Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן, מדידה של תפקודי ריאה של קיבעון של הריאה לחקור את ההשפעה של השמנת יתר, חילוף חומרים לקוי על תוצאות ריאתי

Published: March 15, 2018 doi: 10.3791/56685
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 2, 3, 2, 1,2
1Translational Experimental Pediatrics, Experimental Pulmonology, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, University of Cologne, 2Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, University of Cologne, 3Division of Experimental Pediatrics and Metabolism, University Children's Hospital, Heinrich Heine University Düsseldorf

Summary

השכיחות של השמנת יתר עולה ומגבירה את הסיכון של מחלות ריאה כרונית. להקים את המנגנונים שבבסיס ואת אסטרטגיות מניעה, חיה מוגדרים היטב דרושים מודלים. כאן, אנו מספקים שלוש שיטות (גלוקוז-סובלנות-בדיקה, הגוף plethysmography של הריאה קיבוע) לחקור את ההשפעה של השמנת יתר על תוצאות ריאתי בעכברים.

Abstract

השמנת יתר בעיות נשימה בעיות בריאות קשות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. השמנת יתר הופכת למגיפה המתעוררים עם מספר הצפוי של מעל 1 מיליארד אנשים שמנים ברחבי העולם 2030, ובכך המייצג נטל חברתי-כלכלי הולך וגדל. במקביל, הקשורות להשמנת יתר מחלות רקע, כולל סוכרת, כמו גם מחלות ריאה כרוניות, והלב הם ברציפות בעלייה. למרות ההשמנה נמצא קשור לסיכון מוגבר עבור אסטמה exacerbations, החמרה של תסמינים נשימתיים, ושליטה המסכן, תפקיד פונקציונלי השמנה וחילוף החומרים מודאג בפתוגנזה של מחלת ריאות כרונית היא לעתים קרובות underestimated, ולהישאר המנגנונים המולקולריים שבבסיס חמקמק. מאמר זה שואף להציג את השיטות כדי להעריך את ההשפעה של השמנת יתר על חילוף החומרים, כמו גם ריאות מבנה ותפקוד. כאן, אנו מתארים שלוש טכניקות ללימודי עכברים: (1) ובחינת בקרום הבטן גלוקוזה (ipGTT) כדי לנתח את השפעת השמנת יתר על חילוף החומרים של הגלוקוז; (2) מידת ההתנגדות דרכי הנשימה (במיל ') ותאימות מערכת הנשימה (Cdyn) כדי לנתח את השפעת השמנת יתר על תפקוד הריאות; (3) אופן ההכנה, קיבוע של הריאה להערכת היסטולוגית כמותיים הבאים. מחלות ריאה הקשורים להשמנה הם כנראה multifactorial, הנובעות מערכתית dysregulation דלקתיות וחילוף זה פוטנציאל לרעה על תפקוד הריאות ואת התגובה לטיפול. לכן, מתודולוגיה מתוקננת ללמוד המנגנונים המולקולריים ואת השפעת טיפולים חדשניים חיוני.

Introduction

על-פי ארגון הבריאות העולמי (WHO) בשנת 2008, יותר מ- 1.4 מיליארד מבוגרים, בגילאי 20 ומעלה, היו בעלי משקל עודף עם מדד מסת הגוף (BMI) גדול או שווה ל- 25; יתר על כן, יותר מ-200 מיליון אנשים, כמעט 300 מיליון נשים היו שמנים (BMI≥30)1. השמנת יתר תסמונת מטבולית גורמי סיכון עיקריים עבור מספר רב של מחלות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בעוד השמנת יתר, והמצוות מוגברת שומן לבן מסה בצורה אינטימית נקשר הקלד2,2 סוכרת3, מחלות קרדיו-וסקולרית, כולל מחלת לב כלילית (CHD), אי ספיקת לב (HF), פרפור פרוזדורים4 דלקת מפרקים ניוונית5, תפקידיהם פונקציונלי בפתוגנזה של הפרעות נשימה נשארים ממעטים להבין. עם זאת, מחקרים אפידמיולוגיים הדגימו כי השמנת יתר הוא קשור מאוד עם נשימה כרוניות, כולל exertional קוצר נשימה, תסמונת דום נשימה בשינה חסימתית (OSAS), השמנת יתר hypoventilation תסמונת (OHS), כרונית מחלת ריאות חסימתית (COPD), תסחיף ריאתי, שאיפה דלקת ריאות, אסטמה6,7,8,9. מנגנונים פוטנציאליים קישור השמנה וחילוף החומרים מודאג, למשל, עמידות לאינסולין ועל סוג סוכרת II, בפתוגנזה של מחלת ריאות כרונית לא רק מהווים ההשלכות מכני והפיזי של משקל רווח אלא גם אוורור זירוז של המדינה דלקתית כרונית subacute10,11. עלייתו של השמנת יתר, מחלות ריאה בעשור האחרון, יחד עם העדר אסטרטגיות מניעה אפקטיביות וגישות טיפוליות, מדגיש את הצורך לחקור את המנגנונים המולקולריים להגדרת דרכים חדשות כדי לנהל ריאות הקשורות להשמנת יתר מחלות.

כאן, אנו מתארים שלוש בדיקות תקן, אשר הם יסודות חשוב לחקור ההשמנה והשפעתה על ריאות מבנה ותפקוד במודלים של העכבר: גלוקוז (1) בקרום הבטן סובלנות (ipGTT) (2) מדידה של דרכי הנשימה ההתנגדות (במיל '), מערכת הנשימה תאימות מערכת (Cdyn); (3) אופן ההכנה, קיבוע של הריאה להערכת היסטולוגית כמותיים הבאים. IpGTT הוא מבחן הקרנה חזקה כדי ספיגת הגלוקוז מידה, ולכן ההשפעה של השמנת יתר על חילוף החומרים. הפשטות של השיטה מאפשרת סטנדרטיזציה טוב, ולכן את comparability של תוצאות בין מעבדות. שיטות מתוחכמות יותר, כמו מלחציים hyperglycemic או מחקרים על איים מבודדים, יכול לשמש לניתוח מפורט של פנוטיפ מטבולית12. כאן נוכל להעריך גלוקוזה להגדרת מצב הקשורים להשמנה של הפרעה מערכתית וחילוף כבסיס ללימודי על תוצאה ריאתי. כדי להעריך את ההשפעה של השמנת יתר, הפרעות מטבוליות על תפקודי ריאה, מדדנו התנגדות דרכי הנשימה (במיל ') ותאימות מערכת הנשימה (Cdyn). לאפיון מחלות ריאה, שיטות ערככם וכן מאופקת עבור הערכה של תפקוד הריאות הינם זמינים. Plethysmography ערככם במעבר בחופשיות חיות מחקה מצב טבעי, המשקף את דפוסי נשימה; לעומת זאת, שיטות פולשניות, כגון מדידת עכבת Res, cDyn בעכברים עמוקות ומורדמת ולהעריך מכניקת ריאות דינמי, הן מדויקות יותר13. מאז כרוניות בדרכי הנשימה משתקפים על ידי שינויים היסטולוגית של רקמת הריאה, ריאות תקין קיבוע לצורך ניתוח נוסף הוא בלתי נמנע. הבחירה של השיטה של קיבוע הרקמה והכנות תלוי התא של הריאה אשר להילמד, לדוגמה, ניצוח איירווייז או parenchyma הריאה14. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת הערכה כמותיים של דרכי הנשימה ניצוח לחקור את ההשפעה של השמנת יתר על פיתוח אסטמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים אושרו על ידי רשויות מקומיות (קרקע NRW, AZ: 2012.A424), היו בהתאם לחוק הגרמני רווחת בעלי חיים והתקנון על רווחתם של בעלי החיים שבהם משתמשים עבור ניסויים או למטרות מדעיות אחרות. מאז ניתוח תפקוד הריאות עלולה להשפיע על מבנה הריאות ומנתח הבאים ולכן היסטולוגית, מדידת Res Cdyn, הכנה ואת קיבוע של הריאה עבור histomorphometry צריכה להתבצע בבעלי חיים שונים. עם זאת, מדידה של מיל ו- Cdyn בעקבות ipGTT אפשרי. מאז מתח במהלך ipGTT עלולה להפריע בהרדמה לצורך תפקוד הריאות בדיקות, תקופת ההחלמה כשבועיים לאחר ipGTT מומלץ לאפשר עכברים להתאושש ירידה במשקל הגוף ושינוי פרמטרים דם12.

1. הכנה בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן (ipGTT)

הערה: לאחר 12 שעות של צום, ipGTT השלם לוקח כ 2 h.

  1. מאז הלחץ משפיע על רמת הסוכר בדם באופן משמעותי, ודא כי שני התאקלמות של עכברים, כמו גם הכשרה של המדען, מבוצעות.
  2. העברת החיות לאזור הניסוי בתנאים שקטה ורגועה.
  3. שקול את היישום של דיאטה hypercaloric לזירוז השמנת יתר בעכברים. עיין בסעיף הדיון לייעוץ נוסף.
  4. חיות מהירות של 12 שעות בין לילה, מבלי להגביל גישה למים. למחרת, לאחר 12 שעות של צום, הכנת מד הסוכר הדם על פי היצרן של פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הוספת ציור נסיון החדשות ליציאת רצועת הבדיקה.
  5. פצעים וחתכים בקצה הזנב באמצעות מספריים סטרילי, תוך שמירה על העכבר על זנבו, בעדינות, מיד למדוד את רמת הסוכר בדם התענה על-ידי החלת טיפה דם זורמת (מינימום מדגם בגודל 0.5 µL) רצועת הבדיקה של מד גלוקוז בדם.
    הערה: טיימר מתחיל על המסך לאחר יישום מספקת דגימת הדם. לאחר 4 s, תוצאת הבדיקה מופיעה על המסך.
  6. לאחר מכן, שוקל, תווית החיות בנפרד באמצעות צבע סימון.
  7. לנהל דור 2 גלוקוז/ק"ג גוף במשקל באמצעות בקרום הבטן הזרקה. ודא כי אמצעי האחסון הזרקת 0.1 מ"ל/10 גרם משקל (27 G מחט, מזרק 1 סמ ק).
  8. לאחר מכן, למדוד רמת הסוכר בדם אחרי 15, 30, 60, 120 דקות על-ידי החלת טיפת דם זורמת למפצל מבחן חדש.
    הערה: זרימת הדם יכול להיות מוגברת על ידי עיסוי עדין של המחלקות הקצה הזנב. אם הפצע זנב encrusts, נקה אותו באמצעות מקלון סטרילי ספוגה פתרון נתרן כלוריד 0.9%.
  9. לאפשר את החיות לנוח בכלובים שלהם הביתה עם גישה בלתי מוגבלת למים בין המדידות.

2. ריאות ניתוח פונקציה מדידה Res, cDyn

הערה: למדידה ללא הפרעה בין Res cDyn, עכברים צריך להיות מאוורר תחת הרדמה עמוקה. נטולת מתחים לטיפול בבעלי חיים, פיקוח נאות של הרדמה חיוניים. לקבלת הוראות כלליות תוך שימוש בטכניקות סטריליות, נא עיין במאמר על-ידי Hoogstraten-מילר. et al. 15

  1. לכייל את היא תגלה לפני כל קבוצה של ניסויים ולהכין את ההגדרות מחקר בתוך התוכנה (ראה טבלה של חומרים).
  2. לפני הניתוח, עמוק עזים ומתנגד חיות דרך בקרום הבטן הזרקה של חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף), קטמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) (27 G מחט, מזרק 1 סמ ק). ודא כי אמצעי האחסון הזרקת 0.1 מ"ל/10 גרם לכל משקל גוף.
    הערה: מאז קטמין יש אפקט כאבים נאות בעכברים, אין טיפול כאב נוסף הכרחי. הליך פולשני והכו אותי קטטר/היא תגלה אורכת כ- 5-7 דקות, ולאחר מכן הנתונים יכול להתחיל.
  3. הנח את העכבר במצב פרקדן על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
  4. מכסים את העיניים עם משחה למניעת יובש תחת הרדמה.
  5. כל הזמן לפקח על העומק של הרדמה באמצעות הבוהן קמצוץ-התגובה.
    הערה: ממשל נוספים של הרדמה ייתכן הדרוש לשמירה על מטוס כירורגי של הרדמה.
  6. להרטיב את הפרווה של האזור כירורגי באזור בלוטת התריס עם 70% אתנול.
  7. בזהירות פצעים וחתכים האמצע עבור 1 ס מ בין החריץ צוואר של עצם החזה symphyses פקעת של mentum העור באמצעות הרמת אותו עם מלקחיים חיתוך העור תחת בדיקה ויזואלית באמצעות מספריים בוטה (איור 1 א').
  8. דמיינו את רקמת השומן התת עורית הבסיסית ואת בלוטת התריס.
  9. חושפים את קנה הנשימה על ידי בקפידה בוטה המפריד בין שתי אונות בלוטת התריס מצר, דיסקציה של sternothyroid ושל sternothyroid השרירים (איור 1B). להיזהר לא לפגוע בכל כלי, לגרום לדימום, מאחר שהדבר עלול לגרום השפעות שליליות על מערכת הלב וכלי הדם, ובסופו של דבר על המדידות.
  10. לאחר מכן, תעביר בתפר כירורגי קלועה 4-0 בין הנשימה לבין הוושט באמצעות מלקחיים בוטה. בזהירות פצעים וחתכים קנה הנשימה קרוב הגרון בין הסחוסים והכו אותי עם מספריים מיקרו.
  11. לצנרר עם צינור הנשימה (0.04 אינץ/1.02 מ"מ קוטר) תחת שליטה ויזואלית (איור 1C). לתקן את הצינור דרך מצדו עם תפירה כדי למנוע נזילה במערכת.
  12. הבא, להעביר את החיה המיטה מחוממת של גוף התא, לחבר את הצינור בקנה הנשימה לצלחת הפנים (איור 1D) והפעל האוורור על-ידי לחיצה על כפתור אוורור בלוח הקדמי של הבקר (איור 1E).
  13. סקר האוורור על ידי התבוננות את תנועת בית החזה contemporaneously עם קצב האוורור. כדי לאשר השמה נכונה של הצינור בקנה הנשימה, ודא כי שני הצדדים של בית החזה להעביר בו זמנית.
  14. . שימו לב ללחץ אות על מסך המחשב (איור 1F). ודא עקומות אוורור אחיד. אם זה לא המקרה, לנתק את החיה, נבדוק את הצד ניתוח. היזהרו דם או ליחה חוסמת את הצינור בקנה הנשימה.
    הערה: לבעלי-חיים למבוגרים עם משקל הגוף של 20-25 גרם, ההגדרות הנשמה כמודגם באיור 2 הם הציעו בהתאם להמלצות היצרן.
  15. כדי לשלוט שינויי הלחץ הטרנס-ריאות במהלך אוורור, הכנס של צינור הוושט (0.04 אינץ/1.02 מ"מ קוטר) לתוך הוושט בעומק המעריכה את הרמות של הריאות. תסתכל על המסך בעת הנחת הצינור. במקום שבו לחץ מקסימלי סטיה וחפצים לב מינימלית ניתן לראות על המסך את הצינור.
  16. לאחר הניתוח, להכין את החיה המדידה. מזריק הרדמה דרך בקרום הבטן הזרקה של קטאמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) באמצעות מחט 27-G ו- 1 במזרק cc. ודא כי אמצעי האחסון הזרקת 0.1 מ"ל/10 גרם לכל משקל גוף.
    הערה: כדי להעריך hyperreagibility הסמפונות, nebulize בדיקת אתגור, אגוניסט קולטן מוסקריניים לא בררניים של מערכת העצבים הפאראסימפתטית, אשר גורם bronchoconstriction. חדרי קירור והקפאה מבוצעת בארבעה שלבים שונים (איור 3).
  17. התחל ייבוא נתונים לפי הפרוטוקול manufacturer´s.
    הערה: התוכנה באופן אוטומטי המדריכים משתמשים בתהליך הרכישה.
  18. למרוח את µL 10 ל- PBS (הרכב) מפוחים, ולהתחיל nebulization אחרי 5 דקות של והפיזיולוגי. לאחר מכן, בצע שלב התגובה של 3 דקות, בו נמדדים Res (cmH2O/mL/s), cDyn (mL/cmH2O). בסוף, לספק שלב ההתאוששות של 3 דקות החיה לפני nebulization הבא.
  19. בצע את התוכנה על ידי יישום stepwise µL 10 של הגדלת ריכוזים של בדיקת אתגור (2.5 µL µg/10, µL µg/10 6.25 ו 12.5 µL µg/10) על ההנשמה.
  20. לאחר כל המדידות בוצעו נרשמה, להקריב את החיה על ידי נקע בצוואר הרחם.

3. ריאות בידוד לניתוח Histomorphometric כמותית של עכברים בוגרים

  1. עמוק עזים ומתנגד בבעלי חיים באמצעות בקרום הבטן הזרקה של חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף), קטמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) (27 G מחט, מזרק 1 סמ ק). אמצעי האחסון הזרקת צריך להיות 0.1 מ"ל/10 גרם לכל משקל גוף.
    הערה: כשמגיעים המדינה של ניתוח רגישות, ההכנה לוקח כ 5 דקות ולאחר מכן על ידי איבר זלוף, 30 דקות עבור קיבעון.
  2. ברגע החיה הגיעה המדינה של ניתוח סובלנות (הבוהן שלילי קמצוץ-תגובה), לחטא את החיה עם 70% אתנול, לתקן את החיה על משטח הדבקה.
  3. להקריב את החיה על ידי ניקוב לב ודימום. בקצרה, לפתוח את הבטן עם חתך המדיאלי דרך העור של הצפק באמצעות מספריים בוטה.
  4. אתר המחלקות ראש הסרעפת של הכבד, ולאחר הפרד בזהירות את הכבד מהסרעפת.
  5. עושים חתך קטן בתוך הסרעפת שימוש במספריים קהים, punctate החדר השמאלי של הלב עם מחט 20 גרם המצורפת מזרק 2-mL. לאט לאט תדמם החיה.
    הערה: דימום למוות איטי וזהיר חשוב למניעת החדרים קורסת בשל הלחץ השלילי, עיכוב של זרימת הדם ללא הפרעה.
  6. לנתח את הריאה על ידי פתיחת בית החזה בעדינות דרך חתך מתחת לכל אורכו של כלוב הצלעות באמצעות מספריים מעוגלים, בוטה.
  7. לאחר מכן, הרם את כלוב הצלעות לחשוף את חלל הצדר (איור 3C). להסיר את בלוטת התימוס כדי לראות את הלב והריאות.
    הערה: הזרקה אופציונלי של החדר הימני, ואחריו זלוף של מערכת כלי הדם בריאה עם PBS קר כקרח, ולאחר מכן עם פתרון מקבע [למשל, 4% (מסה/נפח) paraformaldehyde (PFA)] אפשרי. דע כי יש סיכון מוגבר לקרע septae מכתשי, להשפיע לרעה על מבנה הריאות באמצעות שיטה זו.
  8. לנתח את הריאה על ידי הראשון בזהירות להסיר את הלב.
  9. לאחר מכן, תעביר בתפר כירורגי קלועה 4-0 בין הנשימה לבין הוושט באמצעות מלקחיים בוטה.
  10. בשלב הבא, בזהירות פצעים וחתכים קנה הנשימה קרוב הגרון בין הסחוסים והכו אותי לצנרר עם בצינורית תוך ורידי (26 גרם), לנפח הריאה על ידי לחץ קיבעון, בלחץ קבוע של 20 ס מ H2O באמצעות הסוכן מקבע [למשל, 4% (מסה /volume) של כדורגלן].
  11. עבור כדורגלן קיבעון, להשאיר את מקבע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מאתרים ומפסיקים את קנה הנשימה ולהסיר את הצינורית. לאחר מכן, לסלק את הריאה בזהירות מבלי לפגוע הרקמה, לאחסן אותו לשבועיים סוכן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: לחלופין, על-פי ATS/החוצנים קונצנזוס נייר 2.5% GA buffered OsO4, אורציל פתרון משמש לייצוב הרקמה הנכונה. הכנה נוספת רקמות, ראית את העיתון הסכמה מאת Hsia. et al. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נציג תוצאות של בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן (ipGTT) (איור 4), ריאות פונקציה מבחן (איור 5), נציג ותמונות הממחישות hematoxylin ואאוזין מוכתם הריאות (איור 6).

IpGTT בוצעה בעכברים שמנים (כחול) לאחר 7 שבועות של high-שומן-דיאטה (HFD). תקן דיאטה-fed עכברים שימש פקדים (שחור). העכברים המשמינים הראה סרום מוגברת גלוקוז רמות 15 עד 30 דקות לאחר ההזרקה גלוקוז בקרום הבטן, המציין נפגעת ספיגת הגלוקוז הסלולר (איור 4).

לבחון את ההשפעה של השמנת יתר על תפקודי ריאה, בוצע ניתוח תפקוד הריאות פולשני בעכברים שמנים (כחול) לאחר 7 שבועות של high-שומן-דיאטה (HFD). העכברים המשמינים הראה עלייה עד 1.5-fold של דרכי הנשימה התנגדות לעומת בקרת עכברים (שחור) (איור 5).

כדי להמחיש את ההשפעה של הלחץ שנצמד במהלך intratracheal החדרה של כתות ומייצבים parenchyma הריאה, נציג תמונות של hematoxylin אאוזין צבעונית ריאות מקטעים מוצגים (איור 6). מעט מדי לחץ מוביל מרובות אזורים בלתי מופרז, septae מכתשי עבה של alveoli בצורת מצולע (A), בעוד מדי תוצאות הלחץ באזורים כמו נפחת יתר המנופח עם ממזבח מכתשי septae (C). יישום של הלחץ המתאים במהלך ריאות קיבוע מוביל ריאה המנופח לחלוטין עם alveoli בצורת עגול (B).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של תפקודי ריאה פולשני. (א-ג) השלבים של פיום קנה. (ד) את החיבור של החיה לצלחת הפנים של היא תגלה. (ה) התקנת החומרה עבור תפקודי ריאה פולשני. מסך (F) של הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ערכת רכישת נתונים כדי להעריך את הסמפונות hyperreagibility. חדרי קירור והקפאה כולל תקופה להתאקלמות הראשונית (5 דקות), ואחריו 30 s של חומר nebulization, 3 דקות של השלב תגובת ו- 3 דקות של שחזור שלב nebulization מוקדמת של ריכוז החומר הבא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ייצוג סכמטי של שלבי ההכנה. (י-ם) השלבים של פיום קנה. (א) החתך של העור. סיטוס (B) של חלל בית החזה. (ג) תצוגה לאחר הסרת הצלעות. (ד) תצוגה לאחר ההסרה של הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: בדיקת עמידות נציג הגלוקוז בקרום הבטן (ipGTT). C57Bl/6N עכברים הואכלו בדיאטה עתירת שומן עבור 6-8 שבועות; בקרת עכברים קיבלה דיאטה רגילה. n = 3; זאת אומרת ± SEM; ניתוחים סטטיסטיים ביצע היו מבחן ANOVA דו-כיווני Bonferroni posttest. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: כשהילדים פונקציית ריאות נציג C57Bl/6N עכברים הואכלו בדיאטה עתירת שומן עבור 6-8 שבועות; בקרת עכברים קיבלה דיאטה רגילה. n = 3; זאת אומרת ± SEM; ניתוחים סטטיסטיים ביצע היו מבחן ANOVA דו-כיווני Bonferroni posttest. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: להחליפן בתמונות הממחישות hematoxylin & אאוזין צבעונית הריאות. שלוש דרגות שונות של האינפלציה intratracheal: (א) מעט מדי לחץ, הלחץ הראוי (B) ו- (ג) יותר מידי לחץ. מגבית; באזור מצומצמים, אויה (oia); על פני שטח המנופח; התמונות צולמו תחת 20 X הגדלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגדרות ההנשמה Spalte1
. מקס. נפח פעימה 0.25ml
. מקס. לחץ פה 30cmH2O
מקסימום עמוק האינפלציה. נפח 0.5 ml
מקסימום עמוק האינפלציה. לחץ 30cmH2O
קצב 160 נשימה לדקה

טבלה 1: ההנשמה הגדרות עבור עכברים בוגרים. לבעלי-חיים קטנים, הפרמטרים אוורור צריכים להיות מותאמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דוח זה מספק שלושה פרוטוקולים עבור שלוש שיטות שונות לנתח את השפעת השמנת יתר על מטבוליזם הגלוקוז ותוצאות ריאתי. ראשית, הבדיקה סובלנות גלוקוז מציעה את ההזדמנות כדי לנתח את ספיגת הגלוקוז תאיים, יכול להיות מעיד על עמידות לאינסולין. שנית, כל הגוף plethysmography היא טכניקה כדי למדוד את תפקוד הריאות, ובכך מועיל לבדוק את יעילותם של טיפולים חדשניים. שלישית, פרוטוקול קיבוע מתוקננת חיוני לניתוח כמותי morphometric להעריך את ההשפעה של השמנת יתר על שינויים מבניים.

דיאטה-induced השמנת יתר מחקר בבעלי חיים

משמעות שיטות קיימות, יישומים עתידיים: לחקות האנושי הרגלי האכילה, והתוצאה של השמנת יתר, השמנת יתר דיאטה-induced (דיו) מודלים נמצאים בשימוש נרחב מכרסמים. לעומת השימוש של עכברים מהונדסים מחקה מחלות מטבוליות, מודלים דיו לאפשר ניתוח של אטיולוגיה, פתולוגיה ואפשרויות טיפול בעתיד. סקירה לאחרונה על ידי Heydemann. et al., מספק סקירה של דגמים שונים תזונה עתירת שומן מאתר מחקר סוכרת16. שינויים ספציפיים של רכיבים תזונתיים מספקים את האפשרות של מחקרים עתידיים של ההשפעה של מיקרו, מאקרו-מזינים על המנגנון המולקולרי של השמנת יתר, ועל ידי כך על ריאות מבנה ותפקוד.

שינויים ופתרון: דיווחים שונים מראים כי השמנת יתר יכולה להיגרם על ידי שינויים שונים בהרכב של חומרים מזינים תזונתיים16, הידע אשר, בתורו, הוביל את הפיתוח של מגוון דיאטות בשנים האחרונות, לדוגמה, דיאטות גבוהה בתוכן שומן או פחמימות או שילוב של שניהם דיאטות, אשר כביכול המערבי דיאטה16. בסופו של דבר, הבחירה של תזונה עבור מחקר תלוי שאלת המחקר מטרות המחקר. מלבד שליטה על גורמים חשובים אלה, הבחירה של תזונה ראויה הוא בעל חשיבות עליונה; אחרת, הפרשנות של התוצאות תהיה מוגבלת. ובכל זאת, פנוטיפ נגרמת לא רק הסוג של דיאטה, אבל הוא גם תוצאה של תקופת האכלה, מגדר, העכבר זן17.

מגבלות של הטכניקה: ליד ההרכב של רכיבים תזונתיים שונים של הדיאטה, התגובה של בעלי חיים לבין המתח רקע יכול להסביר את התוצאות ואת של פנוטיפ (פירושונים) אינדוקציה של השמנת יתר. לדוגמה, הוכח, כי BALB/C עכברים רגישים יותר steatosis הכבד בהשוואה ל- C57Bl/6 עכברים18. וריאציות גנטיות קלה, למשל, בשל סחף גנטי (C57Bl/6J לעומת C57Bl/6N), יכול להשפיע גם על הרגישות השמנת יתר19. זה מדגיש את המגבלות של טכניקת עבודה עם עכברים מהונדסים עם זנים שונים הרקע הגנטי, שכן אפילו את המתח ואת הספק שממנו התקבלו העכברים יכול להשפיע על התוצאות.

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול: לתוצאות אמין לשחזור, השוואה בין ניסיוני, קבוצות שליטה, רצוי הארנבונים מאותה אמור לשמש ליצירת פקד, עכברים ניסיוני, גורמים סביבתיים, מתח צריך להיות להימנע, ועל בקרת עכברים צריך להילמד במקביל עם עכברים ניסיוני12.

בדיקות רגישות גלוקוז בקרום הבטן (ipGTT)

משמעות שיטות קיימות, יישומים עתידיים: כדי לקבוע את ההשפעה של דיו על חילוף חומרים מאתר, קיימות בדיקות סינון שונות. . האיחוד העכבר מטבולית Phenotyping סנטר (MMPC) הוקמה כדי להציע בשיטות הרגילות להערכת פנוטיפים מטבולית בעכברים ופרסם נהלי עבור המתאר וביצוע בדיקות מטבוליות של גלוקוז הומאוסטזיס עכברים12. GTT היא גישה גלובלית כדי למדוד עד כמה התאים של הגוף הם מסוגלים ספיגת הגלוקוז לאחר בליעת כמות נתונה של סוכר, אשר בתורו מעיד על הפרשת האינסולין ותוצאה אינסולין. הבדלים ברמות אינסולין סרום בחשבון לעתים קרובות גלוקוזה מסולף. לכן, GTT הפך לאחד של בדיקות פיזיולוגיות הנפוצה ביותר כדי לאפיין את העכבר מודלים של סוכרת והשמנה. מאז ipGTT היא גישה קלה ומהירה, זה יכול לשמש במחקרים עתידיים שיטה סטנדרטית כדי לנתח את השפעת תזונה ו/או טיפול על חילוף החומרים.

שינויים ופתרון: GTT מתבצע באופן שגרתי בעקבות מהיר לילה לאזן את רמות הגלוקוז בדם עכברים20. מאז משך תקופת צום יש אפקט חזק על הפרמטרים ובדוקים, והוא לכן חשיבות רבה עבור השוואה ופרשנות של התוצאות, תקופת צום צריך להיות מותאם לגיל, למשקל של עכברים הגוף. אם לוקחים בחשבון כי עכברים הם בעלי חיים ליליים, שני שלישים של סך צריכת המזון היומית נצרך בן לילה, לילה צום מעורר מצב קטבולי. לפיכך, נקודת הזמן של חניכה, משך הצום יש השפעה מאוד רלוונטי על התוצאות, לכן פרמטרים אלה צריך להיות12מתוקננת. יתר על כן, צום ממושך מכלה את מאגרי הגליקוגן בכבד, ולכן ומפחיתה השתנות של רמת הסוכר בדם בסיסית. לסיכום, מאז ניצול הגלוקוז האינסולין בעכברים מוגברת לאחר שהוארך צום תקופות21, 5 עד 6 שעות צום משך מומלץ כדי להעריך את פעילות האינסולין; בעוד לילה צום מספיקה לבדוק גלוקוז ניצול12,20,22. גלוקוז הוא בדרך כלל מנוהלת באמצעות הזרקת i.p., המינון של גלוקוז מותאם גוף במשקל (בדרך כלל 1 או 2 g/ק ג משקל גוף)20,22. דגמים דיו, עולה במשקל הגוף, בעיקר כתוצאה גוש שומן גבוה יותר; ספיגת הגלוקוז, עם זאת, בעיקר מתרחשת השרירים, המוח, הכבד. מאז הכמות של רקמות אלה בדרך כלל לא משתנה על ידי דיו, העכברים המשמינים מקבלים כמויות פרופורציה גבוהה של גלוקוז בהשוואה לעכברים רזה, אשר בתורו יכול להשפיע על הפרשנות של הנתונים, להוביל סובלנות misdiagnosed גלוקוז22 . מסיבה זו, תקופות צום צריך להיות מוגדר, הרכב הגוף צריך להיחשב במהלך פרשנות של תוצאות GTT23. לכן, המחשב טומוגרפיה ממוחשבת (CT) או תהודה מגנטית imaging(MRI) סריקות הינם חלים. למשל, מדידות גלוקוז ע י כל כף יד-הסוכר צגים (ראה טבלה של חומרים) הינם זמינים, אחרי. הצגים האלה הם יותר נפוץ מאשר מנתחי גלוקוז פלזמה. בשל הדם קטן אמצעי אחסון נדרש - בדרך כלל 5 µL או פחות - הם מעשי יותר מאשר מנתחי פלזמה.

מגבלות של הטכניקה: עכברים התענה התערוכה התלות משך הצום ולהראות לאובדן משמעותי במשקל הגוף, טמפרטורת הגוף, נפח הדם, ואת קצב הלב, כמו גם שינויים בפרמטרים סרום, כגון רמות חומצות השומן החופשיות, גופי קטון 24. הזה מתח מטבולית המופעלת על-ידי העובדה כי הטמפרטורה דיור של עכברים במתקנים בעלי חיים יתוקנן כ 23 ° C, ולכן הוא מתחת שלהם התרמו-נייטרלי לטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס25. צום ממושך בטמפרטורות ניטראליים subthermo יכול לגרום קמה, המאופיינת על ידי ירידה של26,27קצב חילוף החומרים.

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול: כאמור לעיל, עבור תוצאות אמינות בין ניסיוני קבוצות שליטה, הארנבונים מאותה אמור לשמש רצוי במהלך המחקר ועל תקופות צום, ואת נקודות זמן צריך להיות מוגדר.

ניתוח תפקוד הריאות

ב פרוטוקול זה, היא תגלה מודד ישירות את השינויים בלחץ המניעות נשימה, את תוצאות זורם פנימה והחוצה דרכי הנשימה. זורם נמדדים על ידי pneumotachograph ממוקם בקיר היא תגלה. כדי לא לכלול ההתנגדות קיר החזה, נמדדים דרכי הנשימה פתיחת לחץ (לחץ על הפה) ואת transpulmonary (צינור הוושט) הלחץ, דרכי הנשימה עמידות ותאימות דינמי מחושבים. תאימות דינמי הוא מחושב באמצעות ההבדל נפח הריאות מינימום ומקסימום מחולק דרך הזרם.

המשמעות שיטות קיימות, יישומים עתידיים: Plethysmography היא הליך רגיל כדי לנתח את התכונות המכאניות של ריאות, וכן ניתן, לכן, לשמש במחקרים עתידיים, לנתח פתולוגיה ריאות ואפשרויות הטיפול. כדי להשוות בין קבוצות ולימודים, בגישה סטנדרטית היא הכרחית.

שינויים ופתרון: באופן כללי, טכניקה זו יכולה להיות מסווגת כ ערככם ומאופק כל הגוף plethysmography. שיטות ערככם לקבוע השהיה משופרת (פן) ולאפשר ניתוח דפוסי נשימה רגילה, בעוד מאופקת, פולשני שיטות למדוד ישירות לחץ, זרימה, או אמצעי אחסון. תכונות מכניות ריאות נקבעים על-ידי התנגדות, elastance; בעוד התנגדות מחושב כיחס בין הלחץ לזרימה, elastance משקף את היחס של הלחץ כרך28. לעומת זאת, plethysmography לכל הגוף ערככם זה רק למדוד את הלחץ בתוך היא תגלה, לכן חישוב של ההתנגדות, elastance הוא בלתי אפשרי. ב-2007, Lundblad. ואח הצהירו כי פן הוא לא הפרמטר הנכון כדי למדוד התנגדות דרכי הנשימה, אבל מייצג השתקפות לא ספציפית של דפוס הנשימה29. לפיכך, עבור הערכה נכונה של מכניקת הריאה, plethysmography פולשנית היא הכרחית29,30,31.

מאז נשימה פרמטרים תלויים הגיל והגודל של עכברים, אוורור פרמטרים צריכים להיות מותאמים. לדוגמה, נפח קשורה במשקל הגוף, צריך להיות מוגדר µL/גרם משקל 10 עם תדירות הנשימה של 120-250 נשימות לדקה. בעת כוונון הפרמטרים האלה, החוקר צריך לקחת בחשבון נפח רשע קשורה הפוך תדירות הנשימה32. מאז נשימה ספונטנית השפעות לחץ, זרימה, נפח, עומק ההרדמה חייב להיות פיקוח ויש אוורור עקומות שחלים ללא הרף. עם זאת, ההרדמה עצמה ישירות עלולה להשפיע לרעה תפקודי ריאה. לדוגמה, Propofol, קטמין חלקית כדי להתגונן מפני כיווץ דרכי הנשימה המזורזת בהשוואה התיופנטל33. יתר על כן, מחקרים קליניים הראו כי קטמין יש השפעה אנטיכולינרגיות, יכול לשמש למצוקת פוטנציאלית באסטמה חמורה34. הרדמה inhalational, כגון איזופלוריין בשילוב עם טיפול בכאב, הם נחשבים אלטרנטיבה לשליטה זריקת הרדמה; עם זאת, לגירוי דרכי הנשימה לאחר הרדמה נדיף מדווח, ולכן אינו כולל שאיפת הרדמה חלופי35.

מגבלות של השיטה: השיטה פולשנית מאופקת למדוד תכונות מכניות ריאות עקב פיום קנה הכרחי, הליך הסופי, ומגביל ובכך המחקר ניתוח נקודה אחת, ללא האפשרות לחקור את המחלה התקדמות. כדי להפחית את רמת invasiveness, מדידה של העברת עכבה בבעלי חיים מודע יכול להתבצע, ובכך המאפשרת לימודים האורך. אולם, כאשר מודדים את מכניקת הנשימה בבעלי חיים שאינם tracheotomized, ההתנגדות של האף תורמת ההתנגדות הנשימה הכולל, ובכך מסבך את מדידות לאחר בדיקת אתגור פרובוקציה13.

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול: כאן אנחנו מדגימים בשיטה אחת בלבד של תפקודי ריאה פולשני. מאז קיימות מספר שיטות פונקציית ריאות פולשנית הוקמה, סטנדרטיזציה בתוך הלימודים, תיאור מפורט של השיטה משתמשים, קבוצות, ואתה משטר של הרדמה בפרסומים יש צורך להשוות בין מחקרים.

כריתה של ריאה לניתוח histomorphometric

משמעות שיטות קיימות, יישומים עתידיים: ניתוח כמותי histomorphometric יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של השמנת יתר על מבנה הריאות (הסמפונות, alveoli), לפרש את התוצאות המתקבלות על-ידי פולשני plethysmography, וכדי ללמוד אפשרויות טיפול אפשרי על התוצאה ריאתי. נתונים הערכות היסטולוגית עשויות להשתנות בהתאם מקבע סוכנים וההליך קיבוע בשימוש. מאז הוכח כי השמנת יתר יש השפעה על מבנה מכתשי ובסימפונות, כמו הרכב מטריקס וסלולר טוב כמו חוץ-תאית, יש צורך לקבוע טכניקה המתאימה בהתבסס על שאלת המחקר במחקרים עתידיים. עבור morphometry כמותיים לא משוחד, עיבוד לאחר קיבוע הרקמה צריכה להתבצע בהתאם לסטנדרטים של החברה הגבילו אמריקאי (ATS) / אירופה הנשימה החברה (ERS) עבור הערכה כמותית של הריאה מבנה14 .

שינויים ופתרון: בשנת 2010 הציג Hsia. et al. הצהרה רשמית ATS/ERS הגדרת תקנים עבור הערכה כמותית של המבנה הריאה, אשר צריכים להילקח בחשבון לפני ריאות בידוד, קיבוע 14. ליד intratracheal ניתן לבצע החדרה של כתות ומייצבים, קיבוע ב באתרו , קיבוע קבוע בנפח או האינפלציה ואקום לנפח רקמת הריאה36. האינפלציה, ובכך הגדלת המרחב האווירי, היא תלויה קיבוע הליכים ואת הציון של הלחץ המופעל במהלך קיבעון. לדוגמה, בלחץ גבוה, ניתן להוביל הקרע מכתשי, ובכך להשפיע על התוצאות. בדומה הפרמטרים אוורור, הפרמטרים קיבוע אידיאלי תלויים על גיל, גודל, ותפקיד של העכברים. קיבוע ניתן להשיג באמצעים כימיים או פיזיים, כולל חומרים כימיים ו/או הקפאה קריוגנית. Intratracheal החדרה של כתות ומייצבים מתאימים מחקה רקמות האינפלציה במהלך הנשימה, המשקף ויוו תנאים, ולכן בשימוש נרחב37. 20-25 ס מ מעל הנקודה הגבוהה ביותר של הריאות מומלצת לחץ, שימוש אבובים רחב וקצר כדי לאפשר חדירה מהירה ואחידה14. יעד מרכזי של קיבעון היא כדי למנוע את תהליך ניוון וכדי לשמר תאים ורקמות בחיים כמו מדינה, תוך שמירה על שלמות אדריכלית parenchyma הריאה. בנוסף, רקמות עליך לשמור את התגובה שלה נוגדנים, כתמים של חומצת גרעין הגששים. מלבד האפקט של autolysis נורמלי, תופעות לוואי של רקמות עיבוד, כולל חדירה עם שעווה חמה, חותך, ויש dewaxing, תימנע. הבחירה של מקבע וכן עיבוד נוסף של הרקמה, למשל באמצעות הטבעה, ניתן לגרום נפיחות, ואת התקשות של רכיבים שונים, רקמות התכווצות, להוביל לכלוכים, כגון autofluorescence מוגברת38. לדוגמה, קיבוע ב 10% buffered פורמלין, עיבוד נוסף עלול לגרום הצטמקות של עד 20% - 30% ביחס נפח הראשונית39. לכן, Hsia ואח . בעיתון הסכמה שלהם 2010 של להמליץ ATS/ERS השימוש של 2.5% גלוטראלדהיד buffered אוסמיום ארבע-חמצני, אצטט uranyl כדי למנוע התכווצות של רקמות. נפח הריאות, ארכיטקטורה פנימית, המבנה הדק הרקמה והתא המבנה השתמר לאחר החדרה דרכי הנשימה זה מקבע מגיב14. דנטורציה של חלבונים היווצרות קישור הם שני מנגנונים עיקריים אשר חשובים קיבוע של רקמות. Dehydrating תרכובות או מקרישים כמו כהלים או אצטון, דנטורציה של חלבונים, וכתוצאה מכך שינוי של מבנה שלישוני חלבון מאת יציב איגודי הידרופובי. Non-מקריש סוכנים תיקון כמו paraformaldehyde או גלוטראלדהיד מגיבים כימית עם חלבונים, טופס הבין-מולקולרי ומולקולרית אינטרה-cross-links. מאז מספר כתמים כמו hematoxylin ואת אאוזין מכתים, תלוי האינטראקציות הבין-מולקולריות, מכתים תוצאות יכול להיות עני, בהתאם הסוכן מקבע. אנטיגן-אחזור שיטות אימונוהיסטוכימיה הראו כי חלק התגובות של קיבעון הם הפיכים, במיוחד אלה של פורמלדהיד40.

מגבלות של הטכניקה: מאז הציפוי משטח מכתשי יוסר על ידי החדרה intratracheal של כתות ומייצבים, פרשנות, למשל, מכתשי המיקרו-ארכיטקטורה, הצטברות ריר, או נדידת תאים דלקתיים ניתן לטפל 41 , 42 , 43.

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול: הנה אנחנו מראים את intratracheal החדרה של 4% מחברים כמו גישה רחבה כדי להמחיש את ההשפעה של השמנת יתר על תוצאות ריאתי. כפי שהוזכר לעיל, הפרוטוקול חייב להיות שונה בהתאם שאלת המחקר, על פי המלצות ATS/ERS14.

בנוסף הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן, מתח הוא גורם מרכזי המשפיעים על תוצאות המחקר. לכן, אימון שני העכברים המדען הוא הכרחי. עכברים צריך להיות מותאם הרחקה, יועבר לאזור ניסויית תחת תנאים שקט44. הלחץ משפיע על חילוף החומרים בגוף, למשל בעקבות שחרור הורמון לחץ, רמות הגלוקוז שפורסמו הוגדלה, אפקט זה יכול להתפרש בתור לקוי גלוקוזה. שחרור הורמון לחץ גם הפיצולים הרגישות הרדמה, במיוחד, המינון של חומרי הרדמה מתגברת, הפעם כדי להגיע סובלנות כירורגי מוארך. כאמור, כמות מוגברת של חומרי הרדמה יכול להשפיע על bronchoconstriction, בזמן מתח עצמו יכול לגרום הרחבה הסמפונות.

לסיכום, מאמר זה מספק שלוש שיטות כדי להעריך את ההשפעה של השמנת יתר, חילוף החומרים על ריאות מבנה ותפקוד בעכברים. כל הזכיר שיטות ניתן להעביר אחרים מודלים של המחלה, מכרסם מינים, כגון השמנת יתר עקב שינויים גנטיים או עכברוש מודלים. היישום של טכניקות אלה יכול להיות מועיל כדי להגדיר את המנגנונים המולקולריים חדש במודלים דיו עם גנים ספציפיים אבלציה, או לבחון גישות טיפוליות חדשות לטיפול/למנוע ההשפעות השליליות של השמנת יתר על מחלות ריאה כרונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

הניסויים נתמכו על ידי מארגה וולטר בול-Stiftung, Kerpen, גרמניה; פרויקט 210-02-16 (MAAA), פרויקט 210-03-15 (MAAA), על ידי קרן מחקר גרמני (DFG; AL1632-02; MAAA), בון, גרמניה; מרכז לרפואה מולקולרית קלן (CMMC; בית חולים אוניברסיטת קלן; תוכנית לקידום הקריירה; MAAA), הון קלן (הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת קלן; KD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GlucoMen LX A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 38969 blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 39765 Test stripes
Glucose 20% B. Braun, Melsung, Germany 2356746
FinePointe Software DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-001
FPRC Controller DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1075-001
FPRC Aerosol Block DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-2306-001
Forceps FST, British Columbia, Canada 11065-07
Blunt scissors FST, British Columbia, Canada 14105-12
Micro scissors FST, British Columbia, Canada 15000-00
Perma-Hand 4-0 Ethicon, Puerto Rico, USA 736H Surgical suture
Roti-Histofix 4% Roth P087.1 4% Paraformaldehyd
Ketaset Zoetis, Berlin, Germany 10013389 Ketamine
Rompun 2% Bayer, Leverkusen, Germany 770081 Xylazine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
  2. Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes? International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
  3. Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
  4. Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
  5. Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
  6. Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
  7. Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
  8. Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
  9. Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
  12. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
  13. Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
  14. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
  15. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 12 11-11 12-14 (2008).
  16. Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
  17. Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
  18. Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
  19. Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
  20. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
  21. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
  22. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).
  23. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
  24. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  25. Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
  26. Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
  27. Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
  28. Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
  29. Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
  30. Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance! Eur Respir J. 30, 805 (2007).
  31. Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
  32. Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
  33. Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
  34. Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
  35. Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).
  36. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
  37. Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
  38. Rolls, G. Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
  39. Winsor, L. Tissue processing. Laboratory histopathology. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
  40. Histochemistry, theoretical and applied. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).
  41. Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
  42. Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
  43. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
  44. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 133 בדיקת הגלוקוז סובלנות תפקודי ריאה קיבוע ריאות השמנת יתר התנגדות דרכי הנשימה ציות דינמי מחלת ריאות כרונית
בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן, מדידה של תפקודי ריאה של קיבעון של הריאה לחקור את ההשפעה של השמנת יתר, חילוף חומרים לקוי על תוצאות ריאתי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinger, K., Mohr, J., Vohlen, C.,… More

Dinger, K., Mohr, J., Vohlen, C., Hirani, D., Hucklenbruch-Rother, E., Ensenauer, R., Dötsch, J., Alejandre Alcazar, M. A. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. J. Vis. Exp. (133), e56685, doi:10.3791/56685 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter