Summary
ويصف هذا البروتوكول أساليب لتسجيل استجابة جذع الدماغ السمعية من الجراء الفئران بعد الولادة. دراسة تطور وظيفي لخلايا الشعر الخارجي، يرد وصف للإجراءات التجريبية لتصحيح كامل الخلية المشبك تسجيل في عزل خلايا الشعر الخارجي خطوة بخطوة.
Abstract
خلية الشعر الخارجي واحد من هذين النوعين من الخلايا الشعر الحسي في القوقعة الثدييات. أنها تغير طول الخلايا مع مستقبلات محتملة لتضخيم الاهتزاز ضعيف لإشارة الصوت منخفض المستوى. مورفولوجيا والخاصية الكهربية لخلايا الشعر الخارجي (أوهكس) تضع في سن مبكرة بعد الولادة. نضوج خلية الشعر الخارجي قد تسهم في تطوير النظام السمعي. ومع ذلك، عملية التنمية أوهكس لم تدرس جيدا. وهذا جزئيا بسبب صعوبة قياس وظيفتها بنهج الكهربية. هدف تطوير طريقة بسيطة لمعالجة هذه المسألة المذكورة أعلاه، هنا نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة وظيفة أوهكس في القوقعة حاد ينتابها من الفئران بعد الولادة. مع هذا الأسلوب، يمكننا تقييم cochlear الاستجابة للمحفزات نغمة نقية ودراسة مستوى التعبير ووظيفة بريستين موتور البروتين في أوهكس. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في خلايا الشعر الداخلية (إيكس).
Introduction
وظيفتين متميزتين من خلايا الشعر الحسية cochlear ضرورية لاستماع الثدييات: ميتشانويليكتريك تنبيغ (MET) واليكتروموتيليتي1،2. MET القنوات الموجودة في حزمة الشعر، إيكس (إيكس) وأوهكس تحويل الاهتزاز الصوت إلى غشاء التغييرات المحتملة، فضلا عن الإشارات الكهربائية من دوامة معصب العقدة العصبية. أوهكس تغيير طول الخلية بغشاء المحتملة وتضخيم الاهتزاز للصوت منخفض المستوى. يتم اشتقاق هذا النشاط الذي يطلق عليه اليكتروموتيليتي بريستين البروتين المحرك الموجود في الجدار الجانبي أوهكس3.
في العديد من الأنواع بما فيها القوارض، وظيفة السمع غير ناضجة في عصر ما بعد الولادة المبكرة4،5. تعذر الكشف عن لا إمكانات العمل استجابة لإشارات الصوت في القشرة السمعية قبل بداية الجلسة6،7. ودرست التنمية مورفولوجيا ووظيفة القوقعة على نطاق واسع في الماوس، وعضل، والفئران4،،من58. ميتشانوترانسدوكشن واليكتروموتيليتي من خلايا الشعر وتوضع أيضا في أوائل حقبة الحياة5.
من أجل تقييم حساسية السمع من الفئران في مختلف الإعمار ما بعد الولادة، قمنا بتطوير طريقة لاستجابة جذع الدماغ السمعية (ABR) التسجيل في الجراء الفئران. تصحيح كامل الخلية المشبك عبارة عن تقنية مثالية للتحقيق في أوهكس اليكتروفيسيولوجيكالي. ومع ذلك، مقارنة مع المشبك التصحيح المنجزة في الخلايا العصبية والخلايا الظهارية الأخرى، المعدل المنخفض لختم كامل الخلية محدودة التحقيق في اليكتروموتيليتي أوهكس معزولة.
هنا يصف لنا إجراء للتحقيق في أوهكس شكلياً واليكتروفيسيولوجيكالي في القوقعة حاد ينتابها من الفئران بعد الولادة. يمكن تعديل هذا الأسلوب لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم التنمية الداخلية الشعر الخلية ووظيفتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة البروتوكولات التجريبية التي تنطوي على الموضوعات الحيوان بموافقة "لجنة الأخلاقيات الحيوان" "الجامعة الطبية جنوب".
1. إعداد حلول لتجارب
- تحضير المخدر (انظر الجدول للمواد): 1.5% بينتوباربيتال الصوديوم المذابة في ddH2o.
- إعداد الحل تشريح (انظر الجدول للمواد): حل كيس واحد من مسحوق L-15 في ليبوفيز في 1 لتر من ddH2O. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.3 مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم. ضبط الاسموليه لموسم 300-330 باستخدام أوسموميتير و 10 ملم حبيس قبل الاستخدام.
- حل 2 مغ/مل كولاجيناز الرابع (انظر الجدول للمواد) في حل تشريح إعدادها في الخطوة 1.2.
- إعداد الحلول إيمونوستينينج (انظر الجدول للمواد): حل بارافورمالدهيد 4% في المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS).
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ملابس الحماية المناسبة. - تمييع عامل نفاذية 0.3% في برنامج تلفزيوني. تمييع مصل الماعز العادي 10% في برنامج تلفزيوني كحظر المخزن المؤقت. تضعف 1: 200 جسم بريستين في المخزن المؤقت لحظر. تضعف مقاومة جسم مترافق Alexa488 في المخزن المؤقت لحظر. تضعف 1: 200 إيسوثيوسياناتي "ب" فالويدين-تيتراميثيلرهوداميني في برنامج تلفزيوني.
- إعداد الحل خارج الخلية (انظر الجدول للمواد): إعداد المتوسطة L-15 ليبوفيز النحو المبين أعلاه (الخطوة 1، 2).
- إعداد الحل داخل الخلايا (انظر الجدول للمواد).
2-العبر التسجيل
ملاحظة: تسجيل ABR سابقا وصفت بالتفصيل في موقعنا الدراسة السابقة9.
- تخدير الفئران سبراغ داولي (SD) (الجراء يوم 1-14 القديمة والكبار 2-شهر القديمة، وكلا الجنسين) بحقنه واحدة من الصوديوم 1.5% بينتوباربيتال (22 ملغ/كغ الجراء و 30 ملغ/كغ للبالغين، وداخل (القائمة)).
- مكان هذا الحيوان أنيسثيتيزيد في العفن رغوة البولي إثيلين شل جسم الحيوان. ضع الحيوان على طاولة المضادة اهتزاز في غرفة لتخفيف الصوت. الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37.5 درجة مئوية مع وسادة تدفئة.
- مسح منطقة الرأس مع الإيثانول 70% (المجلد/المجلد). باستخدام مقص غرامة، إجراء شق 1-2 مم فينترولاتيرال بينا خارجي وضع مرجع قطب كهربائي أو الأرض. قطب إبرة تحت الجلد (تسجيل القطب) يقع على قمة الجمجمة (الشكل 1A).
- استخدام مولد الدالة، تولد لهجة معايرة رشقات نارية (1 ms الارتفاع/الانخفاض، الهضبة 3 مللي ثانية) لترددات مختلفة (2، 4، 8، 16 و 24 و 32 كيلو هرتز) وكثافة (انخفضت من 85 إلى 10 ديسيبل SPL في الخطوة 5 dB). تختلف في التردد والسعة يدوياً أو باستخدام جهاز كمبيوتر. تقديم المحفزات السليمة من خلال أحد المتكلمين الالكتروستاتيكي تقع 10 سم بعيداً نحو رأس الحيوان.
- تصفية (100 1,000 هرتز) وتضخيم ومتوسط (256 مرات) الصوت انتزع إمكانات استخدام معالج متعدد الوظائف للحصول Abr. ويتم رصد آثار العبر عبر الإنترنت وتخزينها للتحليل دون اتصال. ويستغرق حوالي 40 دقيقة لإكمال ABR تسجيل من الحيوان واحدة.
ملاحظة: عادة، من ثلاث إلى سبع قمم (موجه أنا موجه السابع) مع الاختفاء أقل من 15 مرض التصلب العصبي المتعدد يمكن تحديدها (الشكل 1B). عتبة ABR يعرف الحد الأدنى لمستوى الصوت في الموجه التي يمكن الكشف الأول والثاني. - Euthanize من قبل الحيوانات مستيقظا من التخدير (مع حقن داخل بينتوباربيتال الصوديوم 1.5% 0.3 مل).
3-تشريح الجهاز من كورتي (OC)
- تخدير الجراء الفئران. للفئران القديمة أقل من 6 أيام (< P6) وإبقاء الحيوان في صحن ثقافة 100 مم، وتغطي الطبق مع الثلج لمدة 10 دقائق. للفئران > P6، تخدير الحيوان بحقنه واحدة من بينتوباربيتال الصوديوم 1.5% (22 مغ/كغ، والقائمة). قطع رأس الجراء الفئران بعد التخدير.
- تعقيم الرأس بالرش مع الإيثانول (المجلد/المجلد) 70%.
- فتح الجمجمة على طول خط الوسط السهمي مع مقص؛ إزالة الدماغ لفضح الإذن الداخلية.
- نقل الإذن الداخلية إلى طبق بتري 35 ملم مليئة 3 مل من المثلج L-15 (الشكل 2A).
- تحت مجهر التشريح، استخدام الملقط غرامة لإزالة الكبسولة عظمى من القوقعة (الشكل 2).
- بسط قائد والمرتبطة فاسكولاريس ستريا (SV) من موديولوس.
- بعقد فصل الجزء القاعدي من SV بالملقط، قائد من SV تماما بالاسترخاء ببطء من القاعدة إلى قمة (الشكل 2).
- قطع قائد المنطقة بالتساوي إلى ثلاث قطع باستخدام مقص غرامة (الشكل 2D).
4-الفلورة تلطيخ
- باستخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر، نقل أجزاء OC (الخطوة 3.8) إلى شريحة زجاج، والإصلاح مع 100 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% على الأقل من 4 ح في 4 درجات مئوية.
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ملابس الحماية المناسبة. - يغسل النسيج بإزاحة بارافورمالدهيد مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني جديد. تغسل الأنسجة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق.
- احتضان الأنسجة مع عامل نفاذية 0.3% في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل عامل النفاذية في برنامج تلفزيوني وغسل الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- كتلة مع 10% مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان مع الأضداد المضادة-بريستين-ج--المحطة (1: 200) في عرقلة الحل ح 2 في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- أغسل ثلاث مرات ببرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- احتضان مع مترافق Alexa488 الأجسام المضادة الثانوية (مقاومة) في عرقلة الحل ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- أغسل ثلاث مرات ببرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الظلام.
- احتضان مع والرودامين-فالويدين (1: 200) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- أغسل ثلاث مرات ببرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الظلام.
- جبل على شريحة زجاجية مع تصاعد المتوسطة (التي تحتوي على DAPI). صورة مع [كنفوكل] مجهرية باستخدام 405 نانومتر، 488 نانومتر، و 594 نانومتر الليزر. تعيين السلطة الليزر في 0.1-0.5 ميغاواط والمسح الضوئي بسرعة في إطار/ثانية 0.5.
5-تصحيح المشبك "تسجيل أوهكس معزولة"
- استخدام ساحبة ماصة والصغرى-صانعا لجعل التصحيح pipettes يبلغ قطرها تلميح 2-3 ميكرومتر-مرة أخرى--ملء الماصات مع الحل داخل الخلايا. عادة، كانت المقاومة الأولية لتصحيح ماصة MΩ 2.5 3.5 في حمام الحل.
- باستخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر، تحويل قطعة من قائد (من الخطوة 3، 8) إلى 35 مم طبق بيتري. هضم الأنسجة مع 100 ميليلتر من الهضم الأنزيمي المتوسطة (كولاجيناز الرابع، انظر الجدول للمواد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- يزيح متوسطة الهضم الأنزيمي مع 100 ميليلتر من L-15. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة باستخدام مشرط الجزئي لعزل خلايا الشعر.
- بعد بيبيتينج لطيف، نقل الخلايا إلى غرفة بلاستيكية صغيرة محلية صنع (قطر ~ 1.5 سم) مليئة بحل حمام خال من إنزيم (~ 1.5 مل، انظر الجدول للمواد).
- ضع الدائرة على مرحلة المجهر المقلوب. العثور أوهكس الانفرادي صحية الظهور.
- تحميل ماصة التصحيح في مرحلة الرأس مكبر للصوت 700B. نقل ماصة التصحيح بعناية قبل ميكرومانيبولاتور ووضعه حول الجزء السفلي من الخلية الشعر الخارجي (الشكل 3A).
- تصحيح كامل الخلية المشبك والنشرمحفوظه بختم الجدار الجانبي من جسم الخلية. تطبيق شفط الخفيفة حتى هو تمزق في غشاء الخلية. تعيين إجراء محتمل في-70 mV. الخلايا مع المقاومة الوصول تتراوح من 10 إلى 17 MΩ ومقاومة الغشاء تراوحت من 100 إلى 500 MΩ، وتعتبر تكوين كامل الخلية ناجحة.
- مراقبة الكمبيوتر، باستخدام تطبيق هايبربولاريزينج وديبولاريزينج الجهد (250 ms المدة وتتراوح بين −140 + 94 أم في 13 mV الخطوات) للخلية للحصول على كامل الخلية التيارات.
- تضخيم التيارات كامل الخلية، وتصفية (الزاوية تردد 5 كيلوهرتز) بمكبر للصوت 700B. تحويل البيانات بتحويل 1440A ومخزن للتحليل دون اتصال.
- قياس السعة غشاء من أوهكس استخدام بروتوكول حافز جهد موجه جيبية بمعدل اثنين تسيطر برمجيات المشبك تصحيح. تعيين نطاق الجهد الحث من-140 إلى 110 mV. تخزين البيانات للتحليل دون اتصال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن أثارت العبر من الفئران تخديره الجراء الأقدم من يوم الولادة 7 (P7) استخدام لهجة نقية رشقات نارية (الشكل 1A). كما هو مبين في الشكل 1 باء، الحصول على الطول الموجي العبر من الجراء الفئران أظهرت سوى ثلاث أو أربع موجات متميزة مع السعة الصغيرة. عادة، ما يصل إلى سبع قمم لوحظت في الطول الموجي العبر من الحيوانات الكبار (الشكل 1B).
إيمونوستينينج التالية والقياس الكهربية، تشريح الإذن الداخلية الفئران كانت طازجة من العظم الصدغي. نعرض الخطوات المتتالية لتشريح الأنسجة لعزل قائد من SV وموديولوس (الشكل 2A–ج 2). وكان قطع قائد المنطقة إلى ثلاث قطع بالتساوي مع مايكرو-مقص (الشكل 2D). لإظهار مورفولوجية خلايا الشعر، كانت ملطخة الشرائح فالويدين والأجسام المضادة بريستين DAPI (الشكل 2E). باقات الشعر (باللون الأحمر) تشير إلى السطح قمي من خلايا الشعر، بينما اتسمت جسم الخلية أوهكس بريستين (باللون الأخضر). كانت تعتبرها النواة DAPI (باللون الأزرق) تقع في المنطقة السفلي من إيكس وأوهكس. كما هو مبين في الشكل 2 هاء، تم الكشف عن لا بريستين في أوهكس القوقعة في P5. بريستين لوحظ أولاً في P7 في أوهكس الموجود في القوقعة القاعدية.
بعد الهضم لطيف، أوهكس بمعزل عن قائد (الشكل 3A). وأجريت تسجيلات المشبك الجهد كامل الخلية من أوهكس حادة معزولة عن القوقعة الفئران. مثال ممثل الحالي كامل الخلية مسجلة من والنشرمحفوظه P9 معزولة في استجابة لغشاء المحتملة تغير من −140 إلى +107 أم هو مبين في الشكل 3 (ب). يرجى ملاحظة المنطقة N-شكل المنحنى-V، مما يشير إلى وجود KCa الحالي الذي استجابة فريدة من أوهكس. مدفوعا بالجهد غشاء، Cl داخل الخلايا– جنبا إلى جنب مع بريستين، تظهر التغييرات سعة غشاء غير خطية (النيجيري) تحت وضع المشبك تصحيح كامل الخلية. عمال نموذجية من والنشرمحفوظه ناضجة تتسم بالاعتماد على شكل جرس على غشاء المحتملة. العمال يمكن تركيبها مع دالة بولتزمان دولتين ويمكن أن تعكس الدالة اليكتروموتيليتي من أوهكس. الدالة بولتزمان لتركيب السعة يوصف بأنه:
ووصفت المعادلة والمعلمات في أعمالنا السابقة ورقة9. اثنين الممثل NLCs مبينة في الشكل 3.
رقم 1. تسجيل استجابة جذع الدماغ السمعية- (أ) تسجيل مسرى تم إدراجه في فروة الرأس بين الأذنين اثنين. أقطاب الأرض ومرجع وضعت تحت بينا اليسار واليمين، على التوالي. تم وضع أحد المتكلمين حقل مفتوح 10 سم بعيداً عن طرف الآنف من الفئران. (ب) هما الممثل ABR الطول الموجي ردا على 16 كيلوهرتز، 80 ديسيبل SPL لهجة رشقات نارية. وسجل التتبع العلوي من جرو P8. سجل تتبع أسفل من هو جرذ الكبار. تشير الأرقام إلى قمم مختلفة الطول الموجي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. تشريح الجهاز من كورتي. (أ) تشريح الإذن الداخلية من جرو الفئران P9. وترد بقوقعة الإذن والمنطقة الدهليزية. (ب) هيكل القوقعة تعرضت بعد إزالة الجدار عظمى. (ج) جهاز كورتي (OC) وستريا فاسكولاريس (SV) بمعزل عن موديولوس. (د) قطع كورتي من الجهاز بالتساوي إلى ثلاث قطع. تمثل أشرطة مقياس في ألف-دال 1,000 ميكرومتر. (ه) الصور [كنفوكل] إظهار خلايا الشعر الموجود في قطاعات مختلفة (القاعدية والوسطى وقمي) على طول القوقعة. والرودامين-فالويدين (أحمر) يمثل الشعر الحزم الموجودة على سطح خلايا الشعر قمي. DAPI (الأزرق) يمثل نواة تقع في الجزء الأوسط السفلي من خلايا الشعر. وأعرب بريستين (المسمى باللون الأخضر) فقط على الجدار الجانبي لخلايا الشعر الخارجي. للشرائح المتوسطة والقاعدية في P7، يظهر فقط قناة الأخضر لتوضيح التعبير عن بريستين في أوهكس. يمثل الشريط مقياس 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية من خلايا الشعر الخارجي معزول. (أ) خلية الشعر خارجي معزولة كانت مختومة في وضع كامل الخلية. يمثل الشريط مقياس 10 ميكرون. (ب) بالممثل الأول إلى الخامس منحنى المسجلة عن خلية شعر P9 خارجي. (ج) الغشاء غير الخطية السعة (النيجيري) التي تم الحصول عليها من خليتين الشعر الخارجي في مختلف الإعمار. تم تركيب الردود السعة-الجهد (الدوائر المفتوحة) إلى الدالة بولتزمان (كما هو موضح خطوط سميكة). تم تطبيع العمال إلى السعة الخطي المطابق (نوتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في فئران أصغر سنا من يوم 11، يمكن ملاحظة لا إمكانات العمل استجابة للتحفيز سليمة في القشرة السمعية6،7. ولذلك، بعد الولادة يوم 11 توصف بأنها "بداية جلسة الاستماع"10. تطوير وظيفة السمع قبل بداية جلسة الاستماع لم تدرس جيدا حتى الآن. استخدام أسلوب مماثل لتسجيل ABR الكبار، علينا أن نبرهن أن قد أثارت Abr باندفاع نغمة نقية من الفئران الجراء أصغر سنا من P11 (الشكل 1). ومع ذلك، أظهرت الطول الموجي العبر التي تم الحصول عليها من الفئران الجراء بعض ميزات مختلفة عن تلك الخاصة بالكبار الحيوانات. ردود العبر صغيرة في السعة مع عتبات عالية نسبيا. هذه النتيجة تعني أن نظام سمعي النامية لديه حساسية منخفضة لإشارات الصوت. لوحظ فرق كبير في الطول الموجي ABR مسجل من الجراء الفئران. عادة، ما يصل إلى سبع قمم لوحظت في الطول الموجي ABR الكبار9. هذه القمم مع الكمون مختلفة يتم إنشاؤها بواسطة نويات الدماغ المختلفة على طول مسار سمعي11. نتائجنا تشير إلى أن الموجات من الأول إلى الرابع فقط يمكن اكتشافها في العبر من الجراء الفئران (الشكل 1B). الموجات الأولى والثانية تمثل الاستجابات من القوقعة و العصب السمعي11. ولذلك، تبين النتائج أن الأنوية السمعية المستوى العالي فشلت في الاستجابة للمنبهات الصوتية أثناء التطوير. تشير هذه البيانات إلى أن القوقعة الوصول إلى النضج الوظيفي في وقت سابق مما يفعل النظام السمعي المركزي. الأسلوب يصف لنا هنا من المهم دراسة الآليات الجزيئية التي تنظم وظيفة القوقعة التنمية وخلية الشعر.
تشريح عالية الجودة من قائد المنطقة أمر حاسم للمزيد من التجارب بما في ذلك إيمونوستاينينج والغربية النشاف، والقياس الكهربية. تم إجراء هذه التجارب باستخدام الكبار SD الجرذان والفئران الجراء بين 1 و 14 يوما. الجراء الفئران تعتبر مثالية لتشريح غرامة cochlear العظام لينة ويمكن إزالته بسهولة بالملقط دون الأضرار قائد. للفئران الكبار، مطلوب الحذر بصفة خاصة لتجنب تمزيق قائد أثناء إزالة الكبسولة الصعب عظمى. باستخدام الملقط غرامة، يمكن رفع قائد و SV المرتبطة بها من موديولوس. قائد المنفصلين عن ذويهم و SV يكون الملمس مختلفة (الشكل 2). للفئران الجراء، يمكن قطع قائد إلى ثلاثة أجزاء بطول 800-1200 ميكرومتر. يرجى ملاحظة أن جميع الخطوات التي ينبغي أن يقوم في أسرع وقت ممكن بغية التقليل إلى أدنى حد من التدهور وتدهور النسيج المثلج L-15.
شرائح معزولة من قائد المنطقة بالإعداد الجيد إيمونوستاينينج والغربية النشاف، وتحليل الحمض النووي الريبي. هنا نعرض مورفولوجية خلايا الشعر الحسي في OC قبل إيمونوستينينج. أوهكس وقد حزم الشعر على سطحها قمي حين النواة لها يقع بأسالي12. يتم التعبير عن بريستين موتور البروتين على الغشاء الجانبي من أوهكس. بيانات التصوير [كنفوكل] أشار إلى أن بريستين أول أعرب في P6 P7 وأظهرت زيادة مستمرة خلال الأسبوع التالي (الشكل 2E). في مزيد من التجارب، أجريت النشاف الغربية وبكر q تحديد التعبير لوحظت تغيرات مستوى بريستين خلال التنمية (البيانات لا تظهر). لأن خلايا الشعر الأقلية في قائد المنطقة، ينصح كوكليا 6 إلى 10 في تجربة واحدة لتحقيق إشارات قوية.
للتصحيح تسجيلات المشبك أوهكس، أجرى خفيفة الهضم الأنزيمي لفصل في أوهكس. خلايا الشعر هشة، وتوخي الحذر خاصة في هذه الخطوة. استخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر لنقل الأنسجة والخلايا المنفصلة. نقلت الجزء المعزول من قائد إلى قطره حل كولاجيناز (~ 100 ميليلتر) في طبق بتري لمدة حوالي 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجنب أوقات الهضم الطويلة، التي سوف تضر غشاء الخلية أوهكس. واختير أوهكس يبحث صحية تحت المجهر، لتسجيل التصحيح المشبك. تلف خلايا أي بوادر انكماش، تورم، أو استبعدت إزفاء نواة من التجربة المقبلة. صحية الظهور الانفرادي أوهكس وايكس من السهل التعرف على الفرق المورفولوجية. أوهكس إظهار شكل أسطواني ونسبة قطر محور أكبر، في حين إيكس على شكل قارورة مع الرقبة ضيقة12. تصحيح كامل الخلية المشبك في أوهكس صعب إلى حد ما عن تلك الموجودة في الخلايا العصبية والخلايا الظهارية الأخرى. لنجاح كل خلية التكوين، عادة ما تقع ماصة التصحيح القرب من النواة، أبقى بعيداً عن الغشاء الأفقي العلوي التي تحتوي على كثافة عالية من جزيئات بريستين (الشكل 3A). بعد أن كانت تمزق الغشاء، تم تطبيق بروتوكول حافز جهد موجه جيبية بمعدل اثنين إلى الخلية بغية الحصول على السعة غشاء من أوهكس. بنفس الأسلوب، باستخدام الخطوات الجهد، من الممكن للحصول على كامل الخلية الحالية.
هذا الأسلوب أداة جيدة للتحقيق في الدالة اليكتروموتيليتي من أوهكس في المختبر9،13. ويمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في وظيفة قنوات أيون، وكذلك الخصائص الدوائية من مستقبلات في أوهكس وإيهكس14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل منح من برنامج 973 (2014CB943002) والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (11534013, 31500841).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , Academic Press. Dallas. (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
