Summary
Ce protocole décrit les méthodes pour enregistrer la réponse auditif du tronc cérébral de ratons postnatal. Pour examiner le développement fonctionnel des cellules ciliées externes, la procédure expérimentale de cellules entières patch clamp d’enregistrement en isolé les cellules ciliées externes est décrit étape par étape.
Abstract
Les cellules ciliées externes est l’un des deux types de sensorielle des cellules ciliées de la cochlée mammifères. Ils modifient leur longueur des cellules avec le récepteur potentiel pour amplifier la vibration faible du signal sonore à basse altitude. La morphologie et la propriété électrophysiologique des cellules ciliées externes (contaminants organohalogénés) se développent dans l’âge postnatal précoce. La maturation des cellules ciliées externes peut-être contribuer au développement du système auditif. Toutefois, le processus de développement de contaminants organohalogénés n’est pas bien étudié. C’est en partie à cause de la difficulté à mesurer leur fonction par une approche électrophysiologique. Dans le but de développer une méthode simple pour résoudre le problème ci-dessus, nous décrivons ici un protocole étape par étape pour étudier la fonction des contaminants organohalogénés cochlée aiguë dissociés des rats postnatals. Avec cette méthode, nous pouvons évaluer la cochléaire réponse à des stimuli de sons purs et examiner le niveau d’expression et la fonction de la protéine motrice de prestin en contaminants organohalogénés. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier les cellules ciliées internes (CSI).
Introduction
Deux fonctions distinctes de cellules de cheveux sensoriels cochléaires sont essentielles pour l’audience chez les mammifères : mechanoelectric transduction (MET) et electromotility1,2. Par MET les canaux situés dans le faisceau de cheveux, CSI (CSI) et contaminants organohalogénés convertir les vibrations sonores des changements potentiels de membrane, ainsi que les signaux électriques des neurones du ganglion spiral innervés. Contaminants organohalogénés changent leur longueur avec le potentiel de membrane des cellules et amplifient la vibration du son à basse altitude. Cette activité appelée electromotility est dérivée de la protéine motrice prestin situé dans la paroi latérale des contaminants organohalogénés3.
Chez de nombreuses espèces, y compris les rongeurs, la fonction auditive est immature à l’époque postnatale précoce4,5. Aucun potentiel d’action en réponse aux signaux sonores ne pourraient être détectée dans le cortex auditif avant l’audience début6,7. Développement de la morphologie et le fonctionnement de la cochlée a été largement étudiées en souris, gerbille et rat4,5,8. La mécanotransduction et electromotility des cellules ciliées sont également développées dans la première époque de vie5.
Afin d’évaluer la sensibilité auditive des rats à différents âges postnatals, nous avons développé une méthode de réaction auditif du tronc cérébral (PEATC) enregistrement chez les ratons. Cellule entière patch clamp d’est une technologie idéale pour enquêter sur les contaminants organohalogénés électrophysiologique. Toutefois, le faible taux de cellules entières d’étanchéité en comparaison avec le patch clamp de jouée dans les neurones et autres cellules épithéliales, limité l’enquête d’electromotility des contaminants organohalogénés isolés.
Ici, nous décrivons une procédure pour enquêter sur les contaminants organohalogénés morphologiquement et électrophysiologique dans la cochlée aiguë dissociée des rats postnatals. Cette méthode peut être modifiée afin d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent la fonction et le développement des cellules ciliées internes.
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Protocol
Tous les protocoles expérimentaux avec des sujets animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale du Sud.
1. préparer des Solutions pour des expériences
- Préparer l’anesthésique (voir Table des matières) : 1,5 % pentobarbital sodique dissous dans ddH2O.
- Préparer la solution de dissection (voir Table des matières) : dissoudre un sachet de poudre de L-15 de Leiboviz dans 1 L de ddH2O. ajuster le pH à 7,3 avec 1 NaOH M. Ajuster l’osmolarité à 300-330 mOsm en utilisant un osmomètre et 10 mM HEPES avant utilisation.
- Dissoudre 2 mg/mL collagénase IV (voir Table des matières) dans une solution de dissection préparée à l’étape 1.2.
- Préparer les solutions d’immunomarquage (voir Table des matières) : dissoudre la paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée. - Diluer l’agent de perméabilité de 0,3 % dans du PBS. Diluer le sérum de chèvre normal de 10 % dans du PBS comme le tampon de blocage. Diluer au 1 : 200 prestin anticorps dans un tampon bloquant. Diluer l’anticorps conjugué Alexa488 de 1:600 dans un tampon bloquant. Diluer la phalloïdine-tétraméthylrhodamine B isothiocyanate 1 : 200 en PBS.
- Préparer la solution extracellulaire (voir Table des matières) : préparer le milieu de L-15 de la Leiboviz comme décrit ci-dessus (étape 1.2).
- Préparer la solution intracellulaire (voir Table des matières).
2. ABR enregistrement
NOTE : Enregistrement ABR a été précédemment décrit en détail dans notre précédente étude9.
- Anesthésier des rats Sprague Dawley (SD) (1 à 14 jours de vieux petits et adultes 2 - mois vieux, les deux sexes) avec une seule injection de 1,5 % sodium pentobarbital (22 mg/kg pour les petits et 30 mg/kg pour les adultes, intrapéritonéales (i.p.)).
- Placez l’animal anesthésié dans un moule de mousse polyéthylène pour immobiliser le corps de l’animal. Placer l’animal dans une table anti-vibration dans une chambre forte atténuation sonore. Maintenir la température de corps de l’animal à 37,5 ° C, avec un coussin chauffant.
- Essuyer la zone tête d’éthanol à 70 % (vol/vol). En utilisant des ciseaux, faire une incision de 1 à 2 mm ventro à l’externe pinna pour placer l’électrode de référence ou le sol. Une électrode à aiguille hypodermique (électrode d’enregistrement) est située sur le sommet du crâne (Figure 1 a).
- En utilisant le générateur de fonctions, générer des rafales de ton calibré (montée/descente de 1 ms, 3 ms plateau) de diverses fréquences (2, 4, 8, 16, 24 et 32 kHz) et les intensités (a diminué de 85 à 10 dB SPL à l’étape 5 dB). Varier la fréquence et l’amplitude manuellement ou à l’aide d’un ordinateur. Livrer des stimuli sonores grâce à un haut-parleur électrostatique situé 10 cm loin vers la tête de l’animal.
- Filtre (100-1 000 Hz), amplifier et moyenne (256 fois) le potentiel sonore ont incité, en utilisant un processeur multi-function pour obtenir l’abr. Les traces de l’ABR est contrôlé en ligne et stockées pour l’analyse hors ligne. Il faut environ 40 min, pour compléter l’ABR enregistrement à partir d’un animal.
Remarque : En général, trois à sept sommets (j’ai vague à vague VII) avec des latences inférieures à 15 ms peut être identifié (Figure 1 b). Le seuil ABR est défini comme le niveau sonore minimal à laquelle vague I et II pourrait être détecté. - Euthanasier avant les animaux éveillés de l’anesthésie (avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium 0,3 mL 1,5 %).
3. la Dissection de l’organe de Corti (OC)
- Anesthésier les ratons. Chez les rats âgés de moins de 6 jours (< P6), garder l’animal dans une boîte de Petri de 100 mm et couvrir le plat avec de la glace pendant 10 min. Pour les rats > P6, anesthésier l’animal avec une seule injection de 1,5 % le pentobarbital de sodium (22 mg/kg, i.p.). Décapiter les ratons après l’anesthésie.
- Stérilisez la tête par pulvérisation d’éthanol à 70 % (vol/vol).
- Ouvrir le crâne, le long de la ligne sagittale médiane avec des ciseaux ; enlever le cerveau afin d’exposer l’oreille interne.
- Transférer l’oreille interne dans une boite de Petri 35 mm contenant 3 mL de L-15 glacée (Figure 2 a).
- Sous le microscope à dissection, utiliser une pince fine pour retirer la capsule osseuse de la cochlée (Figure 2 b).
- Déballer l’OC et associés strie vasculaire (SV) du modiolus.
- En tenant la partie basale de la SV avec une pince, séparer l’OC de la SV complètement en déroulant lentement de base à l’apex (Figure 2).
- Couper l’OC uniformément en trois morceaux à l’aide des ciseaux fins (Figure 2D).
4. immunofluorescence souillant
- À l’aide d’une pointe de pipette 200 µL, transférer les segments d’OC (étape 3,8) sur une lame de verre et fixer avec 100 µL de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 4 h à 4 ° C.
ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée. - Laver le tissu en déplaçant la paraformaldéhyde avec 100 µL de PBS frais. Laver le tissu trois fois pendant 10 min.
- Incuber le tissu avec agent de perméabilité de 0,3 % dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Jeter l’agent de perméabilité dans du PBS et laver le tissu trois fois avec du PBS.
- Bloc avec 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Incubez avec anticorps anti-prestin-C-terminale (1 : 200) en bloquant la solution pendant 2 h à température ambiante ou à 4 ° C durant la nuit.
- Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min.
- Incuber les anticorps secondaire conjugué Alexa488 (1:600) dans la solution de saturation pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
- Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min dans le noir.
- Incubez avec rhodamine-phalloïdine (1 : 200) pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min dans le noir.
- Monter sur une lame de verre avec support de montage (contenant le DAPI). Image par microscopie confocale à l’aide de 405 nm, 488 nm et 594 nm lasers. La valeur de la puissance du laser à 0,1 à 0,5 mW et le scan vitesses à 0,5 frame/s.
5. Patch clamp enregistrement des contaminants organohalogénés isolé
- Utiliser l’extracteur de pipette et micro-faussaire faire patch pipettes avec un diamètre de pointe, 2 à 3 µm. remblayer les pipettes avec solution intracellulaire. Habituellement, la résistance initiale de pipette de patch a été MΩ de 2,5 à 3,5 dans une solution de bain.
- À l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL, transférer un morceau de l’OC (de l’étape 3,8) dans une boîte de Pétri de 35 mm. Digérer le tissu avec 100 µL de milieu de digestion enzymatique (collagénase IV, voir Table des matières) pendant 5 min à température ambiante.
- Déplacer le milieu de digestion enzymatique avec 100 µL de L-15. Couper le tissu en petits morceaux à l’aide d’un scalpel micro pour isoler les cellules ciliées.
- Après pipetage douce, transférer les cellules dans une petite chambre en plastique fait maison (diamètre ~ 1,5 cm) rempli de solution bain sans enzymes (~ 1,5 mL, voir Table des matières).
- Placez la chambre sur la scène d’un microscope inversé. Trouver les contaminants organohalogénés solitaires apparemment en bonne santé.
- Charger la pipette dans la scène en tête d’un amplificateur de 700 b. Déplacer la pipette avec soin par un micromanipulateur et positionnez-le autour du fond de la cellules ciliées externes (Figure 3 a).
- Cellule entière patch clamp de la CPO en scellant la paroi latérale du corps cellulaire. Applique lumière d’aspiration jusqu'à ce que la membrane cellulaire est rompue. Définir l’exploitation potentielle à -70 mV. Avec accès résistance varie entre 10 et 17 MΩ et la résistance de la membrane des cellules allant de 100 à 500 MΩ et sont considérés comme une configuration réussie de la cellule entière.
- À l’aide de la commande par ordinateur, appliquer hyperpolarisant et dépolarisantes tension (durée de 250 ms et allant de −140 à + 94 mV en 13 étapes mV) à la cellule pour susciter des courants de cellules entières.
- Amplifier les courants de la cellule entière, filtrer (fréquence de coupure de 5 kHz) par un amplificateur de 700 b. Convertir les données par un convertisseur de 1440A et le magasin pour l’analyse hors ligne.
- Mesurer la capacité de la membrane des contaminants organohalogénés en utilisant un protocole de stimulation de tension deux sinusoïdale contrôlé par un logiciel de patch clamp. Régler la gamme de tension de stimuler de -140 à 110 mV. Stocker les données pour l’analyse hors ligne.
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Representative Results
ABR peut être déclenché de rat anesthésié petits plus vieux que le jour après la naissance 7 (P7) à l’aide de salves de sons purs (Figure 1 a). Comme le montre la Figure 1 b, les formes d’onde ABR provenant de ratons ont montré seulement trois ou quatre de vagues distinctes avec petite amplitude. Habituellement, jusqu'à sept sommets ont été observées dans les formes d’onde ABR des animaux adultes (Figure 1 b).
Pour l’immunomarquage suivant et mesures électrophysiologiques, oreille interne de rat a été fraîchement disséquée de l’OS temporal. Nous montrons les étapes successives de la dissection des tissus pour isoler l’OC de la SV et le modiolus (Figure 2 a–2C). L’OC a été coupé en trois morceaux uniformément avec micro-ciseaux (Figure 2D). Pour afficher la morphologie des cellules de cheveux, les segments ont été colorées avec la phalloïdine, anticorps prestin et DAPI (Figure 2E). Les faisceaux de poils (en rouge) indiquent la surface apicale des cellules ciliées, tandis que le corps cellulaire des contaminants organohalogénés a été marqué par prestin (en vert). Le noyau a été étiqueté par DAPI (en bleu) situé dans la région du bas de la CSI et les contaminants organohalogénés. Comme illustré à la Figure 2E, aucun prestin a été détectée dans les contaminants organohalogénés de cochlée à P5. Prestin fut observée à P7 en contaminants organohalogénés situées dans la cochlée basale.
Après digestion douce, les contaminants organohalogénés ont été isolées de l’OC (Figure 3 a). Cellule entière voltage clamp enregistrements ont été effectués de contaminants organohalogénés aiguë isolées de la cochlée de rat. Un exemple représentatif du courant cellule entière enregistré de l’OHC P9 isolé en réponse au potentiel de membrane changé de −140 à + 107 mV est montré dans la Figure 3 b. Veuillez noter la région N-forme de la courbe I-V, indiquant la présence de KCa actuel qui est une réponse unique de contaminants organohalogénés. Pilotée par la tension membranaire, le Cl intracellulaire– combiné avec le prestin, apparaissant comme une capacité de membrane non linéaire (NLC) change sous mode pince patch de cellules entières. Le NLC typique d’un SLO mature se caractérise par la dépendance en forme de cloche sur le potentiel de membrane. La BNC peut être équipée d’une fonction de Boltzmann de deux États et peut refléter la fonction electromotility de contaminants organohalogénés. La fonction de Boltzmann pour le montage de capacité est décrite comme :
L’équation et les paramètres ont été décrits dans notre précédent article9. Deux représentant CLN est indiquées dans la Figure 3.
Figure 1. Enregistrement de réaction auditif du tronc cérébral. (A) l’électrode d’enregistrement a été inséré dans le cuir chevelu entre deux oreilles. Les électrodes de référence et au sol ont été placés sous le pavillon de gauche et droite, respectivement. Un haut-parleur plein champ a été placé à 10 cm de la pointe du nez du rat. (B) deux signaux ABR représentatifs dans la réponse à 16 kHz, 80 dB SPL bouffées tonales. Haute trace enregistré un chiot P8. Trace de fond enregistré chez un rat adult. Les chiffres indiquent les différents sommets de formes d’onde. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. La dissection de l’organe de Corti. (A) l’oreille interne disséqué de pup rat P9. La cochlée et la région vestibulaire sont représentés. (B) la structure de la cochlée est exposé après l’ablation de la paroi osseuse. (C), l’organe de Corti (OC) et de la strie vasculaire (SV) a isolé le modiolus. (D) l’organe de Corti a été coupé uniformément en trois morceaux. Barres d’échelle dans l’A-D représentent 1 000 µm. (E) images confocales show les cellules ciliées situées dans différents segments (basales, moyennes et apicales) le long de la cochlée. Rhodamine-phalloïdine (rouge) représente les ballots de cheveux situées sur la surface apicale des cellules de cheveux. DAPI (bleu) représente les noyaux situés dans la partie du milieu-bas des cellules ciliées. Le prestin (marqué en vert) a été exprimé seulement sur la paroi latérale des cellules ciliées externes. Les segments moyens et basales à P7, seul le canal vert est prévu pour illustrer l’expression du prestin en contaminants organohalogénés. Barre d’échelle représente 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Enregistrement de clamp patch cellule entière de cellules ciliées isolés. (A) une cellule isolée de cheveux externe a été scellé en mode cellule entière. Barre d’échelle représente 10 µm. (B) une représentant I-V courbe enregistrée dans une cellules ciliées externes de P9. Capacité (C) la membrane non linéaire (NLC) provenant de deux cellules ciliées externes à différents âges. Les réponses de capacité-voltage (cercles vides) ont été ajustées à la fonction de Boltzmann (reproduite par les traits épais). Le NLC ont été normalisés à la capacité linéaire correspondante (Clin). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Chez les rats âgés de moins de jour 11, n’on observe aucun potentiel d’action en réponse à une stimulation sonore au cortex auditif6,7. C’est pourquoi, jour après la naissance 11 est décrit comme « début de l’audience »10. Le développement d’une fonction d’audition avant le début de l’audience n’était pas bien étudié encore. En utilisant la méthode semblable pour l’enregistrement de ABR adulte, nous démontrons que ABRs pouvaient être provoquées par ton pur éclat de ratons âgés de moins de P11 (Figure 1). Cependant, les formes d’onde ABR provenant de ratons a montré quelques caractéristiques différentes de celles des animaux adultes. Les réponses ABR sont petites amplitude dont le seuil relativement élevé. Ce résultat implique que le développement du système auditif est peu sensible aux signaux sonores. Différence significative a été observée dans les formes d’onde ABR enregistrés de ratons. Habituellement, jusqu'à sept sommets ont été observés en adultes de formes d’onde ABR9. Ces pics avec différents temps de latence sont générés par des noyaux du tronc cérébral différentes le long de la voie auditive11. Nos résultats indiquent que seules les vagues d’I à IV sont décelables dans ABR de ratons (Figure 1 b). Les ondes I et II représentent les réponses de la cochlée et du nerf auditif11. Par conséquent, les résultats indiquent que les noyaux auditifs niveau supérieurs n’a pas répondu aux stimuli acoustiques au cours du développement. Ces données suggèrent que maturité fonctionnelle de cochlée portée plus tôt que ne le fait le système auditif central. La méthode que nous décrivons ici est importante pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant la fonction de développement et de cellules ciliées cochlée.
Dissection de la qualité de l’OC est critique pour autres expériences notamment immunomarquage, Western Blot et mesures électrophysiologiques. Ces expériences ont été réalisées à l’aide de rats adultes de SD et ratons entre 1 et 14 jours. Ratons sont idéales pour la dissection fine comme l’OS cochléaire est souple et peut être facilement enlevé par forceps sans endommager l’OC. Pour les rats adultes, une prudence particulière est nécessaire pour éviter une rupture de l’OC tout en retirant la capsule dure-osseux. À l’aide de pinces fines, du co et la SV associée peuvent être a décollé le modiolus. Les séparés OC et SV ont une texture différente (Figure 2). Pour les ratons, le OC pourrait être coupé en trois segments d’une longueur de 800-1200 µm. S’il vous plaît note, toutes les étapes doivent être suivies en L-15 glacée aussi vite que possible afin de minimiser la dégradation et détérioration des tissus.
Des segments isolés de l’OC sont bons préparatifs immunomarquage, Western Blot et analyse des RNA. Ici, nous montrons la morphologie des cellules sensorielles de cheveux en OC par immunohistochimie. Contaminants organohalogénés ont des faisceaux de poils sur leur surface apicale, tandis que le noyau a eux situé à la base12. La protéine motrice prestin s’exprime sur la membrane latérale des contaminants organohalogénés. Les données d’imagerie confocale a indiqué que le prestin était tout d’abord exprimé à P6-P7 et a montré a continué d’augmenter au cours de la semaine suivante (Figure 2E). Dans d’autres expériences, Western Blot et q-PCR ont été effectuées pour quantifier les changements de niveau expression observée de prestin au cours du développement (données non présentées). Parce que les cellules ciliées sont la minorité dans l’OC, limaçon de 6 à 10 est recommandés dans une seule expérience afin d’atteindre les signaux robustes.
Pour les enregistrements du patch clamp de contaminants organohalogénés, digestion enzymatique douce a été réalisée pour séparer les contaminants organohalogénés. Les cellules ciliées sont fragiles, et une attention particulière est nécessaire dans cette étape. Utiliser un embout de pipette de 200 µL pour transférer les tissus et les cellules séparées. Le segment isolé du crime organisé a été transféré à une goutte de solution de collagénase (~ 100 µL) dans une boîte de Pétri pendant environ 5 min à température ambiante. Éviter les temps de digestion longue, qui peuvent endommager la membrane cellulaire des contaminants organohalogénés. Sous le microscope, contaminants de la recherche en santé organohalogénés ont été sélectionnées pour l’enregistrement par patch clamp. Endommagent les cellules présentant des signes de rétrécissement, gonflement, ou translocation du noyau ont été exclus de l’expérience suivante. En bonne santé qui apparaissent solitaires contaminants organohalogénés et CSI est faciles à identifier par leur différence morphologique. Contaminants organohalogénés montrent une forme cylindrique et un rapport plus élevé de l’axe de diamètre, tandis que CSI est en forme de flacon avec un cou serré12. Cellule entière patch clamp en contaminants organohalogénés est un peu difficile de celles des neurones et autres cellules épithéliales. Pour la configuration cellule entière réussie, la pipette se trouvait généralement près du noyau, tenu à l’écart la membrane latérale supérieure contenant une haute densité de particules prestin (Figure 3 a). Après que la membrane a été rompue, un protocole de stimulation de tension deux sinusoïdale a été appliqué à la cellule afin d’obtenir la capacité de la membrane des contaminants organohalogénés. Avec la même technique, à l’aide de mesures de tension, il est possible obtenir le courant de la cellule entière.
Cette méthode est un bon outil pour étudier la fonction electromotility de contaminants organohalogénés in vitro9,,13. Cette méthode pourrait également être utilisée pour étudier la fonction des canaux ioniques, ainsi que les propriétés pharmacologiques des récepteurs en contaminants organohalogénés et IHCs14.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du programme 973 (2014CB943002) et la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (11534013, 31500841).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
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