Summary
L’incidence de l’obésité augmente et augmente le risque de maladies pulmonaires chroniques. Modèles sont nécessaires pour établir les mécanismes sous-jacents et des stratégies préventives, animal bien défini. Ici, nous fournissons trois méthodes (épreuve d’hyperglycémie provoquée, pléthysmographie de corps et fixation du poumon) pour étudier l’effet de l’obésité sur résultats pulmonaires chez des souris.
Abstract
L’obésité et les troubles respiratoires sont les principaux problèmes de santé. L’obésité devient une épidémie émergente avec un nombre prévu de personnes obèses plus 1 milliard dans le monde en 2030, ce qui représente un fardeau socio-économique croissant. Simultanément, les comorbidités associées à l’obésité, y compris le diabète ainsi que maladies cardiaques et pulmonaires chroniques, sont continuellement à la hausse. Bien que l’obésité a été associée à un risque accru d’exacerbations de l’asthme, aggravation des symptômes respiratoires et mauvais contrôle, le rôle fonctionnel de l’obésité et le métabolisme perturbé dans la pathogenèse de la maladie pulmonaire chronique est souvent sous-estimée, et les mécanismes moléculaires sous-jacents demeurent insaisissables. Cet article vise à présenter les méthodes d’évaluation de l’effet de l’obésité sur le métabolisme, ainsi que la structure de poumon et fonction. Nous décrivons ici trois techniques d’études de la souris : (1) l’évaluation de la tolérance au glucose intrapéritonéale (HPI) pour analyser l’effet de l’obésité sur le métabolisme du glucose ; (2) mesure de la résistance des voies aériennes (Res) et de la conformité de l’appareil respiratoire (Cdyn) pour analyser l’effet de l’obésité sur la fonction pulmonaire ; et (3) préparation et fixation du poumon pour évaluation histologique quantitative ultérieur. Maladies pulmonaires liées à l’obésité sont probablement multifactorielles, découlant de la systémique inflammatoire et métabolique le dérèglement qui influencent potentiellement néfastes de la fonction pulmonaire et la réponse au traitement. Par conséquent, une méthode normalisée pour étudier les mécanismes moléculaires et l’effet de nouveaux traitements est essentielle.
Introduction
Selon le World Health Organisation (OMS) en 2008, plus de 1,4 milliards adultes, 20 ans et plus, faisaient de l’embonpoint avec un indice de masse corporelle (IMC) supérieur ou égal à 25 ; en outre, plus 200 millions d’hommes et les femmes presque 300 millions sont obèses (BMI≥30)1. Obésité et syndrome métabolique sont les principaux facteurs de risque pour une multitude de maladies. Tandis que l’obésité et le tissu adipeux blanc une augmentation concomitant masse a été intimement liée au type 2 diabète2,3, maladies cardiovasculaires, y compris la maladie coronarienne (CHD), insuffisance cardiaque (IC), fibrillation auriculaire4 et5de l’arthrose, leur rôle fonctionnel dans la pathogenèse des troubles respiratoires reste mal compris. Cependant, les études épidémiologiques ont démontré que l’obésité est fortement associée à des troubles respiratoires chroniques, y compris une dyspnée, syndrome d’apnée obstructive du sommeil (SAOS), syndrome obésité hypoventilation (OHS), chronique bronchopneumopathies obstructives (BPCO), embolie pulmonaire, pneumonie par aspiration et l’asthme bronchique6,7,8,9. Mécanismes possibles liens entre l’obésité et métabolisme perturbé, p. ex., résistance à l’insuline et diabète de type II, à la pathogenèse de la maladie pulmonaire chronique comprennent non seulement des conséquences physiques et mécaniques du poids gain sur la ventilation, mais aussi induire un état inflammatoire subaiguë chronique10,11. La montée de l’obésité et les maladies pulmonaires au cours de la dernière décennie, conjugués à l’absence de stratégies efficaces de prévention et d’approches thérapeutiques, met en évidence la nécessité d’étudier les mécanismes moléculaires pour définir de nouvelles voies pour gérer pulmonaire liée à l’obésité maladies.
Nous décrivons ici trois tests standards, qui sont des bases importantes pour enquêter sur l’obésité et son impact sur la structure du poumon et la fonction dans des modèles murins : glucose (1) intrapéritonéal tolérance (HPI) (2) mesure de la résistance des voies aériennes (Res) et respiratoire conformité au système (Cdyn) ; et (3) préparation et fixation du poumon pour évaluation histologique quantitative ultérieur. Le HPI est un test de dépistage fiable à l’absorption du glucose mesure et donc l’effet de l’obésité sur le métabolisme. La simplicité de la méthode permet de bonne normalisation et par conséquent la comparabilité des résultats entre les laboratoires. Des méthodes plus élaborées, tels que pinces hyperglycémiques ou d’études sur des îlots isolés, peuvent être utilisés pour une analyse détaillée du phénotype métabolique12. Ici, nous évaluons la tolérance au glucose pour définir un État trouble systémique et métabolique associées à l’obésité comme base pour poursuivre ses études sur un résultat pulmonaire. Pour évaluer l’effet de l’obésité et les troubles métaboliques sur la fonction pulmonaire, nous avons mesuré la résistance des voies aériennes (Res) et la conformité de l’appareil respiratoire (Cdyn). Afin de caractériser une maladie pulmonaire, il existe des méthodes sobres mais aussi sans retenue pour l’évaluation de la fonction pulmonaire. Pléthysmographie sans retenue en se déplaçant librement les animaux imite un état naturel, reflétant les cycles respiratoires ; en revanche, les méthodes invasives, comme mesure d’impédance d’entrée de Res et cDyn chez les souris profondément anesthésiés pour évaluer la mécanique pulmonaire dynamique, sont plus précis13. Étant donné que les affections respiratoires chroniques sont traduisent par des altérations histologiques du tissu pulmonaire, fixation pulmonaire correcte pour une analyse plus approfondie est imminente. Le choix de la méthode de fixation du tissu et de préparation dépend du compartiment du poumon qui est étudié, par exemple, mener airways ou poumon parenchyme14. Nous décrivons ici une méthode qui permet une évaluation qualitative et quantitative des des voies pour étudier l’effet de l’obésité sur le développement de l’asthme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures d’animaux ont été menées dans le respect de protocoles approuvés par les pouvoirs publics locaux (Land NRW, AZ : 2012.A424) et étaient conformes à la loi allemande de bien-être animal et de la réglementation sur le bien-être des animaux utilisés pour des expériences ou pour autres fins scientifiques. Puisque l’analyse de fonction de poumon peut-être affecter la structure du poumon et une analyse histologique donc ultérieurs, la mesure des Res Cdyn et la préparation et la fixation du poumon pour l’histomorphométrie doit être effectuée chez les différents animaux. Toutefois, la mesure de Res et Cdyn suite HPI est possible. Puisque le stress pendant la HPI pourrait interférer avec l’anesthésie nécessaire pour la fonction pulmonaire teste, une période de récupération d’environ 2 semaines après que HPI est recommandé de laisser la souris récupérer de la perte de poids de corps et changements de paramètres sanguins12.
1. préparation pour l’épreuve d’hyperglycémie intrapéritonéale (HPI)
Remarque : Après 12 h de jeûne, la HPI complet prend environ 2 h.
- Étant donné que le stress influe sur la glycémie significativement, s’assurer que les deux adaptation des souris, ainsi que la formation du savant, sont effectuées.
- Transférer les animaux dans la zone expérimentale dans des conditions calmes et sans stress.
- Envisager l’application d’une alimentation hypercaloric d’induire l’obésité chez les souris. Consultez la section « discussion » pour plus de conseils.
- Animaux rapide pendant 12 h la nuit, sans limitation de l’accès à l’eau. Le lendemain, après 12 h de jeûne, préparer le lecteur de glycémie selon le fabricant du protocole (voir table des matières) en insérant une nouvelle bandelette de test dans le port de bandelette de test.
- Inciser la pointe de la queue à l’aide de ciseaux stériles, tout en conservant doucement la souris à sa queue et immédiatement mesurer la glycémie à jeun en appliquant une goutte de sang coulant librement (échantillon minimal taille 0,5 µL) sur la bandelette de test de la glycémie.
Remarque : Un compte à rebours démarre sur l’écran après une demande suffisante de l’échantillon de sang. Après 4 s, le résultat du test apparaît à l’écran. - Par la suite, peser et étiqueter les animaux individuellement à l’aide de couleurs de marquage.
- Administrer 2 g glucose/kg corps poids par injection intrapéritonéale. Assurez-vous que le volume d’injection est de 0,1 mL/10 g de poids corporel (1 cc seringue et une aiguille de 27 G).
- Par la suite, mesurer la glycémie après 15, 30, 60 et 120 min en appliquant une goutte de sang coulant librement sur une nouvelle bandelette de test.
Remarque : Le débit sanguin peut être augmenté en massant doucement la queue Astuce-quartiers. Si la plaie de la queue encrusts, nettoyez-le à l’aide d’un écouvillon stérile imbibé de solution de chlorure de sodium 0,9 %. - Que les animaux puissent reposer dans leur maison avec un accès illimité à de l’eau entre les mesures.
2. poumon fonction analyse mesure Res et cDyn
Remarque : Pour mesurer non perturbée Res et cDyn, souris doivent être aérés sous anesthésie profonde. Animal sans stress traitement et une surveillance appropriée de l’anesthésie sont essentiels. Pour des instructions générales à l’aide de techniques stériles, veuillez consulter l’article de Hoogstraten-Miller et al. 15
- Calibrer la pléthysmographie avant chaque série d’expériences et de préparer les paramètres de l’étude au sein du logiciel (voir Table des matières).
- Avant la chirurgie, profondément anesthésier animaux par injection intrapéritonéale de Xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) (1 cc seringue et une aiguille de 27 G). Assurez-vous que le volume d’injection est de 0,1 mL/10 g / poids corporel.
Remarque : Étant donné que la kétamine a un effet analgésique chez la souris, aucun traitement de la douleur supplémentaire n’est nécessaire. La procédure invasive sonde trachéale/pléthysmographie prend environ 5-7 minutes, puis d’acquisition de données puisse commencer. - Placez votre souris dans la position allongée sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle.
- Couvrir les yeux avec l’onguent pour prévenir le dessèchement sous anesthésie.
- Surveiller constamment la profondeur de l’anesthésie à l’aide de la TEP pincée-réponse.
NOTE : Supplémentaires d’administration de l’anesthésique peuvent être nécessaire pour maintenir un plan chirurgical de l’anesthésie. - Humidifiez la fourrure de la zone chirurgicale dans la région de la thyroïde avec l’éthanol à 70 %.
- Inciser délicatement la peau dans la ligne médiane d’environ 1 cm entre l’encoche jugulaire du sternum et les symphyses de tubercule du mentum en soulevant avec une pince et le découpage de la peau sous l’inspection visuelle à l’aide de ciseaux émoussé (Figure 1 a).
- Visualiser le sous-jacent du tissu adipeux sous-cutané et la glande thyroïde.
- Exposer la trachée en soigneusement émoussé séparant les deux lobes de la thyroïde à l’isthme et la dissection des muscles sternothyroid (Figure 1 b) et sternothyroid. Veillez à ne pas de nuire à tous les navires et provoquer des saignements, car cela peut provoquer des effets indésirables sur le système cardio-vasculaire et, finalement, sur les mesures.
- Par la suite, passer une suture chirurgicale tressé 4-0 entre la trachée et le œsophage à l’aide de forceps émoussé. Soigneusement inciser la trachée près le larynx entre l’anneau trachéal avec micro ciseaux.
- Intuber le malade avec un tube trachéal (0,04 pouce/1,02 mm de diamètre) sous contrôle visuel (Figure 1). Fixer la tube par la ligature avec la suture chirurgicale pour éviter toute fuite dans le système.
- Ensuite, déplacer l’animal au lit de la chambre de corps chauffé et connecter le tube trachéal à la têtière (Figure 1) et tourner sur la ventilation en appuyant sur le bouton de ventilation sur la face avant du contrôleur (Figure 1E).
- Enquête sur la ventilation en observant le mouvement du thorax en même temps avec le taux de ventilation. Pour confirmer le positionnement correct du tube trachéal, veiller à ce que les deux côtés du thorax se déplacent en même temps.
- Regarder la pression signal sur l’écran de l’ordinateur (Figure 1F). Veiller à ce que les courbes de ventilation sont uniformes. Si ce n’est pas le cas, détachez l’animal et vérifiez du côté de la chirurgie. Méfiez-vous de sang ou de mucus bloquant le tube trachéal.
Remarque : Pour les animaux adultes avec un poids de 20-25 g, les réglages du ventilateur comme illustré à la Figure 2 sont proposées conformément aux recommandations du fabricant. - Pour contrôler les changements dans la pression trans-pulmonaire au cours de la ventilation, insérez un tube oesophagiens (0,04 pouce/1,02 mm de diamètre) dans le œsophage à la profondeur qui se rapproche au niveau des poumons. Regarder l’écran tout en plaçant le tube. Placer le tube où déflexion maximale de pression et artefacts de coeur minimes sont visibles sur l’écran.
- Après la chirurgie, préparer l’animal pour la mesure. Réinjecter anesthésie par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) à l’aide d’une aiguille de 27 G et 1 seringue cc. Assurez-vous que le volume d’injection est de 0,1 mL/10 g / poids corporel.
NOTE : Afin d’évaluer les hyperreagibility bronchique, nébuliser méthacholine, un agoniste des récepteurs muscariniques non sélective du système nerveux parasympathique, qui induit une bronchoconstriction. Acquisition de données se déroule en quatre phases distinctes (Figure 3). - Commencer d’acquisition de données selon le protocole manufacturer´s.
Remarque : Le logiciel automatiquement guide les utilisateurs tout au long du processus d’acquisition. - Appliquer 10 µL de PBS (véhicule) sur le nébuliseur et commencer la nébulisation après 5 min d’acclimatation. Ensuite, suivre une phase d’intervention de 3 min, où Res (cmH2O/mL/s) et cDyn (mL/cmH2O) sont mesurés. À la fin, prévoir une phase de reprise de 3 min à l’animal avant la prochaine nébulisation.
- Suivre le logiciel par application par étapes de 10 µL de concentrations croissantes de méthacholine (2,5 µg/10 µL, 6,25 µg/10 µL et 12,5 µg/10 µL) du ventilateur.
- Une fois que toutes les mesures ont été effectuées et enregistrées, sacrifier l’animal par dislocation cervicale.
3. poumon isolement pour analyse histomorphométrique Quantitative de souris adultes
- Profondément anesthésier l’animaux par injection intrapéritonéale de Xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) (1 cc seringue et une aiguille de 27 G). Le volume d’injection doit être 0,1 mL/10 g / poids corporel.
Remarque : Après avoir atteint l’état de tolérance chirurgicale, la préparation prend environ 5 min, suivie d’une perfusion orgue et 30 min pour la fixation. - Une fois que l’animal a atteint l’état de tolérance chirurgicale (orteil négatives pincée-réponse), désinfecter l’animal avec l’éthanol à 70 % et fixer l’animal sur un socle avec ruban chirurgical.
- Sacrifier l’animal par ponction cardiaque et hémorragie. En bref, ouvrir l’abdomen avec une incision médiale à travers la peau et le péritoine, à l’aide de ciseaux émoussé.
- Recherchez les quartiers tête diaphragme du foie et soigneusement séparer le foie et le diaphragme.
- Faire une petite incision dans la membrane à l’aide de ciseaux émoussé et le ventricule gauche du coeur avec une aiguille de 20 G ponctuée attaché à une seringue de 2 mL. Lentement exsanguinate l’animal.
NOTE : Exsanguination lente et minutieuse est importante pour éviter les ventricules s’effondrer en raison de la pression négative, empêchant une circulation sanguine non perturbée. - Disséquer le poumon en ouvrant le thorax doucement à travers une incision parasternale sur toute la longueur de la cage thoracique à l’aide de ciseaux courbes, émoussé.
- Ensuite, soulevez la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale (Figure 3). Retirez le thymus pour voir le coeur et les poumons.
Remarque : Facultative injection du ventricule droit, suivie d’une perfusion du système vasculaire pulmonaire avec PBS glacée et ensuite avec une solution de fixation [par exemple, 4 % (masse/volume) paraformaldéhyde (PFA)] est possible. Sachez qu’il y a une augmentation du risque d’entraîner une rupture des cloisons alvéolaires et altèrent la structure du poumon à l’aide de cette méthode. - Disséquer le poumon d’abord soigneusement retirer le cœur.
- Par la suite, passer une suture chirurgicale tressé 4-0 entre la trachée et le œsophage à l’aide de forceps émoussé.
- Ensuite, soigneusement inciser la trachée près le larynx entre l’anneau trachéal intubation avec une canule intraveineuse (26 G) et gonfler les poumons par la fixation de la pression à une pression constante de 20 cm H2O à l’aide d’agent fixateur [par exemple, 4 % (masse /volume) de l’IFP].
- Pour la fixation de la PFA, laisser le fixateur pendant 30 min à température ambiante. Par la suite, ligaturer la trachée et retirer la canule. Puis, d’accise du poumon soigneusement sans léser les tissus et stockez-le dans un agent fixateur à 4 ° C durant la nuit.
Remarque : Par ailleurs, selon l’ATS/ETS GA de 2,5 % pour le papier un consensus tamponnée OsO4, solution uracile est utilisée pour la stabilisation du tissu approprié. Pour la préparation du tissu plus loin, voir le document de consensus par Hsia et al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les résultats représentatifs du test de tolérance au glucose intrapéritonéal (HPI) (Figure 4), poumon fonction test (Figure 5) et représentant des images illustrant l’hématoxyline et éosine teint de poumons (Figure 6).
Le HPI a été réalisée chez des souris obèses (bleus) après 7 semaines de haute-graisse-alimentation (HFD). Norme alimentaire chez les souris nourries ont servi de témoins (noir). Souris obèses a montré une augmentation sérique glucose niveaux 15 et 30 min après l’injection intrapéritonéale de glucose, indiquant impaired glucose cellulaire par (Figure 4).
Pour examiner l’effet de l’obésité sur la fonction pulmonaire, analyse de la fonction pulmonaire invasive a été réalisée chez des souris obèses (bleus) après 7 semaines de haute-graisse-alimentation (HFD). Les souris obèses ont montré une augmentation jusqu'à 1,5 fois de résistance des voies aériennes par rapport aux souris témoins (noir) (Figure 5).
Pour visualiser l’effet de la fixation de la pression lors de l’instillation intratrachéale de fixatifs sur parenchyme pulmonaire, des images représentatives de l’hématoxyline et éosine poumon coupes colorées apparaissent (Figure 6). Une pression insuffisante entraîne plusieurs zones non gonflés, cloisons alvéolaires épaisseur et alvéoles de forme polygonales (A), alors que trop résulte de la pression dans des domaines comme l’emphysème sur-gonflé avec cloisons alvéolaires destructed (C). Application de la pression appropriée durant la fixation pulmonaire entraîne un poumon complètement gonflé avec alvéoles de forme rondes (B).
Figure 1 : représentation schématique de la fonction pulmonaire invasive. (A-C) Étapes de la trachéotomie. (D) la connexion de l’animal à la plaque frontale de la pléthysmographie. Installation du matériel (E) pour la fonction pulmonaire invasive. (F) capture d’écran d’acquisition des données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : schéma d’acquisition de données pour évaluer les bronches hyperreagibility. Acquisition de données inclut une période d’acclimatation initiale (5 min), suivie de 30 s de nébulisation de substance, 3 min de la phase d’intervention et 3 min de récupération phase préalable nébulisation de concentration de la substance suivante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : représentation schématique des étapes de préparation. (A-D) Étapes de la trachéotomie. (A) Incision de la peau. Situs (B) de la cavité thoracique. (C) vue après l’enlèvement de la cage thoracique. (D) vue après l’ablation du coeur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : test de tolérance au glucose intrapéritonéal représentatif (HPI). Les souris C57BL/6N recevaient une alimentation riche en graisses pendant 6 à 8 semaines ; contrôle souris ont reçu une alimentation standard. n = 3 ; Moyenne ± SEM ; des analyses statistiques effectuées étaient bidirectionnel test ANOVA et post-test de Bonferroni. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : test de fonction pulmonaire représentant Les souris C57BL/6N recevaient une alimentation riche en graisses pendant 6 à 8 semaines ; contrôle souris ont reçu une alimentation standard. n = 3 ; Moyenne ± SEM ; des analyses statistiques effectuées étaient bidirectionnel test ANOVA et post-test de Bonferroni. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : images représentatives illustrant l’hématoxyline et éosine teint poumons. Trois qualités différentes d’inflation intratrachéale : (A) trop peu pression, pression appropriée (B) et (C) trop de pression. UIA ; région s’est effondrée, OIA ; sur la zone gonflée ; Images ont été prises à moins de 20 X grossissement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Réglages du ventilateur | Spalte1 |
| Max. volume systolique | 0,25 ml |
| Max. pression de la bouche | 30cmH2O |
| Inflation profonde max. volume | 0,5 ml |
| Inflation profonde max. pression | 30cmH2O |
| Taux | souffle de 160 / minute |
Tableau 1 : réglages du ventilateur pour souris adultes. Pour de petits animaux, les paramètres de ventilation doivent être ajustés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce rapport fournit trois protocoles pour trois différentes méthodes analyser l’impact de l’obésité sur le métabolisme du glucose et résultats pulmonaires. Tout d’abord, l’épreuve d’hyperglycémie provoquée offre la possibilité d’analyser l’absorption du glucose intracellulaire et peut être un indice de résistance à l’insuline. Deuxièmement, la pléthysmographie de corps entier est une technique de mesure de la fonction pulmonaire et est donc utile de tester l’efficacité de nouveaux traitements. Troisièmement, un protocole standardisé de fixation est essentiel pour l’analyse morphométrique quantitatives évaluer l’impact de l’obésité sur des changements structurels.
Induite par le régime de l’obésité en recherche animale
Signification en ce qui concerne les méthodes existantes et futures applications : pour imiter les habitudes alimentaires humaines, entraînant l’obésité, les modèles de l’obésité induite par l’alimentation (DIO) sont largement utilisés chez les rongeurs. Par rapport à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, imitant une maladie métabolique, modèles DIO activer l’analyse de l’étiologie, la pathologie et futures options de traitement. Un examen récent par Heydemann et al., donne un aperçu des modèles murins de régime alimentaire riche en graisses différent dans le diabète de recherche16. Des modifications spécifiques des composants nutritifs offrent la possibilité de futures études de l’impact des micro - et macro-nutriments sur les mécanismes moléculaires de l’obésité et donc sur la fonction et la structure du poumon.
Modifications et dépannage : différents rapports montrent que l’obésité peut être induite par différents changements dans la composition des nutriments alimentaires16, connaissances qui a, à son tour, conduit à l’élaboration d’une variété de régimes alimentaires ces dernières années, par exemple, régimes riches en graisses ou glucides contenu ou une combinaison de ces deux régimes, qui est le soi-disant régime occidental16. En fin de compte, le choix du régime alimentaire d’une étude dépend de la question de recherche et les objectifs de l’étude. En plus de contrôler ces facteurs importants, le choix d’un régime de contrôle adéquat est primordial ; dans le cas contraire, l’interprétation des résultats sera limitée. Néanmoins, le phénotype est causé non seulement par le type de régime mais est aussi le résultat de l’alimentation période, les femmes et les souris de la souche17.
Limites de la technique : à côté de la composition de divers nutriments de l’alimentation, la réponse de l’animal et la souche de fond pourrait expliquer les résultats et le phénotype observé par l’induction de l’obésité. Par exemple, il a été démontré, que les souris BALB/C sont plus sensibles à une stéatose hépatique par rapport à de souris C57Bl/618. Légères variations génétiques, par exemple, en raison de la dérive génétique (C57Bl/6J versus C57Bl/6N), peuvent également influencer la susceptibilité à l’obésité,19. Cela met en évidence les limites de la technique travaillant avec des souris génétiquement modifiées avec des souches de bagage génétique différent, puisque même la souche et le vendeur auprès duquel les souris ont été obtenus peuvent influencer les résultats.
Étapes critiques au sein du protocole : pour des résultats reproductibles, fiables et comparables entre l’expérimental et les groupes témoins, préférence de même portée doivent être utilisés pour générer le contrôle et souris expérimentales, les facteurs environnementaux et le stress doivent être évitée, et souris témoins devraient être étudiées en parallèle avec la souris expérimentales12.
Tests de tolérance de glucose intrapéritonéal (HPI)
Signification en ce qui concerne les méthodes existantes et futures applications : pour déterminer l’effet de DIO sur le métabolisme de la murin, tests de dépistage différents existent. Le Consortium Centre souris de Phénotypage métabolique (MMPC) a été créé pour proposer des méthodes normalisées pour évaluer des phénotypes métaboliques chez la souris et a publié des procédures d’utilisation normalisées pour la description et les tests métaboliques du glucose homéostasie en souris12. Un GTT est une approche globale pour mesurer la façon dont les cellules sont capables de glucose uptake après avoir ingéré une quantité donnée de sucre, qui à son tour, est révélateur de la sécrétion d’insuline et l’effet de l’insuline. Différences dans les taux d’insuline sérique représentent souvent la tolérance altérée de glucose. Par conséquent, le GTT est devenu l’un des tests physiologiques plus largement utilisés pour caractériser des modèles murins de diabète et d’obésité. Comme le HPI est une approche rapide et facile, il peut être utilisé dans les études à venir comme une méthode normalisée pour analyser l’effet du régime alimentaire et/ou le traitement sur le métabolisme.
Modifications et dépannage : le GTT est effectué systématiquement après un jeûne d’un nuit pour équilibrer la glycémie en souris20. Étant donné que la durée de la période de jeûne a des effets importants sur les paramètres étudiés et est donc d’une grande importance pour la comparaison et l’interprétation des résultats, la période doit être adaptée à l’âge et poids corporel de souris. En tenant compte du fait que les souris sont des animaux nocturnes et deux-tiers de la dose journalière totale de nourriture est consommée durant la nuit, une nuit de jeûne provoque un état catabolique. Ainsi, le moment de l’initiation et la durée du jeûne, ont un impact très important sur les résultats, et donc ces paramètres doivent être normalisées12. En outre, un jeûne prolongé épuise les réserves de glycogène hépatique et donc réduit la variabilité des taux de glucose sanguin de base. En conclusion, étant donné que l’utilisation du glucose stimulée par l’insuline chez des souris est améliorée après prolongées jeûne périodes21, un 5 à 6 heures durée de jeûne est recommandée afin d’évaluer l’action de l’insuline ; considérant que, du jour au lendemain le jeûne est suffisant pour tester glucose utilization12,20,22. Le glucose est normalement administrée via l’injection intrapéritonéale et la dose de glucose est ajustée au corps poids (généralement 1 ou 2 g/kg de poids corporel)20,22. Dans les modèles DIO, poids corporel est augmenté, principalement en raison d’une masse grasse plus élevée ; captation du glucose, cependant, se produit principalement dans le muscle, cerveau et le foie. Étant donné que le montant de ces tissus n’est généralement pas altéré par DIO, souris obèses reçoivent une quantité anormalement élevée de glucose par rapport aux souris maigres, qui à son tour pourraient influer sur l’interprétation des données et conduire à une intolérance au glucose mal diagnostiquées22 . Pour cette raison, périodes de jeûne doivent être normalisés et composition corporelle doit être examinée au cours de l’interprétation des résultats GTT23. Donc, la tomographie par ordinateur (CT) ou les scans de imaging(MRI) de résonance magnétique sont applicables. Par exemple, glucose de mesures prises par les moniteurs de glucose de sang total à main (voir la Table des matières), et ces moniteurs sont utilisés plus fréquemment que les analyseurs de glucose plasmatique. À cause du sang de petit volumes requis - généralement 5 µL ou moins, ils sont plus pratiques que les analyseurs de plasma.
Limites de la technique : souris à jeun pièce dépend de la durée du jeûne et montrer une perte importante de poids corporel, température corporelle, volume sanguin et fréquence cardiaque ainsi que les changements des paramètres sériques, tels que les taux d’acides gras libres et des corps cétoniques 24. ce stress métabolique est déclenché par le fait que la température du boîtier de la souris dans les animaleries est normalisée à environ 23 ° C et est donc inférieure à leur température thermo-neutre de 30 ° C,25. Un jeûne prolongé à une température de subthermo-neutre peut résulter en torpeur, caractérisée par une diminution du taux métabolique26,27.
Étapes critiques au sein du protocole : comme mentionné ci-dessus, pour des résultats fiables entre l’expérimental et groupe témoin de même portée préférence doit être utilisé qu’au cours de l’étude et les périodes de jeûne, et points dans le temps doivent être normalisés.
Analyse de la fonction pulmonaire
Dans ce protocole, la pléthysmographie mesure directement les variations de pression qui sont le moteur de la respiration et les flux qui en résulte dans et hors des voies respiratoires. Débits sont mesurés par une pneumotachograph située sur la paroi de la pléthysmographie. Pour exclure la résistance de la paroi thoracique, des voies respiratoires, ouvrant la bouche (pression) et pression transpulmonaire (tube oesophagien) sont mesurées et résistance des voies aériennes et dynamiques de la conformité sont calculés. Compliance dynamique est calculée par la différence du volume pulmonaire minimale et maximale divisée par le biais de la circulation.
Signification en ce qui concerne les méthodes existantes et futur applications : pléthysmographie est la procédure standard pour analyser les propriétés mécaniques du poumon et peut, par conséquent, être utilisés dans de futures études pour analyser les options de pathologie et le traitement du poumon. Pour comparer les groupes et les études, une approche normalisée est indispensable.
Modifications et dépannage : en général, cette technique peut être classifiée comme pléthysmographie de corps entier sans retenue et sobriété. Méthodes effrénées déterminer pause améliorée (Penh) et activer l’analyse des modes de respiration normale, tandis que les méthodes invasives sobres directement mesurent pression, débit ou volume. Les propriétés mécaniques du poumon sont déterminées par la résistance et l’élastance ; alors que la résistance est calculée comme le rapport de la pression à l’écoulement, élastance reflète le rapport entre la pression au volume28. En revanche, débridé pléthysmographie corporelle est seulement mesurer la pression à l’intérieur de la pléthysmographie, et un calcul de résistance et de l’élastance est donc impossible. En 2007, Lundblad et coll. ont déclaré que Penh n’est pas le bon paramètre à mesurer la résistance des voies aériennes, mais représente une réflexion non spécifique de la respiration modèle29. Ainsi, pour une estimation correcte de la mécanique pulmonaire invasive pléthysmographie est indispensable29,30,31.
Puisque la respiration paramètres dépendent de l’âge et la taille de la souris, ventilation paramètres doivent être ajustés. Par exemple, le volume de marée est lié au poids de corps et doit être réglé sur 10 µL/g de poids corporel avec une fréquence respiratoire de 120-250 respirations / minute. Lors du réglage de ces paramètres, le chercheur devrait tenir compte du fait que le volume de marée moyens est inversement proportionnelle à la fréquence respiratoire32. Étant donné que la respiration spontanée influe sur la pression, débit et le volume, la profondeur de l’anesthésie doit être surveillée et courbes de ventilation doivent être respectées en permanence. Cependant, l’anesthésie elle-même peut directement nuire fonction pulmonaire. Par exemple, Propofol et kétamine protègent en partie contre la constriction des voies respiratoires induite par rapport au Thiopental,33. En outre, les études cliniques ont montré que la kétamine a un effet anticholinergique et peut être utilisée comme un bronchodilatateur potentiel dans l’asthme sévère34. Anesthésiques par inhalation, comme l’isoflurane en conjonction avec le traitement de la douleur, sont considérés comme une alternative contrôlable à l’anesthésie de l’injection ; Cependant, une irritation des voies respiratoires après les anesthésiques volatils est signalée et exclut donc les anesthésiques par inhalation comme une alternative35.
Limites de la technique : la méthode invasive retenue pour mesurer les propriétés mécaniques du poumon en raison de la trachéotomie nécessaire, une procédure définitive et limite ainsi l’étude d’une analyse point par point, sans l’option d’enquêter sur la maladie progression. Pour réduire le niveau des techniques invasives, mesure de l’impédance de transfert chez des animaux conscients peut être effectuée, qui permet ainsi aux études longitudinales. Toutefois, lors de la mesure mécanique respiratoire chez les animaux non trachéotomisés, la résistance du nez contribue à la résistance respiratoire totale et ce qui complique les mesures après la méthacholine provocation13.
Étapes critiques au sein du protocole : nous ne démontrons qu’une seule méthode de la fonction pulmonaire invasive. Plusieurs méthodes de fonction de poumon envahissantes établies existent, la normalisation au sein des études et une description détaillée de la méthode utilisée, groupes, et un régime anesthésique dans les publications est nécessaire de comparer les études.
Excision de poumon pour analyse histomorphométrique
Signification en ce qui concerne les méthodes existantes et futures applications : analyse histomorphométrique Quantitative peut être utilisé pour étudier l’impact de l’obésité sur la structure de poumon (bronches et les alvéoles), d’interpréter les résultats obtenus par envahissantes pléthysmographie et d’étudier les options de traitement possibles résultats pulmonaires. Données de l’évaluation histologique peuvent différer selon les agents fixateur et la procédure de fixation utilisé. Puisqu’il a été démontré que l’obésité a un effet sur la structure alvéolaire et bronchique, bien qu’extracellulaire composition de matrice et cellulaires, il est nécessaire de déterminer une technique appropriée basée sur la question de la recherche dans de futures études. Pour la morphométrie quantitative non biaisée, tissus traitement après fixation doivent être effectuée conformément aux normes de l’American Thoracic Society (ATS) / European Respiratory Society (ERS) pour une évaluation quantitative du poumon structure14 .
Modifications et dépannage : en 2010, Hsia et coll. a présenté une déclaration officielle de l’établissement de normes ATS/ERS pour une évaluation quantitative de la structure du poumon, qui devrait être prise en considération avant l’isolement du poumon et de la fixation 14. à côté d’intratrachéale instillation de fixatifs, in situ de fixation, fixation de volume fixe ou de l’inflation sous vide peut être effectuée pour gonfler les tissus pulmonaires,36. L’inflation, et l’élargissement de l’espace aérien, est tributaire des procédures de fixation et le degré de pression appliqué durant la fixation. Haute pression, par exemple, peut conduire à la rupture de la paroi alvéolaire et ainsi influer sur les résultats. Comme pour les paramètres de ventilation, les paramètres de fixation idéal dépendent de l’âge, la taille et le phénotype des souris. La fixation est possible par des moyens chimiques ou physiques, y compris les agents chimiques et/ou de cryoconservation. Instillation intratrachéale de fixatifs adaptés imite l’inflation des tissus au cours de la respiration, ce qui reflète des conditions in vivo et est donc largement utilisé37. 20-25 cm au-dessus du point le plus élevé du poumon est recommandé pour une pression suffisante, à l’aide d’un tube court et large pour permettre une pénétration rapide et uniforme de14. Des principaux objectifs de la fixation est d’empêcher le processus de dégénérescence et de préserver les cellules et tissus dans un « état de vie comme », tout en préservant l’intégrité architecturale du parenchyme pulmonaire. En outre, le tissu doit conserver sa réactivité aux anticorps, taches et sondes d’acide nucléique. Outre l’effet d’autolyse normal, les effets indésirables du traitement, y compris l’infiltration à la cire chaude, le tissu tranchage et décirage, doivent être évités. Le choix du fixateur ainsi que le traitement ultérieur du tissu, par exemple par incorporation, peut causer le rétrécissement des tissus, gonflement et le durcissement des diverses composantes et conduisent à des artefacts, tels que l’autofluorescence accrue38. Par exemple, fixation à 10 % tamponnée au formol et poursuite de la procédure peut entraîner retrait de jusqu'à 20 % - 30 % par rapport au volume initial de39. Par conséquent, Hsia et coll. dans leur document de consensus 2010 de la recommander ATS/ERS l’emploi de 2,5 % glutaraldéhyde tamponnée avec le tétroxyde d’osmium et l’acétate d’uranyle pour éviter le rétrécissement des tissus. Volume pulmonaire, architecture interne, structure fine tissulaire et cellulaire structure a été conservée après l’instillation des voies aériennes de ce réactif fixateur14. La dénaturation des protéines et réticulation formation sont deux mécanismes principaux qui sont importants dans la fixation du tissu. Déshydratation des composés ou des coagulants, tels que les alcools ou de l’acétone, provoquent la dénaturation des protéines, entraînant des modifications de la structure tertiaire protéique par déstabiliser les liaisons hydrophobes. Agents de fixation non-coagulant comme paraformaldéhyde ou glutaraldéhyde réagissent chimiquement avec les protéines et forme intra- moléculaire et inter-cross-links. Étant donné que plusieurs coloration des procédures, telles que l’hématoxyline et éosine coloration, dépendent de leurs interactions, résultats de coloration peut être mauvaise, selon l’agent fixateur. Méthodes de recherche d’antigène en immunohistochimie ont montré que les réactions de fixation sont réversibles, en particulier ceux de formaldéhyde40.
Limites de la technique : étant donné que le revêtement de surface alvéolaire est enlevé par instillation intratrachéale des fixatifs, interprétation de, par exemple, alvéolaire microarchitecture, accumulation de mucus, ou migration des cellules inflammatoires peut être manipulée 41 , 42 , 43.
Étapes critiques au sein du protocole : ici, nous montrons l’instillation intratrachéale de 4 % PFA comme une approche large pour visualiser l’effet de l’obésité sur résultats pulmonaires. Comme mentionné ci-dessus, le protocole doit être modifié selon la question de recherche, selon l’ATS/ERS recommandations14.
Outre les paramètres mentionnés précédemment, le stress est un facteur important influençant les résultats de la recherche. Formation en conséquence, les deux souris et le scientifique est indispensable. Souris doivent être adaptées à la contention et devraient être transférés à la zone expérimentale sous conditions calme44. Stress influence le métabolisme, par exemple par suite de la libération d’hormones de stress, libéré de la glycémie est portée, un effet qui peut être interprété à tort comme une intolérance au glucose. Libération d’hormones de stress modifie également la sensibilité aux médicaments anesthésiques, plus précisément, on augmente la dose d’anesthésiques et le temps pour atteindre la tolérance chirurgicale se prolonge. Tel que mentionné, la quantité accrue d’anesthésiques peut influencer bronchoconstriction, tandis que le stress lui-même peut provoquer une dilatation bronchique.
En résumé, cet article présente trois méthodes pour évaluer l’impact de l’obésité et de métabolisme sur la structure du poumon et la fonction chez les souris. Tous mentionnés méthodes peuvent être transférées à d’autres modèles de maladies et les espèces de rongeurs, tels que l’obésité en raison de modifications génétiques ou des modèles de rat. L’application de ces techniques peut être utile pour définir de nouveaux mécanismes moléculaires dans les modèles DIO avec ablation de gènes spécifiques, ou pour tester de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter/prévenir les effets néfastes de l’obésité sur les maladies pulmonaires chroniques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les expériences ont été pris en charge par la Marga et Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Allemagne ; 16-02-210 (MAAA), projet 210-03-15 (MAAA) du projet et par la Fondation allemande de recherche (DFG ; AL1632-02 ; MAAA), Bonn (Allemagne) ; Centre de médecine moléculaire de Cologne (CMMC ; Hôpital universitaire de Cologne ; Programme de promotion de carrière ; MAAA), Köln, Fortune (Faculté de médecine, Université de Cologne ; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
References
- Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
- Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes? International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
- Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
- Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
- Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
- Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
- Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
- Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
- Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
- McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 12 11-11 12-14 (2008).
- Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
- Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
- Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
- Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
- Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
- Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
- Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance! Eur Respir J. 30, 805 (2007).
- Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
- Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
- Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
- Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
- Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
- Rolls, G. Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
- Winsor, L. Tissue processing. Laboratory histopathology. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
- Histochemistry, theoretical and applied. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).
- Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
- Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).
