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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Intraperitoneal ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण, फेफड़ों के समारोह का मापन, और फेफड़े के परिणामों पर मोटापे और बिगड़ा चयापचय के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए फेफड़ों के निर्धारण

Published: March 15, 2018 doi: 10.3791/56685
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 2, 3, 2, 1,2
1Translational Experimental Pediatrics, Experimental Pulmonology, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, University of Cologne, 2Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, University of Cologne, 3Division of Experimental Pediatrics and Metabolism, University Children's Hospital, Heinrich Heine University Düsseldorf

Summary

मोटापे की घटनाएं बढ़ती हैं और क्रोनिक फेफड़ों की बीमारियों का खतरा बढ़ जाता है । अंतर्निहित तंत्र और निवारक रणनीतियों को स्थापित करने के लिए, अच्छी तरह से परिभाषित पशु मॉडल की जरूरत है । यहां, हम तीन तरीकों (ग्लूकोज सहनशीलता-परीक्षण, शरीर plethysmography, और फेफड़ों के निर्धारण) चूहों में फुफ्फुसीय परिणामों पर मोटापे के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रदान करते हैं ।

Abstract

मोटापा और सांस संबंधी विकार प्रमुख स्वास्थ्य समस्याएं हैं । मोटापे से अधिक १,०००,०००,००० मोटापे से ग्रस्त व्यक्तियों 2030 तक दुनिया भर की एक उंमीद की संख्या के साथ एक उभरती हुई महामारी बन रही है, इस प्रकार एक बढ़ती सामाजिक बोझ का प्रतिनिधित्व । इसके साथ ही मोटापे से संबंधित comorbidities, जिनमें मधुमेह के साथ-साथ हृदय और जीर्ण फेफड़े के रोग भी बढ़ रहे हैं, पर लगातार हो रहे हैं. हालांकि मोटापा अस्थमा तीव्रता के लिए बढ़ा जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है, श्वसन लक्षण की बिगड़ती, और गरीब नियंत्रण, पुरानी फेफड़ों की बीमारी के रोगजनन में मोटापा और परेशान चयापचय की कार्यात्मक भूमिका अक्सर कम करके आंका जाता है, और अंतर्निहित आणविक तंत्र मायावी बने रहते हैं. यह लेख करने के लिए चयापचय पर मोटापे के प्रभाव का आकलन करने के लिए तरीकों वर्तमान करना है, साथ ही फेफड़े संरचना और समारोह । यहां, हम चूहों के अध्ययन के लिए तीन तकनीकों का वर्णन: (1) ग्लूकोज चयापचय पर मोटापे के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए intraperitoneal ग्लूकोज सहनशीलता (ipGTT) का आकलन; (2) फेफड़ों के समारोह पर मोटापे के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए airway प्रतिरोध (Res) और श्वसन प्रणाली अनुपालन (Cdyn) का मापन; और (3) तैयार करने और बाद मात्रात्मक ऊतकवैज्ञानिक आकलन के लिए फेफड़ों के निर्धारण । मोटापा से संबंधित फेफड़ों के रोगों शायद multifactorial हैं, प्रणालीगत भड़काऊ और चयापचय dysregulation से उपजी है कि संभावित रूप से प्रभाव फेफड़ों समारोह और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया । इसलिए, एक मानकीकृत पद्धति आणविक तंत्र और उपंयास उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है ।

Introduction

विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के अनुसार 2008 में, १,४००,०००,००० से अधिक वयस्कों, आयु वर्ग के 20 और पुराने, एक शरीर द्रव्यमान सूचकांक (बीएमआई) के साथ अधिक से अधिक वजन थे या 25 के बराबर; इसके अलावा, अधिक २००,०००,००० पुरुषों और लगभग ३००,०००,००० महिलाओं मोटापे से ग्रस्त थे (बीएमआई ≥ 30)1. मोटापा और चयापचय सिंड्रोम रोगों के एक भीड़ के लिए प्रमुख जोखिम कारक हैं । जबकि मोटापा और सहवर्ती वृद्धि सफेद वसा ऊतक द्रव्यमान है परिचित प्रकार से जुड़ा हुआ है 2 मधुमेह2,3, हृदय रोग (CHD), दिल विफलता (HF), अलिंद अलिंद 4 सहित हृदय संवहनी रोगों और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस5, श्वसन विकारों के रोगजनन में उनके कार्यात्मक भूमिकाओं खराब समझ में रहते हैं । हालांकि, महामारी विज्ञान के अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि मोटापा दृढ़ता से पुरानी श्वसन शर्तों के साथ जुड़ा हुआ है, exertional dyspnea सहित, प्रतिरोधी स्लीप एपनिया सिंड्रोम (ओएसएएस), मोटापा hypoventilation सिंड्रोम (OHS), जीर्ण प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी), फुफ्फुसीय आवेश, आकांक्षा निमोनिया और दमा6,7,8,9. संभावित मोटापे और परेशान चयापचय को जोड़ने तंत्र, जैसे, इंसुलिन प्रतिरोध और प्रकार द्वितीय मधुमेह, क्रोनिक फेफड़ों के रोग के रोगजनन के लिए न केवल यांत्रिक और वजन वेंटिलेशन पर लाभ के शारीरिक परिणाम शामिल लेकिन यह भी एक पुरानी तीव्र भड़काऊ राज्य10,11प्रेरित । पिछले दशक के दौरान मोटापा और फेफड़ों के रोगों की वृद्धि, प्रभावी निवारक रणनीतियों और चिकित्सीय दृष्टिकोण की कमी के साथ युग्मित, के लिए नए रास्ते को परिभाषित करने के लिए मोटापे से संबंधित फेफड़ों के प्रबंधन के लिए आणविक तंत्र की जांच की जरूरत पर प्रकाश डाला बीमारियों.

यहां, हम तीन मानक परीक्षणों का वर्णन है, जो महत्वपूर्ण मूल बातें है मोटापे की जांच और फेफड़ों की संरचना और माउस मॉडल में समारोह पर इसके प्रभाव: (1) intraperitoneal ग्लूकोज सहिष्णुता (ipGTT) (2) airway प्रतिरोध की माप (Res) और श्वसन सिस्टम अनुपालन (Cdyn); और (3) तैयार करने और बाद मात्रात्मक ऊतकवैज्ञानिक आकलन के लिए फेफड़ों के निर्धारण । ipGTT ग्लूकोज को मापने के लिए एक मजबूत स्क्रीनिंग परीक्षण है, और इस प्रकार चयापचय पर मोटापे का प्रभाव. विधि की सादगी अच्छा मानकीकरण की अनुमति देता है, और इसलिए प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना. ऐसे hyperglycemic clamps या पृथक टाप पर अध्ययन के रूप में और अधिक परिष्कृत तरीकों, चयापचय phenotype के विस्तृत विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है12। यहां हम ग्लूकोज सहिष्णुता का आकलन करने के लिए एक मोटापे से संबंधित राज्य के एक फेफड़े के परिणाम पर आगे की पढ़ाई के लिए आधार के रूप में प्रणालीगत और चयापचय विकार की स्थिति को परिभाषित । फेफड़ों समारोह पर मोटापा और चयापचय विकार के प्रभाव का आकलन करने के लिए, हम मापा airway प्रतिरोध (Res) और श्वसन प्रणाली अनुपालन (Cdyn). फेफड़ों के रोग, अनर्गल के रूप में अच्छी तरह के रूप में फेफड़े समारोह के आकलन के लिए रोका तरीकों की विशेषता उपलब्ध हैं । आज़ादी से चलती पशुओं में अनर्गल plethysmography एक प्राकृतिक राज्य की नकल, श्वास पैटर्न को दर्शाती है; इसके विपरीत, इस तरह के इनपुट प्रतिबाधा माप के रूप में जैसे आक्रामक तरीकों, Res और cDyn गहरी anesthetized चूहों में गतिशील फेफड़े यांत्रिकी का आकलन करने के लिए, अधिक सटीक हैं13. के बाद से पुरानी श्वसन शर्तों फेफड़े के ऊतकों के histologic परिवर्तन से परिलक्षित होते हैं, आगे के विश्लेषण के लिए उचित फेफड़ों के निर्धारण आसंन है । ऊतक निर्धारण और तैयारी की विधि का चुनाव फेफड़ों के डिब्बे पर निर्भर करता है जो अध्ययन किया जाएगा, उदाहरण के लिए, एयरवेज या फेफड़ों पैरेन्काइमा14का आयोजन । यहां, हम एक विधि है कि आयोजित करने एयरवेज के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन अस्थमा के विकास पर मोटापे के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है का वर्णन ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं स्थानीय सरकार के अधिकारियों द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुपालन में आयोजित किया गया (भूमि NRW, AZ: 2012. A424), और जर्मन पशु कल्याण कानून और प्रयोगों के लिए या के लिए इस्तेमाल किया जानवरों के कल्याण पर नियमों के अनुसार थे अंय वैज्ञानिक प्रयोजनों । के बाद से फेफड़े समारोह विश्लेषण फेफड़ों की संरचना को प्रभावित और इसलिए बाद में ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण करती है, Res और Cdyn की माप और histomorphometry के लिए फेफड़ों की तैयारी और निर्धारण अलग जानवरों में प्रदर्शन किया जाना चाहिए हो सकता है । हालांकि, Res और Cdyn म् ipGTT का मापन संभव है । ipGTT के दौरान तनाव के बाद से फेफड़े समारोह परीक्षण के लिए आवश्यक संज्ञाहरण के साथ हस्तक्षेप सकता है, लगभग 2 सप्ताह के एक वसूली की अवधि के बाद ipGTT चूहों शरीर के वजन घटाने और रक्त मापदंडों में परिवर्तन से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए सिफारिश की है12.

1. Intraperitoneal ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (ipGTT) के लिए तैयारी

नोट: उपवास के 12 ज के बाद, पूरा ipGTT लगभग 2 एच लेता है ।

  1. चूंकि तनाव रक्त ग्लूकोज काफी प्रभावित करता है, यह सुनिश्चित करें कि चूहों के दोनों अनुकूलन, साथ ही वैज्ञानिक के प्रशिक्षण, प्रदर्शन कर रहे हैं.
  2. शांत और तनाव मुक्त शर्तों के तहत प्रयोगात्मक क्षेत्र के लिए जानवरों का स्थानांतरण ।
  3. चूहों में मोटापा पैदा करने के लिए एक hypercaloric आहार के आवेदन पर विचार करें । आगे की सलाह के लिए चर्चा अनुभाग देखें ।
  4. 12 घंटे के लिए तेजी से जानवरों पानी के लिए उपयोग को सीमित किए बिना, रात । अगले दिन, उपवास के 12 घंटे के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रक्त ग्लूकोज मीटर तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) परीक्षण पट्टी बंदरगाह में एक नया परीक्षण पट्टी डालने के द्वारा).
  5. Incise पूंछ बाँझ कैंची का उपयोग कर टिप, जबकि धीरे अपनी पूंछ पर माउस को बनाए रखने, और तुरंत एक मुक्त बहने रक्त ड्रॉप (ंयूनतम नमूना आकार 0.5 µ एल) रक्त ग्लूकोज मीटर के परीक्षण पट्टी को लागू करने के द्वारा तेजी से रक्त ग्लूकोज उपाय ।
    नोट: एक उलटी गिनती टाइमर रक्त के नमूने के पर्याप्त आवेदन के बाद स्क्रीन पर शुरू होता है । 4 एस के बाद, परीक्षा परिणाम स्क्रीन पर दिखाई देता है ।
  6. बाद में, वजन और व्यक्तिगत रूप से रंग अंकन का उपयोग कर जानवरों लेबल ।
  7. intraperitoneal इंजेक्शन के जरिए 2 ग्राम ग्लूकोज/ यह सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन की मात्रा 0.1 mL/10 ग्राम शरीर का वजन (27 ग्राम सुई और 1 सीसी सिरिंज) है ।
  8. बाद में, एक नया परीक्षण पट्टी पर मुक्त बहने रक्त की एक बूंद लगाने के द्वारा 15, 30, 60, और 120 मिनट के बाद रक्त ग्लूकोज को मापने ।
    नोट: टेल टिप-वॉर्ड की कोमल मसाज से रक्त का प्रवाह बढ़ाया जा सकता है । यदि पूंछ घाव के कंक्रीट, यह एक बाँझ झाड़ू 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ लथपथ का उपयोग कर साफ ।
  9. जानवरों के माप के बीच पानी के लिए असीमित उपयोग के साथ अपने घर पिंजरों में आराम करने के लिए अनुमति दें ।

2. फेफड़ों समारोह विश्लेषण Res और cDyn को मापने के लिए

नोट: Res और cDyn के अबाधित माप के लिए, चूहों को गहरी संज्ञाहरण के तहत हवादार होने की जरूरत है । तनाव से मुक्त पशु हैंडलिंग और संज्ञाहरण के समुचित निगरानी आवश्यक हैं । सामांय बाँझ तकनीकों का उपयोग कर के निर्देशों के लिए, कृपया Hoogstraten द्वारा लेख की समीक्षा करें-मिलर एट अल । 15

  1. प्रयोगों के प्रत्येक सेट से पहले plethysmograph जांचना और सॉफ्टवेयर के भीतर अध्ययन सेटिंग्स तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें).
  2. सर्जरी से पहले, Xylazine के intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से गहराई से anesthetize जानवरों (10 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) और Ketamine (100 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) (27 ग्राम सुई और 1 सीसी सिरिंज) । सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन की मात्रा शरीर के वजन के अनुसार 0.1 मिलीलीटर/
    नोट: के बाद से ketamine चूहों में एक उचित एनाल्जेसिक प्रभाव है, कोई अतिरिक्त दर्द उपचार आवश्यक है । इनवेसिव सांस कैथेटर/plethysmograph प्रक्रिया लगभग 5-7 मिनट लगते हैं, तो डेटा अधिग्रहण शुरू कर सकते हैं ।
  3. शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर लापरवाह स्थिति में माउस रखें ।
  4. संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए मरहम के साथ आंखों को कवर ।
  5. लगातार संज्ञाहरण की अंगुली चुटकी-प्रतिक्रिया का उपयोग कर गहराई की निगरानी.
    नोट: संवेदनाहारी के अतिरिक्त प्रशासन संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान को बनाए रखने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  6. 70% इथेनॉल के साथ थायराइड क्षेत्र में शल्य क्षेत्र के फर गीला ।
  7. ध्यान से उरोस्थि के jugular पायदान और symphyses के mentum के साथ उठाने और कुंद कैंची (आंकड़ा 1a) का उपयोग कर दृश्य निरीक्षण के तहत त्वचा कतरन के बीच लगभग 1 सेमी के लिए midline में त्वचा incise ।
  8. अंतर्निहित चमड़े के नीचे वसा ऊतक और थायरॉयड ग्रंथि कल्पना ।
  9. ध्यान से श्वासनली बेनकाब स्थलडमरूमध्य और sternothyroid और sternothyroid की मांसपेशियों के विच्छेदन में दोनों थाइरोइड पालियों को अलग कुंद (चित्र 1b) । सावधान रहना किसी भी जहाजों को नुकसान नहीं है और कारण खून बह रहा है, क्योंकि यह हृदय प्रणाली पर प्रतिकूल प्रभाव और माप पर अंततः पैदा कर सकता है ।
  10. बाद में, कुंद संदंश का उपयोग कर श्वासनली और घेघा के बीच एक 4-0 लट सर्जिकल टांका पास । सूक्ष्म कैंची के साथ सांस उपास्थि के बीच गला करने के लिए श्वासनली बंद incise ध्यान से.
  11. विजुअल कंट्रोल (फिगर 1C) के तहत सांस ट्यूब (0.04 इंच/1.02 mm व्यास) के साथ Intubate । प्रणाली में किसी भी रिसाव से बचने के लिए सर्जिकल सीवन के साथ बंधाव के माध्यम से ट्यूब ठीक करें ।
  12. इसके बाद, पशु को शरीर के चैंबर के गर्म बिस्तर पर ले जाएं और सांस ट्यूब को फेस प्लेट (चित्रा 1 डी) से कनेक्ट करें और कंट्रोलर (figure 1E) के सामने वाले पैनल पर वेंटिलेशन बटन दबाकर वेंटिलेशन को चालू करें ।
  13. छाती आंदोलन को वेंटिलेशन रेट के साथ contemporaneously देख कर वेंटिलेशन का सर्वेक्षण कराएं । सांस ट्यूब की उचित स्थान की पुष्टि करने के लिए, सुनिश्चित करें कि छाती के दोनों पक्षों को एक साथ ले जाएं ।
  14. कंप्यूटर स्क्रीन (फिगर 1F) पर प्रेशर सिग्नल देखें । सुनिश्चित करें कि वेंटिलेशन घटता एक समान हैं । यदि यह मामला नहीं है, पशु अलग और सर्जरी की ओर की जांच करें । रक्त या बलगम अवरुद्ध सांस ट्यूब के खबरदार ।
    नोट: एक शरीर के वजन के साथ वयस्क जानवरों के लिए 20-25 ग्राम, वेंटीलेटर सेटिंग्स के रूप में चित्रा 2 में दिखाया निर्माता की सिफारिशों के अनुसार सुझाव दिया है ।
  15. वेंटिलेशन के दौरान ट्रांस फेफड़े के दबाव में परिवर्तन को नियंत्रित करने के लिए, गहराई है कि फेफड़ों के स्तर अनुमानित पर घेघा में एक घेघा ट्यूब (0.04 इंच/1.02 mm व्यास) डालें । ट्यूब रखने के दौरान स्क्रीन को देखो । ट्यूब प्लेस जहां अधिक से अधिक दबाव विक्षेपन और ंयूनतम दिल कलाकृतियों स्क्रीन पर देखा जा सकता है ।
  16. सर्जरी के बाद, माप के लिए पशु तैयार करते हैं । Ketamine के intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से संज्ञाहरण सुई लेना (100 मिलीग्राम/27-जी सुई और 1 सीसी सिरिंज का उपयोग कर. सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन की मात्रा शरीर के वजन के अनुसार 0.1 मिलीलीटर/
    नोट: दमा hyperreagibility का आकलन करने के लिए, nebulize methacholine, एगोनिस्ट तंत्रिका तंत्र के एक गैर चयनात्मक मस्करीनिक रिसेप्टर parasympathetic, जो ब्रोन्कोकन्सट्रिक्शन लाती है. डेटा प्राप्ति चार भिंन चरणों (चित्र 3) में की जाती है ।
  17. निर्माता ´ एस प्रोटोकॉल के अनुसार डेटा प्राप्ति प्रारंभ करें ।
    नोट: सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से प्राप्ति प्रक्रिया के माध्यम से उपयोगकर्ताओं को मार्गदर्शन करता है.
  18. छिटकानेवाला पर पंजाब (वाहन) के 10 µ एल लागू करें, और acclimation के 5 मिनट के बाद nebulization शुरू करते हैं । अगला, 3 मिनट, जहां Res (cmH2o/एमएल/s) और cDyn (एमएल/cmH2o) की एक प्रतिक्रिया चरण का पालन करें मापा जाता है । अंत में, अगले nebulization करने से पहले पशु के लिए 3 मिनट की वसूली चरण प्रदान करते हैं ।
  19. methacholine की बढ़ती सांद्रता के 10 µ l के stepwise आवेदन द्वारा सॉफ्टवेयर का पालन करें (2.5 µ g/10 µ l, 6.25 µ g/10 µ l, और 12.5 µ g/10 µ l) वेंटीलेटर पर ।
  20. एक बार सभी माप प्रदर्शन किया और दर्ज की गई है, गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन से पशु बलिदान ।

3. वयस्क चूहों की मात्रात्मक Histomorphometric विश्लेषण के लिए फेफड़ों अलगाव

  1. गहराई से Xylazine के intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से पशु anesthetize (10 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) और Ketamine (100 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) (27 ग्राम सुई और 1 सीसी सिरिंज) । इंजेक्शन की मात्रा शरीर के वजन के अनुसार 0.1 mL/10 ग्राम होना चाहिए ।
    नोट: शल्य सहिष्णुता की स्थिति तक पहुंचने के बाद, तैयारी लगभग 5 अंग छिड़काव और निर्धारण के लिए 30 मिनट के बाद मिनट लेता है ।
  2. एक बार पशु शल्य सहिष्णुता (नकारात्मक पैर की अंगुली चुटकी-प्रतिक्रिया) की स्थिति तक पहुंच गया है, 70% इथेनॉल के साथ पशु को संक्रमित और सर्जिकल टेप के साथ एक पैड पर पशु को ठीक ।
  3. हृदय पंचर और खून बह रहा द्वारा पशु बलिदान । संक्षेप में, त्वचा के माध्यम से एक औसत दर्जे का चीरा और कुंद कैंची का उपयोग कर के साथ पेट खुला ।
  4. डायाफ्राम हेड वार्ड जिगर की स्थिति जानें, और ध्यान से डायाफ्राम से जिगर अलग ।
  5. डायाफ्राम कुंद कैंची का उपयोग कर में एक छोटा सा चीरा बनाओ, और एक 20 जी सुई से जुड़ी एक 2 मिलीलीटर सिरिंज के साथ दिल की बाईं निलय कबरा । धीरे से पशु को exsanguinate ।
    नोट: धीमी और सावधान exsanguination नकारात्मक दबाव के कारण टूट निलय को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, एक अबाधित रक्त प्रवाह में बाधा.
  6. घुमावदार, कुंद कैंची का उपयोग कर रिब पिंजरे की पूरी लंबाई के साथ एक parasternal चीरा के माध्यम से धीरे छाती खोलने के द्वारा फेफड़े काटना ।
  7. बाद में, रिब पिंजरे लिफ्ट (चित्रा 3सी) फुफ्फुस गुहा बेनकाब करने के लिए । दिल और फेफड़ों को देखने के लिए थाइमस निकालें ।
    नोट: सही निलय के वैकल्पिक इंजेक्शन, बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ फेफड़ों संवहनी प्रणाली के छिड़काव द्वारा पीछा किया और फिर एक निर्धारण समाधान के साथ [उदा., 4% (द्रव्यमान/मात्रा) paraformaldehyde (पीएफए)] संभव है । ध्यान रखें कि वायुकोशीय septae टूटना करने के लिए एक बढ़ा जोखिम है और इस विधि का उपयोग कर फेफड़ों की संरचना को प्रतिकूल रूप से प्रभावित ।
  8. पहले सावधानी से हृदय को हटाकर फेफड़े को काटना.
  9. बाद में, कुंद संदंश का उपयोग कर श्वासनली और घेघा के बीच एक 4-0 लट सर्जिकल टांका पास ।
  10. अगले, ध्यान से सांस उपास्थियों के बीच गला के करीब श्वासनली incise, एक नसों प्रवेशनी (26 ग्राम) के साथ intubate, और 20 सेमी एच2के एक निरंतर दबाव में दबाव निर्धारण से फेफड़ों फुलाना निर्धारण एजेंट का उपयोग कर [उदा, 4% (मास /volume) के पीएफए].
  11. पीएफए निर्धारण के लिए, निर्धारण को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए छोड़ दें । बाद में, ligate श्वासनली और प्रवेशनी को हटा दें । फिर, ऊतक को नुकसान पहुँचाए बिना फेफड़े सावधानी से एक्साइज, और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर निर्धारण एजेंट में स्टोर ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, के अनुसार एटीएस/ETS आम सहमति कागज 2.5% GA बफ़र्ड OsO4, Uracil समाधान उचित ऊतक स्थिरीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है । आगे ऊतक तैयार करने के लिए, Hsia एट अल द्वारा आम सहमति कागज देखें । 14

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Representative Results

intraperitoneal ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (ipGTT) के प्रतिनिधि परिणाम (चित्रा 4), फेफड़े समारोह परीक्षण (चित्रा 5), और hematoxylin और eosin सना हुआ फेफड़ों (चित्रा 6) चित्रण प्रतिनिधि छवियों.

ipGTT मोटापे से ग्रस्त चूहों में प्रदर्शन किया गया था (नीला) के बाद 7 सप्ताह के उच्च वसा आहार (HFD). मानक आहार-फेड चूहों नियंत्रण (काला) के रूप में सेवा की । मोटापे से ग्रस्त चूहों intraperitoneal ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद बढ़ी हुई सीरम ग्लूकोज का स्तर 15 और 30 मिनट दिखाया, बिगड़ा सेलुलर ग्लूकोज के ऊपर का संकेत (चित्रा 4).

फेफड़ों समारोह पर मोटापे के प्रभाव की जांच करने के लिए, इनवेसिव फेफड़े समारोह विश्लेषण मोटापे से ग्रस्त चूहों में प्रदर्शन किया गया था (नीला) के बाद 7 सप्ताह के उच्च वसा आहार (HFD). मोटापे से ग्रस्त चूहों नियंत्रण चूहों (काला) (चित्रा 5) की तुलना में airway प्रतिरोध की 1.5 गुना वृद्धि करने के लिए एक अप करने के लिए दिखाया.

फेफड़ों पैरेन्काइमा पर fixatives के intratracheal जगाकर के दौरान दबाव निर्धारण के प्रभाव की कल्पना करने के लिए, hematoxylin और eosin दाग फेफड़ों के वर्गों के प्रतिनिधि छवियों (चित्रा 6) दिखाया जाता है । बहुत कम दबाव एकाधिक संयुक्त राष्ट्र के फुलाया क्षेत्रों की ओर जाता है, मोटी वायुकोशीय septae, और बहुभुज के आकार का alveoli (ए), जबकि अधिक फुलाया वातस्फीति में बहुत अधिक दबाव परिणाम-संहार वायुकोशीय septae (सी) के साथ की तरह क्षेत्रों । फेफड़ों के निर्धारण के दौरान उचित दबाव के आवेदन गोल आकार alveoli (ख) के साथ एक पूरी तरह से फुलाया फेफड़ों की ओर जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: इनवेसिव फेफड़ों समारोह के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (A-C) tracheotomy के कदम । (घ) plethysmograph की फेस प्लेट के लिए पशु का कनेक्शन. (ङ) इनवेसिव फेफड़ों समारोह के लिए हार्डवेयर सेटअप । (F) डेटा प्राप्ति का स्क्रीनशॉट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: दमा hyperreagibility का आकलन करने के लिए डेटा अधिग्रहण की योजना. डेटा अधिग्रहण एक प्रारंभिक acclimation अवधि (5 मिनट), पदार्थ nebulization, प्रतिक्रिया चरण के 3 मिनट के 30 एस द्वारा पीछा भी शामिल है, और वसूली चरण के 3 मिनट अगले पदार्थ एकाग्रता के पहले nebulization । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: तैयारी चरणों का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण. (A-D) tracheotomy के कदम । (क) त्वचा का चीरा. (ख) सीटू ने वक्ष गुहार की. (ग) रिब पिंजरे के हटाने के बाद देखें । (D) दिल को हटाने के बाद देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि intraperitoneal ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (ipGTT). C57Bl/6N चूहों एक उच्च वसा वाले आहार के लिए खिलाया गया 6-8 सप्ताह; नियंत्रण चूहों एक मानक आहार प्राप्त किया । n = 3; मतलब ± SEM; सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन दो तरह ANOVA परीक्षण और Bonferroni posttest थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि फेफड़ों समारोह परीक्षण । C57Bl/6N चूहों एक उच्च वसा वाले आहार के लिए खिलाया गया 6-8 सप्ताह; नियंत्रण चूहों मानक आहार प्राप्त किया । n = 3; मतलब ± SEM; सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन दो तरह ANOVA परीक्षण और Bonferroni posttest थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: hematoxylin और eosin दाग फेफड़ों चित्रण प्रतिनिधि छवियों. intratracheal मुद्रास्फीति के तीन अलग ग्रेड: (एक) बहुत कम दबाव, (ख) उचित दबाव, और (ग) बहुत ज्यादा दबाव । उिा; ढह गया क्षेत्र, OIA; फुलाया हुआ क्षेत्र पर; 20X आवर्धन के अंतर्गत छवियां ली गईं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

वेंटीलेटर सेटिंग्स Spalte1
अधिकतम. स्ट्रोक वॉल्यूम 0.25 मिलीलीटर
अधिकतम. मुंह के दबाव 30cmH२हे
गहरी मुद्रास्फीति अधिकतम । वॉल्यूम 0.5 मिलीलीटर
गहरी मुद्रास्फीति अधिकतम । दबाव 30cmH२हे
दर प्रति मिनट 160 सांस

तालिका 1: वयस्क चूहों के लिए वेंटीलेटर सेटिंग्स. छोटे जानवरों के लिए, वेंटिलेशन मापदंडों को समायोजित करने की आवश्यकता है ।

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Discussion

इस रिपोर्ट तीन विभिंन तरीकों के लिए ग्लूकोज चयापचय और फेफड़े के परिणामों पर मोटापे के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए तीन प्रोटोकॉल प्रदान करता है । सबसे पहले, ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण intracellular ग्लूकोज का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है और इंसुलिन प्रतिरोध का संकेत किया जा सकता है. दूसरा, पूरे शरीर plethysmography फेफड़ों समारोह को मापने के लिए एक तकनीक है और इस तरह के उपंयास उपचार की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए उपयोगी है । तीसरा, एक मानकीकृत निर्धारण प्रोटोकॉल मात्रात्मक morphometric विश्लेषण के लिए आवश्यक है के लिए संरचनात्मक परिवर्तन पर मोटापे के प्रभाव का आकलन ।

आहार-पशु अनुसंधान में प्रेरित मोटापा

मौजूदा तरीकों और भविष्य के अनुप्रयोगों के संबंध में महत्व: मानव खाने की आदतों, जो मोटापा में परिणाम की नकल करने के लिए, आहार प्रेरित मोटापा (दिो) मॉडल व्यापक रूप से कुतर में इस्तेमाल किया जाता है । चयापचय रोग नकल उतार आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उपयोग की तुलना में, दिो मॉडल एटियलजि, विकृति, और भविष्य के उपचार के विकल्पों का विश्लेषण सक्षम करें । Heydemann एट अलद्वारा हाल ही की एक समीक्षा, मधुमेह अनुसंधान में विभिन्न murine उच्च वसा आहार मॉडल का अवलोकन16प्रदान करता है. पोषक तत्वों घटकों के विशिष्ट संशोधनों के मोटापे के आणविक तंत्र पर सूक्ष्म और स्थूल पोषक तत्वों के प्रभाव के भविष्य के अध्ययन की संभावना प्रदान करते हैं, और इस तरह फेफड़ों की संरचना और समारोह पर ।

संशोधन और समस्या निवारण: विभिंन रिपोर्टों से पता चलता है कि मोटापा आहार पोषक तत्वों की संरचना में अलग परिवर्तन से प्रेरित किया जा सकता है16, ज्ञान, जो बारी में है, हाल के वर्षों में आहार की एक किस्म के विकास के लिए नेतृत्व, उदाहरण के लिए, वसा या कार्बोहाइड्रेट सामग्री या दोनों आहार है, जो तथाकथित पश्चिमी आहार16का एक संयोजन में उच्च आहार । अंत में, एक अध्ययन के लिए आहार का चुनाव अनुसंधान प्रश्न और अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करता है । इन महत्वपूर्ण कारकों को नियंत्रित करने के अलावा, एक उचित नियंत्रण आहार का चुनाव अत्यंत महत्व का है; अन्यथा परिणाम की व्याख्या सीमित हो जाएगी । फिर भी, phenotype न केवल आहार के प्रकार के कारण होता है बल्कि खिला अवधि, लिंग और माउस तनाव17का एक परिणाम है ।

तकनीक की सीमाएं: आहार के विभिंन पोषक तत्वों की संरचना के बगल में, पशु की प्रतिक्रिया और पृष्ठभूमि तनाव परिणामों के लिए खाते सकता है और मोटापे की प्रेरण द्वारा मनाया phenotype । उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है, कि बालब/सी चूहों C57Bl/6 चूहों की तुलना में जिगर steatosis के लिए अतिसंवेदनशील हैं18. मामूली आनुवंशिक विविधताओं, जैसे, आनुवंशिक बहाव के कारण (C57Bl/6J बनाम C57Bl/6N), भी मोटापे के लिए संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकते है19। यह अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि उपभेदों के साथ आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ काम कर रहे तकनीक की सीमाओं पर प्रकाश डाला गया है, क्योंकि यहां तक कि तनाव और विक्रेता से प्राप्त किए गए थे परिणाम प्रभावित कर सकते हैं ।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम: विश्वसनीय, reproducible, और प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों के बीच तुलनीय परिणामों के लिए, अधिमानतः littermates नियंत्रण और प्रयोगात्मक चूहों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, पर्यावरणीय कारकों और तनाव होना चाहिए परहेज, और नियंत्रित चूहों प्रयोगात्मक चूहों के साथ समानांतर में अध्ययन किया जाना चाहिए12.

Intraperitoneal ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (ipGTT)

मौजूदा तरीकों और भविष्य के अनुप्रयोगों के संबंध में महत्व: murine चयापचय पर दिो के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, विभिंन स्क्रीनिंग टेस्ट मौजूद हैं । माउस चयापचय Phenotyping केंद्र (MMPC) कंसोर्टियम चूहों में चयापचय phenotypes का आकलन करने के लिए मानक तरीकों का प्रस्ताव करने के लिए स्थापित किया गया था और वर्णन और ग्लूकोज के चयापचय परीक्षण प्रदर्शन के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं प्रकाशित चूहों में homeostasis12. एक GTT एक वैश्विक दृष्टिकोण को मापने के लिए कितनी अच्छी तरह शरीर की कोशिकाओं को शर्करा की एक दी गई राशि घूस लेने के बाद ग्लूकोज में सक्षम हैं, जो बारी में इंसुलिन स्राव और इंसुलिन प्रभाव का संकेत है. सीरम इंसुलिन के स्तर में अंतर अक्सर बदल ग्लूकोज सहिष्णुता के लिए खाते । इसलिए, GTT मधुमेह और मोटापे के माउस मॉडल की विशेषता के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया शारीरिक परीक्षणों में से एक बन गया है । चूंकि ipGTT एक तेजी से और आसान तरीका है, यह एक मानकीकृत विधि के रूप में भविष्य के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है आहार और चयापचय पर या उपचार के प्रभाव का विश्लेषण ।

संशोधन और समस्या निवारण: GTT नियमित रूप से चूहों में रक्त शर्करा का स्तर बराबर करने के लिए एक रात के बाद तेजी से किया जाता है20. उपवास अवधि की अवधि के बाद से जांच मापदंडों पर मजबूत प्रभाव पड़ता है और इसलिए परिणामों की तुलना और व्याख्या के लिए बहुत महत्व का है, उपवास की अवधि चूहों के उम्र और शरीर के वजन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । ध्यान में रखते हुए कि चूहों रात जानवरों और कुल दैनिक भोजन के सेवन के दो तिहाई रातोंरात भस्म हो जाता है, रात भर उपवास एक catabolic राज्य भड़काने । इस प्रकार, दीक्षा के समय बिंदु और उपवास की अवधि के परिणामों पर एक अत्यधिक प्रासंगिक प्रभाव पड़ता है, और इस प्रकार इन मापदंडों12मानकीकृत किया जाना चाहिए । इसके अलावा, लंबे समय तक उपवास जिगर ग्लाइकोजन भंडार घट जाती है और इसलिए आधारभूत रक्त ग्लूकोज में परिवर्तनशीलता कम कर देता है । अंत में, के बाद से इंसुलिन उत्तेजित चूहों में ग्लूकोज उपयोग लंबे समय तक उपवास अवधि के बाद बढ़ाया जाता है21, एक 5 से 6 घंटे उपवास अवधि इंसुलिन कार्रवाई का आकलन करने के लिए सिफारिश की है; जबकि, रात भर उपवास के लिए ग्लूकोज का उपयोग12,20,22परीक्षण के लिए पर्याप्त है । ग्लूकोज सामान्य रूप से आईएफसआई इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित है और ग्लूकोज की खुराक शरीर के वजन के लिए समायोजित किया जाता है (आमतौर पर 1 या 2 जी/ दिो मॉडलों में, शरीर का वजन बढ़ जाता है, मुख्य रूप से एक उच्च वसा द्रव्यमान के कारण; ग्लूकोज, हालांकि, मुख्य रूप से मांसपेशियों, मस्तिष्क, और जिगर में होता है । इन ऊतकों की मात्रा के बाद से आम तौर पर नहीं बदला है दिो, मोटापे से ग्रस्त चूहों दुबला चूहों, जो बारी में डेटा की व्याख्या को प्रभावित और एक गलत निदान ग्लूकोज असहिष्णुता के लिए नेतृत्व कर सकता है की तुलना में ग्लूकोज की एक अधिकतर उच्च राशि प्राप्त22 . इस कारण से, उपवास के समय के लिए मानकीकृत और शरीर रचना की जरूरत है GTT परिणाम23की व्याख्या के दौरान विचार किया जाना चाहिए । इसलिए, कंप्यूटर टोमोग्राफी (सीटी) या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) स्कैन लागू होते हैं । उदाहरण के लिए, ग्लूकोज हाथ से लिया माप-आयोजित पूरे रक्त ग्लूकोज पर नज़र रखता है ( सामग्री की तालिकादेखें) उपलब्ध हैं, और इन पर नज़र रखता है और अधिक सामांयतः प्लाज्मा ग्लूकोज विश्लेषक की तुलना में उपयोग किया जाता है । छोटे रक्त की मात्रा की आवश्यकता के कारण-आमतौर पर 5 µ l या कम-वे प्लाज्मा विश्लेषक से अधिक व्यावहारिक हैं.

तकनीक की सीमाएं: उपवास की अवधि पर चूहों प्रदर्शन निर्भरता और शरीर के वजन में एक महत्वपूर्ण नुकसान दिखाने के लिए, शरीर का तापमान, रक्त की मात्रा, और हृदय की दर के साथ-साथ सीरम पैरामीटर में परिवर्तन, मुक्त फैटी एसिड का स्तर और कीटोंन निकायों के रूप में 24. इस चयापचय तनाव तथ्य यह है कि पशु सुविधाओं में चूहों के आवास तापमान लगभग 23 डिग्री सेल्सियस करने के लिए मानकीकृत है द्वारा शुरू हो रहा है, और इसलिए उनके थर्मामीटरों-30 डिग्री सेल्सियस के तटस्थ तापमान के नीचे है25। उपथर्मामीटरों में लंबे समय तक उपवास-तटस्थ तापमान torpor में परिणाम कर सकते हैं, चयापचय दर की कमी की विशेषता26,27.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम: जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, प्रायोगिक और नियंत्रण समूहों के बीच विश्वसनीय परिणामों के लिए, littermates अधिमानतः अध्ययन और उपवास के समय के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और टाइम अंक मानकीकृत किया जाना चाहिए ।

फेफड़े समारोह विश्लेषण

इस प्रोटोकॉल में, plethysmograph सीधे दबाव परिवर्तन है कि श्वसन चला रहे है उपाय है, और परिणामी में और वायुमार्ग से बाहर बहती है । बहती plethysmograph की दीवार में स्थित एक pneumotachograph द्वारा मापा जाता है । छाती की दीवार से प्रतिरोध को बाहर करने के लिए, airway खोलने के दबाव (मुंह दबाव) और transpulmonary (घेघा ट्यूब) दबाव मापा जाता है और airway प्रतिरोध और गतिशील अनुपालन की गणना कर रहे हैं । डायनेमिक अनुपालन प्रवाह के माध्यम से विभाजित न्यूनतम और अधिकतम फेफड़ों की मात्रा के अंतर के माध्यम से की गणना की है.

मौजूदा तरीकों और भविष्य के अनुप्रयोगों के संबंध में महत्व: Plethysmography फेफड़ों के यांत्रिक गुणों का विश्लेषण करने के लिए मानक प्रक्रिया है, और कर सकते हैं, इसलिए, फेफड़े विकृति और उपचार के विकल्प का विश्लेषण करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है । समूहों और अध्ययनों की तुलना करने के लिए, एक मानकीकृत दृष्टिकोण अपरिहार्य है ।

संशोधन और समस्या निवारण: सामांय में, इस तकनीक को अनर्गल और प्रतिबंधित पूरे शरीर plethysmography के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है । अनर्गल तरीकों का निर्धारण बढ़ाया ठहराव (पेंह) और सामांय श्वास पैटर्न के विश्लेषण सक्षम, whilst रोका, आक्रामक तरीके सीधे दबाव, प्रवाह, या मात्रा को मापने । फेफड़ों यांत्रिक गुणों प्रतिरोध और elastance द्वारा निर्धारित कर रहे हैं; जबकि प्रतिरोध प्रवाह के दबाव के अनुपात के रूप में गणना की है, elastance मात्रा के लिए दबाव के अनुपात को दर्शाता है28. इसके विपरीत, अनर्गल पूरे शरीर plethysmography केवल plethysmograph के अंदर दबाव को मापने है, और इसलिए प्रतिरोध और elastance की एक गणना असंभव है । 2007 में, Lundblad एट अल. ने कहा है कि पेंह सही पैरामीटर airway प्रतिरोध को मापने के लिए नहीं है, लेकिन29श्वास पैटर्न के एक विशिष्ट प्रतिबिंब का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रकार, फेफड़ों के यांत्रिकी के उचित आकलन के लिए, इनवेसिव plethysmography अपरिहार्य29,30,31है ।

श्वास मापदंडों चूहों की उम्र और आकार पर निर्भर के बाद से, वेंटिलेशन मापदंडों समायोजित करने की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, ज्वार की मात्रा शरीर के वजन से संबंधित है और प्रति मिनट 120-250 सांस की एक श्वास आवृत्ति के साथ 10 µ एल/जी शरीर के वजन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । इन मापदंडों को समायोजित करते समय, जांचकर्ता को यह ध्यान रखना चाहिए कि ज्वार की मात्रा व्युत्क्रम श्वसन आवृत्ति32से संबंधित है । के बाद से सहज श्वास प्रभाव दबाव, प्रवाह, और मात्रा, संज्ञाहरण की गहराई पर नजर रखी जा करने के लिए है और वेंटिलेशन घटता लगातार मनाया जाना है । हालांकि, संज्ञाहरण ही सीधे प्रतिकूल फेफड़े समारोह को प्रभावित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, Propofol और Ketamine आंशिक रूप से Thiopental33की तुलना में प्रेरित airway कसना के खिलाफ की रक्षा. इसके अलावा, नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि Ketamine एक कोलीनधर्मरोधी प्रभाव है और गंभीर अस्थमा में एक संभावित bronchodilator के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है34. सांस का निश्चेतक, दर्द उपचार के साथ संयोजन के रूप में isoflurane के रूप में, इंजेक्शन संज्ञाहरण के लिए एक नियंत्रणीय विकल्प के रूप में माना जाता है; हालांकि, अस्थिर निश्चेतक के बाद airway जलन की सूचना दी है और इसलिए एक वैकल्पिक35के रूप में सांस लेना निश्चेतक शामिल नहीं है ।

तकनीक की सीमाएं: नियंत्रित इनवेसिव विधि फेफड़ों यांत्रिक गुणों को मापने के लिए आवश्यक tracheotomy, एक अंतिम प्रक्रिया के कारण है, और इस तरह एक एकल बिंदु विश्लेषण करने के लिए अध्ययन की सीमा, रोग की जांच करने के लिए विकल्प के बिना प्रगति. आक्रामकता के स्तर को कम करने के लिए, जागरूक पशुओं में स्थानांतरण प्रतिबाधा की माप किया जा सकता है, जिससे अनुदैर्ध्य अध्ययन सक्षम बनाता है. हालांकि, जब गैर tracheotomized पशुओं में श्वसन यांत्रिकी को मापने, नाक के प्रतिरोध कुल श्वसन प्रतिरोध करने के लिए योगदान देता है, और इस तरह methacholine के बाद माप पेचीदा13.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम: यहां हम आक्रामक फेफड़ों समारोह के केवल एक ही विधि का प्रदर्शन । के बाद से कई स्थापित इनवेसिव फेफड़ों समारोह के तरीके मौजूद हैं, अध्ययन के भीतर मानकीकरण और विधि का इस्तेमाल किया, समूहों का एक विस्तृत वर्णन, और प्रकाशनों में एक संवेदनाहारी शासन के अध्ययन की तुलना करने के लिए आवश्यक है ।

histomorphometric विश्लेषण के लिए फेफड़ों के उत्पाद

मौजूदा तरीकों और भविष्य के अनुप्रयोगों के संबंध में महत्व: मात्रात्मक histomorphometric विश्लेषण फेफड़ों की संरचना पर मोटापे के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (ब्रांकाई और alveoli), इनवेसिव द्वारा प्राप्त परिणामों की व्याख्या करने के लिए plethysmography, और फुफ्फुसीय परिणाम पर संभव उपचार विकल्पों का अध्ययन करने के लिए । ऊतकवैज्ञानिक आकलन से डेटा निर्धारण एजेंटों और इस्तेमाल किया निर्धारण प्रक्रिया के आधार पर अलग हो सकता है । चूंकि यह दिखाया गया है कि मोटापा वायुकोशीय और दमा संरचना पर एक प्रभाव है, साथ ही extracellular मैट्रिक्स और सेलुलर संरचना, यह भविष्य के अध्ययन में अनुसंधान के सवाल पर आधारित एक उपयुक्त तकनीक का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है. निष्पक्ष मात्रात्मक morphometry के लिए, ऊतक प्रसंस्करण निंनलिखित निर्धारण अमेरिकी वक्ष समाज (एटीएस)/European श्वसन सोसायटी (ERS) फेफड़ों की संरचना के मात्रात्मक आकलन के लिए 14 के मानकों के अनुसार किया जाना चाहिए .

संशोधन और समस्या निवारण: में 2010 Hsia एट अल. एटीएस की एक आधिकारिक बयान/ERS की मात्रा निर्धारण फेफड़ों की संरचना है, जो ध्यान में फेफड़े के अलगाव और निर्धारण करने से पहले लिया जाना चाहिए के लिए मानकों की स्थापना प्रस्तुत 14. बगल में fixatives के intratracheal जगाकर, सीटू निर्धारण में , निश्चित मात्रा निर्धारण, या वैक्यूम मुद्रास्फीति फेफड़े के ऊतकों को फुलाने के लिए किया जा सकता है36. मुद्रास्फीति, और इस तरह हवाई क्षेत्र इज़ाफ़ा, निर्धारण प्रक्रियाओं और निर्धारण के दौरान लागू दबाव के ग्रेड पर निर्भर है । उच्च दबाव, उदाहरण के लिए, वायुकोशीय दीवार टूटना करने के लिए नेतृत्व और इस तरह के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । इसी तरह वेंटिलेशन पैरामीटर्स के लिए आदर्श निर्धारण पैरामीटर चूहों की उम्र, आकार, और phenotype पर निर्भर करता है । निर्धारण रासायनिक या भौतिक साधन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, रासायनिक एजेंटों और/cryopreservation सहित । उपयुक्त fixatives के Intratracheal जगाकर सांस लेने के दौरान ऊतक मुद्रास्फीति की नकल, vivo परिस्थितियों में दर्शाती है, और इसलिए व्यापक रूप से37इस्तेमाल किया जाता है । फेफड़ों के उच्चतम बिंदु से ऊपर 20-25 सेमी पर्याप्त दबाव के लिए सिफारिश की है, एक व्यापक और कम टयूबिंग का उपयोग करने के लिए तेजी से और वर्दी प्रवेश14अनुमति देते हैं । निर्धारण का एक प्रमुख उद्देश्य अध कि प्रक्रिया को रोकना तथा फेफड़ों की पैरेन्काइमा की स्थापत्य अखंडता का संरक्षण करते हुए "जीवन की तरह अवस्था" में कोशिकाओं और ऊतकों को संरक्षित करना है । इसके अलावा, ऊतक एंटीबॉडी, दाग, और न्यूक्लिक एसिड जांच के लिए अपनी जेट बनाए रखने चाहिए । सामान्य autolysis के प्रभाव के अलावा, गर्म मोम के साथ घुसपैठ सहित ऊतक प्रसंस्करण के प्रतिकूल प्रभाव, टुकड़ा करने की क्रिया, और एपिलेशन, रोका जा करने के लिए है । निर्धारण के विकल्प के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक के आगे प्रसंस्करण, embedding के माध्यम से उदा, ऊतक संकोचन, सूजन पैदा कर सकता है, और विभिंन घटकों के कठोर और कलाकृतियों के लिए सीसा, जैसे वृद्धि हुई autofluorescence38। उदाहरण के लिए, 10% में निर्धारण बफ़र्ड formalin और आगे की प्रक्रिया में 20% से 30%-प्रारंभिक वॉल्यूम39के सापेक्ष के सिकुड़ने का कारण हो सकता है । इसलिए, Hsia एट अल । एटीएस के अपने 2010 आम सहमति कागज में/ERS 2.5% Glutaraldehyde आज़मियम tetroxide और uranyl एसीटेट के साथ बफर के उपयोग के लिए ऊतक सिकुड़ना से बचने की सिफारिश । फेफड़ों की मात्रा, आंतरिक वास्तुकला, ऊतक ठीक संरचना, और सेल संरचना इस निर्धारण रिएजेंट14के airway जगाकर के बाद संरक्षित किया गया था । प्रोटीन और परस्पर कड़ी गठन के विकार दो प्रमुख तंत्र है जो ऊतक के निर्धारण में महत्वपूर्ण हैं । निर्जलीकरण यौगिकों या coagulants, जैसे अल्कोहल या एसीटोन, प्रोटीन के विकार कारण, तृतीयक प्रोटीन संरचना के परिवर्तन में hydrophobic बाइंडिंग को स्थिर करने के परिणामस्वरूप । गैर कौयगुलांट फिक्सिंग एजेंटों जैसे paraformaldehyde या glutaraldehyde रासायनिक प्रोटीन और फार्म का अंतर आणविक और इंट्रा आणविक पार लिंक के साथ प्रतिक्रिया । के बाद से कई दाग प्रक्रियाओं, जैसे hematoxylin और eosin धुंधला, अंतर आणविक बातचीत पर निर्भर करता है, धुंधला परिणाम गरीब हो सकता है, निर्धारण एजेंट के आधार पर । immunohistochemistry में प्रतिजन-पुनर्प्राप्ति विधियों से पता चला है कि निर्धारण की प्रतिक्रियाओं के कुछ प्रतिवर्ती हैं, विशेष रूप से उन formaldehyde के40।

तकनीक की सीमाएं: के बाद से वायुकोशीय सतह अस्तर fixatives के intratracheal जगाकर द्वारा हटा दिया जाता है, की व्याख्या, जैसे, वायुकोशीय microarchitecture, बलगम संचय, या भड़काऊ सेल प्रवास चालाकी से किया जा सकता है 41 , 42 , 43.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम: यहां हम एक व्यापक दृष्टिकोण के रूप में 4% पीएफए के intratracheal जगाकर दिखाने के लिए फुफ्फुसीय परिणामों पर मोटापे के प्रभाव कल्पना । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, प्रोटोकॉल अनुसंधान प्रश्न के आधार पर संशोधित किया जाना चाहिए, एटीएस के अनुसार/ERS सिफारिशें14।

पहले उल्लेख किया मानकों के अलावा, तनाव एक प्रमुख अनुसंधान परिणामों को प्रभावित कारक है । इसलिए चूहों और वैज्ञानिक दोनों को प्रशिक्षण अपरिहार्य है । चूहों को नियंत्रित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और शांत शर्तों के तहत प्रयोगात्मक क्षेत्र में स्थानांतरित किया जाना चाहिए44. तनाव चयापचय को प्रभावित करता है, जैसे तनाव हार्मोन रिहाई का एक परिणाम के रूप में, जारी ग्लूकोज का स्तर बढ़ रहे हैं, एक प्रभाव है कि बिगड़ा ग्लूकोज सहिष्णुता के रूप में गलत व्याख्या कर सकते हैं. तनाव हार्मोन रिलीज भी संवेदनाहारी दवाओं के लिए संवेदनशीलता बदल, विशेष रूप से, निश्चेतक की खुराक बढ़ जाती है और शल्य चिकित्सा सहिष्णुता तक पहुँचने के लिए समय है । के रूप में उल्लेख किया है, निश्चेतक की वृद्धि हुई मात्रा ब्रोन्कोकन्सट्रिक्शन प्रभावित कर सकते हैं, जबकि तनाव ही दमा फैलाव पैदा कर सकता है ।

संक्षेप में, यह आलेख चूहों में फेफड़ों की संरचना और समारोह पर मोटापा और चयापचय के प्रभाव का आकलन करने के लिए तीन विधियाँ प्रदान करता है. सभी उल्लेख विधियों आनुवंशिक संशोधनों या चूहे मॉडल के कारण मोटापे के रूप में अन्य रोग मॉडल और मूषक प्रजातियों, को हस्तांतरित किया जा सकता है । इन तकनीकों के आवेदन के लिए विशिष्ट जीन पृथक के साथ दिो मॉडलों में नए आणविक तंत्र को परिभाषित करने के लिए मददगार हो सकता है, या नए चिकित्सीय दृष्टिकोण का परीक्षण करने के लिए इलाज/जीर्ण फेफड़ों के रोगों पर मोटापे के प्रतिकूल प्रभाव को रोकने के ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

प्रयोगों Marga और वाल्टर टिण्डा द्वारा समर्थित थे-Stiftung, Kerpen, जर्मनी; परियोजना 210-02-16 (मािे), परियोजना 210-03-15 (मािे) और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG; AL1632-02; मािे), बॉन, जर्मनी; आणविक चिकित्सा कोलोन का केंद्र (CMMC; विश्वविद्यालय अस्पताल कोलोन; कैरियर उंनति कार्यक्रम; मािे), Köln फॉर्च्यून (मेडिसिन के संकाय, कोलोन विश्वविद्यालय; केडी) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GlucoMen LX A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 38969 blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 39765 Test stripes
Glucose 20% B. Braun, Melsung, Germany 2356746
FinePointe Software DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-001
FPRC Controller DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1075-001
FPRC Aerosol Block DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-2306-001
Forceps FST, British Columbia, Canada 11065-07
Blunt scissors FST, British Columbia, Canada 14105-12
Micro scissors FST, British Columbia, Canada 15000-00
Perma-Hand 4-0 Ethicon, Puerto Rico, USA 736H Surgical suture
Roti-Histofix 4% Roth P087.1 4% Paraformaldehyd
Ketaset Zoetis, Berlin, Germany 10013389 Ketamine
Rompun 2% Bayer, Leverkusen, Germany 770081 Xylazine

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References

  1. Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
  2. Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes? International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
  3. Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
  4. Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
  5. Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
  6. Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
  7. Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
  8. Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
  9. Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
  12. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
  13. Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
  14. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
  15. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 12 11-11 12-14 (2008).
  16. Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
  17. Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
  18. Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
  19. Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
  20. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
  21. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
  22. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).
  23. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
  24. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  25. Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
  26. Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
  27. Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
  28. Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
  29. Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
  30. Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance! Eur Respir J. 30, 805 (2007).
  31. Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
  32. Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
  33. Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
  34. Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
  35. Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).
  36. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
  37. Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
  38. Rolls, G. Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
  39. Winsor, L. Tissue processing. Laboratory histopathology. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
  40. Histochemistry, theoretical and applied. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).
  41. Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
  42. Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
  43. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
  44. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).

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Intraperitoneal ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण, फेफड़ों के समारोह का मापन, और फेफड़े के परिणामों पर मोटापे और बिगड़ा चयापचय के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए फेफड़ों के निर्धारण
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Dinger, K., Mohr, J., Vohlen, C., Hirani, D., Hucklenbruch-Rother, E., Ensenauer, R., Dötsch, J., Alejandre Alcazar, M. A. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. J. Vis. Exp. (133), e56685, doi:10.3791/56685 (2018).

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