Summary
Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.
Abstract
L'esterno della cellula ciliata è uno dei due tipi di cellule ciliate sensoriali nella coclea dei mammiferi. Essi alterano la loro lunghezza di cella con il recettore potenziale per amplificare la vibrazione debole del segnale a basso livello sonoro. La morfologia e la proprietà elettrofisiologiche delle cellule ciliate esterne (OHCs) si sviluppano in età postnatale precoce. La maturazione della cellula ciliata esterna può contribuire allo sviluppo del sistema uditivo. Tuttavia, il processo di sviluppo di OHCs non è ben studiato. Questo è in parte a causa della difficoltà per misurare la loro funzione da un approccio elettrofisiologico. Con lo scopo di sviluppare un metodo semplice per risolvere il problema di cui sopra, qui descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la funzione di OHCs nella coclea acutamente dissociato da ratti postnatali. Con questo metodo, possiamo valutare la risposta coclea agli stimoli di tono puro ed esaminare il livello di espressione e la funzione della proteina motore prestin nel OHCs. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare le cellule ciliate interne (IHCs).
Introduction
Due funzioni distinte di cellule ciliate sensoriali cocleari sono essenziali per l'udito dei mammiferi: trasduzione del mechanoelectric (MET) ed electromotility1,2. Dai canali MET situati nel fascio di capelli, IHCs (IHCs) e OHCs Converti vibrazione sonora in variazioni di potenziale di membrana, come pure i segnali elettrici dei neuroni del ganglio spirale innervate. OHCs cambiano la loro lunghezza di cella con il potenziale di membrana e amplificare la vibrazione del suono di basso livello. Questa attività definita electromotility è derivata dalla proteina motore prestin situato nella parete laterale del OHCs3.
In molte specie, tra cui roditori, la funzione uditiva è immatura in epoca postnatale iniziale4,5. Nessun potenziale d'azione in risposta ai segnali audio potrebbe essere rilevato nella corteccia uditiva prima della udienza inizio6,7. Sviluppo della morfologia e funzione della coclea è stata ampiamente studiate in mouse, gerbillo e ratto4,5,8. La meccanotrasduzione ed electromotility delle cellule ciliate sono anche sviluppati nei primi anni di vita epoca5.
Al fine di valutare la sensibilità di udienza dei ratti a diverse età postnatale, abbiamo sviluppato un metodo per la risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) registrazione nei cuccioli di ratto. Intero-cellula patch clamp è una tecnologia ideale per indagare il OHCs electrophysiologically. Tuttavia, confrontato con il morsetto di patch eseguito in neuroni ed altre cellule epiteliali, il basso tasso di cellule intere tenuta limitata l'inchiesta del electromotility di OHCs isolato.
Qui descriviamo una procedura per studiare il OHCs morfologicamente ed electrophysiologically nella coclea acutamente dissociato da ratti postnatali. Questo metodo può essere modificato per studiare i meccanismi molecolari che regolano la funzione e lo sviluppo della cellula ciliata interna.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato di etica animale dell'Università medica del sud.
1. preparare le soluzioni per gli esperimenti
- Preparare l'anestetico (Vedi Tabella materiali): sodio pentobarbital 1,5% disciolto in ddH2O.
- Preparare la soluzione di dissezione (Vedi Tabella materiali): sciogliere un sacchetto di polvere di L-15 di Leiboviz in 1 L di ddH2O. Adjust pH a 7,3 con 1 M NaOH. Regolare osmolarità di 300-330 mOsm utilizzando un Osmometro e 10 mM HEPES prima dell'uso.
- Sciogliere 2 mg/mL collagenasi IV (Vedi Tabella materiali) in soluzione di dissezione preparata al punto 1.2.
- Preparare le soluzioni di immunostaining (Vedi Tabella materiali): sciogliere la paraformaldeide al 4% in tampone fosfato salino (PBS).
Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare una protezione appropriata. - Diluire l'agente di permeabilità di 0.3% in PBS. Diluire il siero di capra normale del 10% in PBS come il tampone di bloccaggio. Diluire l'anticorpo prestin s 1: 200 in tampone bloccante. Diluire l'anticorpo coniugato Alexa488 1:600 in tampone bloccante. Diluire 1: 200 isotiocianato falloidina-tetrametilrodamina B in PBS.
- Preparare la soluzione extracellulare (Vedi Tabella materiali): preparare mezzo L-15 di Leiboviz, come descritto in precedenza (punto 1.2).
- Preparare la soluzione intracellulare (Vedi Tabella materiali).
2. ABR registrazione
Nota: Registrazione ABR precedentemente è stato descritto in dettaglio nel nostro precedente studio9.
- Anestetizzare ratti Sprague Dawley (deviazione standard) (1-14 giorno vecchio cuccioli e adulti 2 - mesi-vecchi, entrambi i sessi) con una singola iniezione del 1,5% sodio pentobarbital (22 mg/kg per cuccioli e 30 mg/kg per gli adulti, intraperitoneali (i.p.)).
- Metti l'animale anestetizzato in uno stampo di schiuma di polietilene per immobilizzare il corpo dell'animale. Metti l'animale su un tavolo antivibrazione in una camera di attenuazione di suono. Mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37,5 ° C con un rilievo di riscaldamento.
- Pulire la zona della testa con etanolo al 70% (vol/vol). Utilizzando una forbice, praticare un'incisione di 1-2mm ventrolateral alla pinna esterno per posizionare l'elettrodo di riferimento o la terra. Un elettrodo ad ago ipodermico (elettrodo di registrazione) si trova sopra il vertice del cranio (Figura 1A).
- Utilizzando il generatore di funzioni, generare raffiche di tono calibrato (altopiano di 3 ms, 1 ms salita/discesa) di varie frequenze (2, 4, 8, 16, 24 e 32 kHz) e intensità (è diminuito da 85 a 10 dB SPL nel passaggio 5 dB). Variare la frequenza e l'ampiezza manualmente o utilizzando un computer. Fornire stimoli sonori attraverso un altoparlante elettrostatico che si trova 10 cm distanza verso la testa dell'animale.
- Filtro (100-1.000 Hz), amplificare e media (256 volte) il suono hanno suscitato potenziale utilizzando un processore multi-funzione per ottenere l'ABR. Le tracce ABR viene monitorata online e memorizzati per l'analisi offline. Si impiegano circa 40 minuti per completare la registrazione da un animale ABR.
Nota: Solitamente, il tre-sette cime (onda I ad onda VII) con latenze meno di 15 ms può essere identificato (Figura 1B). La soglia ABR è definita come il livello sonoro minimo al quale onda potremmo essere rilevati I e II. - Eutanasia prima degli animali svegli dall'anestesia (con un'iniezione intraperitoneale di 0,3 mL 1,5% sodio pentobarbital).
3. la dissezione dell'organo del Corti (OC)
- Anestetizzare cuccioli del ratto. Per meno di 6 giorni vecchi ratti (< P6), mantenere l'animale in una piastra di coltura di 100 mm e coprire il recipiente con ghiaccio per 10 min. Per i ratti > P6, anestetizzare l'animale con una singola iniezione del 1,5% sodio pentobarbital (22 mg/kg, i.p.). Decapitare i cuccioli di ratto dopo l'anestesia.
- Sterilizzare la testa di spruzzatura con etanolo al 70% (vol/vol).
- Aprire il cranio lungo la linea mediana sagittale con le forbici; rimuovere il cervello per esporre l'orecchio interno.
- Trasferire l'orecchio interno in una capsula di Petri 35 mm riempito con 3 mL di L-15 ghiacciata (Figura 2A).
- Sotto il microscopio di dissezione, è necessario utilizzare una pinzetta per rimuovere la capsula ossea della coclea (Figura 2B).
- Scartare l'OC e associati vascularis dello stria (SV) dal modiolus.
- Tenendo la porzione basale della SV con il forcipe, separare l'OC da SV completamente tramite rimozione lentamente dalla base all'apice (Figura 2).
- Tagliare in modo uniforme l'OC in tre pezzi utilizzando forbici bene (Figura 2D).
4. immunofluorescenza
- Utilizzando una punta di pipetta 200 µ l, trasferire i segmenti di OC (punto 3.8) su un vetrino e difficoltà con 100 µ l di paraformaldeide al 4% per almeno 4 ore a 4 ° C.
Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare una protezione appropriata. - Lavare il tessuto spostando il paraformaldeide con 100 µ l di PBS fresco. Lavare il tessuto tre volte per 10 min.
- Incubare il tessuto con agente di permeabilità di 0.3% in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
- Scartare l'agente di permeabilità in PBS e lavare il tessuto tre volte con PBS.
- Bloccare con 10% siero di capra normale in PBS per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare con l'anticorpo anti-prestin-C-terminale (1: 200) in blocco soluzione per 2 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte.
- Lavare tre volte con PBS per 5 min.
- Incubare con anticorpi secondari coniugati Alexa488 (1:600) in soluzione bloccante per 1 h a temperatura ambiente al buio.
- Lavare tre volte con PBS per 5 min al buio.
- Incubare con rodamina-falloidina (1: 200) per 10 min a temperatura ambiente al buio.
- Lavare tre volte con PBS per 5 min al buio.
- Montare su un vetrino con mezzo di montaggio (contenente DAPI). Immagine con microscopia confocale utilizzando 405 nm, 488 nm e 594 nm laser. Impostare la potenza del laser a 0,1-0,5 mW e la scansione velocità a 0,5 fotogrammi/s.
5. Patch clamp registrazione di OHCs isolato
- Utilizzare la levetta della pipetta e micro-falsario per rendere patch pipette con una punta di diametro 2-3 µm. Back-riempimento le pipette con soluzione intracellulare. Solitamente, la resistenza iniziale della pipetta patch era MΩ 2.5-3.5 nella soluzione del bagno.
- Utilizzando una pipetta 200 µ l, trasferire un pezzo di the OC (dal punto 3.8) in una capsula di Petri da 35 mm. Digerire il tessuto con 100 µ l di terreno di digestione enzimatica (collagenasi IV, Vedi Tabella materiali) per 5 min a temperatura ambiente.
- Spostare il mezzo di digestione enzimatica con 100 µ l di L-15. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi utilizzando un micro bisturi per isolare le cellule ciliate.
- Dopo delicato pipettaggio, trasferire le cellule in un piccolo alloggiamento di plastica fatti in casa (diametro ~ 1,5 cm) riempito con soluzione del bagno senza enzima (~ 1,5 mL, Vedi Tabella materiali).
- Posizionare la camera sul palco di un microscopio invertito. Trovare il OHCs solitario che appaiono sani.
- Caricare la pipetta patch in fase di testa di un amplificatore di 700B. Muoversi con cautela la pipetta patch di un micromanipolatore e posizionarlo intorno alla parte inferiore della cella capelli esterna (Figura 3A).
- Morsetto della intero-cellula patch OHC sigillando la parete laterale del corpo cellulare. Applicare l'aspirazione di luce fino a quando la membrana cellulare è rotto. Impostare l'azienda potenziale a -70 mV. Cellule con accesso ha variato da 10 a 17 MΩ e resistenza di membrana hanno variato da 100 a 500 MΩ e sono considerate una corretta configurazione di cellule intere.
- Utilizzando il computer di controllo, applicare hyperpolarizing e depolarizzazione tensione (durata 250 ms e che vanno da −140 a + 94 mV in 13 passi mV) alla cella di suscitare correnti della intero-cellula.
- Amplificare le correnti della intero-cellula, (angolo frequenza di 5 kHz) del filtro da un amplificatore di 700B. Convertire i dati da un convertitore 1440A e archivio per l'analisi offline.
- Misurare la capacità di membrana del OHCs utilizza un protocollo di stimolo di tensione due sinusoidale controllato da un software di patch clamp. Impostare l'intervallo di tensione di stimolare da -140 a 110 mV. Memorizzare i dati per l'analisi offline.
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Representative Results
ABR può essere suscitata da cuccioli del ratto anestetizzato oltre postnatale giorno 7 anni di età (P7) utilizzando gli scoppi di tono puro (Figura 1A). Come mostrato in Figura 1B, le forme d'onda ABR ottenuti da cuccioli del ratto ha mostrati solo tre o quattro distinte ondate con piccola ampiezza. Di solito, fino a sette cime sono state osservate nelle forme d'onda ABR di animali adulti (Figura 1B).
Per la seguente immunostaining e valutazione elettrofisiologica, orecchio interno ratto appena è stata sezionata dal osso temporale. Vi mostriamo i passaggi consecutivi di dissezione del tessuto per isolare l'OC da SV e modiolus (Figura 2A–2 C). L'OC è stato tagliato in tre pezzi in modo uniforme con micro-forbici (Figura 2D). Per visualizzare la morfologia delle cellule ciliate, i segmenti sono stati macchiati con falloidina, prestin anticorpo e DAPI (Figura 2E). I pacchi dei capelli (in rosso) indicano la superficie apicale delle cellule ciliate, mentre il corpo cellulare del OHCs è stato segnato da prestin (in verde). Il nucleo è stato etichettato da DAPI (in blu) si trova nella regione inferiore della IHCs e OHCs. Come mostrato in Figura 2E, è stato rilevato nessun prestin OHCs della coclea a P5. Prestin in primo luogo è stata osservata a P7 in OHCs situato nella coclea basale.
Dopo la digestione delicata, il OHCs sono stati isolati da OC (Figura 3A). Tensione della intero-cellula-morsetto registrazioni sono state eseguite da OHCs acutamente isolato dalla coclea del ratto. Un esempio rappresentativo della intero-cellula corrente registrata da un isolato OHC P9 in risposta al potenziale di membrana cambiato da −140 a + 107 mV è mostrato nella Figura 3B. Si prega di notare la regione N-forma della curva I-V, che indica la presenza di KCa corrente che è una risposta unica di OHCs. Guidato dalla tensione della membrana, il Cl intracellulare– combinato con prestin, apparendo come una capacità di membrana non lineari (NLC) cambia sotto modalità di morsetto di cellule intere patch. NLC tipico di un maturo OHC è caratterizzato dalla dipendenza dal potenziale di membrana a forma di campana. NLC può essere dotato di una funzione di Boltzmann di due Stati e può riflettere la funzione electromotility di OHCs. La funzione di Boltzmann per il montaggio di capacitanza è descritto come:
L'equazione e i parametri sono stati descritti nel nostro precedente carta9. Due rappresentante NLCs sono mostrati in Figura 3.
Figura 1. Registrazione di risposta uditiva del tronco cerebrale. (A), l'elettrodo di registrazione è stato inserito nel cuoio capelluto tra le due orecchie. Elettrodi di riferimento e di terra furono poste sotto il pinna sinistro e destro, rispettivamente. Un altoparlante di campo aperto è stato disposto 10 cm di distanza della punta del naso del ratto. (B) due rappresentative ABR forme d'onda in risposta a 16 kHz, 80 dB SPL scoppi di tono. Superiore traccia registrata da un cucciolo di P8. Traccia di fondo registrato da un ratto adulto. I numeri indicano i diversi picchi di forme d'onda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La dissezione dell'organo del Corti. (A) l'orecchio interno sezionato da un cucciolo di ratto P9. La coclea e la regione vestibolare sono mostrati. (B) la struttura della coclea è stata esposta dopo la rimozione della parete ossea. (C), l'organo del Corti (OC) e stria vascularis (SV) sono stati isolati dalla modiolus. (D) l'organo del Corti è stato tagliato in modo uniforme in tre pezzi. Barre di scala in A-D rappresentano 1.000 µm. (E) immagini Confocal Visualizza le cellule ciliate situate a diversi segmenti (basale, centrale e apicale) lungo la coclea. Rodamina-falloidina (rosso) rappresenta i pacchi dei capelli si trova sulla superficie apicale delle cellule ciliate. DAPI (blu) rappresenta i nuclei situati nella parte medio-inferiore delle cellule ciliate. Prestin (contrassegnato in verde) è stata espressa solo sulla parete laterale delle cellule ciliate esterne. Per i segmenti medio e basale a P7, solo il canale verde è riportato per illustrare l'espressione di prestin nel OHCs. Barra della scala rappresenta 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Registrazione morsetto della intero-cellula patch di cellule ciliate esterne isolate. (A) un'isolato esterna della cellula ciliata è stata sigillata nel modo della intero-cellula. Barra della scala rappresenta 10 µm. (B) rappresentante V curva registrata da una P9 esterna della cellula ciliata. Capacità (C), la membrana non lineare (NLC) ottenuti da due cellule ciliate esterne alle età differenti. Le risposte di capacità-tensione (cerchi aperti) sono state montate per la funzione di Boltzmann (indicata come le linee spesse). NLC sono stati normalizzati per la corrispondente capacità lineare (Clin). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In ratti più giovani di giorno 11, nessun potenziale d'azione in risposta a stimolazione sonora potrebbe essere osservato nella corteccia uditiva6,7. Di conseguenza, postnatale giorno 11 è descritto come "inizio dell'udito"10. Lo sviluppo della funzione uditiva prima insorgenza di udienza non è stato ben studiato ancora. Utilizzando il metodo simile per la registrazione di ABR adulto, dimostriamo che ABRs potrebbe essere suscitata da scoppio di tono puro da cuccioli del ratto più giovani di P11 (Figura 1). Tuttavia, le forme d'onda ABR ottenute da cuccioli del ratto ha mostrato alcune caratteristiche diverse da quelli di animali adulti. Le risposte ABR sono piccole in ampiezza con soglie relativamente alte. Questo risultato implica che lo sviluppo del sistema uditivo ha bassa sensibilità ai segnali sonori. Le forme d'onda ABR registrate da cuccioli del ratto è stata osservata differenza significativa. Di solito, fino a sette cime sono stati osservati in adulto ABR forme d'onda9. Questi picchi con latenza differente vengono generati dai nuclei del tronco cerebrale diversa lungo la via uditiva11. I nostri risultati indicano che solo le onde IV erano rilevabili in ABR da cuccioli di ratto (Figura 1B). Le onde I ed II rappresentano le risposte dalla coclea e nervo uditivo11. Di conseguenza, i risultati indicano che i nuclei uditivi livelli superiori non è riuscito a rispondere agli stimoli acustici durante lo sviluppo. Questi dati suggeriscono quella maturità funzionale di coclea da raggiungere prima di quanto fa il sistema uditivo centrale. Il metodo che qui descritto è importante per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano la funzione di sviluppo e cellula ciliata di coclea.
Dissezione di alta qualità di the OC è critica per ulteriori esperimenti tra cui immunostaining, Western blotting e misurazione elettrofisiologica. Questi esperimenti sono stati eseguiti utilizzando ratti SD adulti e cuccioli di ratto tra 1 e 14 giorni di età. Cuccioli del ratto sono ideali per dissezione bene come l'osso coclea è morbida e può essere facilmente rimosso dal forcipe senza danneggiare l'OC. Per ratti adulti, particolare attenzione è richiesta per evitare la rottura del OC durante la rimozione della capsula duro ossuto. Utilizzando una pinzetta, OC e SV associato può essere sollevato dal modiolus. Il separato OC e SV hanno consistenza diversa (Figura 2). Per cuccioli del ratto, l'OC potrebbe essere tagliato in tre segmenti con una lunghezza di 800-1200 µm. Siete pregati di notare che tutti i passaggi devono essere eseguiti nella gelida L-15 più velocemente possibile al fine di ridurre al minimo il degrado e deterioramento del tessuto.
Segmenti isolati di OC sono buoni preparativi per immunostaining, Western blotting e analisi di RNA. Qui vi mostriamo la morfologia delle cellule ciliate sensoriali in OC immunostaining. OHCs hanno pacchi dei capelli sulla loro superficie apicale, mentre il nucleo ha li trova basalmente12. La proteina motore prestin è espressa sulla membrana laterale di OHCs. I dati di imaging confocale indicavano che il prestin prima espressa a P6-P7 e ha mostrato un aumento costante nel corso della settimana seguente (Figura 2E). In ulteriori esperimenti, Western blotting e q-PCR sono stati effettuati per quantificare i cambiamenti di livello di espressione osservata di prestin durante lo sviluppo (dati non mostrati). Poiché le cellule ciliate sono la minoranza in OC, coclee di 6 a 10 sono raccomandati in un singolo esperimento per ottenere segnali di robusti.
Per registrazioni di morsetto di patch di OHCs, mite digestione enzimatica è stata effettuata per separare il OHCs. Le cellule ciliate sono fragili, e particolare cautela è necessaria in questo passaggio. Utilizzare una punta di pipetta 200 µ l per trasferire il tessuto e cellule separate. Il segmento isolato di OC è stato trasferito da una goccia di soluzione di collagenasi (~ 100 µ l) in una capsula Petri per circa 5 min a temperatura ambiente. Evitare i tempi di digestione lunga, che danneggiano la membrana cellulare di OHCs. Sotto il microscopio, dall'aspetto sano OHCs sono stati selezionati per la registrazione di patch clamp. Danneggiano le cellule che mostrano segni di ritiro, gonfiore, o lo spostamento del nucleo sono stati esclusi dal prossimo esperimento. Sano che appare solitario OHCs e IHCs sono facili da identificare con loro differenza morfologica. OHCs mostrano una forma cilindrica e un rapporto più grande del diametro di asse, mentre IHCs sono a forma di pallone con un collo stretto12. Intero-cellula patch clamp in OHCs è un po' difficile da quelli in neuroni ed altre cellule epiteliali. Per la corretta configurazione di cellule intere, la pipetta patch era solito si trova vicino al nucleo, tenuto lontano la membrana laterale superiore contenente un'alta densità di particelle prestin (Figura 3A). Dopo la membrana era rotto, un protocollo di stimolo di tensione due sinusoidale è stato applicato alla cella al fine di ottenere la capacità di membrana del OHCs. Con la stessa tecnica, attenendosi alla procedura di tensione, è possibile suscitare correnti della intero-cellula.
Questo metodo è un buon strumento per indagare la funzione electromotility di OHCs in vitro9,13. Questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per studiare la funzione dei canali ionici, così come le proprietà farmacologiche dei recettori nel OHCs e IHCs14.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma del 973 (2014CB943002) e il National Natural Science Foundation della Cina (11534013, 31500841).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
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