Summary
La incidencia de la obesidad está aumentando y aumenta el riesgo de enfermedades pulmonares crónicas. Establecer los mecanismos subyacentes y estrategias preventivas, el animal bien definido son necesarios modelos. Presentamos tres métodos (prueba de tolerancia a la glucosa, pletismografía corporal y fijación del pulmón) para estudiar el efecto de la obesidad sobre los resultados de pulmonares en ratones.
Abstract
Obesidad y trastornos respiratorios son importantes problemas de salud. La obesidad se está convirtiendo en una epidemia emergente con el número esperado de individuos obesos más 1 billón en todo el mundo en 2030, lo que representa una carga socioeconómica creciente. Al mismo tiempo, relacionadas con la obesidad comorbilidades, incluyendo diabetes, así como corazón y enfermedades pulmonares crónicas, están continuamente en aumento. Aunque la obesidad se ha asociado con mayor riesgo de las exacerbaciones del asma, empeoramiento de los síntomas respiratorios y un control deficiente, el papel funcional de la obesidad y el metabolismo perturbado en la patogenesia de la enfermedad pulmonar crónica es a menudo subestimado, y los mecanismos moleculares subyacentes permanecen fuera de alcance. Este artículo pretende presentar métodos para evaluar el efecto de la obesidad sobre el metabolismo, así como la estructura pulmonar y función. Aquí, Describimos tres técnicas para los estudios de ratones: (1) evaluación de la tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ipGTT) para analizar el efecto de la obesidad sobre el metabolismo de la glucosa; (2) medición de la resistencia de vía aérea (Res) y cumplimiento del sistema respiratorio (Cdyn) para analizar el efecto de la obesidad sobre la función pulmonar; y (3) preparación y fijación del pulmón para evaluación histológica cuantitativa posterior. Enfermedades pulmonares relacionadas con la obesidad son probablemente multifactoriales, de desregulación inflamatoria y metabólica sistémica que potencialmente negativamente influyen en la función pulmonar y la respuesta al tratamiento. Por lo tanto, una metodología estandarizada para el estudio de mecanismos moleculares y el efecto de nuevos tratamientos es esencial.
Introduction
Según la Salud Organización Mundial (OMS) en 2008, más de 1,4 billones de adultos, más de 20 años, tenían sobrepeso con índice de masa corporal (IMC) mayor o igual a 25; Además, más 200 millones de hombres y casi 300 millones de mujeres eran obesos (BMI≥30)1. Obesidad y síndrome metabólico son factores de riesgo para una multitud de enfermedades. Obesidad y tejido adiposo blanco aumento concomitante masa ha estado íntimamente vinculado al tipo 2 diabetes2,3, enfermedades cardiovasculares incluyendo la enfermedad cardíaca coronaria (CHD), insuficiencia cardiaca (IC), fibrilación auricular4 y artrosis5, su papel funcional en la patogenesia de desórdenes respiratorios siguen siendo mal entendidos. Sin embargo, estudios epidemiológicos han demostrado que la obesidad está fuertemente asociada con enfermedades respiratorias crónicas, incluyendo disnea del exertional, síndrome de apnea obstructiva del sueño (SAOS), síndrome de obesidad hipoventilación (SOH), crónica enfermedad pulmonar obstructiva (EPOC) y embolia pulmonar, neumonía por aspiración, asma bronquial6,7,8,9. Posibles mecanismos de vinculación de obesidad y metabolismo perturbado, por ejemplo, resistencia a la insulina y tipo diabetes II, a la patogenesia de la enfermedad pulmonar crónica comprenden no sólo las consecuencias mecánicas y físicas de peso aumento en la ventilación sino también inducir un estado inflamatorio subagudo crónico10,11. El aumento de la obesidad y las enfermedades pulmonares durante la última década, juntadas con la falta de estrategias preventivas eficaces y enfoques terapéuticos, destaca la necesidad de investigar los mecanismos moleculares para definir nuevas vías para la gestión de pulmón relacionados con la obesidad enfermedades.
Aquí, Describimos tres pruebas estándares, que son bases importantes para investigar la obesidad y su impacto en la estructura pulmonar y la función en modelos de ratón: (1) intraperitoneal glucosa tolerancia (ipGTT) (2) medición de la resistencia (Res) de la vía aérea y respiratorio cumplimiento del sistema (Cdyn); y (3) preparación y fijación del pulmón para evaluación histológica cuantitativa posterior. La ipGTT es una prueba de detección robusta a la captación de glucosa medida y así el efecto de la obesidad sobre el metabolismo. La simplicidad del método permite buena estandarización y por lo tanto la comparabilidad de resultados entre laboratorios. Métodos más sofisticados, tales como abrazaderas de hyperglycemic o estudios en islotes aislados, pueden utilizarse para un análisis detallado del fenotipo metabólico12. Aquí evaluar tolerancia a la glucosa para definir un estado de obesidad asociados de trastorno metabólico y sistémico como la base para estudios posteriores en un resultado pulmonar. Para evaluar el efecto de la obesidad y desorden metabólico sobre la función pulmonar, se evaluó la resistencia de vía aérea (Res) y cumplimiento del sistema respiratorio (Cdyn). Para caracterizar la enfermedad pulmonar, están disponibles sin restricciones, así como restringidos métodos para la evaluación de la función pulmonar. Pletismografía libre libremente mover animales imita un estado natural, lo que refleja patrones de respiración; en contraste, métodos invasivos, tales como medición de la impedancia de entrada de Res y cDyn en ratones profundamente anestesiados para evaluar la mecánica pulmonar dinámica, son más exactos13. Enfermedades respiratorias crónicas son reflejados por alteraciones histologic del tejido pulmonar, fijación de pulmón adecuada para su posterior análisis es inminente. La elección del método de fijación del tejido y la preparación depende del compartimiento del pulmón que se estudiará, por ejemplo, conducción de las vías respiratorias o de parénquima pulmonar14. Aquí, describimos un método que permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de las vías aéreas conductoras para estudiar el efecto de la obesidad en el desarrollo de asma.
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Protocol
Animales todos los procedimientos se realizaron en cumplimiento de protocolos de actuación aprobados por las autoridades del gobierno local (tierra NRW, AZ: 2012.A424) y estaban de acuerdo con la ley de bienestar animal alemán y las normas sobre el bienestar de los animales utilizados para experimentos o para otros fines científicos. Desde análisis de función de pulmón pueden afectar la estructura del pulmón y por lo tanto posteriores analiza histológica, debe realizarse la medición de Res Cdyn y preparación y fijación del pulmón para histomorfometría en diferentes animales. Sin embargo, es posible medición de Res y Cdyn después de ipGTT. Puesto que el estrés durante la ipGTT puede interferir con la anestesia necesaria para la función pulmonar, pruebas, un período de recuperación de aproximadamente 2 semanas después de ipGTT se recomienda para permitir ratones para recuperarse de la pérdida de peso corporal y cambios en sangre parámetros12.
1. preparación para la prueba de tolerancia a glucosa Intraperitoneal (ipGTT)
Nota: Después de 12 h de ayuno, la ipGTT completa toma aproximadamente 2 h.
- Puesto que el estrés influye significativamente en glucosa en la sangre, asegúrese de que tanto la adaptación de ratones, así como la formación del científico, se realizan.
- Transferencia de los animales a la zona experimental bajo condiciones tranquillas y sin estrés.
- Considerar la aplicación de una dieta hipercalórica para inducir obesidad en ratones. Consulte la sección de discusión para más información.
- Animales rápidos para 12 h noche a la mañana, sin limitar el acceso al agua. Al día siguiente, después de 12 h de ayuno, prepare el medidor de glucosa de la sangre según el fabricante de protocolo (véase tabla de materiales) introduciendo una nueva tira reactiva en el puerto de la tira de prueba.
- Haga una incisión en la punta de la cola con unas tijeras estériles, manteniendo ligeramente el ratón en su cola y medir inmediatamente la glucemia ayunas aplicando una gota de sangre de flujo libre (mínimo de la muestra tamaño 0.5 μl) a la tira de prueba de medidor de glucosa en la sangre.
Nota: Un temporizador de cuenta atrás comienza en la pantalla después de la aplicación suficiente de la muestra de sangre. Después de 4 s, el resultado aparece en la pantalla. - Luego, pesar y etiquetar los animales individualmente con el color de la marca.
- Administrar 2 g glucosa/kg cuerpo peso mediante inyección intraperitoneal. Asegúrese de que el volumen de inyección es de 0,1 mL/10 g de peso (aguja de 27 G y jeringa de 1 cc).
- Posteriormente, medida de glucosa en sangre después de 15, 30, 60 y 120 min, aplicando una gota de sangre de flujo libre en una nueva tira reactiva.
Nota: Flujo de sangre puede aumentarse dando masajes suaves de las salas de punta de la cola. Si encrusts la herida de la cola, límpiela con un hisopo estéril empapado con solución de cloruro de sodio 0.9%. - Permitir a los animales descansar en sus jaulas hogar con acceso ilimitado al agua entre las mediciones.
2. pulmón función análisis a medida Res y cDyn
Nota: Para medir Res y cDyn, ratones que deba ventilarse bajo anestesia profunda. Manejo de animales libre de estrés y un seguimiento adecuado de la anestesia son esenciales. Instrucciones generales técnicas estériles, consulte el artículo de Hoogstraten-Miller et al. 15
- Calibrar el pletismógrafo antes de cada serie de experimentos y preparar la configuración de estudio dentro del software (véase Tabla de materiales).
- Antes de la cirugía, profundamente anestesiar animales mediante inyección intraperitoneal de xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y ketamina (100 mg/kg de peso corporal) (aguja de 27 G y jeringa de 1 cc). Asegúrese de que el volumen de inyección es de 0,1 mL/10 g por peso corporal.
Nota: Dado que la ketamina tiene un adecuado efecto analgésico en ratones, ningún tratamiento adicional es necesario. El procedimiento invasivo catéter traqueal/pletismógrafo toma aproximadamente 5-7 minutos, luego de adquisición de datos puede comenzar. - Coloque el ratón en la posición supina sobre una almohada para mantener la temperatura corporal.
- Cubrir los ojos con ungüento para evitar la sequedad bajo anestesia.
- Monitoree constantemente la profundidad de la anestesia con la respuesta de pellizco del dedo del pie.
Nota: La administración adicional de anestésicos puede ser necesaria para mantener un plano quirúrgico de anestesia. - Humedezca la piel del área quirúrgica en la región de la tiroides con etanol al 70%.
- Cuidadosamente haga una incisión en la piel en la línea media de aproximadamente 1 cm entre la muesca yugular del esternón y el symphyses del tubérculo de la mentum levantando con pinzas y corte la piel en una inspección visual con unas tijeras embotadas (figura 1A).
- Visualizar el tejido adiposo subcutáneo subyacente y la glándula tiroides.
- Exponer la tráquea separando con cuidado embotado ambos lóbulos de la tiroides en el Istmo y la disección de los sternothyroid y sternothyroid músculos (figura 1B). Tenga cuidado de no dañar cualquier vasos y causar sangrado, ya que esto puede causar efectos adversos sobre el sistema cardiovascular y en última instancia en las medidas.
- Posteriormente, pasar una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y del esófago usando fórceps romos. Con cuidado haga una incisión en la tráquea cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales con micro tijeras.
- Intubar con un tubo traqueal (0,04 pulgadas/1,02 mm de diámetro) bajo control visual (figura 1). Fijar el tubo a través de la ligadura con sutura quirúrgica para evitar cualquier fuga en el sistema.
- A continuación, mueva al animal a la cama caliente de la cámara de cuerpo y conectar el tubo traqueal a la placa frontal (figura 1) y encender la ventilación pulsando la tecla de ventilación en el panel frontal del controlador (Figura 1E).
- Estudio de la ventilación mediante la observación del movimiento del tórax al mismo tiempo con la tasa de ventilación. Para confirmar la colocación correcta del tubo traqueal, asegúrese de que ambos lados del tórax se mueven simultáneamente.
- Vigilar la presión de señal en la pantalla del ordenador (Figura 1F). Que sean las curvas de ventilación uniforme. Si este no es el caso, separar el animal y comprobar el lado de la cirugía. Cuidado con sangre o moco que bloquea el tubo traqueal.
Nota: Para animales adultos con un peso de 20-25 g, los ajustes del ventilador como se muestra en la figura 2 se proponen según las recomendaciones del fabricante. - Para control de cambios en la presión trans pulmonar durante la ventilación, inserte un tubo del esófago (0,04 pulgadas/1,02 mm de diámetro) en el esófago a la profundidad que se aproxima a los niveles de los pulmones. Miren la pantalla colocando el tubo. Coloque el tubo donde se aprecia desviación de la presión máxima y mínima corazón artefactos en la pantalla.
- Después de la cirugía, preparar al animal para la medición. Re anestesia mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) utilizando una aguja de 27 G y jeringa de 1 cc. Asegúrese de que el volumen de inyección es de 0,1 mL/10 g por peso corporal.
Nota: Para evaluar la hyperreagibility bronquial, nebulizar metacolina, un agonista no selectivo de los receptores muscarínicos del sistema nervioso parasimpático, que induce broncoconstricción. Adquisición de datos se realiza en cuatro fases (figura 3). - Iniciar la adquisición de datos según el protocolo de manufacturer´s.
Nota: El software de guía automáticamente a los usuarios a través del proceso de adquisición. - Aplicar 10 μl de PBS (vehículo) en el nebulizador y comenzar la nebulización después de 5 minutos de aclimatación. A continuación, sigue una fase de respuesta de 3 minutos, donde se miden Res (cmH2O/mL/s) y cDyn (mL/cmH2O). Al final, dar una fase de recuperación de 3 minutos al animal antes de la próxima nebulización.
- Siga el software de aplicación paso a paso de 10 μl de aumentar las concentraciones de metacolina (2,5 μg/10 μl, 6,25 μg/10 μl y 12,5 μg/10 μl) en el ventilador.
- Una vez que todas las mediciones se han realizado y registrado, sacrifican los animales por dislocación cervical.
3. pulmón aislamiento cuantitativo análisis histomorfométrico de ratones adultos
- Profundamente anestesiar el animal mediante inyección intraperitoneal de xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y ketamina (100 mg/kg de peso corporal) (aguja de 27 G y jeringa de 1 cc). El volumen de inyección debe ser de 0,1 mL/10 g por peso corporal.
Nota: Después de alcanzar el estado de tolerancia quirúrgica, la preparación lleva unos 5 min seguido de perfusión de órganos y 30 min para la fijación. - Una vez que el animal ha alcanzado el estado de tolerancia quirúrgica (toe negativo pizca-respuesta), desinfectar el animal con etanol al 70% y para fijar el animal en una plataforma con cinta quirúrgica.
- Sacrificar el animal por punción cardíaca y hemorragias. Brevemente, abrir el abdomen con una incisión medial a través de la piel y el peritoneo con tijeras embotadas.
- Ubicar las salas jefe del diafragma del hígado y separar cuidadosamente el hígado del diafragma.
- Hacer una pequeña incisión en el diafragma usando tijeras embotadas, y punteado el ventrículo izquierdo del corazón con una aguja de 20 G conectada a una jeringa de 2 mL. Poco a poco exsanguinate el animal.
Nota: Exsanguination lento y cuidadoso es importante para evitar que los ventrículos que se derrumban debido a la presión negativa, inhibiendo un flujo de sangre. - Diseccionar el pulmón abriendo el tórax suavemente a través de una incisión paraesternal a lo largo de toda la longitud de la caja torácica usando tijeras curvas, romos.
- Luego, levantar la caja torácica para exponer la cavidad pleural (figura 3). Quitar el timo para ver el corazón y los pulmones.
Nota: Opcional inyección del ventrículo derecho, seguido de perfusión del sistema vascular pulmonar con PBS helada y luego con una solución fijadora [e.g., paraformaldehído al 4% (masa/volumen) (PFA)] es posible. Tenga en cuenta que existe un mayor riesgo a ruptura de septos alveolares y afectar estructura pulmonar usando este método. - Disecar cuidadosamente el pulmón primero quitar el corazón.
- Posteriormente, pasar una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y del esófago usando fórceps romos.
- A continuación, con cuidado haga una incisión en la tráquea, cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales, intubar con una cánula intravenosa (26 G) e inflar el pulmón por la fijación de la presión a una presión constante de 20 cm H2O mediante agente fijador [p. ej., 4% (masa /Volume) de PFA].
- Para la fijación de la PFA, dejar el fijador durante 30 min a temperatura ambiente. Ligar la tráquea y luego, retirar la cánula. Luego, suprimir el pulmón cuidadosamente sin dañar el tejido y almacenar en agente fijador a 4 ° C durante la noche.
Nota: Como alternativa, según la ATS/ETS consenso papel 2.5% GA tamponado con OsO4, solución de uracilo se utiliza para la estabilización de tejido apropiado. Para preparación de tejido adicional, consulte el documento de consenso por Hsia et al. 14
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Representative Results
Resultados representativos de la prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal (ipGTT) (figura 4), imágenes de prueba (figura 5) y representante de la función de pulmón que ilustran hematoxilina y eosina teñidos pulmones (figura 6).
La ipGTT fue realizado en ratones obesos (azul) después de 7 semanas de dieta alta en grasa (HFD). Ratones alimentados con dieta estándar sirvieron como controles (negro). Ratones obesos mostraron creciente del suero glucosa niveles 15 y 30 min después de la inyección intraperitoneal de glucosa, indicando problemas de absorción de la glucosa celular (figura 4).
Para examinar el efecto de la obesidad sobre la función pulmonar, análisis de función pulmonar invasiva fue realizado en ratones obesos (azul) después de 7 semanas de dieta alta en grasa (HFD). Ratones obesos mostraron un aumento hasta 1.5-fold de resistencia de vía aérea en comparación con ratones control (negro) (figura 5).
Para visualizar el efecto de la fijación de la presión durante la instilación intratraqueal de fijadores en el parénquima pulmonar, imágenes representativas de hematoxilina y eosina, tinción de secciones del pulmón se muestran (figura 6). Una presión demasiado pequeña conduce a múltiples áreas desinfladas, gruesos septos alveolares y alvéolos en forma poligonales (A), mientras que muchos resultados de presión en zonas de enfisema infladas con destrucción alveolar septos (C). Aplicación de la presión adecuada durante la fijación del pulmón conduce a un pulmón completamente inflado con alvéolos en forma redondeos (B).
Figura 1: representación esquemática de la función pulmonar invasor. (A-C) Pasos de traqueotomía. (D) la conexión del animal a la placa delantera de la pletismografía. Configuración de Hardware (E) para función pulmonar invasiva. (F) captura de pantalla de adquisición de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: esquema de adquisición de datos para evaluar bronquial hyperreagibility. Adquisición de datos incluye un período de aclimatación inicial (5 min), seguido por 30 s de nebulización de sustancia, 3 minutos de la etapa de respuesta y a 3 min de nebulización previa de recuperación fase de concentración de la sustancia siguiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: representación esquemática de los pasos de preparación. (A-D) Pasos de traqueotomía. (A) incisión de la piel. (B) Situs de la cavidad torácica. (C) vista después del retiro de la caja torácica. (D) vista después del retiro del corazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal representativa (ipGTT). Ratones C57BL/6N fueron alimentados con una dieta alta en grasas durante 6-8 semanas; control de ratones recibieron una dieta estándar. n = 3; Media ± SEM; los análisis estadísticos realizados fueron la prueba de ANOVA de dos vías y postest de Bonferroni. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: test de función pulmonar representante Ratones C57BL/6N fueron alimentados con una dieta alta en grasas durante 6-8 semanas; ratones de control recibieron la dieta estándar. n = 3; Media ± SEM; los análisis estadísticos realizados fueron la prueba de ANOVA de dos vías y postest de Bonferroni. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: imágenes representativas que ilustran hematoxilina & eosina teñidos pulmones. Tres grados diferentes de inflación intratraqueal: (A) muy poca presión, presión adecuada (B) y (C) demasiado la presión. UIA; área colapsada, OIA; sobre área hinchado; Imágenes fueron tomadas en 20 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ajustes del ventilador | Spalte1 |
| Max. volumen de movimiento | 0.25ml |
| Max. presión de la boca | 30cmH2O |
| Máximo de inflación profunda. volumen | 0, 5 ml |
| Máximo de inflación profunda. presión | 30cmH2O |
| Tasa de | respiración de 160 por minuto |
Tabla 1: ajustes del ventilador para los ratones adultos. Para animales más pequeños, deben ajustarse los parámetros de ventilación.
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Discussion
Este informe proporciona tres protocolos para tres diferentes métodos analizar el impacto de la obesidad sobre el metabolismo de la glucosa y resultados pulmonares. En primer lugar, la prueba de tolerancia a la glucosa ofrece la oportunidad de analizar la captación de glucosa intracelular y puede ser indicativa de resistencia a la insulina. En segundo lugar, pletismografía del cuerpo entero es una técnica para medir la función pulmonar y es así útil para probar la eficacia de nuevos tratamientos. En tercer lugar, un protocolo estandarizado de fijación es esencial para el análisis morfométrico cuantitativo evaluar el impacto de la obesidad en los cambios estructurales.
Obesidad inducida por dieta en investigaciones en animales
Importancia con respecto a los métodos existentes y futuras aplicaciones: para imitar hábitos humanos, que resultan en obesidad, obesidad inducida por dieta (DIO) modelos se utilizan ampliamente en roedores. En comparación con el uso de ratones modificados genéticamente que mímico enfermedad metabólica, DIO modelos permiten análisis de la etiología, patología y opciones de tratamiento futuro. Una revisión reciente por Heydemann et al., proporciona una visión general de los modelos de dieta alta en grasas murino diferente en diabetes investigación16. Modificaciones específicas de los nutrientes componentes ofrecen la posibilidad de futuros estudios sobre el impacto de micro - y macro-nutrientes en los mecanismos moleculares de la obesidad y de tal modo en la función y estructura del pulmón.
Modificaciones y la resolución de problemas: distintos informes muestran que la obesidad puede ser inducida por diversos cambios en la composición de nutrientes16, conocimiento que tiene, a su vez, condujo al desarrollo de una variedad de dietas en los últimos años, por ejemplo, dietas altas en contenido de grasas o hidratos de carbono o una combinación de ambas dietas, que es la llamada dieta occidental16. Al final, la elección de la dieta de un estudio depende de la pregunta de investigación y los objetivos del estudio. Además de estos importantes factores, la elección de una dieta de control adecuado es de suma importancia; de lo contrario, la interpretación de los resultados será limitada. Sin embargo, el fenotipo no sólo es causado por el tipo de dieta pero es también un resultado del período de alimentación, género y ratón cepa17.
Limitaciones de la técnica: al lado de la composición de varios nutrientes de la dieta, la respuesta del animal y la tensión de fondo podría explicar los resultados y el fenotipo observado por la inducción de la obesidad. Por ejemplo, se ha demostrado, que los ratones BALB/C son más susceptibles a esteatosis hepática en comparación con el de ratones C57Bl/618. Pequeñas variaciones genéticas, por ejemplo, debido a deriva genética (C57Bl/6J versus C57Bl/6N), también pueden afectar la susceptibilidad a la obesidad19. Esto pone de relieve las limitaciones de la técnica de trabajo con ratones modificados genéticamente con cepas de distintos antecedentes genéticos, ya que incluso la tensión y el proveedor de que se obtuvieron los ratones pueden influir en los resultados.
Pasos críticos en el protocolo: para obtener resultados confiables, reproducibles y comparables entre los experimentales y grupos control, preferentemente hermanos de camada puede usarse para generar control y ratones experimentales, factores ambientales y el estrés deben ser se evita, y ratones de control deben ser estudiados en paralelo con ratones experimentales12.
Pruebas de tolerancia a glucosa intraperitoneal (ipGTT)
Importancia con respecto a los métodos existentes y futuras aplicaciones: para determinar el efecto de DIO sobre el metabolismo del ratón, existen diferentes exámenes. El consorcio centro de fenotipado metabólico (MMPC) de ratón se creó para proponen métodos estándar para la evaluación de fenotipos metabólicos en ratones y ha publicado los procedimientos operativos estándar para describir y realizar pruebas metabólicas de la glucosa homeostasis en ratones12. Un GTT es un enfoque global para medir qué tan bien las células del cuerpo son capaces de glucosa de absorción después de ingerir una cantidad determinada de azúcar, que a su vez es indicativo de secreción de insulina y el efecto de la insulina. Diferencias en los niveles de insulina de suero a menudo responsables de tolerancia a la glucosa alterada. Por lo tanto, el GTT se ha convertido en una de las pruebas fisiológicas más ampliamente utilizadas para caracterizar modelos de ratón de la diabetes y la obesidad. Puesto que el ipGTT es un enfoque rápido y sencillo, puede utilizarse en estudios futuros como un método estandarizado para analizar el efecto de la dieta o tratamiento sobre el metabolismo.
Modificaciones y la resolución de problemas: el GTT habitualmente se realiza tras un ayuno nocturno para igualar los niveles de glucosa en sangre en ratones20. Puesto que la duración del periodo de ayuno tiene fuertes efectos sobre los parámetros investigados y es por lo tanto de gran importancia para la comparación e interpretación de los resultados, el período de ayuno debe ser adaptado a la edad y peso de ratones del cuerpo. Teniendo en cuenta que los ratones son animales nocturnos y dos tercios de la ingesta de comida diaria total se consume durante la noche, el ayuno durante la noche provoca un estado catabólico. Así, el momento de la iniciación y la duración del ayuno tienen un impacto muy relevante en los resultados, y por lo tanto estos parámetros deberán ser estandarizada12. Además, el ayuno prolongado agota las reservas de glucógeno hepático y por lo tanto reduce la variabilidad en la glucemia basal. En conclusión, puesto que la utilización de glucosa estimulada por insulina en ratones es mayor después de prolongado ayuno períodos21, un 5 a 6 horas duración ayuno se recomienda evaluar la acción de la insulina; Considerando que, el ayuno durante la noche es suficiente para probar la utilización de glucosa12,20,22. La glucosa es normalmente administrado por inyección i.p. y se ajusta la dosis de glucosa al cuerpo peso (generalmente 1 o 2 g/kg de peso corporal)20,22. En los modelos DIO, peso corporal aumenta, debido principalmente a una mayor masa grasa; la absorción de glucosa, sin embargo, ocurre predominante en hígado, músculo y cerebro. Puesto que generalmente no se altera la cantidad de estos tejidos por DIO, ratones obesos reciben una cantidad desproporcionadamente alta de glucosa en comparación con ratones magros, que a su vez podrían afectar la interpretación de los datos y llevar a una intolerancia a la glucosa diagnosticada22 . Por esta razón, períodos de ayuno tienen que estar estandarizados y composición corporal debe ser considerado durante la interpretación de GTT resultados23. Por lo tanto, la tomografía computerizada (TC) o resonancia magnética imaging(MRI) exploraciones son aplicables. Por ejemplo, las mediciones de glucosa realizadas por monitores de mano glucosa de la sangre entera (véase Tabla de materiales) están disponibles, y estos monitores se utilizan más comunmente que los analizadores de glucosa del plasma. Debido a la sangre pequeños volúmenes requeridos - típicamente 5 μl o menos - que son más prácticos que los analizadores de plasma.
Limitaciones de la técnica: ayunas ratones exhiben dependencia de la duración del ayuno y muestran una pérdida significativa de peso corporal, temperatura corporal, volumen sanguíneo y la frecuencia cardíaca así como cambios en los parámetros del suero, tales como los niveles de ácidos grasos libres y cuerpos cetónicos 24. este estrés metabólico se dispara por el hecho de que la temperatura de la vivienda de los ratones de Bioterio se estandardiza a aproximadamente 23 ° C y es por lo tanto debajo de la temperatura del termo-neutral de 30 ° C25. El ayuno prolongado a temperaturas de subthermo neutro puede resultar en letargo, caracterizado por una disminución de la tasa metabólica26,27.
Pasos críticos dentro del Protocolo: como se mencionó anteriormente, para obtener resultados fiables entre los experimentales y grupos control, hermanos de camada preferiblemente deben utilizarse durante los períodos ayuno y estudio, y puntos de tiempo tienen que estar estandarizados.
Análisis de la función pulmonar
En este protocolo, el pletismógrafo mide directamente los cambios de presión que conducción la respiración y la resultante fluye dentro y fuera de las vías respiratorias. Los flujos se miden por un pneumotachograph situado en la pared de la pletismografía. Para excluir la resistencia de la pared torácica, vía aérea apertura de presión (presión de la boca) y la presión transpulmonar (tubo del esófago) se mide y se calcularon la resistencia de vía aérea y la compliance dinámica. Compliance dinámica es calculado mediante la diferencia de la capacidad pulmonar máxima y mínima dividida por el flujo.
Importancia con respecto a los métodos existentes y futuras aplicaciones: pletismografía es el procedimiento estándar para analizar las propiedades mecánicas del pulmón y puede, por lo tanto, ser utilizado en estudios futuros analizar el pulmón patología y opciones de tratamiento. Para comparar grupos y estudios, es indispensable un enfoque estandarizado.
Modificaciones y la resolución de problemas: en general, esta técnica se puede clasificar como pletismografía del cuerpo entero libre y sobrio. Métodos determinan mayor pausa (Penh) y permiten el análisis de los patrones de respiración normal, mientras que métodos invasivos contenidos directamente medir presión, flujo o volumen. Propiedades mecánicas del pulmón son determinados por la resistencia y elastancia; mientras que la resistencia se calcula como el cociente de la presión para el flujo, elastancia refleja el cociente de la presión por el volumen28. En cambio, pletismografía corporal total sin restricciones sólo mide la presión en el pletismógrafo, y por lo tanto es imposible un cálculo de resistencia y elastancia. En 2007, Lundblad et al han declarado Penh no es el parámetro adecuado para medir la resistencia de vía aérea, que representa una reflexión no específica de la respiración patrón29. Así, para la estimación adecuada de la mecánica pulmonar, invasor es indispensable29,30,31.
Puesto que los parámetros de la respiración dependen de la edad y el tamaño de los ratones, parámetros de ventilación deben ajustarse. Por ejemplo, el volumen de marea está relacionada con el peso corporal y debe ajustarse a 10 μl/g de peso corporal con una frecuencia de respiración de 120-250 respiraciones por minuto. Al ajustar estos parámetros, el investigador debe tener en cuenta que el volumen promedio es inversamente proporcional a la frecuencia respiratoria32. Puesto que la respiración espontánea influye en la presión, flujo y volumen, la profundidad de la anestesia debe vigilarse y curvas de ventilación deben de ser observados constantemente. Sin embargo, la anestesia sí mismo puede directamente afectar la función pulmonar. Por ejemplo, Propofol y ketamina en parte protegen contra constricción de las vías respiratorias inducida comparado con tiopental33. Por otra parte, estudios clínicos han demostrado que la ketamina tiene un efecto anticolinérgico y puede ser utilizada como un potencial broncodilatador en el asma grave34. Anestésicos inhalatorios, como isoflurano junto con el tratamiento del dolor, son considerados como una alternativa controlable a anestesia inyección; sin embargo, la irritación de las vías respiratorias después de anestésicos volátiles se divulga y por lo tanto excluye los anestésicos de inhalación como un alternativa35.
Limitaciones de la técnica: el método invasivo restringido para medir las propiedades mecánicas del pulmón es debido a la traqueotomía es necesaria, un procedimiento final y así limita el estudio a un análisis de un solo punto, sin la opción para investigar la enfermedad progresión. Para reducir el nivel de invasividad, medición de impedancia de transferencia en animales conscientes se puede realizar, lo que permite estudios longitudinales. Sin embargo, al medir la mecánica respiratoria en los animales no crujía, la resistencia de la nariz contribuye a la resistencia total respiratoria y así complica las medidas después de la provocación de methacholine13.
Pasos críticos dentro del Protocolo: aquí se demuestra solamente un método de la función pulmonar invasiva. Puesto que existen varios métodos de función de pulmón invasor establecido, normalización dentro de los estudios y una descripción detallada del método había utilizado, los grupos, y un régimen anestésico en publicaciones es necesario comparar los estudios.
Excisión de pulmón para el análisis histomorfométrico
Importancia con respecto a los métodos existentes y futuras aplicaciones: Análisis de histomorphometric cuantitativo pueden utilizarse para investigar el impacto de la obesidad en la estructura del pulmón (bronquios y alvéolos), para interpretar los resultados obtenidos por invasor Pletismografía y estudiar posibles opciones de tratamiento en los resultados pulmonares. Datos de la evaluación histológica pueden diferir dependiendo de agentes fijadores y el procedimiento de fijación utilizado. Puesto que se ha demostrado que la obesidad tiene un efecto en la estructura alveolar y bronquial, como la composición celular y matriz extracelular así como, es necesario determinar una técnica apropiada basada en la pregunta de investigación en estudios futuros. Para morfometría cuantitativa objetiva, proceso después de la fijación del tejido debe realizarse según las normas de la sociedad torácica americana (ATS) / European Respiratory Society (ERS) para la evaluación cuantitativa del pulmón estructura14 .
Modificaciones y la resolución de problemas: en 2010 Hsia et al. presentó una declaración oficial de las normas de configuración de ATS/ERS para evaluación cuantitativa de la estructura del pulmón, que debe ser tenida en cuenta antes de aislamiento pulmonar y fijación 14. al lado de intratraqueal puede realizarse instilación de fijadores, en situ fijación, fijación de volumen fijo o inflación vacío para inflar tejido pulmonar36. Inflación, y ampliación del espacio aéreo, de tal modo es dependiente sobre métodos de fijación y el grado de presión aplicada durante la fijación. Alta presión, por ejemplo, puede conducir a la ruptura de la pared alveolar y así influir en los resultados. Similar a los parámetros de ventilación, los parámetros de fijación ideal dependen de la edad, tamaño y fenotipo de los ratones. La fijación se logra por medios químicos o físicos, incluyendo agentes químicos o criopreservación. Instilación intratraqueal de fijadores adecuados imita inflación de tejido durante la respiración, lo que refleja condiciones en vivo y por lo tanto es ampliamente utilizado37. 20-25 cm por encima del punto más alto del pulmón se recomienda una presión suficiente, utilizando un tubo ancho y corto para permitir la penetración rápida y uniforme14. Un objetivo importante de la fijación es evitar que el proceso de degeneración y preservar células y tejidos en un "estado de vida-como," preservando la integridad arquitectónica de la parenquimia de pulmón. Además, el tejido debe conservar su reactividad frente a anticuerpos, las manchas y las sondas de ácido nucleico. Además del efecto de autolisis normal, efectos adversos del tejido, proceso, incluyendo la infiltración con cera caliente, corte y desparafinado, debe evitarse. La elección del fijador, así como proseguir la elaboración de los tejidos, por ejemplo a través de incrustación, puede causar contracción del tejido, inflamación y endurecimiento de los diversos componentes y conducir a los artefactos, tales como aumento de Autofluorescencia38. Por ejemplo, fijación en el 10% tamponada con formalina y la transformación posterior puede causar contracción de 20% - 30% en relación con el volumen inicial39. Por lo tanto, Hsia et al. en su documento de consenso 2010 de recomendar ATS/ERS el uso de 2,5% glutaraldehído tamponado con tetraóxido de osmio y acetato de uranilo para evitar la contracción del tejido. Capacidad pulmonar, arquitectura interna, estructura del tejido fino y la célula estructura se conservó después de la instilación de la vía aérea de este reactivo fijador14. Desnaturalización de proteínas y reticulación de formación son dos mecanismos principales que son importantes en la fijación del tejido. Deshidratación de compuestos o coagulantes, como alcohol o acetona, causan desnaturalización de proteínas, dando por resultado cambios de la estructura terciaria de la proteína por desestabilizar los enlaces hidrofóbicos. No coagulante fijadores como paraformaldehído o glutaraldehído reaccionan químicamente con proteínas y forma molecular inter e intra molecular aglutina. Puesto que varias manchas procedimientos, como la hematoxilina y eosina, dependen de interacciones inter moleculares, resultados de tinción puede ser pobre, dependiendo del agente fijador. Métodos de recuperación de antígeno en inmunohistoquímica han demostrado que algunas de las reacciones de fijación son reversibles, particularmente los de formaldehído de40.
Limitaciones de la técnica: puesto que el revestimiento alveolar superficial se retira mediante instilación intratraqueal de fijadores, la interpretación de, por ejemplo, alveolar microarquitectura, acumulación de moco, o migración de células inflamatorias puede ser manipulada 41 , 42 , 43.
Pasos críticos dentro del Protocolo: a continuación os mostramos la instilación intratraqueal de 4% PFA como un criterio amplio para visualizar el efecto de la obesidad sobre los resultados de la pulmonares. Como se mencionó anteriormente, se debe modificar el protocolo dependiendo de la pregunta de investigación, según las recomendaciones ATS/ERS del14.
Además de los parámetros anteriormente mencionados, el estrés es un factor que influyen en los resultados de investigación. Por lo tanto, de formación ambos ratones y al científico es indispensable. Ratones deben adaptarse a refrenar y deben transferirse al área experimental bajo condiciones de tranquilidad44. El estrés influye en el metabolismo, por ejemplo, como consecuencia de la liberación de la hormona de estrés, aumentan los niveles de glucosa liberada, un efecto que puede ser malinterpretado como intolerancia a la glucosa. Liberación de hormonas de estrés también altera la susceptibilidad a las drogas anestésicas, específicamente, se aumenta la dosis de anestésicos y se prolonga el tiempo para alcanzar la tolerancia quirúrgica. Como se mencionó, la mayor cantidad de anestésicos puede influir en broncoconstricción, mientras que el estrés sí puede causar dilatación bronquial.
En Resumen, este artículo proporciona tres métodos para evaluar el impacto de la obesidad y metabolismo en la estructura pulmonar y la función en los ratones. Todos los mencionan métodos pueden transferirse a otros modelos de la enfermedad y roedores, como la obesidad debido a modificaciones genéticas o modelos de rata. La aplicación de estas técnicas puede ser útil para definir nuevos mecanismos moleculares en modelos DIO con la ablación del gen específico, o para poner a prueba nuevos enfoques terapéuticos para tratar o prevenir los efectos adversos de la obesidad en enfermedades pulmonares crónicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los experimentos fueron apoyados por la Marga y Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Alemania; 210-02-16 (MAAA), proyecto 210-03-15 (MAAA) del proyecto y por la Fundación de investigación alemana (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Alemania; Centro de Medicina Molecular de Colonia (CMMC; Hospital de la Universidad de Colonia; Programa de adelanto de carrera; MAAA), fortuna Köln (Facultad de medicina, Universidad de Colonia; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
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