Summary
本协议描述的方法, 记录的听觉脑干反应的产后鼠幼崽。为研究外发细胞的功能发育情况, 本文分步介绍了全细胞膜片钳在分离外毛细胞中的实验过程。
Abstract
外毛细胞是哺乳动物耳蜗内两种感觉毛细胞之一。它们通过受体电位改变细胞长度, 放大低电平声信号的弱振动。OHCs 外毛细胞的形态和电生理特性在产后早期发育。外毛细胞的成熟可能有助于听觉系统的发展。然而, OHCs 的发展过程还没有得到很好的研究。这部分是由于难以用电生理方法来测量它们的功能。为了开发一种简单的方法来解决上述问题, 我们在这里描述了一步一步的协议, 以研究 OHCs 在急性离型耳蜗从产后大鼠的功能。通过这种方法, 我们可以对纯色调刺激的耳蜗反应进行评价, 并对 OHCs 中运动蛋白 prestin 的表达水平和功能进行研究。该方法也可用于研究内毛细胞 (IHCs)。
Introduction
耳蜗感觉毛细胞的两个不同功能是哺乳动物听觉的关键: mechanoelectric 转导 (见) 和 electromotility1,2。通过在发束中遇到的通道, IHCs (IHCs) 和 OHCs 将声音振动转换成膜电位的变化, 以及支配螺旋神经节神经元的电信号。OHCs 改变其细胞长度与膜电位, 放大低电平声音的振动。这种活动称为 electromotility 是由位于 OHCs3侧壁的运动蛋白 prestin 所衍生。
在许多物种中, 包括啮齿类动物, 听觉功能是不成熟的早期出生的时代4,5。在听觉皮层中, 在听觉皮质上没有任何动作电位可以检测到声音信号6,7。耳蜗的形态学和功能的发展已被广泛研究的老鼠, 沙鼠, 鼠4,5,8。毛发细胞的 mechanotransduction 和 electromotility 也在早期生命世纪的5中发展起来。
为评价大鼠不同出生年龄的听觉敏感性, 研制了一种听觉脑干反应 (ABR) 记录方法。全细胞贴片钳是研究 OHCs electrophysiologically 的理想技术。然而, 与神经元和其他上皮细胞中的膜片钳相比, 全细胞封闭率低, 限制了孤立 OHCs electromotility 的调查。
在这里, 我们描述了一个程序, 以调查 OHCs 的形态和 electrophysiologically 在急性分离的耳蜗从产后大鼠。该方法可对调节内毛细胞发育和功能的分子机制进行改进。
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Protocol
所有涉及动物学科的实验性协议均由南方医科大学动物伦理委员会批准。
1. 准备实验解决方案
- 准备麻醉剂 (参见材料表): 1.5% 戊巴比妥钠溶解在 ddH2O。
- 准备解剖解决方案 (参见材料表): 在 ddH2的1升中溶解一袋 Leiboviz 的 L-15 粉, o 将 pH 值调整为 7.3, 用1米氢氧化钠。使用前使用 osmometer 和 10 mM HEPES 将渗透调整为 300-330 mOsm。
- 溶出2毫克/毫升胶原酶 IV (参见材料表) 在步骤1.2 中制备的解剖溶液中。
- 准备染色解决方案 (参见材料表): 将4% 多聚甲醛溶解在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。
注意: 多聚甲醛有毒;穿戴适当的保护。 - 稀释0.3% 渗透剂在 PBS。将 PBS 中的10% 正常山羊血清稀释为阻塞缓冲液。在阻塞缓冲器中稀释 prestin 抗体1:200。在阻塞缓冲器中稀释 Alexa488-conjugated 抗体1:600。在 PBS 中稀释罗丹明-四甲基罗丹明 B 异硫氰酸酯1:200。
- 准备胞外溶液 (参见材料表): 准备 Leiboviz 的 L-15 介质, 如上文所述 (步骤 1.2)。
- 准备细胞内溶液 (参见材料表)。
2. ABR 记录
注意: 以前的研究9中已经详细描述了 ABR 记录。
- 麻醉大 (SD) 大鼠 (1-14 天的老幼崽和2月大的成年人, 两性) 与单一注射1.5% 戊巴比妥钠 (22 毫克/千克为幼崽和30毫克/公斤成人, 腹腔 (ip))。
- 将麻醉动物放入聚乙烯泡沫霉菌中, 使动物的身体固定。将动物放在隔音室的防振台上。用暖气垫把动物的体温保持在37.5 摄氏度。
- 用 70% (卷/卷) 乙醇擦拭头部区域。使用细剪刀, 使1-2 毫米切口延髓到外部耳廓放置参考电极或地面。真皮下针电极 (记录电极) 位于头骨顶点 (图 1A)。
- 使用函数发生器, 产生校准的音调爆发 (1 毫秒上升/下降, 3 ms 高原) 的各种频率 (2, 4, 8, 16, 24, 和32赫) 和强度 (从85分贝到10分贝在 5 db 步骤)。手动或使用计算机改变频率和振幅。通过一个位于10厘米处的静电扬声器向动物头部传递声音刺激。
- 过滤器 (100-1, 000 Hz), 放大和平均 (256 倍) 的声音产生的潜力使用多功能处理器获得 ABRs。ABR 跟踪被在线监视并存储以进行离线分析。从一个动物那里完成 ABR 记录需要大约40分钟。
注: 通常, 三到七峰 (波 I 到波 VII) 的潜伏期小于15毫秒, 可以识别 (图 1B)。ABR 阈值定义为可以检测到波 I 和 II 的最小声级。 - 弄死在动物醒之前从麻醉 (与腹腔注射0.3 毫升1.5% 戊巴比妥钠)。
3. Corti (OC) 解剖机构
- 麻醉鼠崽。对于不到6天的老鼠 (< P6), 将动物放在100毫米的培养皿中, 用冰覆盖盘子10分钟。对于老鼠 > P6, 麻醉的动物与单一注射1.5% 戊巴比妥钠 (22 毫克/千克, ip)。麻醉后斩首鼠幼崽。
- 用 70% (卷/卷) 乙醇喷雾消毒头部。
- 用剪刀将头骨沿矢状中线打开;去掉大脑, 露出内耳。
- 把内耳转成一个35毫米的培养皿, 里面装满3毫升冰冷的 L-15 (图 2A)。
- 在解剖显微镜下, 使用细钳去除耳蜗骨胶囊 (图 2B)。
- 从蜗轴中打开 OC 和相关的纹耳蜗 (SV)。
- 通过将 sv 的基底部分与镊子保持在一起, 完全通过从基到顶点 (图 2C) 慢慢展开来将 OC 与 SV 分开。
- 使用细剪刀将 OC 均匀地切成三块 (图 2D)。
4. 免疫荧光染色
- 通过使用200µL 吸管尖端, 将 OC (步骤 3.8) 的段转移到玻璃滑块上, 然后用100µL 4% 多聚甲醛, 在4摄氏度上修复至少4小时。
注意: 多聚甲醛有毒;穿戴适当的保护。 - 用100µL 的新鲜 PBS 取代多聚甲醛来冲洗组织。把纸巾洗三次, 10 分钟。
- 室温下在 PBS 中用0.3% 通透剂孵化组织, 室温30分钟。
- 在 pbs 中丢弃渗透剂, 用 pbs 清洗组织三次。
- 在室温下, 在 PBS 中用10% 正常山羊血清阻断1小时。
- 在室温或4摄氏度时, 用抗 prestin-C 终点抗体 (1:200) 在2小时的阻塞溶液中孵化。
- 用 PBS 洗三次, 5 分钟。
- 用 Alexa488-conjugated 次生抗体 (1:600) 在室温下的1小时的阻塞溶液中孵化。
- 在黑暗中用 PBS 洗三次, 5 分钟。
- 用罗丹明-罗丹明 (1:200) 在室温下在黑暗中孵育10分钟。
- 在黑暗中用 PBS 洗三次, 5 分钟。
- 安装在带有安装介质的玻璃滑梯上 (含 DAPI)。使用 405 nm、488 nm 和 594 nm 激光的共焦显微图像。将激光功率设置为 0.1-0.5 兆瓦, 扫描速度为0.5 帧/秒。
5. 隔离 OHCs 的膜片钳记录
- 使用吸管拉拔和微伪造器, 使修补吸管与尖端直径2-3 µm. 背部填充吸管细胞内的溶液。通常, 在浴缸溶液中, 贴片吸管的初始电阻为 2.5-3.5 MΩ。
- 通过使用200µL 吸管尖端, 将 OC 的一块 (从步骤 3.8) 转移到35毫米培养皿中。用100µL 酶消化培养基 (胶原酶 IV, 参见材料表) 在室温下5分钟消化组织。
- 用100µL 的 L-15 取代酶消化培养基。用微型手术刀将组织切成小块, 以隔离毛发细胞。
- 经过温和的吹打, 将细胞转移到自制的小塑料室 (直径 ~ 1.5 厘米), 填充无酶浴溶液 (~ 1.5 毫升, 见材料表)。
- 把房间放在倒置显微镜的舞台上。找到健康出现的孤独 OHCs。
- 将贴片吸管加载到700B 放大器的头部阶段。小心地移动机器人, 并将其定位在外发单元格的底部 (图 3A)。
- 全细胞贴片通过封闭细胞体的外侧壁来夹紧 OHC。应用轻吸, 直到细胞膜破裂。设置保持电位在-70 mV。具有接触阻力的细胞从10到 17 MΩ, 膜阻力范围从100到 500 MΩ, 被认为是一个成功的全细胞构型。
- 使用计算机控制, 应用极化和去极化型电压 (250 毫秒的持续时间和范围从−140到 +94 mv 在 13 mv 步骤) 到细胞, 以引出全细胞电流。
- 放大整个细胞电流, 过滤器 (5 赫的角频率) 由700B 放大器。将数据转换为1440A 转换器并存储为离线分析。
- 用膜片钳软件控制的两个正弦波电压刺激协议测量 OHCs 的膜电容。将刺激电压范围设置为-140 到 110 mV。存储数据以进行离线分析。
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Representative Results
ABR 可以从7岁以上的麻醉鼠幼崽 (P7) 使用纯音调爆发 (图 1A) 中诱发。如图 1B所示, 从鼠幼崽获得的 ABR 波形仅显示三到四个小振幅的不同波。通常在成年动物的 ABR 波形中观察到七峰值 (图 1B)。
对于以下染色和电生理测量, 大鼠内耳从颞骨进行了新的解剖。我们显示了组织解剖的连续步骤, 以隔离 OC 与 SV 和蜗轴 (图2A-2C).该 OC 被切成三块, 用微剪刀均匀 (图 2D)。为了显示毛细胞的形态学, 这些片段被罗丹明、prestin 抗体和 DAPI (图 2E) 染色。毛发束 (红色) 表示毛细胞的顶端表面, 而 OHCs 的细胞体则由 prestin (绿色) 标记。细胞核被标记为 DAPI (蓝色), 位于 IHCs 和 OHCs 的底部区域。如图 2E所示, 在 P5 的耳蜗 OHCs 中未检测到 prestin。Prestin 第一次观察在 P7 的 OHCs 位于基底耳蜗。
经过温和消化后, OHCs 与 OC (图 3A) 隔离。全细胞电压钳记录是从 OHCs 从大鼠耳蜗敏锐地分离出来的。图 3B中显示了从独立的 P9 OHC 中记录的全细胞电流的代表性示例, 该实例反映了从−140到 +107 mV 的膜电位的变化。请注意 I-V 曲线的 N 形区域, 指示存在 KCa电流, 这是 OHCs 的唯一响应。在膜电压驱动下, 胞内 Cl-与 prestin 相结合, 在全细胞膜片钳模式下出现作为非线性膜电容 (NLC) 的变化。成熟 OHC 的典型 NLC 是以钟形依赖性膜电位为特征的。NLC 可配以两态玻尔兹曼函数, 可反映 OHCs 的 electromotility 功能。本文介绍了电容拟合的玻尔兹曼函数:
方程和参数在前面的文章9中进行了描述。图 3C中显示了两个具有代表性的 NLCs。
图1。听觉脑干反应记录.(A) 记录电极插入到头皮之间的两个耳朵之间。接地和参考电极分别放在左、右耳廓下。一个开放的现场扬声器被放置在10厘米以外的大鼠鼻尖。(B) 两个代表的 ABR 波形, 响应16赫, 80 分贝的 SPL 音爆发。从 P8 的小狗身上记录的上部痕迹。从成年鼠身上记录下来的底部痕迹。数字表示波形的不同峰值。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。器官的 Corti 解剖.(A) 从 P9 鼠幼犬解剖的内耳。耳蜗和前庭区域显示。(B) 切除骨壁后, 耳蜗的结构暴露。(C) 从蜗轴中分离出了 Corti (OC) 和纹耳蜗 (SV) 的器官。(D) 将 Corti 的器官平均切割成三块。D 中的刻度条表示1000µm. (E) 共焦图像显示了沿耳蜗的不同段 (基底、中部和顶端) 的毛细胞。罗丹明-罗丹明 (红色) 代表毛发束位于毛细胞顶端表面。DAPI (蓝色) 代表头发细胞中下部的细胞核。prestin (标记为绿色) 仅表达在外毛细胞的侧壁上。对于 P7 中、基底段, 只有绿色通道显示 prestin 在 OHCs 中的表达。缩放栏代表20µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图3。全细胞膜片钳记录分离的外毛细胞.(A) 隔离的外层毛发细胞以全细胞模式密封。缩放栏代表10µm. (B) 从 P9 外毛细胞记录的具有代表性的一 V 曲线。(C) 从不同年龄的两个外毛细胞获得的非线性膜电容 (NLC)。电容-电压响应 (开放圈) 安装在玻尔兹曼函数 (显示为粗线)。NLC 对相应的线性电容 (杂志) 进行了规范化。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在11岁以下的老鼠中, 听觉皮层可能没有反应出对声音刺激的动作电位6,7。因此, 后天11被描述为 "听觉发作"10。听力发病前听力功能的发展尚未得到很好的研究。使用类似的方法, 成人 ABR 记录, 我们证明, ABRs 可以引起的纯音调爆裂的鼠幼崽比 P11 (图 1)。然而, 从大鼠幼崽获得的 ABR 波形显示出与成年动物不同的特征。ABR 响应幅度小, 阈值相对较高。这一结果意味着开发的听觉系统对声音信号的灵敏度较低。在大鼠幼崽的 ABR 波形中观察到显著差异。通常, 在成年 ABR 波形9中观察到七个峰值。不同潜伏期的峰值由不同的脑干核沿听觉通路11产生。我们的结果表明, 只有 I IV 波在 ABR 中检测到的鼠幼崽 (图 1B)。波浪 I 和 II 代表反应从耳蜗和听觉神经11。因此, 研究结果表明, 在发育过程中, 较高水平的听觉细胞核未能对声学刺激反应。这些数据表明, 耳蜗达到功能成熟早于中央听觉系统。我们这里描述的方法对于研究调节耳蜗发育和毛细胞功能的分子机制是很重要的。
对于进一步的实验, 包括染色、西方印迹和电生理测量, 对 OC 进行高质量的解剖是至关重要的。这些实验已经使用成年 SD 大鼠和大鼠幼崽在1和14天的年龄。大鼠幼崽是理想的细解剖, 因为耳蜗骨是软的, 可以很容易地清除钳, 而不损害 OC。对于成年大鼠, 需要特别小心, 以避免破裂的 OC, 而删除硬骨胶囊。通过使用细钳, 可以从蜗轴中解除 OC 和相关 SV。分离的 OC 和 SV 具有不同的纹理 (图 2C)。对于大鼠幼崽, OC 可以切成三段, 长度为800-1200 µm。请注意, 所有步骤应尽可能快地在冰冷的 L-15 中进行, 以尽量减少降解和组织恶化。
OC 的孤立段是染色、西方印迹和 RNA 分析的良好准备。在这里, 我们展示了染色的感官毛细胞的形态学。OHCs 在它们的顶端表面有毛发束, 而原子核则有它们位于基部的12。运动蛋白 prestin 在 OHCs 的侧膜上表达。共焦成像数据表明, prestin 首先在 P6-P7 上表达, 并显示下一周的持续增加 (图 2E)。在进一步的实验中, 采用西方印迹法和 q PCR 法对 prestin 在发育过程中观察到的表达水平变化进行量化 (未显示数据)。因为毛细胞是 OC 中的少数, 所以在单个实验中建议6到10耳蜗, 以达到强健的信号。
对于 OHCs 的膜片钳记录, 进行了轻度酶消化, 以分离 OHCs。毛细胞是脆弱的, 这一步需要特别小心。使用200µL 吸管尖端转移组织和分离的细胞。在室温下, 在培养皿中, OC 的分离段被转移到一滴胶原酶溶液 (约100µL) 中, 约为5分钟。避免长时间的消化, 这会破坏 OHCs 的细胞膜。在显微镜下, 选择了健康的前瞻 OHCs 的补丁钳录音。细胞显示任何收缩, 肿胀, 损伤, 或转移细胞核的迹象被排除在下一个实验。健康出现的孤立 OHCs 和 IHCs 是容易识别的形态差异。OHCs 显示一个圆柱形和一个较大的轴径比, 而 IHCs 是烧瓶形与紧颈部12。OHCs 的全细胞膜片钳在神经元和其他上皮细胞中有些困难。对于成功的全细胞配置, 贴片吸管通常位于细胞核附近, 远离含有高密度 prestin 颗粒的上侧膜 (图 3A)。膜破裂后, 为了获得 OHCs 的膜电容, 将两种正弦波电压刺激协议应用于该细胞。采用同样的技术, 通过使用电压步骤, 可以引出全电池电流。
此方法是调查 OHCs体外9、13electromotility 功能的好工具。该方法还可用于研究离子通道的功能, 以及 OHCs 和 IHCs14中受体的药理性质。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了973计划 (2014CB943002) 和中国国家自然科学基金 (11534013, 31500841) 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , Academic Press. Dallas. (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
