Summary
Dit protocol wordt beschreven methoden om vast te leggen van de auditieve brainstem response van postnatale rat pups. Om te onderzoeken de functionele ontwikkeling van buitenste haarcellen, is de experimentele procedure van geheel-cel patch klem opnemen in geïsoleerde buitenste haarcellen stapsgewijze beschreven.
Abstract
De buitenste Haarcel is één van de twee soorten zintuiglijke haarcellen in het slakkenhuis van zoogdieren. Ze veranderen de lengte van hun cellen met de receptor potentieel aan het vergroten van de zwakke trilling van low-level geluidssignaal. De morfologie en elektrofysiologische eigenschap van de buitenste haarcellen (OHCs) ontwikkelen in vroege postnatale leeftijden. De rijping van buitenste Haarcel kan bijdragen aan de ontwikkeling van het auditieve systeem. Het proces van OHCs ontwikkeling is echter niet goed bestudeerd. Dit is deels vanwege de moeilijkheid om het meten van hun functie door een elektrofysiologische aanpak. Met als doel het ontwikkelen van een eenvoudige methode om de bovengenoemde kwestie, beschrijven hier we een stapsgewijze protocol om te bestuderen van de functie van OHCs in acuut gedissocieerde slakkenhuis van postnatale ratten. Met deze methode kunnen we evalueren de cochleair reactie op zuivere Toon stimuli en onderzoeken of het niveau van expressie en functie van de motor eiwit-prestin in OHCs. Deze methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van de binnenste haarcellen (IHCs).
Introduction
Twee afzonderlijke functies van cochleair zintuiglijke haarcellen zijn essentieel voor zoogdieren hoorzitting: mechanoelectric transductie (BMO) en electromotility1,2. Door BMO kanalen bevindt zich in de haar bundel, IHCs (IHCs) en OHCs converteren geluid trillingen in membraan potentiële wijzigingen, alsmede de elektrische signalen van bezenuwde spiraalvormige ganglion neuronen. OHCs wijzigen van de lengte van hun cellen met de membraanpotentiaal en versterken de trillingen van laag niveau geluid. Deze activiteit genoemd electromotility is afgeleid van de prestin van de motor eiwit gelegen in de laterale wand van OHCs3.
In vele soorten, met inbegrip van knaagdieren, is het gehoor onvolwassen in vroege postnatale epoch4,5. Geen actiepotentiaal in reactie op sound '-signalen kunnen worden opgespoord in de auditieve cortex vóór de hoorzitting begin6,7. Ontwikkeling van de morfologie en functie van het slakkenhuis is veel onderzocht in gerbil, muis en rat4,5,8. De mechanotransduction en de electromotility van haarcellen worden ook ontwikkeld in de vroege leven epoch5.
Om te evalueren van de gevoeligheid van de hoorzitting van ratten op verschillende postnatale leeftijden, hebben we een methode voor auditieve brainstem response (ABR) opname in rat pups ontwikkeld. Geheel-cel patch klem is een ideale technologie te onderzoeken van de OHCs electrophysiologically. Echter, vergeleken met de patch klem uitgevoerd in neuronen en andere epitheliale cellen, het lage tarief van geheel-cel afdichting beperkt het onderzoek van electromotility van geïsoleerde OHCs.
Hier beschrijven we een procedure voor het onderzoek naar de OHCs morfologisch en electrophysiologically in acuut gedissocieerde slakkenhuis van postnatale ratten. Deze methode kan worden aangepast voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die binnenste Haarcel ontwikkeling en functie regelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen met betrekking tot dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de ethische commissie van het dier van de zuidelijke medische universiteit.
1. Prepareer oplossingen experimenten
- Voorbereiden van de verdoving (Zie Tabel van materialen): 1,5% pentobarbital natrium opgelost in ddH2O.
- Bereid de dissectie-oplossing (Zie Tabel van materialen): Los een tas van Leiboviz van L-15 poeder in 1 L van ddH2O. Adjust pH ten slotte op 7.3 met 1 M NaOH. Osmolariteit naar 300-330 mOsm aanpassen met behulp van een osmometer en 10 mM HEPES vóór gebruik.
- Ontbinden van 2 mg/mL collagenase IV (Zie Tabel van materialen) in dissectie oplossing bereid in stap 1.2.
- Bereiden van de oplossingen van immunokleuring (Zie Tabel van materialen): Los de 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
Let op: Paraformaldehyde is giftig; Draag passende bescherming. - Verdun de 0,3% permeabiliteit agent in PBS. Verdun het serum 10% normale geit in PBS als de buffer met blokkerend. Verdun de prestin antilichaam 1:200 in de blokkeerbuffer. Verdun de 1:600 van de Alexa488-geconjugeerde antilichaam in blokkeerbuffer. Verdun de Phalloidin-Tetramethylrhodamine-B-isothiocyanaat 1:200 in PBS.
- Bereid de extracellulaire oplossing (Zie Tabel van materialen): voorbereiden van de Leiboviz L-15 medium zoals hierboven (stap 1.2) beschreven.
- Bereid de intracellulaire oplossing (Zie Tabel van materialen).
2. ABR opname
Opmerking: ABR opname heeft al eerder in detail beschreven in onze eerdere studie9.
- Anesthetize Sprague-Dawley (SD) ratten (1-14 dag oud pups en 2 - maand oude volwassenen, beide geslachten) met een enkele injectie van 1,5% natrium pentobarbital (22 mg/kg voor pups en 30 mg/kg voor volwassenen, intraperitoneaal (i.p.)).
- Plaats de narcose dier in een POLYETHYLEENSCHUIM mal te immobiliseren lichaam van het dier. Plaats het dier op de tafel van een anti-trillingen in een kamer met geluid-verzachtende. Houd het dier de lichaamstemperatuur bij 37,5 ° C met een verwarming pad.
- Veeg het hoofd gebied met ethanol 70% (vol/vol). Met behulp van een fijne schaar, maken de insnijding van een 1-2 mm ventrolateral de externe pinna de referentie-elektrode of de grond te plaatsen. Een onderhuidse naald elektrode (opname elektrode) is gelegen op het hoekpunt van de schedel (figuur 1A).
- Met behulp van de functiegenerator, genereren gekalibreerde Toon uitbarstingen (1 ms stijging/daling, 3 ms plateau) van verschillende frequenties (2, 4, 8, 16, 24 en 32 kHz) en intensiteiten (daalde van 85 tot 10 dB SPL in stap 5 dB). Variëren de frequentie en amplitude handmatig of met behulp van een computer. Leveren goede stimuli via een elektrostatische luidspreker gelegen 10 cm weg richting het hoofd van het dier.
- Filteren (100-1000 Hz), versterken en gemiddelde (256 keer) het geluid elicited potentieel met behulp van een multi-functioneel processor om de ABR's. De ABR sporen wordt gecontroleerd online en opgeslagen voor off line analyse. Het duurt ongeveer 40 minuten te voltooien de ABR opnemen van het ene dier.
Opmerking: Meestal drie tot zeven toppen (Golf ik aan Golf VII) met latencies minder dan 15 ms kan worden geïdentificeerd (figuur 1B). De ABR drempel wordt gedefinieerd als het minimum geluidsniveau welke Golf I en II kunnen worden gedetecteerd. - Voordat de dieren wakker uit narcose (met een intraperitoneale injectie van 0.3 mL 1,5% natrium pentobarbital) euthanaseren.
3. het orgaan van Corti (OC) dissectie
- Anesthetize rat pups. Voor ratten minder dan 6 dagen oud (< P6), houd het dier in een schotel van 100 mm cultuur en dekking van de schotel met ijs gedurende 10 minuten. Voor ratten > P6, anesthetize het dier met een enkele injectie van 1,5% natrium pentobarbital (22 mg/kg, i.p.). Decapitate de rat pups na narcose.
- Steriliseren het hoofd door te besproeien met 70% (vol/vol) ethanol.
- Open de schedel langs de Sagittaal middellijn met een schaar; Verwijder de hersenen om het binnenoor bloot te stellen.
- Breng het binnenoor in een 35-mm petrischaal gevuld met 3 mL ijskoud L-15 (figuur 2A).
- Gebruik onder de Microscoop dissectie, fijne pincet te verwijderen van de benige capsule van het slakkenhuis (figuur 2B).
- Uitpakken van de OC en bijbehorende stria vascularis (SV) van de modiolus.
- Door te houden het basale gedeelte van de SV met pincet, scheiden de OC vanaf de SV volledig tot rust te komen langzaam van base-naar-apex (figuur 2C).
- De OC gelijkmatig in drieën gesneden met behulp van fijn schaar (figuur 2D).
4. immunofluorescentie kleuring
- Met behulp van een 200 µL pipette uiteinde, overdracht van de segmenten van OC (stap 3.8) op een glasplaatje en repareren met 100 µL van 4% paraformaldehyde gedurende ten minste 4 uur bij 4 ° C.
Let op: Paraformaldehyde is giftig; Draag passende bescherming. - Het wassen van het weefsel door verdringt de paraformaldehyde met 100 µL van verse PBS. Het wassen van het weefsel drie keer, gedurende 10 min.
- Het weefsel met 0,3% permeabiliteit agent in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Negeren van de permeabiliteit agent in PBS en wassen van het weefsel driemaal met PBS.
- Blok met 10% serum van de normale geit in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer met anti-prestin-C-terminus antilichaam (1:200) in het blokkeren van de oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C's nachts.
- Spoel driemaal met PBS voor 5 min.
- Incubeer met Alexa488-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:600) in blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Spoel driemaal met PBS gedurende 5 min. in het donker.
- Incubeer met rhodamine-phalloidin (1:200) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Spoel driemaal met PBS gedurende 5 min. in het donker.
- Monteren op een glasplaatje met montage medium (dat DAPI). Afbeelding met confocale microscopie met behulp van 405 nm, 488 nm, en 594 nm lasers. De kracht van de laser vastgesteldop 0,1-0,5 mW en de scan snelheid op 0.5 frame/s.
5. Patch klem opname van geïsoleerde OHCs
- Gebruik de pipet trekker en micro-vervalser om patch pipettes met een diameter van tip 2-3 µm. Back-fill de pipetten met intracellulaire oplossing. Meestal was het aanvankelijke verzet van patch Pipetteer 2.5-3.5 MΩ in Bad oplossing.
- Pipetteer een stuk van de OC (uit stap 3.8) in een 35 mm petrischaal met behulp van een 200 µL Pipetteer tip. Het verteren van het weefsel met 100 µL van enzymatische spijsvertering medium (collagenase IV, Zie Tabel van materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verplaats de enzymatische spijsvertering medium met 100 µL van L-15. Snijd het weefsel in kleine stukjes met behulp van een micro scalpel te isoleren van de haarcellen.
- Na de zachte pipetteren, breng de cellen in een zelfgemaakte kleine kunststof kamer (diameter ~ 1,5 cm) gevuld met enzym-gratis Bad oplossing (~ 1,5 mL, Zie Tabel van materialen).
- Plaats de zaal op het toneel van een omgekeerde Microscoop. De gezonde-verschijnende eenzame OHCs vinden.
- Laad de patch pipet in de hoofd fase van een 700B versterker. Verplaatsen van de patch pipet zorgvuldig door een micromanipulator en plaats het rond de onderkant van het buitenste Haarcel (figuur 3A).
- Geheel-cel patch klem de Kopklep door het afdichten van de laterale wand van de cel lichaam. Lichte afzuigen totdat het celmembraan is gescheurd. Vastgesteldop hetbedrijf potentiële-70 mV. Cellen met toegang weerstand varieerden van 10 tot 17 MΩ en membraan weerstand varieerde van 100 tot 500 MΩ, en worden beschouwd als een succesvolle configuratie van geheel-cel.
- Met behulp van computer control, toepassing hyperpolarizing en depolarizing van de spanning (250 ms duur en variërend van −140 tot +94 mV in 13 stappen van de mV) naar de cel te ontlokken geheel-cel stromingen.
- Versterken van de gehele-cel stromingen, (hoek frequentie van 5 kHz) filteren met een 700B versterker. De gegevens door een 1440A converter en het petto voor off line analyse converteren.
- Het meten van de capaciteit van de membraan van OHCs met een twee sinusvormige spanning stimulans protocol gecontroleerd door een klem van de Patchsoftware. Instellen van de stimuleren spanningsbereik van-140 tot 110 mV. Opslaan van de gegevens voor off line analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR kunt ontlokte worden uit narcose rat pups ouder dan postnatale dag 7 (P7) met behulp van zuivere toon uitbarstingen (figuur 1A). Zoals blijkt uit figuur 1B, verkregen de ABR golfvormen rat pups bleek slechts drie tot vier verschillende golven met een kleine amplitude. Meestal werden tot zeven pieken waargenomen in de ABR-golfvormen van volwassen dieren (figuur 1B).
Voor de volgende immunokleuring en elektrofysiologische meting, was rat binnenoor vers van de temporale-bot ontleed. We tonen de opeenvolgende stappen van weefsel dissectie te isoleren van de OC van SV en de modiolus (figuur 2A-2 C). De OC werd gesneden in drie stukken gelijkmatig met een micro-schaar (figuur 2D). Als u wilt weergeven van de morfologie van de haarcellen, waren de segmenten gekleurd met phalloidin prestin antilichaam en DAPI (figuur 2E). De haar bundels (in rood) geven het apicale oppervlak van haarcellen, overwegende dat de cel lichaam van de OHCs werd gekenmerkt door de prestin (in groen). De kern is het label van de DAPI (in blauw) gelegen in de regio van de onderkant van de IHCs en de OHCs. Zoals blijkt uit figuur 2E, werd geen prestin ontdekt in de OHCs van slakkenhuis op P5. Prestin werd voor het eerst waargenomen op P7 in OHCs gelegen in het basale slakkenhuis.
Na de vertering van het zachte werden de OHCs geïsoleerd van de OC (figuur 3A). Geheel-cel spanning-clamp opnames werden uitgevoerd van OHCs acuut geïsoleerd van het slakkenhuis rat. Een representatief exemplaar van de huidige geheel-cel opgenomen van een geïsoleerde P9 Kopklep in reactie op de membraanpotentiaal veranderd van −140 naar +107 mV wordt weergegeven in figuur 3B. Let op: de regio van de N-vorm van de curve-V, met vermelding van de aanwezigheid van KCa huidige die een unieke reactie van OHCs is. Gedreven door de membraan-spanning, de intracellulaire Cl- in combinatie met de prestin, wordt weergegeven als een niet-lineaire membraan capaciteit (NLC) verandert onder geheel-cel patch klem modus. De typische NLC van een volwassen Kopklep wordt gekenmerkt door klokvormige afhankelijkheid van de membraanpotentiaal. De NLC kan worden uitgerust met een tweestaten-Boltzmann-functie en de functie van de electromotility van OHCs kan weerspiegelen. De functie van Boltzmann voor precisiecapaciteit montage wordt beschreven als:
De vergelijking en de parameters werden beschreven in onze eerdere papier9. Twee vertegenwoordiger NLCs worden weergegeven in Figuur 3 c.
Figuur 1. Auditieve brainstem response opname. (A) de opname elektrode is ingevoegd in de hoofdhuid tussen twee oren. Grond en referentie-elektroden werden onder de linker en rechter pinna, respectievelijk geplaatst. Een open veld luidspreker werd 10 cm afstand van de nasale tip van de rat. (B) twee representatieve ABR golfvormen in reactie op 16 kHz, 80 dB SPL Toon uitbarstingen. Bovenste spoor opgenomen van een pup P8. Onder trace opgenomen van een volwassen ratten. De aantallen wijzen op de verschillende toppen van golfvormen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Het orgaan van Corti dissectie. (A) het binnenoor ontleed van P9 rat pup. Het slakkenhuis en vestibulaire regio worden getoond. (B) de structuur van het slakkenhuis werd blootgesteld na verwijdering van de benige wand. (C) het orgaan van Corti (OC) en stria vascularis (SV) werden geïsoleerd van de modiolus. (D) is het orgaan van Corti in drieën gelijkmatig gesneden. Schaal staven in A-D 1000 µm. (E) Confocal beelden Toon de haarcellen gelegen in verschillende segmenten (basale, middelste en apicaal) langs het slakkenhuis. Rhodamine-phalloidin (rood) vertegenwoordigt de bundels van de haren gelegen op het apicale oppervlak van de haarcellen. DAPI (blauw) vertegenwoordigt de kernen gelegen in het midden-bodemgedeelte van haarcellen. De prestin (gemarkeerd in groen) was alleen kenbaar gemaakt over de laterale wand van de buitenste haarcellen. Voor Midden- en basale segmenten op P7, wordt alleen het groene kanaal weergegeven om te illustreren de uitdrukking van prestin in OHCs. Schaal staaf vertegenwoordigt 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Geheel-cel patch klem opname van geïsoleerde buitenste haarcellen. (A) een geïsoleerde buitenste Haarcel was verzegeld in geheel-cel modus. Schaal staaf vertegenwoordigt 10 µm. (B) A representatieve I-V kromme opgenomen van een P9 buitenste Haarcel. (C) het niet-lineaire membraan capaciteit (NLC) verkregen uit de twee buitenste haarcellen op verschillende leeftijden. De capaciteit-spanning Reacties (open cirkels) werden uitgerust aan de Boltzmann-functie (weergegeven als de dikke lijnen). De NLC waren genormaliseerd naar de corresponderende lineaire capaciteit (Clin). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij ratten jonger dan dag 11, kon geen actiepotentiaal in reactie op geluid stimulatie worden waargenomen in de auditieve cortex6,7. Daarom, postnatale dag 11 wordt beschreven als "hoorzitting begin"10. De ontwikkeling van gehoor voordat hoorzitting begin was niet goed nog onderzocht. Met de soortgelijke methode voor volwassen ABR opname, we laten zien dat de ABR's kunnen worden ontlokte door zuivere Toon burst van rat pups jonger dan P11 (Figuur 1). De ABR golfvormen verkregen rat pups toonde echter enkele verschillende functies van die van volwassen dieren. De ABR reacties zijn klein in amplitude met relatief hoge drempels. Dit resultaat betekent dat het ontwikkelen van de auditieve systeem lage gevoeligheid voor sound '-signalen. Significant verschil werd waargenomen in de ABR golfvormen opgenomen van rat pups. Meestal werden tot zeven pieken waargenomen in volwassen ABR golfvormen9. Deze pieken met verschillende latentie worden gegenereerd door verschillende hersenstam kernen langs de auditieve traject11. Onze resultaten wijzen erop dat alleen de-IV golven in ABR van rat pups (figuur 1B) worden opgespoord waren. De golven I en II vertegenwoordigen de reacties van het slakkenhuis en de gehoorzenuw11. Dus de resultaten wijzen erop dat het hoger niveau auditieve kernen niet gereageerd op akoestische stimuli tijdens de ontwikkeling. Deze gegevens blijkt dat slakkenhuis reach functionele looptijd eerder dan het centrale auditieve systeem. De methode die we hier beschrijven is belangrijk voor de studie van moleculaire mechanismen die slakkenhuis ontwikkeling en haar cel functie regelen.
Hoge kwaliteit dissectie van de OC is essentieel voor verdere experimenten met inbegrip van immunokleuring, Western blotting en elektrofysiologische meting. Deze experimenten zijn uitgevoerd met behulp van volwassen SD ratten en rat pups tussen 1 en 14 dagen oud. Rat pups zijn ideaal voor fijne dissectie omdat het cochleair bot zacht is en kan gemakkelijk verwijderd worden door pincet zonder beschadiging van de OC. Voor volwassen ratten is bepaalde terughoudendheid geboden om te voorkomen dat de OC tijdens het verwijderen van de harde-benige capsule bezwijken. Met behulp van fijne pincet, kan de OC en de bijbehorende SV worden getild vanaf de modiolus. De gescheiden OC en SV hebben verschillende textuur (figuur 2C). Voor rat pups, kon de OC worden verdeeld in drie segmenten met een lengte van 800-1200 µm. Houd er rekening mee dat alle stappen moeten worden uitgevoerd in ijskoude L-15 zo snel mogelijk om te minimaliseren van afbraak- en verslechtering van het weefsel.
Geïsoleerde segmenten van de OC zijn goede voorbereidingen voor immunokleuring, Western blotting en RNA analyse. Hier laten we de morfologie van sensorische haarcellen in OC door immunokleuring. OHCs hebben haar bundels op hun apicale oppervlak terwijl de nucleus hen heeft gelegen basally12. De motor eiwit-prestin wordt uitgedrukt op de laterale membraan van OHCs. De confocal imaging gegevens aangegeven dat de prestin op de eerst was uitgedrukt op P6-P7 en een voortdurende stijging ten opzichte van de volgende week (2E figuur toonde). In verdere experimenten, werden westelijke bevlekken en q-PCR uitgevoerd om te kwantificeren van de waargenomen expressie niveau veranderingen van prestin tijdens de ontwikkeling (gegevens niet worden weergegeven). Omdat de haarcellen de minderheid in de OC zijn, worden 6 tot en met 10 cochleae aanbevolen in een enkele experiment om robuuste signalen.
Voor patch klem opnames van OHCs, werd milde enzymatische spijsvertering uitgevoerd om te scheiden van de OHCs. De haarcellen zijn kwetsbaar, en bijzondere voorzichtigheid in deze stap is verplicht. Gebruik een 200 µL Pipetteer tip om over te brengen van de weefsels en cellen gescheiden. De geïsoleerde segment van OC werd overgedragen aan een daling van collagenase oplossing (~ 100 µL) in een petrischaal voor ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur. Vermijd lange spijsvertering tijden, die schade aan de celmembraan van OHCs toebrengen zal. Onder de Microscoop, werden gezond ogende OHCs geselecteerd voor de opname van de klem patch. Cellen die tekenen van krimp, zwelling, schade, of translocatie van de kern van volgende experiment werden uitgesloten. Gezonde verschijnen eenzame OHCs en IHCs zijn gemakkelijk te herkennen door hun morfologische verschil. OHCs Toon een cilindrische vorm en een grotere as-diameter verhouding, overwegende dat IHCs kolf-vormig met een strakke nek12. Geheel-cel patch klem in OHCs is enigszins moeilijk uit die in neuronen en andere epitheliale cellen. Voor succesvolle geheel-cel configuratie lag de patch pipet meestal in de buurt van de kern, bleef uit de buurt van de bovenste laterale membraan met een hoge dichtheid van prestin deeltjes (figuur 3A). Nadat het membraan was gescheurd, werd een twee-sinusvormige spanning stimulans protocol toegepast op de cel met het oog op de capaciteit van de membraan van OHCs. Met dezelfde techniek, is met behulp van de stappen van de spanning, het mogelijk om ontlokken geheel-cel huidige.
Deze methode is een goed hulpmiddel om de functie van de electromotility van OHCs in vitro9,13te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt om de onderzoeken van de functie van ionenkanalen, evenals de farmacologische eigenschappen van receptoren in OHCs en IHCs14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van het 973 programma (2014CB943002) en de nationale Natural Science Foundation van China (11534013, 31500841).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , Academic Press. Dallas. (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
