Summary
De incidentie van obesitas stijgt en verhoogt het risico van chronische longziekten. De onderliggende mechanismen en preventieve strategieën, welomschreven dier vast te stellen modellen nodig zijn. Hier bieden wij drie methoden (glucose-tolerantie-test, lichaam plethysmography en fixatie van de Long) te bestuderen van het effect van obesitas op pulmonaire resultaten in muizen.
Abstract
Obesitas en respiratoire aandoeningen zijn grote gezondheidsproblemen. Obesitas is steeds een opkomende epidemie met een verwachte aantal zwaarlijvige individuen van meer dan 1 miljard wereldwijd in 2030, dus vertegenwoordigen een groeiende sociaal-economische last. Gelijktijdig, zijn obesitas-gerelateerde comorbidities, met inbegrip van diabetes, alsmede hart en chronische longziekten, voortdurend op de stijging. Hoewel obesitas is geassocieerd met verhoogd risico op astma exacerbaties, wordt verslechtering van de respiratoire symptomen, en slechte controle, de functionele rol van obesitas en verontrust metabolisme in de pathogenese van chronische longziekte vaak onderschat, en moleculaire mechanismen blijven elusive. Dit artikel beoogt te presenteren van de methoden voor de beoordeling van het effect van obesitas op metabolisme, evenals Long structuur en functie. Hier beschrijven we drie technieken voor muizen studies: (1) beoordeling van intraperitoneaal glucosetolerantie (ipGTT) voor analyseren het effect van obesitas op glucose metabolisme; (2) meting van de weerstand van de luchtwegen (Res) en ademhalingswegen compliance (Cdyn) voor het analyseren van de invloed van obesitas op de longfunctie; en (3) voorbereiding en fixatie van de longen voor verdere kwantitatieve histologische beoordeling. Obesitas longziekten zijn waarschijnlijk multifactoriële, die voortvloeien uit de systemische inflammatoire en metabole disregulatie die potentieel ongunstig beïnvloeden longfunctie en de respons op therapie. Daarom is een gestandaardiseerde methode voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen en het effect van nieuwe behandelingen essentieel.
Introduction
Volgens de World Health Organization (WHO) in 2008, waren meer dan 1,4 miljard volwassenen, leeftijd 20 en ouder, overgewicht met een index van de lichaamsmassa (BMI) groter is dan of gelijk aan 25; verder, meer dan 200 miljoen mannen en bijna 300 miljoen vrouwen waren zwaarlijvig (BMI≥30)1. Obesitas en het metabool syndroom zijn belangrijke risicofactoren voor een veelheid aan ziekten. Terwijl de zwaarlijvigheid en de daarmee gepaard gaande verhoogde witte vetweefsel massa is nauw gekoppeld om type 2 diabetes2,3, cardio-vasculaire ziekten, met inbegrip van coronaire hartziekte (CHZ), hartfalen (HF), boezemfibrilleren4 en artrose5, hun functionele rol in de pathogenese van respiratoire aandoeningen blijven slecht begrepen. Echter, de epidemiologische studies hebben aangetoond dat obesitas sterk geassocieerd met chronische respiratoire aandoeningen is, met inbegrip van inspanningsdyspnoe kortademigheid, obstructieve slaap apneu syndroom (OSAS), obesitas Ademdepressie syndroom (OHS), chronische obstructieve longziekte (COPD), longembolie, aspiratie pneumonie en bronchiale astma6,,7,,8,9. Potentiële mechanismen tussen obesitas en metabolisme verstoord, bijvoorbeeld, insulineresistentie en diabetes type II, aan de pathogenese van chronische longziekte niet alleen bestaan uit mechanische en fysieke gevolgen van gewicht maar ook winst op ventilatie veroorzaken een chronische subacute inflammatoire staat10,11. De opkomst van obesitas en longziekten tijdens het afgelopen decennium, in combinatie met het gebrek aan effectieve preventieve strategieën en therapeutische benaderingen, wijst op de noodzaak te onderzoeken van de moleculaire mechanismen voor het definiëren van nieuwe wegen voor het beheer van obesitas Long ziekten.
Hier beschrijven we drie standaard tests, die belangrijke basisprincipes om obesitas en het effect ervan op longkanker structuur en functie in muismodellen te onderzoeken: (1) intraperitoneaal glucose tolerantie (ipGTT) (2) meting van de weerstand van de luchtwegen (Res) en respiratoire naleving van het systeem (Cdyn); en (3) voorbereiding en fixatie van de longen voor verdere kwantitatieve histologische beoordeling. De ipGTT is een robuuste screeningtest voor maatregel glucose-opname, en dus het effect van obesitas op metabolisme. De eenvoud van de methode kan goede normalisatie, en daarom de vergelijkbaarheid van de resultaten tussen laboratoria. Meer verfijnde methoden, zoals hyperglycemic klemmen of studies van geïsoleerde eilandjes, kunnen worden gebruikt voor gedetailleerde analyse van de metabole fenotype12. Hier beoordelen we glucosetolerantie als u wilt definiëren een obesitas-geassocieerde staat van systemische en metabolische wanorde als basis voor verdere studies over een pulmonaire resultaten. Om te beoordelen van het effect van obesitas en stofwisselingsziekte op de longfunctie, gemeten we airway weerstand (Res) en ademhalingswegen compliance (Cdyn). Karakteriseren longziekte, zijn ongebreidelde evenals ingetogen methoden voor de beoordeling van de longfunctie beschikbaar. Ongebreidelde plethysmography in vrij bewegende dieren bootst een natuurlijke staat, als gevolg van ademhaling patronen; daarentegen zijn invasieve methoden, zoals ingangsimpedantie meting van Res en cDyn in diep narcose muizen te beoordelen van dynamische Long mechanica, nauwkeuriger13. Omdat chronische respiratoire aandoeningen worden weerspiegeld door histologische wijzigingen van het longweefsel, staat voor de deur goede longen fixatie voor verdere analyse. De keuze van de methode van weefsel fixatie en voorbereiding is afhankelijk van het compartiment van de longen, die zal worden bestudeerd, bijvoorbeeld airways of Long parenchym14. Hier beschrijven we een methode die het mogelijk kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van de dirigent luchtwegen maakt te bestuderen van het effect van obesitas op ontwikkeling van astma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met inachtneming van de protocollen aangenomen door lokale overheden (Land NRW, AZ: 2012.A424), en werden overeenkomstig de Duitse dierenwelzijn-wet en de verordeningen inzake het welzijn van dieren die voor experimenten of voor andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Aangezien Long functie analyse van invloed kan zijn op de structuur van de longen en dus latere histologische analyseert, moet de meting van Res en Cdyn en de voorbereidings- en fixatie van de longen voor histomorphometry in verschillende dieren worden uitgevoerd. Meting van Res en Cdyn na ipGTT is echter mogelijk. Omdat stress tijdens de ipGTT zou kunnen met interfereren de narcose die nodig zijn voor de longfunctie test, een herstelperiode van ongeveer 2 weken na ipGTT is aanbevolen dat muizen om te herstellen van lichaam gewichtsverlies en veranderingen in bloed parameters12.
1. voorbereiding voor intraperitoneaal Glucose tolerantie Test (ipGTT)
Opmerking: Na 12 uur vasten, gaat de volledige ipGTT ongeveer 2 h.
- Omdat stress invloeden bloedglucose aanzienlijk, opdat beide adaptie van muizen, alsmede opleiding van de wetenschapper, worden uitgevoerd.
- De dieren overbrengen in het experimentele gebied rustig en stress-vrij voorwaarden.
- Overweeg de toepassing van een hypercaloric dieet voor het opwekken van obesitas in muizen. Zie de sectie discussie voor verder advies.
- Snelle dieren voor 12u 's nachts, zonder toegang tot water te beperken. De volgende dag, de na 12 uur vasten, bereiden de bloedglucosemeter volgens de fabrikant protocol (Zie tabel van materialen) door het invoegen van een nieuwe test strip in de test strip poort.
- Incise het uiteinde van de staart met behulp van steriele schaar, zachtjes behoud van de muis bij de staart, en onmiddellijk de snelste bloedglucose meten door een druppel bloed vrijstromend (minimaal een steekproef grootte 0,5 µL) toe te passen op de strook van de test van de bloedglucosemeter.
Opmerking: Een countdown timer begint op het scherm na voldoende toepassing van het bloedmonster. Na 4 s, het testresultaat op het scherm verschijnt. - Daarna, wegen en label van de dieren die individueel met kleur markeren.
- Beheren van 2 g glucose/kg lichaam gewicht via intraperitoneale injectie. Zorg ervoor dat het geïnjecteerde volume 0,1 mL/10 g lichaamsgewicht (27 G naald en injectiespuit van 1 cc).
- Vervolgens meten van bloedglucose na 15, 30, 60 en 120 min door een druppel bloed vrijstromend op een nieuwe test strip toe te passen.
Opmerking: Bloedstroom kan worden verhoogd door het zachte masseren van de staart tip-wijken. Als de wond staart encrusts, schoon te maken met behulp van een steriel doekje gedrenkt met 0,9% natriumchlorideoplossing. - Toestaan dat de dieren kunnen rusten in hun huis kooien met onbeperkte toegang tot het water tussen de metingen.
2. Long functie analyse maatregel Res en cDyn
Opmerking: Voor ongestoord meting van Res en cDyn, muizen moeten worden geventileerd onder diepe verdoving. Stressvrij dier behandeling en goede controle van de verdoving zijn essentieel. Voor algemene instructies met behulp van steriele technieken, door Hoogstraten-Miller et al. het artikel Lees 15
- Kalibreren van het plethysmograph vóór elke set van experimenten en voorbereiden van de instellingen van de studie binnen de software (Zie Tabel van materialen).
- Voorafgaand aan de operatie, diep anesthetize dieren via intraperitoneale injectie van Xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht) en Ketamine (100 mg/kg lichaamsgewicht) (27 G naald en injectiespuit van 1 cc). Zorg ervoor dat het geïnjecteerde volume 0,1 mL/10 g per lichaamsgewicht.
Opmerking: Aangezien ketamine een goede pijnstillende effect bij muizen heeft, geen extra pijnbehandeling nodig is. De invasieve tracheale katheter/plethysmograph procedure duurt ongeveer 5-7 minuten, dan u kunt beginnen met data-acquisitie. - Plaats de muis op de liggende positie van een verwarming pad te handhaven van de lichaamstemperatuur.
- Dekking van de ogen met zalf om te voorkomen dat droogte onder verdoving.
- De diepte van de verdoving met behulp van de teen snuifje-reactie voortdurend te controleren.
Opmerking: Extra toediening van verdoving mogelijk noodzakelijk zijn voor een chirurgische vliegtuig van de verdoving. - Bevochtig de vacht van het chirurgische gebied in de regio van de schildklier met 70% ethanol.
- Zorgvuldig incise de huid in de schouderstreek voor ongeveer 1 cm tussen de jugular inkeping van het borstbeen en de tuber symphyses van de mentum door tillen met een tang en knippen van de huid onder de visuele inspectie met behulp van botte schaar (figuur 1A).
- Visualiseer de onderliggende onderhuids vetweefsel en de schildklier.
- Bloot in de luchtpijp door het zorgvuldig botte scheiden beide lobben van de schildklier bij de landengte en dissectie van de sternothyroid en de sternothyroid spieren (figuur 1B). Wees voorzichtig niet te schaden geen schepen en bloeden, omdat dit leiden nadelige effecten op het cardiovasculaire systeem tot kan en uiteindelijk op de metingen.
- Vervolgens passeren een 4-0 gevlochten chirurgische hechtdraad tussen de luchtpijp en de slokdarm met behulp van botte pincet. Zorgvuldig incise de luchtpijp dichtbij het strottenhoofd tussen de tracheale kraakbeen met micro schaar.
- Intubate met een tracheale buis (0,04 inch/1,02 mm doorsnede) onder visuele controle (Figuur 1 c). De buis via afbinding met de chirurgische hechtdraad om te voorkomen dat een lek in het systeem vast te stellen.
- Vervolgens verplaatst het dier aan het verwarmd bed van de kamer van het lichaam en de tracheale buis verbinden met de voorplaat (Figuur 1 d) en zet de ventilatie door op de ventilatie-knop op het voorpaneel van de controller (figuur 1E).
- Enquête de ventilatie door het observeren van de beweging van de borstkas gelijktijdig met het tarief van de ventilatie. Om te bevestigen de juiste plaatsing van de trachea buis, zien erop toe dat beide zijden van de thorax tegelijk verplaatsen.
- Bekijk de druk signaal op het scherm (figuur 1F). Ervoor zorgen dat de ventilatie-curven uniform. Als dit niet het geval, los van het dier en controleren van de kant van de chirurgie. Beware van bloed of slijm blokkeren de tracheale buis.
Opmerking: Voor volwassen dieren met een lichaamsgewicht van 20-25 g, de ventilator instellingen zoals afgebeeld in Figuur 2 worden voorgesteld overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. - Om wijzigingen in de trans-pulmonaire druk tijdens ventilatie, plaatst u een oesofageale buis (0,04 inch/1,02 mm doorsnede) in de slokdarm op de diepte die het niveau van de longen benadert. Let op het scherm terwijl het plaatsen van de buis. Plaats de buis waar maximale druk doorbuiging en minimale hart artefacten op het scherm kunnen worden gezien.
- Na de operatie, door het dier te voorbereiden door de meting. Terug verdoving via intraperitoneale injectie van Ketamine (100 mg/kg lichaamsgewicht) met behulp van een naald 27-G en 1 cc spuiten. Zorg ervoor dat het geïnjecteerde volume 0,1 mL/10 g per lichaamsgewicht.
Opmerking: Om te beoordelen bronchiale hyperreagibility, inhalatie methacholine, een niet-selectieve muscarinerge receptor agonist van het parasympatisch zenuwstelsel, die bronchoconstrictie induceert. Data-acquisitie wordt uitgevoerd in vier verschillende fasen (Figuur 3). - Start data-acquisitie volgens het manufacturer´s-protocol.
Opmerking: De software automatisch begeleidt gebruikers door de acquisitie proces. - 10 µL van PBS (voertuig) toepast op de vernevelaar en beginnen nebulization na 5 min van de acclimatisering. Vervolgens volgt u van een fase van de reactie van 3 min, waar Res (cmH2O/mL/s) en cDyn (mL/cmH2van O) worden gemeten. Aan het eind, door een herstelfase van 3 min te geven door het dier vóór de volgende nebulization.
- Volg de software door stapsgewijze toepassing van 10 µL van toenemende concentraties van methacholine (2,5 µg/10 µL 6,25 µg/10 µL en 12,5 µg/10 µL) op de ventilator.
- Zodra alle metingen zijn uitgevoerd en geregistreerd, het dier te door cervicale dislocatie offeren.
3. lung isolatie voor de kwantitatieve analyse van de Histomorphometric van volwassen muizen
- Diep anesthetize de dierlijke via intraperitoneale injectie van Xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht) en Ketamine (100 mg/kg lichaamsgewicht) (27 G naald en injectiespuit van 1 cc). Het geïnjecteerde volume moet 0,1 mL/10 g per lichaamsgewicht.
Opmerking: Na het bereiken van de staat van chirurgische tolerantie, de voorbereiding neemt ongeveer 5 min gevolgd door orgel perfusie en 30 min. voor fixatie. - Zodra het dier bereikt de status van chirurgische tolerantie (negatieve teen snuifje-reactie), desinfecteren van het dier met 70% ethanol en monteren van het dier op een pad met chirurgische tape.
- Offeren het dier door cardiale punctie en bloeden. Kort, open de buik met een mediale incisie door de huid en het buikvlies met behulp van botte schaar.
- Zoek de middenrif hoofd wijken van de lever en zorgvuldig de lever te scheiden van het middenrif.
- Maak een kleine snede in het middenrif met behulp van botte schaar en punctate het linkerventrikel van het hart met een naald van 20 G gekoppeld aan een 2-mL spuit. Langzaam exsanguinate het dier.
Opmerking: Langzaam en voorzichtig exsanguination is belangrijk om te voorkomen dat de ventrikels instorten als gevolg van de negatieve druk, remming van een ongestoorde bloedstroom. - Ontleden de longen door het openen van de thorax zachtjes via een snede van de parasternal langs de gehele lengte van de ribbenkast gebogen, botte schaar gebruikt.
- Daarna til de ribbenkast blootstellen de pleurale Holte (Figuur 3 c). Verwijder de zwezerik om te zien van het hart en de longen.
Opmerking: Optionele injectie van het rechterventrikel, gevolgd door perfusie van het vaatstelsel van longkanker met ijskoude PBS en vervolgens met een kleefpoeders oplossing [b.v.4% (massa/volume) paraformaldehyde (PFA)] is mogelijk. Wees ervan bewust dat er een verhoogd risico op scheuren alveolaire septum en negatieve invloed hebben op de structuur van de longen met behulp van deze methode. - Ontleden van de longen door eerste zorgvuldig verwijderen van het hart.
- Vervolgens passeren een 4-0 gevlochten chirurgische hechtdraad tussen de luchtpijp en de slokdarm met behulp van botte pincet.
- Vervolgens zorgvuldig de luchtpijp dichtbij het strottenhoofd tussen de tracheale kraakbeen incise, intubate met een intraveneuze canule (26 G) en de longen blazen door druk fixatie bij een constante druk van 20 cm H2O met behulp van kleefpoeders agent [b.v.4% (massa /volume) van PFA].
- PFA fixatie, laat de fixeerspray gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Daarna het afbinden van de luchtpijp en verwijder de canule. Vervolgens, de Long zorgvuldig accijnzen zonder nadelige gevolgen voor het weefsel, en sla het in kleefpoeders agent bij 4 ° C's nachts.
Opmerking: U kunt ook volgens de ATS/ETS consensus papier 2,5% GA gebufferd OsO4, Uracil oplossing wordt gebruikt voor de stabilisatie van het juiste weefsel. Zie voor verdere voorbereiding van weefsel, de consensus papier door Hsia et al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten van intraperitoneaal glucose tolerantie test (ipGTT) (Figuur 4), Long functie test (Figuur 5), en de vertegenwoordiger beelden ter illustratie van de haematoxyline en eosine gekleurd longen (Figuur 6).
De ipGTT werd uitgevoerd in zwaarlijvige muizen (blauw) na 7 weken van hoog-vet-dieet (HFD). Standaard dieet-gevoed muizen diende als besturingselementen (zwart). Zwaarlijvige muizen bleek verhoogde serum glucose niveaus 15 en 30 min na intraperitoneale glucose injectie, die aangeeft verminderde cellulaire glucose-opname (Figuur 4).
Onderzoek naar het effect van obesitas op de longfunctie, werd invasieve Long functie analyse uitgevoerd in zwaarlijvige muizen (blauw) na 7 weken van hoog-vet-dieet (HFD). Zwaarlijvige muizen toegenomen tot 1.5-fold van airway resistentie t.o.v. controle muizen (zwart) (Figuur 5).
Om te visualiseren van het effect van druk fixatie tijdens intratracheale instillatietest van fixatives op longkanker parenchym, worden representatieve beelden van haematoxyline en eosine gekleurd Long secties weergegeven (Figuur 6). Te weinig druk leidt tot meerdere un-opgeblazen gebieden, dikke alveolaire septum en veelhoekige gevormde longblaasjes (A), terwijl de resultaten van teveel druk op overdreven opgeblazen emfyseem-achtige gebieden met vernachelde alveolaire septum (C). Toepassing van de juiste druk tijdens Long fixatie leidt tot een volledig opgeblazen Long met ronde gevormde longblaasjes (B).
Figuur 1: schematische weergave van invasieve longfunctie. (A-C) Stappen van de tracheotomie. (D) de verbinding van het dier aan de voorplaat van de plethysmograph. (E) de installatie van de Hardware voor invasieve longfunctie. (F) Screenshot van data-acquisitie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schema van data-acquisitie te beoordelen van de bronchiale hyperreagibility. Data-acquisitie omvat een eerste acclimatisering periode (5 min), gevolgd door 30 s van stof nebulization, 3 min van reactie-fase en 3 min van herstel fase voorafgaande nebulization van volgende concentratie van de teststof. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: schematische weergave van de stappen van de voorbereiding. (A-D) Stappen van de tracheotomie. (A) insnijding van de huid. (B) Situs van de borstholte. (C) weergave na verwijdering van de ribbenkast. (D) weergave na verwijdering van het hart. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger intraperitoneaal glucose tolerantie test (ipGTT). C57Bl/6N muizen werden gevoed een vetrijke dieet voor 6-8 weken; controle muizen ontvangen een standaard dieet. n = 3; Bedoel ± SEM; statistische analyses uitgevoerd waren de two-way ANOVA-test en Bonferroni post-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: vertegenwoordiger Long functie test C57Bl/6N muizen werden gevoed een vetrijke dieet voor 6-8 weken; controle muizen ontvangen standaard dieet. n = 3; Bedoel ± SEM; statistische analyses uitgevoerd waren de two-way ANOVA-test en Bonferroni post-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: vertegenwoordiger beelden ter illustratie van de haematoxyline en eosine gekleurd longen. Drie verschillende soorten intratracheale inflatie: (A) te weinig druk, de nodige druk (B) en (C) teveel druk. UIA; samengevouwen gebied, OIA; over opgeblazen gebied; Beelden werden genomen onder 20 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Ventilator-instellingen | Spalte1 |
| Max. volume van de beroerte | 0,25 ml |
| Max. mond druk | 30cmH2, O |
| Diepe inflatie max. volume | 0,5 ml |
| Diepe inflatie max. Druk | 30cmH2, O |
| Tarief | 160 adem per minuut |
Tabel 1: Ventilator instellingen voor volwassen muizen. Voor kleinere dieren, de parameters van de ventilatie moeten worden aangepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit rapport bevat drie protocollen voor drie verschillende methoden voor het analyseren van de gevolgen van obesitas op glucose metabolisme en pulmonaire resultaten. Eerst de glucose tolerantie test biedt de mogelijkheid om het analyseren van intracellulaire glucose-opname en kan worden indicatie van insulineresistentie. Ten tweede, hele lichaam plethysmography is een techniek voor het meten van de longfunctie en is daarmee handig voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe behandelingen. Ten derde, een gestandaardiseerde fixatie protocol is essentieel voor kwantitatieve Morfometrische analyse naar het effect van obesitas op structurele veranderingen.
Dieet-geïnduceerde obesitas in dierlijk onderzoek
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden en toekomstige toepassingen: om na te bootsen menselijke eetgewoonten, die in overgewicht resulteren, voeding-geïnduceerde obesitas (DIO) modellen worden veel gebruikt bij knaagdieren. In vergelijking met het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen metabole ziekte na te bootsen, inschakelen DIO modellen analyse van etiologie, pathologie en toekomstige behandelingsopties. Een recente studie door Heydemann et al., geeft een overzicht van verschillende lymfkliertest vetrijke dieet modellen in diabetes onderzoek16. Specifieke wijzigingen van nutriënten componenten bieden de mogelijkheid van toekomstige studies naar het effect van de micro - en macro-nutriënten op de moleculaire mechanismen van obesitas, en daarmee op longkanker structuur en functie.
Wijzigingen en probleemoplossing: verschillende verslagen blijkt dat obesitas kan worden opgewekt door verschillende veranderingen in de samenstelling van de voeding voedingsstoffen16, kennis die op zijn beurt leidde tot de ontwikkeling van allerlei diëten in de afgelopen jaren, bijvoorbeeld heeft diëten hoog in vet of koolhydraten inhoud of een combinatie van beide diëten, oftewel de zogenaamde Westerse dieet16. Op het einde hangt de keuze van het dieet voor een studie af van de onderzoeksvraag en de doelstellingen van de studie. Naast controle voor deze belangrijke elementen, is de keuze van een goede controle van het grootste belang; anders, de interpretatie van de resultaten zal worden beperkt. Echter het fenotype wordt niet alleen veroorzaakt door het type van dieet, maar is ook een gevolg van het voederen periode, het geslacht en de muis stam17.
Beperkingen van de techniek: naast de samenstelling van verschillende voedingsstoffen in de voeding, de reactie van het dier en de achtergrond stam zou goed zijn voor de resultaten en het fenotype waargenomen door de inductie van obesitas. Bijvoorbeeld, heeft het aangetoond, dat de BALB/C muizen zijn meer vatbaar voor lever steatosis in vergelijking met C57Bl/6 muizen18. Lichte genetische variaties, bijvoorbeeldals gevolg van genetische drift (C57Bl/6J versus C57Bl/6N), kunnen ook van invloed op de gevoeligheid voor obesitas19. Dit benadrukt de beperkingen van de techniek werkt met genetisch gemodificeerde muizen met verschillende genetische achtergrond stammen, aangezien zelfs de stam en de leverancier waar de muizen werden verkregen de resultaten kunnen beïnvloeden.
Kritische stappen binnen het protocol: voor betrouwbare, reproduceerbare en vergelijkbare resultaten tussen de experimentele en controlegroepen, bij voorkeur nestgenoten moeten worden gebruikt voor het genereren van controle en experimentele muizen, omgevingsfactoren en stress moet vermeden, en controle muizen parallel met experimentele muizen12moeten worden bestudeerd.
Intraperitoneaal glucose tolerantie test (ipGTT)
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden en toekomstige toepassingen: om te bepalen van het effect van DIO op lymfkliertest metabolisme, andere screeningtests bestaan. Het Consortium muis metabole fenotypering Center (MMPC) werd opgericht om voor te stellen van de standaardmethoden voor het beoordelen van metabole fenotypes bij muizen en operationele standaardprocedures voor het beschrijven en uitvoeren van metabole tests van glucose heeft gepubliceerd homeostase in muizen12. Een GTT is een totaalaanpak om te meten hoe goed cellen van het lichaam na inname van een bepaalde hoeveelheid suiker, die op zijn beurt is een indicatie van de insuline secretie en effect van de insuline opname glucose kunnen zijn. Verschillen in serum insulineniveaus zijn vaak goed voor veranderde glucosetolerantie. Daarom de GTT uitgegroeid tot een van de meest gebruikte fysiologische tests te karakteriseren Muismodellen van diabetes en obesitas. Aangezien de ipGTT een snelle en gemakkelijke manier is, kan het worden gebruikt in toekomstige studies als een gestandaardiseerde methode voor het analyseren van het effect van het dieet en/of behandeling op metabolisme.
Wijzigingen en probleemoplossing: The GTT routinematig wordt uitgevoerd na een overnachting snel te egaliseren van de niveaus van de glucose van het bloed in muizen20. Aangezien de duur van de periode van vasten heeft een sterk effect op de onderzochte parameters en is moet daarom van groot belang voor de vergelijking en de interpretatie van de resultaten, de periode van vasten worden aangepast aan de leeftijd en lichaamsgewicht van muizen. Rekening houdend met dat muizen nachtdieren zijn en tweederde van de totale dagelijkse voedselinname 's nachts wordt verbruikt, lokt nacht vasten een katabole staat. Dus, het tijdstip van aanvang en de duur van het vasten een relevant effect hebben op de resultaten, en aldus deze parameters gestandaardiseerde12moeten zijn. Bovendien, langdurig vasten put lever glycogeen winkels en daarom vermindert variabiliteit in basislijn bloedglucose. Kortom, omdat glucose insuline-gestimuleerd gebruik in muizen is verbeterd na langdurig vasten perioden21, een 5 tot 6 uur vasten duur wordt aanbevolen om te beoordelen van insuline actie; Overwegende dat het nacht vasten is voldoende voor het testen van glucose gebruik12,20,22. Glucose wordt normaal toegediend via i.p. injectie en de dosis van glucose wordt aangepast aan het lichaam gewicht (meestal 1 of 2 g/kg lichaamsgewicht)20,22. In DIO modellen, wordt lichaamsgewicht verhoogd, voornamelijk als gevolg van een hogere vet massa; glucose-opname, echter komt overwegend voor in spieren, hersenen en lever. Aangezien het bedrag van deze weefsels wordt over het algemeen niet gewijzigd door DIO, ontvangen zwaarlijvig muizen een onevenredig hoog gehalte aan glucose in vergelijking met mager muizen, die op zijn beurt kunnen invloed hebben op de interpretatie van de gegevens en leiden tot een verkeerde diagnose gesteld glucose-intolerantie22 . Om deze reden, vasten perioden moeten worden gestandaardiseerd en lichaamssamenstelling moet worden beschouwd tijdens interpretatie van GTT resultaten23. Computer tomografie (CT) of magnetische resonantie imaging(MRI) scans zijn daarom van toepassing. Bijvoorbeeld, glucose metingen door hand-held volbloed glucose monitoren (Zie Tabel van materialen) zijn beschikbaar, en deze monitoren worden vaker gebruikt dan plasma glucose analysers. Als gevolg van het kleine bloed volumes verplicht - meestal 5 µL of minder - ze zijn praktischer dan plasma analysers.
Beperkingen van de techniek: snelste muizen vertonen van afhankelijkheid van de duur van het vasten en een aanzienlijk verlies in lichaamsgewicht, lichaamstemperatuur, bloed volume, en hartslag, alsmede veranderingen in serum parameters, zoals vrije vetzuren en ketonlichamen weergeven 24. deze metabole stress wordt veroorzaakt door het feit dat de temperatuur van de huisvesting van muizen in dierlijke voorzieningen is gestandaardiseerd tot ongeveer 23 ° C, en is daarom onder hun thermo-neutrale temperatuur van 30 ° C25. Langdurig vasten bij subthermo-neutrale temperaturen kan resulteren in torpor, gekenmerkt door een daling van de stofwisseling26,27.
Kritische stappen binnen het protocol: zoals hierboven vermeld, voor betrouwbare resultaten tussen de experimentele en controlegroepen, nestgenoten moeten bij voorkeur worden gebruikt tijdens de studie en de periodes van vasten, en tijd punten moeten worden gestandaardiseerd.
Long functie analyse
In dit protocol meet de plethysmograph direct druk wijzigingen die ademhaling, en de resulterende stromen in en uit de luchtwegen rijdt. Stromen worden gemeten door een pneumotachograph gelegen in de wand van de plethysmograph. Als u wilt uitsluiten van weerstand van de borstwand, luchtweg druk (mond druk) en transpulmonary (oesofageale buis) openen worden gemeten en luchtwegen-weerstand en dynamische naleving worden berekend. Dynamische naleving is berekend via het verschil van het volume van de minimale en maximale Long verdeeld via de informatiestroom.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden en toekomstige toepassingen: Plethysmography is de standaardprocedure voor het analyseren van de mechanische eigenschappen van de longen, en kan, daarom, worden gebruikt in toekomstige studies voor het analyseren van longkanker pathologie en behandeling opties. Om te vergelijken groepen en studies, is een gestandaardiseerde aanpak onmisbaar.
Wijzigingen en probleemoplossing: In het algemeen, deze techniek kan worden geclassificeerd als ongebreidelde en ingetogen hele lichaam plethysmography. Ongebreidelde methoden bepalen verbeterde pauze (Penh) en analyse van normale ademhaling patronen, inschakelen terwijl ingetogen, invasieve methoden direct meten van druk, flow of volume. Long mechanische eigenschappen worden bepaald door de weerstand en elastance; terwijl weerstand wordt berekend als de verhouding van de druk aan de stroom, weerspiegelt elastance de verhouding van de druk op de volume-28. In tegenstelling, ongebreidelde gehele lichaam plethysmography is alleen het meten van de druk binnen de plethysmograph, en daarom een berekening van weerstand en elastance is onmogelijk. In 2007, hebben Lundblad et al. verklaard dat Penh is niet de juiste parameter voor het meten van de weerstand van de luchtwegen, maar vertegenwoordigt een niet-specifieke weerspiegeling van de ademhaling patroon29. Dus voor de juiste schatting van de Long mechanica is invasieve plethysmography onmisbaar29,30,31.
Omdat ademhaling parameters is afhankelijk van de leeftijd en de grootte van de muizen, ventilatie parameters moeten worden aangepast. Bijvoorbeeld, de ademhalingsvolume betrekking heeft op lichaamsgewicht en moet worden ingesteld op 10 µL/g lichaamsgewicht met een frequentie van de ademhaling van 120-250 ademhalingen per minuut. Bij het aanpassen van deze parameters, moet de onderzoeker rekening houden dat de gemiddelde ademhalingsvolume omgekeerd is gerelateerd aan het respiratoire frequentie32. Aangezien spontane ademhaling druk, flow, en volume invloeden, de diepte van de verdoving moet worden gecontroleerd en ventilatie bochten moeten voortdurend worden nageleefd. Verdoving zelf kan echter direct nadelig beïnvloeden voor longfunctie. Bijvoorbeeld, beschermen Propofol en Ketamine gedeeltelijk tegen geïnduceerde airway vernauwing ten opzichte van Thiopental33. Bovendien, klinische studies hebben aangetoond dat Ketamine anticholinergica effect heeft en kan worden gebruikt als een potentiële bronchodilatator in ernstige astma34. Respiratoire anesthetica, zoals Isofluraan in combinatie met pijnbehandeling, worden beschouwd als een beheersbaar alternatief voor injectie anesthesie; echter irritatie van de luchtwegen na vluchtige anesthetica wordt gerapporteerd en daarom sluit inhalatie anesthetica als een alternatieve35.
Beperkingen van de techniek: de ingetogen invasieve methode voor het meten van de mechanische eigenschappen van de Long is te wijten aan de nodige tracheotomie, een definitieve procedure en daardoor beperkt de studie aan een single-point-analyse, zonder de mogelijkheid te onderzoeken van de ziekte progressie. Verklein de hoeveelheid invasiviteit en kan meting van de impedantie van de overdracht in de bewuste dieren plaatsvinden, waardoor aldus longitudinale studies. Echter bij het meten van respiratoire mechanica in niet-tracheotomized dieren, de weerstand van de neus draagt bij aan de totale weerstand van de luchtwegen en bemoeilijkt waardoor metingen na methacholine provocatie13.
Kritische stappen binnen het protocol: hier tonen we slechts één methode van invasieve longfunctie. Aangezien er bestaan verscheidene gevestigde invasieve Long functie methoden, standaardisatie binnen de studies en een uitvoerige beschrijving van de methode gebruikt, groepen, en een verdoving regime in publicaties is nodig om de studies te vergelijken.
Long excisie voor histomorphometric analyse
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden en toekomstige toepassingen: kwantitatieve histomorphometric analyse kan worden gebruikt om de impact van obesitas op de structuur van de longen (bronchiën en longblaasjes), te interpreteren van de resultaten van invasieve onderzoeken plethysmography, en te bestuderen of mogelijke behandelingsopties op pulmonaire uitkomst. Gegevens uit histologische evaluaties kan verschillen afhankelijk van kleefpoeders agenten en de gebruikte fixatie-procedure. Aangezien is gebleken dat obesitas een effect op alveolaire en bronchiale structuur, als goed als extracellulaire matrix en mobiele samenstelling heeft, is het noodzakelijk om een geschikte techniek op basis van de onderzoeksvraag in toekomstige studies. Voor onbevooroordeelde kwantitatieve morphometry, weefsel verwerking na fixatie moet worden uitgevoerd volgens de normen van de American Thoracic Society (ATS) / Europese Respiratory Society (ERS) voor kwantitatieve beoordeling van de Long structuur14 .
Wijzigingen en probleemoplossing: In 2010 gepresenteerd Hsia et al. een officiële verklaring van de ATS/ERS tot vaststelling voor kwantitatieve beoordeling van de structuur van de longen, die voorafgaand aan longkanker afzondering en fixatie rekening moet worden gehouden 14. naast intratracheale instillatietest van fixatives, in situ fixatie, vast volume fixatie of vacuüm inflatie kan worden uitgevoerd om het opblazen van pulmonaire weefsel36. Inflatie, en daardoor luchtruim uitbreiding, is afhankelijk van de fixatie procedures en de rang van de druk die tijdens de fixatie wordt toegepast. Hoge druk, bijvoorbeeld, kan leiden tot alveolaire muur breuk en daardoor de resultaten beïnvloeden. Gelijkaardig aan de parameters van de ventilatie, de ideale fixatie parameters afhankelijk van de leeftijd, de grootte en het fenotype van de muizen. Fixatie kan bereikt worden door chemische of fysische middelen, met inbegrip van chemische agentia en/of cryopreservatie. Intratracheale instillatietest van geschikte fixatives bootst weefsel inflatie tijdens de ademhaling, als gevolg van in-vivo -voorwaarden, en is daarom gebruikte37. 20-25 cm boven het hoogste punt van de longen wordt aanbevolen voor voldoende druk, met behulp van een brede en korte buis om snelle en uniforme penetratie14. Een belangrijke doelstelling van fixatie is om te voorkomen dat de degeneratie proces en het behoud van cellen en weefsels in een "levensechte staat", met behoud van de architectonische integriteit van de Long parenchym. Bovendien moet weefsel zijn reactiviteit antilichamen, vlekken en nucleïnezuur probes behouden. Naast het effect van normale autolyse, bijwerkingen van weefsel verwerking, met inbegrip van infiltratie met hete wax, snijden, en Wasuitsmeltovens, moet worden voorkomen. De keuze van fixeerspray evenals de verdere verwerking van het weefsel, bijvoorbeeld via insluiten, kan leiden tot weefsel krimp, zwelling en verharding van verschillende componenten en leiden tot artefacten, zoals de verhoogde autofluorescence38. Bijvoorbeeld, fixatie in 10% gebufferd formaline en verdere verwerking kan veroorzaken krimp van maximaal 20% - 30% ten opzichte van het oorspronkelijke volume39. Daarom Hsia et al. in hun paper consensus 2010 van de ATS/ERS aanbevelen het gebruik van 2,5% Glutaaraldehyde gebufferd met osmium tetroxide en uranyl acetaat om te voorkomen dat weefsel krimp. Volume van de Long, interne architectuur, fijnstructuur weefsel en cel structuur na de luchtweg instillation van deze kleefpoeders reagens14werd bewaard. Denaturatie van eiwitten en kruislings gekoppelde vorming zijn twee belangrijke mechanismen die belangrijk zijn in de fixatie van weefsel. Dehydraterend verbindingen of stollingsmiddelen, zoals alcoholen of aceton, veroorzaken denaturatie van eiwitten, wat resulteert in veranderingen van de tertiaire eiwitstructuur door destabiliserende hydrofobe bindingen. Non-coagulant fixing agenten zoals paraformaldehyde of Glutaaraldehyde chemisch reageert met de eiwitten en vorm tussen moleculaire en intra moleculaire cross-links. Omdat verschillende kleuring van procedures, zoals de haematoxyline en eosine-kleuring, is afhankelijk van Inter moleculaire interacties, kunnen kleuring resultaten arme, afhankelijk van de kleefpoeders agent. Antigeen-ophalen methoden in immunohistochemistry is gebleken dat sommige van de reacties van fixatie omkeerbaar zijn, met name die van formaldehyde40.
Beperkingen van de techniek: aangezien de alveolaire oppervlak voering wordt verwijderd door intratracheale instillatietest van fixatives, de interpretatie van, bijvoorbeeld, alveolaire-microarchitectuur, ophoping van slijm, of inflammatoire cel migratie kan worden gemanipuleerd 41 , 42 , 43.
Kritische stappen binnen het protocol: hier laten we zien de intratracheale instillatietest van 4% PFA als een brede aanpak om te visualiseren van het effect van obesitas op pulmonaire resultaten. Zoals hierboven vermeld, moet het protocol worden aangepast afhankelijk van de onderzoeksvraag, volgens de ATS/ERS aanbevelingen14.
Naast de eerder genoemde parameters is stress een belangrijke factor die onderzoeksresultaten beïnvloeden. Daarom opleiding beide muizen en de wetenschapper is onmisbaar. Muizen moeten worden aangepast aan de beteugeling en overgedragen moeten worden aan het experimentele gebied onder rustige omstandigheden44. Stress invloed op metabolisme, bijvoorbeeld als gevolg van stress-hormonen, vrijgegeven glucoseniveaus zijn toegenomen, een effect dat kan worden geïnterpreteerd als een verminderde glucosetolerantie. Stress hormoon release verandert ook gevoeligheid voor verdoving drugs, specifiek, de dosis van verdoving wordt verhoogd en de tijd om te bereiken van chirurgische tolerantie wordt verlengd. Zoals vermeld, kan de toegenomen hoeveelheid verdoving beïnvloeden bronchoconstrictie, terwijl de stress zelf bronchiale maagdilatatie kan veroorzaken.
Kortom biedt dit artikel drie methoden voor de beoordeling van de gevolgen van obesitas en metabolisme op longkanker structuur en functie in muizen. Alle genoemde methoden kunnen worden overgedragen aan andere ziekte modellen en andere knaagdiersoort, zoals obesitas als gevolg van genetische modificaties of rat modellen. De toepassing van deze technieken kunnen nuttig zijn om te definiëren van nieuwe moleculaire mechanismen in DIO modellen met specifiek gen ablatie, of voor het testen van nieuwe therapeutische benaderingen om te behandelen/voorkomen van de nadelige gevolgen van obesitas op chronische longziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De experimenten werden ondersteund door de Marga en Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Duitsland; Project 210-02-16 (MAAA), Project 210-03-15 (MAAA) en door de Duitse Research Foundation (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Duitsland; Centrum voor moleculaire geneeskunde Keulen (CMMC; Universitair ziekenhuis Keulen; Carrière Advancement programma; MAAA), Köln Fortune (faculteit geneeskunde, Universiteit van Keulen; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
References
- Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
- Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes? International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
- Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
- Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
- Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
- Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
- Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
- Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
- Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
- McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 12 11-11 12-14 (2008).
- Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
- Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
- Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
- Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
- Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
- Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
- Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance! Eur Respir J. 30, 805 (2007).
- Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
- Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
- Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
- Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
- Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
- Rolls, G. Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
- Winsor, L. Tissue processing. Laboratory histopathology. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
- Histochemistry, theoretical and applied. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).
- Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
- Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).
