkinleştirme. 2 tek katlı görev mendil üstünde tepe-in belgili tanımlık kese yatıyordu ve vücut ısısını korumak için kese fareyi getirin.
  9. (Yaklaşık 20-40 lar) karın kürk eriyene kadar pamuk temizleme bezi ile karın bölgesi üzerine depilatory krem masaj sonra kapalı karın kürk silin. Dikkatle kalan herhangi bir kalıntı ve depilatory krem % 70 etanol ve pamuk temizleme bezi ile temizle. Delikli steril cerrahi örtüsü karın bölgesi getirin.
  10. Aseptik teknik kullanarak, deriyi yukarı ve karın uzak Graefe Forseps ile çekin ve ~ 2 cm ventral Ensizyon temel kas kesim değil sağlanması Iris makas kullanarak cilt üzerinde yapın.
    Not: bir kesi Graefe forseps ve Iris makasla yapmak için kabul edilebilir bir alternatif bir neşter, daha önce yayımlanmış17olarak kullanmaktır.
  11. Bul linea alba rektus karın midline görselleştirmek için. Kas yukarı ve karın uzak Graefe Forseps ile çekin ve karın boşluğu açığa Iris makas ile başka bir ~ 2 cm Ensizyon orada yapmak (rahim yarı saydam ve embriyo altında görünür olacaktır). Rahim ve bağırsak dokusu altında yatan değil kesin emin olun. Belgili tanımlık kesme sadece yeterince büyük (genellikle ~ 2 cm) dışarı çekin ve rahim konforlu maruz olun.
    Not: bir kesi Graefe forseps ve Iris makasla yapmak için kabul edilebilir bir alternatif bir neşter, daha önce yayımlanmış17olarak kullanmaktır.
  12. Steril bir 10 µL micropipette ucu kullanarak, (steril % 0,9 serum içinde çözünmüş) carprofen 4 mg/kg, Analjezi için karın boşluğu içine dağıtmak.
  13. Bir Hartman sivrisinek forseps rektus karın kesi sol kenarına kelepçe. Forseps devrilmiş Petri kabına belgili tanımlık kesme sol tarafındaki açık tutmak belgili tanımlık kesme solundaki üzerine getirin. Başka bir Hartman sivrisinek forseps rektus karın kesi sağ kenarına Klamp ve forseps üzerine devrilmiş bir Petri kabına belgili tanımlık kesme sağ tarafında açık tutarak kesi, sağına getirin. Gazlı bez sünger belgili tanımlık kesme etrafına yerleştirin.
  14. Halka forseps (olmadan bir ekli sınırı vida) kullanarak, rahim kırma veya herhangi bir doku yaralanmasına olmadan herhangi bir iki komşu embriyo arasında çek. Onları gazlı bez üstüne sünger döşeme kesi aracılığıyla tüm embriyoların çekerek başlayın. Karın boşluğu üzerinden geçen embriyo çekerek, yumurtalık veya rahim boynu çek değil emin olun. Bir kez maruz, rahim sıcak salin ile nemli tutmak için önemlidir. Rahim genellikle arasında 5 ve 8 embriyo içerir.
    Not: Penisilin ve streptomisin tuzlu17' ye eklemek mümkündür.
  15. Kalibre edilmiş bir pipet aspiratör boru montaj için bağlanmak (malzeme listesine bakınız) ve 2. adımda rahim duvarından her embriyo bir lateral ventrikül içine hazırlanan DNA çözüm tam olarak 1 µL enjekte. Lateral ventrikül (yamalar telencephalon dokusunun çevreleyen daha koyu olan) embriyonun dorsal telencephalon üzerinde iki sembolü olarak görünür. Başparmak ve işaret parmağı mikroenjeksiyon ve elektroporasyon sırasında embriyolar rahim duvara enjeksiyon sırasında yavaşça itti izin ve lateral ventrikül ifşa embriyo işlemek için kullanın. Başarılı enjeksiyon trypan mavi lateral ventrikül dolum gözlemleyerek onaylayın.
  16. (Bkz: malzeme listesi) cımbız tipi elektrot katot rahim, görsel korteksin hedeflemek için doğrudan medial ve Kaudal korteks üzerinde yerleştirin (beyin alternatif alanlarda hedefleme gerekecek farklı elektrot yerleştirme)16, 26. Anot rahim, sadece aşağı ve embriyo'nın kafa anterior yerleştirin.
  17. Anot ve katot embriyonun uygun yerlerde çevreleyen rahim dokunuyorsun onaylayın. Ayak pedalı ile 50 V (950 ms aralığı ile) beş 50 ms darbeleri teslim elektrotlar arasında tetikler.
    Not: Enjekte, olumsuz ücret DNA katot doğru hareket edecek ve katot için en yakın ventrikül bölge hücreye dahil edilecek.
  18. Rahim karın boşluğu bulundu aynı yönde dönün. El ile ve son derece yavaş, embriyolar rahim içindeki konumlarını üzerinden yerinden değil için dikkat çekici rehberlik ederken rahim yağlamak için serum kullanın.
  19. (Bkz: malzeme listesi) absorbe dikiş ile karın kasları yakın bir cerrah 's düğüm ile biter bağlayan basit bir kesintiye uğramış dikiş kullanarak. Uçları çok düğüm için yakın klip yapmak veya düğüm unfastened olacak.
    Not: Bu önemlidir dikiş yara kenarları tamamen kapalı öyle ki karın kasları kapa, ancak kas sarararak neden olmadan. Unfastened olamazlar knot sıkı olmalı.
  20. Absorbe dikiş (basit kesintiye uğramış dikiş, cerrah 's knot, adım 4,19 olduğu gibi) Cilt katmanıyla kapatın. Yarayı kapatmaya doku yapıştırıcı az miktarda uygulayın. Doku yapıştırıcı unfastening önlemek için deniz mili üzerinde uygulayın. Bir micropipette tarafından micropipette Aspire yaranın çevresindeki herhangi bir doku yapıştırıcı kaldırmak için kullanın.
  21. Alt isoflurane düzeyleri 0,5-%1,5. Doku yapıştırıcı (test eldiven yapıştırıcı için dokunarak) kuru, isoflurane kaldır ve sıcak bir kafeste tek başına kurtarmak için kadın izin. Buprenorfin 0.03 mg/kg 1 mL şırınga bir 26 G, ½" ile kullanarak, intraperitoneally yönetmek iğne.
  22. Fare fare tamamen iyileşti kadar izlemeye devam edin ve normal davranışlar (Yani damat, kafes keşfetmek, yeme veya içme). Yeniden elde etmek bir kez geri kafes erkek ile kadın yerleştirin.
    Not: tüm adımları izlediyseniz, fare genellikle bilinç 2 dakika içinde yeniden elde etmek ve hemen hiçbir rahatsızlık belirtileri gösteren kafes hakkında hareket başlar.
  23. Fare rahatsızlık (kamburörneğin duruş, porfirin salgıları)33belirtileri sergileyen, carprofen 0.1 mg/mL su kaynağı yönetmek. Birçok rahatsızlık belirtileri varsa veya rahatsızlık için daha--dan 4 h carprofen yönetim rağmen ederse, hemen fareyi ketamin (240 mg/kg) - xylazine (48 mg/kg) - bir mayi öldürücü enjeksiyon yönetmek olarak ötenazi 1 mL şırınga bir 26 G, ½" ile kullanarak acepromazine (1.85 mg/kg) kokteyl iğne ve ötenazi33onaylanmış bir ikincil şeklinde ile izleyin.
  24. Electroporated embriyo yaşama doğumdan sonra artırmak için Tutuklu odası, gürültü ve titreşim ücretsiz bir sessizlik içinde belgili tanımlık kafes tutun. Plastik igloolarda, iç içe geçmiş malzeme ve ayçiçeği tohumu (malzeme listesine bakınız) gibi diyet takviyeleri ile çevre zenginleştirmek. Taşımayın veya kafes, özellikle ilk 3 gün sonra doğum sırasında rahatsız.

5. histolojik hazırlık Floresans mikroskobu

Not: Bu Histoloji Protokolü electroporated içinde rahimolan hayvanlardan postnatal günden (P) 13 büyük doku hazırlamak için optimize edilmiştir. Beyin bölümleri (Adım 5,9) hazırlanıyor önce agar gömülü rağmen doku genç postnatal hayvanlardan (P0-P13) hazırlamak için bu (transcardial perfüzyon dahil olmak üzere) tüm adımları gerçekleştirmeniz önerilir. Doku bile hazırlıklı elektroporasyon sonra 1-2 gün içinde embriyo yöntemleri kullanarak daha önce18,20açıklanan.

  1. Paraformaldehyde (PFA) çözüm hazırlamak.
    Not: Taze PFA, bir gün içinde deneme hazırlamak için zorunludur.
    Dikkat: Paraformaldehyde zehirli ve duman başlıklı uygun kişisel koruyucu ekipman ile ele alınmalıdır.
    1. 50 mL % 4'lük yapmak PFA, ısı 40 mL su ile 60 ° c Cam çubuk veya karıştırma çubuğu ile karıştırma sırasında 2 g PFA ekleyin. İngiltere'de yılın eriyene kadar 10 M NaOH her 2 dk 10 µL ekleyin.
    2. 10 x PBS 5 mL ekleyin ve 50 mL su ile son hacmi çözüm getirmek.
    3. Çözüm için 50 mL getirdikten sonra pH 7.4 için serin ve 4 ° C'de depolamak için 10 M HCl. izin ver solüsyonu ile gerektiği gibi ayarlayın
  2. Fare ötenazi ketamin (240 mg/kg) - xylazine (48 mg/kg) - mayi bir enjeksiyon ile 1 mL şırınga bir 26 G, ½" ile kullanarak acepromazine (1.85 mg/kg) kokteyl iğne. Transcardially 25-40 mL taze yapılmış, buz gibi % 4 İngiltere'de yılın17tarafından takip 10 veya 20 mL buz gibi 1 x PBS sıvı. Genç postnatal (P0-P13) fareler ve büyük fareler için daha yüksek miktarlar düşük miktarlar kullanın (P14 ve üstü).
  3. Hemen sonra perfüzyon, fare leşi oksipital kemik ve C1 vertebra arasında büyük makasla başını kesmek ve peel away ve Iris makas kullanarak kafatasını çevreleyen deri çoğunu atmak, özellikle deri çevreleyen ön, yan ve oksipital kemikler. Kafatası ve beyin sağlam tutmak.
  4. 10 mL %4 oranında yer kafatası ve beyin dokusu sonrası düzeltmek için İngiltere'de yılın 50 mL konik tüp için 4 ° C'de 24 saat içinde. 30 mL 1 x PBS % 1 için çözüm sulandırmak için konik tüp eklemek için depolama 4 ° C'de PFA
    Not: her kafatası ve beyin için ayrı bir konik tüp sonrası düzeltilmesi için kullanın. Beyin kuluçkaya değil % 1 2 hafta veya floresan daha uzun süre PFA solmaya başlar.
  5. Yer beyin ve kafatası ile düz bir yüzeye tek görev mendil 1 x PBS ile nemlendirilmiş kat. (Bkz: malzeme listesi) cımbız bir çift herhangi bir kalan deri ya da kafatasını çevreleyen zar kaldırmak için kullanın.
  6. Cımbız kullanarak, ilk oksipital kemik kaldırın ve sonra cımbız dışarı ve beyin yüzeyinden taşınıyor çeper dikkatli bir şekilde çıkarın. Korteks için zarar önlemek için herhangi bir meninkslerde dikkatli bir şekilde çıkarın.
  7. Boyunca herhangi bir kranial sinirler koparmaya kafatası beyin altında cımbız arkası kama ve beyin kaldırın.
  8. Genç postnatal (P0-P13) beyin yerine
    1. %4 agar 25 mL 25 mL 1 x PBS ile 80 ° c Isıtma tarafından olun Karıştırın ve 1 g agar bir cam çubuk veya karıştırma çubuğu ile çözülür).
    2. Serin çözüm ila 35 ° C karıştırmaya devam ederken. Beyin (örneğin 50 mL konik tüp kap) küçük bir kapsayıcısına getirin ve beyin Ağar solüsyonu dökün. Agar sertleşmesine izin.
  9. Beyin, yaklaşık 0,5 mm bregma için rostral aracılığıyla tek-kenar jilet kullanarak el ile bir koronal kesim yapmak. Başka bir koronal kesim beynine yaklaşık 0,5 mm için görsel korteksin Kaudal olun. Bir havuz cyanoacrylate tutkal beyin rostral sonu olarak aynı çapı ile titreşimli microtome numune diskin ortasına yerleştirin. Havuzun tutkal, tüm rostral yüzey doku yapıştırıcı ile numune diske bağlı garanti üzerine beyin rostral sonuna yerleştirin.
  10. Arabellek tepsi microtome titreşimli üzerine monte ve yerleşik sıkma kolu ile güvenli. Bıçak bıçak yuvasına takın ve dahili sıkma vidalı microtome titreşimli üzerine bıçaklıklı bağlayabilirsiniz. Örnek disk yerleşik sıkma aygıtı kullanarak arabellek tepsi üzerine beyin ile güvenli. 5.70 (0.285 mm/s =) için ekstra hız ayarı ve frekans ayarı 5,33 (53,3 Hz) ayarlayın.
  11. Beyin seviyesinden Odası 1 x PBS ile doldurun ve bıçak PBS alt. Doku ile 100 µm koronal bölümler alarak başlamak.
  12. Eğer daha fazla işleme, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nükleer boyama veya immünhistokimya gibi gerektirmeyen.
    1. İnce uçlu fırça bölümleri titreşimli microtome 4-6 bölüm her slayda uydurma bir mikroskop slayda doğrudan aktarmak için kullanın.
    2. Bir ince uçlu fırça ile dış görev çözüm esneklik tarafından beyin dilimleri artık slaytlarda drift öyle ki kurumaya bölümler de olanak sağlar.
    3. O zaman, mountant bir damla yer (malzeme listesine bakınız) slayttaki her bölümünde.
    4. Yavaşça bir 24 x 50 mm coverslip üstüne yattı, form bölümleri, 2) bölümleri üzerinde hareket etmiyor 1) hiçbir hava kabarcıkları sağlamak ve 3) mountant tam olarak coverslip ve slayt arasındaki alanı kapsar. En az 24-48 h için tedavi mountant izin verir.
  13. Kortikal lamina histolojik muayene için DAPI ile çekirdeği leke
    1. İnce uçlu fırça her bölüm içeren 10 µg/mL DAPI (malzeme listesine bakınız) seyreltilmiş hisse senedi çözümden (20 mg/mL suda DAPI) 1 x PBS içinde bir çözüm içine aktarmak için kullanın.
    2. Oda sıcaklığında 5 min için DAPI çözümde kuluçkaya sonra bölüm DAPI eriyik--dan 1 x PBS'ye aktarıp 1 x PBS oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya ince uçlu fırça kullanın. Bölüm iki kez daha taze 1 x PBS 5 min için transfer. Sonra ince uçlu fırça, transfer kullanarak bölümü bir mikroskop slayda adımları 5.11.2-5.11.4 izleyin ve 5.13 adımla devam edin.
  14. Bir cam Petri Valap (eşit parçaya vazelin, lanolin ve parafin) içeren bir düşük ısı ayarında tamamen eriyene kadar sıcak tabakta ısı. Mühür kenarları slaytların üzerinde eritilmiş Valap fırçalama tarafından maruz.
  15. Floresans doku incelemek için bir ışık mikroskobu veya confocal mikroskop kullanın (malzeme listesine bakınız) ve filtre ayarlamak fluorophore görüntülemek için yeterli (örneğin DAPI: uyarma 325-375 nm, emisyon 435-485 nm; GFP: uyarma 450-490 nm, emisyon 500-550 nm)17. Confocal görüntüleri alınabilir düşük - (4 X, sayısal diyafram, NA 0,20 =), orta-(20 X, NA 0,75 =) ve yüksek güçlü (60 X, NA 1,40 =) hedefler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tek yapı GFP. CRE electroporated E15.5 de yapıldı (malzeme listesine bakınız) ve P14 görüntülenir. Yapı konsantrasyon ve enjeksiyon hacmine bağlı olarak, bir seyrek veya yoğun sonuç22,26elde edilebilir. Örneğin, 2 mg/ml GFP 1 µL enjeksiyon. Etiketli hücre, biraz-in hangi-ebilmek var olmak parlak (şekil 1A) ve yerelleştirilmiş içinde katman II/III (şekil 1B) seyrek bir dağıtım sonuçları CRE. Doku 100 µm kalın olduğundan, dendritik arbors çoğunu (şekil 1 c) korunur. Dendritik spines (60 X; yüksek büyütme oranlarında görülebilmektedir Şekil 1 d). Aynı konsantrasyonu, 1,5 µL enjeksiyon çok yoğun (şekil 2A) Katman II/III (şekil 2B), hangi-ebilmek var olmak alt-optimal neurites ve dendritik spines (şekil 2C) kaynağı izlemek zor olduğu gibi etiketleme sonuçlanır. Ancak, bir nöron (şekil 2B) ve onunla işlemler (şekil 2E) etiketli alanı (şekil 2B) çevre içinde parlak bir hücreyi seçerek görüntü hala mümkündür.

Son olarak, seyrek bir dağıtım etiketli hücre korurken parlaklık nöronların en üst düzeye çıkarmak mümkündür. Burada, E15.5, electroporated (malzeme listesine bakınız) süpernova GFP yapıldı ve P23 görüntülenir. Unutmayın, gözlemler çeşitli postnatal yaş, çekilen beyin dokusunun temel yok görünüyor parlaklık floresan herhangi bir yapıları, yaş bir etkisi kullanılan burada23,24,26olmak. 1 mg/mL Sn-GFP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) ve 10 µg/mL TRE-Cre sonucu çoğunlukla parlak hücreleri (şekil 3A) Katman II/III (şekil 3B) seyrek dağılımdaki içeren bir karışımdan 1 µL enjeksiyon. Dendritik ve aksonal işlemleri (şekil 3B) ve dendritik spines (şekil 3 c) görüntülenir. Deneyim, ikisinden biri ile GFP gibi tek bir yapı hedefleme. CRE veya "Süpernova" yapıları tekrarlanarak electroporated embriyo en az %75 olarak ifade verecektir.

Figure 1
Şekil 1: Sparse ve sonra rahim içinde elektroporasyon ile a tek parlak ifade oluşturmak içeren GFP ve Cre recombinase. (A)düşük-büyütme (4 X) floresan test çoğalmasıyla, E15.5 sonra P23, serebral korteksin. (B) orta-büyütme (20 X) floresan test, DAPI nükleer leke, kortikal laminasyon (ı, II/III, IV ve IV derin katmanları Katmanlar) açığa. (C) orta-büyütme (20 X) floresan test tek bir nöron. (D) yüksek-büyütme (60 X) floresan test dendritik spines ile. Ölçek Bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C); ve 5 mikron (D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Dense ve sonra rahim içinde elektroporasyon ile a tek parlak ifade oluşturmak içeren GFP ve Cre recombinase. (A)düşük-büyütme (4 X) floresan test çoğalmasıyla, E15.5 sonra P14, serebral korteksin. (B) orta-büyütme (20 X) floresan test, DAPI nükleer leke, kortikal laminasyon (ı, II/III, IV ve IV derin katmanları Katmanlar) açığa. (C) orta-büyütme (20 X) floresan test en yoğun etiketleme alandaki nöronların. (D) orta-büyütme (20 X) floresan test en yoğun etiketleme alan çevre alınan nöronların. (E) yüksek-büyütme (60 X) floresan test dendritik spines ile. Ölçek Bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C, D); ve 5 mikron (E). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Sparse ve rahim içinde elektroporasyon ile süpernova GFP içeren GFP ve Cre recombinase oluşturur sonra parlak ifade. (A)düşük-büyütme (4 X) floresan test çoğalmasıyla, E15.5 sonra P14, serebral korteksin. (B) orta-büyütme (20 X) floresan test, DAPI nükleer leke, kortikal laminasyon (ı, II/III, IV ve IV derin katmanları Katmanlar) açığa. (C) orta-büyütme (20 X) floresan test tek bir nöron. (D) yüksek-büyütme (60 X) floresan test dendritik spines ile. Ölçek Bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C); ve 5 mikron (D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase mozaik beyin doku oluşturmak için floxed farelerde ile kombinasyonu tanıtmak. Bu yaklaşımın avantajı, yeni bir fare satır farklı hücresel alt türü hedef için her zaman var olmak oluşturmak yeterli değil olmasıdır: rahim içinde elektroporasyon eksitatör nöronlar, inhibitör nöronlar veya glia süreye bağlı olarak hedeflemek için kullanılan ve konumu elektroporasyon15,16,17,18,19,20,21,34. Çünkü biz gelişmekte olan telencephalon büyük bir alan üzerinde yer olabilir 5 mm çap elektroporasyon elektrotlar kullanma bizim yaklaşım, serebral korteks tutarlı ve tekrarlanabilir hedefliyor. Alternatif siteleri (örneğin diencephalon, retina) beyindeki veya serebral korteks Berisi Bölgeler Klasiği daha özel hedefleme için hedeflemek için yordamları ve açıkça bu amaç için tasarlanmış elektrotlar kullanılan15, -ebilmek var olmak 16. Ayrıca parlak etiketleme sağlar ve her fluorescently etiketli nöron Cre recombinase içeren garanti eden tek bir yapı sağlar. Parlak etiketleme elde etmek için tek bir yapı kullanarak bir dezavantaj etiketli nüfus çok yoğun (şekil 2C) olabilir, ancak bu hücreleri (2D rakam) etiketli alan çevre Imaging tarafından çözülebilir olduğunu. Alternatif olarak, floresan bir yapı ifade Cre recombinase ifade17tarihinde bağlıdır için tasarlanmış, ancak düşük ifade düzeyleri immunostaining floresan işaretçisi için gerektirebilir. Bu sınırlama Cre-bağımlı floresan marker ifade (şekil 3A)23,24"Süpernova" sistemi tarafından ele alınmaktadır.

CRE-lox rekombinasyon rahim içinde elektroporasyon ile birleştirerek ek olarak, zaman aşımına uğradı-hamile kadın optimum üreme için çeşitli iyileştirmeler sunar. Sesler ve laminar akış davlumbaz gibi donanımları kaynaklanan titreşimleri arınmış bir holding odada fareler tutmak önemlidir. Plastik igloolarda, malzeme, iç içe geçmiş ile çevre zenginleştirmek ve ayçiçeği tohumu (malzeme listesine bakınız) gibi diyet takviyeleri. Çevresel hususlar dışında biz bir erkek ilk çöp genellikle en düşük sağkalım oranı vardır fark etmişsinizdir. Böylece, bizim Protokolü ikinci gebelik rahim içinde adım gerçekleştirmek için kadın kadar bekleyen öneriyor. Bu strateji çöp yaşama artırır iken, bu da çöp büyüklük, hangi cerrahi saat uzatmak ve böylece ameliyat başarısı daha düşük artış eğilimindedir. Bu nedenle, embriyo (örneğin 8'den daha fazla) özellikle çok sayıda karşılaşma, doku yaralanma en yatkın nerede bazı embriyoların, özellikle embriyo yumurtalık ve rahim, yakın elektroporasyon atlama okumanızı öneririz. Ayrıca, aynı çevre zenginleştirme strateji (malzeme, diyet takviyeleri iç içe geçme plastik igloolarda,) belirtilen kullanarak çöp yaşama doğumdan sonra artış eğilimindedir. O estrus birkaç saat sonra ilk çöp doğum kadın oluşabilir unutmamak önemlidir. Bu durumda, ikinci onun çöp doğum sonra çiftleşme girişimi için Sütten kesme zaman aşımına uğradı sonra ayırmak erkek izin verir. Ne zaman seyir için vajinal prizler, bir fiş bile bulunursa, özellikle dişi önceki gece içinde estrus olsaydı dişi ayırmak iyi bir uygulamadır. Fişler belirli suşları içinde fark etmek zordur ve anlayışı zaten gerçekleşmiş olabilir.

Başka bir iyileştirme rahim içinde adım için yeterli mikroenjeksiyon Pipetler üretiminde alandır. Pipetler DNA enjeksiyon için lateral ventrikül çekerek kritik bir adımdır. Burada, biz Pipetler ile tutarlı ucu boyutunu ve kaba İpucu kenar oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Diğer yöntemler geri bir neşter bıçak15 ucuyla kırılma veya forseps16,17ucuyla uzakta pinching içerir. Pipet ipuçları çok küçük ise, doğru bir şekilde rahim duvarı ponksiyon ancak enjeksiyon akış oranları çok düşük, pipet embriyonik beyinde sıkıştığı sanılıyor zaman uzatma olacak unutmayın. Pipet ipuçları çok büyük iseniz, rahim duvarı ve embriyonik beyin zarar verebilir. Pipet ipuçları çok düzgündür, onlar büyük bir divot rahim duvarı ve/veya embriyonik kafatası içinde muhtemelen embriyo zarar aracılığıyla, kırma önce neden olur. 20-25 µm bahşiş üretmek ve ipuçları (örneğin 10 X amacı ile) basit bir ışık mikroskop altında incelemek için kaba bir ara oluşturma uygulama kadar tutarlı bir sonuç elde edilir. O sıvı test olabilir bir aspiratör boru montaj ile makul oranda (örneğin ~0.5 µL/s) pipetted, ucu boyutunu kabul edilebilir bir Aralık dahilindeyse olduğunu kontrol ettikten başka bir yöntemdir. Enjeksiyon Pipetler kalibre edilmiş ve mezun oldu, lateral ventrikül teslim DNA miktarı bilinir. Bu istenen sparseness tekrarlanarak için bir büyüklük elde etmek için en önemli adımdır. Başka bir deyişle, belirli bir konsantrasyon belirli bir aralık içinde örneğin 10-100 etiketli nöronlar etiketleme verim.

Protokol konusunda en önemli adım rahim içinde adım işlemdir. Rahim teşhir ederken son derece nazik ol. Karın boşluğu üzerinden geçen embriyo çekerek, yumurtalık veya rahim boynu çek değil emin olun. Başparmak ve işaret parmağı mikroenjeksiyon ve elektroporasyon sırasında kullanarak lateral ventrikül ortaya çıkarmak için embriyo nazik, hünerli manipülasyon ve yavaşça rahim duvara itti embriyo olanak sağlar. Son derece nazik bir dokunuş rahim ve embriyo işlerken önemlidir. Bu nazik bir dokunuş elde etmek zordur, halka forseps bir yerleşik sınırı vida ile bir embriyo veya doku hasarına neden olan rahim, sıkma forseps engellemek için kullanın. Carprofen ve buprenorfin ameliyattan hemen önce yönetmek için daha fazla dikkat etmeniz gereken, embriyonik hayatta kalma etkilemeden rahim içinde ameliyat sırasında etkili ağrı yönetimi sağlamak için görünür bir uygulama35 oranları .

Bizim Basitleştirilmiş histolojik yordamı uygulamadan, birkaç adım kritik öneme sahiptir. Deneysel beyin sabitleştirici ile Ventriküler sonra beyin beyin dokusuna zarar sırasında sonrası fiksasyon korumak için kafatasını sağlam tutmak. Beyin % 1 İngiltere'de yılın çözüm polymerizes gibi PFA gün haftalar, o floresan Not düşecektir depolamak mümkün iken. 100 µm Dilimleme koronal bölümler olduğunu confocal mikroskobu tüm bölüm dendritik ve aksonal Morfoloji çoğunu korurken izin vermek için genellikle ince. Fiksasyon düzgün oluştuysa, hayvanlardan P13 büyük beyin sadece cyanoacrylate tutkal ile titreşimli microtome üzerine monte edilebilir. Beyin titreşimli microtome tarafından kesim sırasında çok esnek ise, ancak, bir küçük agar veya özel blok kesitli iken bükme gelen önlemek için beyin arkasında aşağı tutkal. Sorun çözülmezse, beyin genç doğum sonrası beyin yerine (Adım 5,8) önerilen titreşimli microtome ile kesmek için bir blok oluşturmak için agar katıştırın.

Bu yöntem Cre-lox rekombinasyon sistemi nöronlar genlerin hücre özerk işlev eğitim için kullanılan mozaik oluşturmak için rahim içinde elektroporasyon ile birleştirir. Bu yöntem aynı zamanda rahim içinde elektroporasyon gen yapıları (örneğin CRISPR/Cas9)6veya olabilir diğer siteye özgü adlandırılan (örneğin Flp/FRT veya Dre/rox24), düzenleme desteklemek üzere yapılandırılmış Mozaik beyin dokusu üretmek için tasarlanmış. Mozaik doku üretmek için kullanılabilecek bir gelecek vaat eden alternatif yenidoğan fareler36İntraventriküler enjeksiyon yoluyla viral teslim tekniktir. Embriyonik yaş olarak gösterdiği, İntraventriküler enjeksiyon ile burada ve başka yerlerde15,16,17,18,19,20birlikte, 21,22,37, viral vektörler Cre recombinase için kodlama önce doğum floxed progenitör hücre ventrikül bölgede bulaştırmak için teslim. Bir kritik dikkate viral vektörler yeterince seyrek eksizyon ve etiketleme elde etmek için seyreltilmiş sağlamak olacaktır. Ancak, bu da floresan işaretleri nöroanatomik gözlemler (örneğin dendritik dikenleri veya arborization)24için gerekli dahil olmak üzere teslim edilen yapı, alt kopya rakamlarla neden olacaktır. Bu bir tuzak, yeni yapıları "Süpernova" olarak aynı stratejiyi kullanarak sayaç için aşağıda gösterildiği yapıları etiketli hücreleri24parlaklığını karşılık gelen bir azalma olmadan seyrek etiketleme elde etmek için kullanılabilir. Teslim edilen yapıları rehberleri okudu hücre nüfus (örneğin eksitatör piramidal nöronların) belirli olması için viral teslim ile başka bir kritik unsurlardan biridir. Viral vektörler İntraventriküler enjeksiyon nerede kortikal ve Hipokampal eksitatör nöronlar oluşturulur, sadece ventrikül bölgenin dorsal telencephalon de dahil olmak üzere ventrikül çevresindeki tüm doku aynı zamanda medial enfeksiyonu neden olur ve lateral ganglionic efendiler burada birçok kortikal interneurons34doğarlar. Başka bir rahim içinde elektroporasyon yapıları, viral teslim karşılaştırıldığında nispeten dar zaman penceresi teslimat özelliğidir. Lateral ventrikül enjekte virüs ventrikül bölge astar hücreleri enfekte devam ameliyattan sonra devam edebilir. Buna ek olarak, çok daha özel bir hücre kümesi hedefleme saniyede çoğalmasıyla oluşur. Bu bir avantaj ya da dezavantaj belirlenmesi için hücre subpopulation bağlı olarak araştırmacı için olabilir.

Yaklaşımımız Cre-lox rekombinasyon tek bir yapı veya "Süpernova" yapıları tarafından destekler. "Süpernova" yapıları söz konusu olduğunda biz müfettişler avantajları ve bu strateji kullanarak sınırlamaları ile tanımak için teşvik. Örneğin, Cre silme işlemini zamanlama Katman II/III eksitatör nöronlar serebral korteks242 gün içinde gerçekleşmesi için kanıtlanmıştır. Böylece, üzerinde 48 elektroporasyon takip, yerine hemen ardından elektroporasyon h Cre eksizyon meydana gelebilir akla yatkın. Bu nedenle, zamanlama ve Cre eksizyon (Cre muhabir fare satırını kullanarakörneğin ) konumunu corroborating diğer formları özellikle Cre eksizyon küçük bir zaman çerçevesi içinde bir kritik nerede çalışmalarda yeni bu tekniğin kullanımı tamamlayacak şekilde kullanılması gerektiğini dikkate. Başka bir potansiyel hatadır "Süpernova" deney etiketlenmemiş hücrelerde küçük bir yüzdesi Cre recombinase ifade olabilir olduğunu. Örneğin, şekil 3' te biz co-electroporated iki plazmid: CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE yüksek konsantrasyon ve TRE-Cre düşük konsantrasyon. TRE bir bulky organizatörü olduğu için bu nadir bir olay olsa Cre recombinase TRE-Cre plazmid ama değil loxP-dur-loxP-EGFP-tTA plazmid, alınan hücrelerde ifade edilebilmektedir anlamına gelir. Tüm etiketsiz hücreleri yok Cre-aracılı eksizyon olursa olsun var, "Süpernova" deney ile kontrol hangi Cre recombinase ifade dışında nöronlar etiketli deneme takıma gerekebilir temel nerede bir deneyde değerlendirildi yoluyla diğer (örneğin Cre recombinase immünhistokimya) anlamına gelir.

Özet olarak, bizim iletişim kuralı kolayca rahim içinde elektroporasyon yapım bir daha yararlı ve uyarlanabilir yöntemi mozaik analiz için bu yeni yapıları içerecek şekilde değişiklik. Böylece, rahim içinde elektroporasyon mozaik beyin dokusu içinde vivoeğitim için birden çok şekilde genetik rekombinasyon gücü ile kombine edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Yazar James Madison Üniversitesi Biyoloji bölümü ve James Madison Üniversitesi ışık mikroskobu ve tesis Imaging cömert destek teşekkür ederiz. Dr. Mark L. Gabriele için yararlı tavsiyeler genç doğum sonrası doku hazırlık, ilgili ve Drs. Justin W. Brown ve Corey L. Cleland cerrahi malzemeler ve mekan cömert koordinasyon için. Bu araştırma kısmen 4-VA, ilerleyen Virginia Commonwealth (G.S.V.) için işbirliğine dayalı bir ortaklık tarafından ve tarafından bir Virginia Akademisi bilim küçük proje araştırma Grant'ın (G.S.V.) bir ortak araştırma hibe tarafından finanse edildi. Destek cömertçe sağlanmıştır Betty Jo sevgi dolu Butler 58 ' bağış tarafından lisans araştırma bursu (için K.M.B.), Farrell yaz araştırma bursu (için K.M.B.), James Madison Üniversitesi ikinci yüzyıl burs (K.M.B.), James Madison Üniversitesi Centennial burs (C.J.H.), James Madison Üniversitesi Lucy Robinson arama ' 30 Memorial burs (Z.L.H.) ve James Madison üniversiteler, bilim ve matematik Fakültesi yardım Grant (için G.S.V.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641 (2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163 (2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747 (2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
  31. Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232 (2014).
  33. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).

Tags

Neuroscience sayı: 129 geliştirme serebral korteks hücre özerk gen teslim Cre recombinase loxP rahim içinde çoğalmasıyla dendritik omurgalar Mozaik işlevi işlev kaybı kazanç
CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks <em>rahim içinde</em> elektroporasyon ile inducing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bland, K. M., Casey, Z. O.,… More

Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter