Summary
L'incidenza dell'obesità è in aumento e aumenta il rischio di malattie polmonari croniche. Per stabilire i meccanismi sottostanti e le strategie preventive, animale ben definiti modelli sono necessari. Qui, mettiamo a disposizione tre metodi (prova di tolleranza di glucosio, pletismografia corporea e fissazione del polmone) per studiare l'effetto dell'obesità sui risultati polmonari nei topi.
Abstract
L'obesità e i disturbi respiratori sono gravi problemi di salute. L'obesità sta diventando un'epidemia emergente con un numero previsto di oltre 1 miliardo individui obesi in tutto il mondo entro il 2030, rappresentando così un crescente onere socio-economico. Contemporaneamente, comorbidità associate all'obesità, compreso il diabete così come cuore e malattie polmonari croniche, sono continuamente in aumento. Anche se l'obesità è stata associata con un rischio aumentato per le esacerbazioni di asma, peggioramento dei sintomi respiratori e scarso controllo, il ruolo funzionale di obesità e metabolismo perturbato nella patogenesi della malattia polmonare cronica è spesso sottovalutato, e meccanismi molecolari rimangono evasivi. Questo articolo si propone di presentare i metodi per valutare l'effetto dell'obesità sul metabolismo, così come la struttura del polmone e la funzione. Qui, descriviamo tre tecniche per studi di topi: (1) valutazione della tolleranza al glucosio intraperitoneale (ipGTT) per analizzare l'effetto dell'obesità sul metabolismo del glucosio; (2) misurazione della resistenza delle vie aeree (Res) e la conformità del sistema respiratorio (Cdin) per analizzare l'effetto dell'obesità sulla funzione polmonare; e (3) preparazione e la fissazione del polmone per la successiva valutazione istologica quantitativa. Malattie polmonari legate all'obesità sono probabilmente multifattoriali, derivanti dalla disregolazione infiammatori e metabolici sistemici che potenzialmente compromettere la funzione polmonare e la risposta alla terapia. Pertanto, una metodologia standardizzata per studiare i meccanismi molecolari e l'effetto di nuovi trattamenti è essenziale.
Introduction
Secondo il mondo salute organizzazione (OMS) nel 2008, più di 1,4 miliardi adulti, di età compresa tra 20 e più anziani, erano in sovrappeso con un indice di massa corporea (BMI) maggiore o uguale a 25; ulteriormente, oltre 200 milioni di uomini e donne quasi 300 milioni erano obesi (BMI≥30)1. Obesità e sindrome metabolica sono fattori di rischio importanti per un gran numero di malattie. Mentre l'obesità e il tessuto adiposo aumentato concomitante bianco massa è stato intimamente collegato per tipo 2 diabete2,3, malattie cardiovascolari, tra cui la malattia coronarica (CHD), insufficienza cardiaca (IC), fibrillazione atriale4 e osteoartrite5, loro ruoli funzionali nella patogenesi dei disordini respiratori rimangono poco compresi. Tuttavia, gli studi epidemiologici hanno dimostrato che l'obesità è fortemente associata con condizioni respiratorie croniche, tra cui dispnea da sforzo, sindrome di apnea ostruttiva del sonno (OSAS), sindrome di hypoventilation di obesità (OHS), cronica malattia polmonare ostruttiva (BPCO), embolia polmonare, polmonite da aspirazione e asma bronchiale6,7,8,9. Potenziali meccanismi che collegano l'obesità e metabolismo perturbato, per esempio, l'insulino-resistenza e diabete di tipo II, alla patogenesi dell'affezione polmonare cronica comprendono non solo le conseguenze fisiche e meccaniche del peso ma anche di guadagno sulla ventilazione indurre una condizione infiammatoria subacuta cronica10,11. L'aumento dell'obesità e malattie polmonari durante l'ultimo decennio, accoppiati con la mancanza di efficaci strategie preventive e approcci terapeutici, evidenzia la necessità di studiare i meccanismi molecolari per definire nuove vie per gestire l'obesità-collegata del polmone malattie.
Qui, descriviamo tre prove standard, che sono basi importanti per studiare l'obesità e il suo impatto sulla struttura del polmone e sulla funzione in modelli murini: (1) intraperitoneale glucosio tolleranza (ipGTT) (2) misurazione della resistenza delle vie aeree (Res) e delle vie respiratorie conformità del sistema (Cdin); e (3) preparazione e la fissazione del polmone per la successiva valutazione istologica quantitativa. Il ipGTT è un test di screening robusto per l'assorbimento del glucosio di misura e quindi l'effetto dell'obesità sul metabolismo. La semplicità del metodo consente buona standardizzazione e pertanto la comparabilità dei risultati tra i laboratori. Metodi più sofisticati, come hyperglycemic morsetti o studi sugli isolotti isolati, possono essere utilizzati per un'analisi dettagliata del fenotipo metabolico12. Qui valutiamo la tolleranza al glucosio per definire uno stato di disordine sistemico e metaboliche associate all'obesità come base per ulteriori studi su un risultato polmonare. Per valutare l'effetto dell'obesità e del disordine metabolico sulla funzione polmonare, abbiamo misurato la resistenza delle vie aeree (Res) e la conformità del sistema respiratorio (Cdin). Per caratterizzare l'affezione polmonare, sono disponibili metodi sfrenati come pure trattenuti per la valutazione della funzione polmonare. Pletismografia sfrenato in animali liberi di muoversi imita uno stato naturale, che riflette i modelli di respirazione; al contrario, metodi invasivi, come misura di impedenza di ingresso di Res e CDIN in topi anestetizzati profondamente per valutare la meccanica polmonare dinamica, sono più accurate13. Poiché le condizioni respiratorie croniche sono riflessi da alterazioni istologiche del tessuto polmonare, fissazione del polmone adeguato per un'ulteriore analisi è imminente. La scelta del metodo di fissazione del tessuto e preparazione dipende il vano del polmone che sarà studiato, ad esempio, lo svolgimento di vie respiratorie o del polmone parenchima14. Qui, descriviamo un metodo che permette la valutazione qualitativa e quantitativa delle vie aeree conduce per studiare l'effetto dell'obesità su sviluppo di asma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure di animali sono stati condotti in conformità a protocolli approvati dalle autorità di governo locale (Land NRW, AZ: 2012.A424) ed erano in conformità con la legge tedesca sul benessere degli animali e le norme sul benessere degli animali utilizzati per esperimenti o per altri fini scientifici. Poiché analisi di funzione polmonare possono influenzare la struttura del polmone e quindi successive analisi istologica, la misurazione di Res e CDIN e la preparazione e la fissazione del polmone per istomorfometria dovrebbe essere eseguita in diversi animali. Tuttavia, la misura della Res e CDIN seguendo ipGTT è possibile. Poiché lo stress durante il ipGTT potrebbe interferire con l'anestesia necessaria per la funzione di polmone test, un periodo di recupero di circa 2 settimane dopo ipGTT è consigliato per consentire topi recuperare dalla perdita di peso del corpo e cambia nel sangue parametri12.
1. preparazione per il Test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (ipGTT)
Nota: Dopo 12 ore di digiuno, il ipGTT completo impiegano circa 2 ore.
- Poiché lo stress influenza significativamente la glicemia, assicurarsi che entrambi adattamento dei topi, così come formazione dello scienziato, sono eseguite.
- Trasferire gli animali dell'area sperimentale in condizioni tranquille e senza stress.
- Prendere in considerazione l'applicazione di una dieta ipercalorica per indurre l'obesità in topi. Vedere la sezione di discussione per ulteriori consigli.
- Animali veloci per 12 h durante la notte, senza limitare l'accesso all'acqua. Il giorno successivo, dopo 12 ore di digiuno, preparare il misuratore di glucosio del sangue secondo il produttore di protocollo (Vedi tabella materiali) inserendo una nuova striscia alla porta della striscia di test.
- Incidere la punta della coda utilizzando forbici sterili, mantenendo delicatamente il mouse alla sua coda e immediatamente misurare la glicemia a digiuno applicando una goccia di sangue flusso libero (campione minimo dimensioni 0,5 µ l) per la striscia del misuratore di glucosio nel sangue.
Nota: Avvia un timer di conto alla rovescia sullo schermo dopo l'applicazione sufficiente del campione di sangue. Dopo 4 s, il risultato del test viene visualizzato sullo schermo. - In seguito, pesare ed etichettare gli animali individualmente utilizzando il colore di marcatura.
- Somministrare 2 g glucosio/kg corpo peso tramite l'iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che il volume di iniezione è 0,1 mL/10 g di peso corporeo (G 27 ago e siringa da 1 cc).
- Successivamente, misurare la glicemia dopo 15, 30, 60 e 120 min applicando una goccia di sangue flusso libero su una nuova striscia.
Nota: Il flusso sanguigno può essere aumentato massaggiando delicata delle circoscrizioni-punta della coda. Se la ferita di coda incrostazioni, pulirlo utilizzando un tampone sterile imbevuto di soluzione di cloruro di sodio 0,9%. - Consentire agli animali di riposare nelle loro gabbie casa con accesso illimitato all'acqua tra le misurazioni.
2. analisi di funzione polmonare a misura Res e CDIN
Nota: Per la misura indisturbato di Res e CDIN, topi necessario essere ventilato sotto anestesia profonda. Animale privo di stress gestione e un controllo adeguato dell'anestesia sono essenziali. Per istruzioni generali usando tecniche sterili, consultare l'articolo di Hoogstraten-Miller et al. 15
- Calibrare il pletismografo prima di ogni serie di esperimenti e preparare le impostazioni di studio all'interno del software (Vedi Tabella materiali).
- Prima della chirurgia, profondamente anestetizzare gli animali tramite l'iniezione intraperitoneale di xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) (27 G ago e siringa da 1 cc). Assicurarsi che il volume di iniezione è 0,1 mL/10 g per peso corporeo.
Nota: Poiché la ketamina ha un effetto analgesico adeguato nei topi, nessun trattamento ulteriore dolore è necessario. La procedura invasiva tracheale catetere/pletismografo dura circa 5-7 minuti, quindi acquisizione dati può iniziare. - Posizionare il mouse nella posizione supina su un rilievo di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea.
- Coprire gli occhi con l'unguento per prevenire la secchezza sotto anestesia.
- Monitorare costantemente la profondità dell'anestesia utilizzando la punta pizzico-risposta.
Nota: Ulteriore somministrazione di anestetico potrebbe essere necessario mantenere un aereo chirurgico di anestesia. - Inumidire il pelo della zona chirurgica della regione della tiroide con etanolo al 70%.
- Incise con cura la pelle nel midline per circa 1 cm tra la tacca giugulare dello sterno e il symphyses di tubero del mentum sollevandolo con il forcipe e ritaglio la pelle sotto controllo visivo utilizzando forbici smussate (Figura 1A).
- Visualizzare il tessuto adiposo sottocutaneo sottostante e la ghiandola tiroide.
- Esporre la trachea separando accuratamente smussato entrambi i lobi della tiroide all'istmo e dissezione dei sternothyroid e sternothyroid muscoli (Figura 1B). Fare attenzione a non danneggiare le navi e causare sanguinamento, poiché ciò può causare effetti negativi sul sistema cardiovascolare e, infine, sulle misurazioni.
- Successivamente, passare una sutura chirurgica intrecciato 4-0 tra la trachea e l'esofago usando il forcipe smussato. Accuratamente incise la trachea vicino la laringe tra le cartilagini tracheale con micro-forbici.
- Intubare con un tubo tracheale (0,04 pollici/1,02 mm di diametro) sotto controllo visivo (Figura 1). Fissare il tubo tramite la legatura con la sutura chirurgica per evitare eventuali perdite nell'impianto.
- Successivamente, spostare l'animale al letto riscaldato della sezione corpo e collegare il tubo trachea per la piastra di faccia (Figura 1) e accendere la ventilazione premendo il pulsante di ventilazione sul pannello frontale del controller (Figura 1E).
- Sondaggio la ventilazione osservando il movimento del torace contemporaneamente con il tasso di ventilazione. Per confermare il corretto posizionamento del tubo tracheale, assicurarsi che entrambi i lati del torace si muovono simultaneamente.
- Guarda la pressione segnale sullo schermo del computer (Figura 1F). Assicurarsi che le curve di ventilazione siano uniformi. Se questo non è il caso, staccare l'animale e controllare il lato di chirurgia. Fate attenzione di sangue o muco bloccando il tubo trachea.
Nota: Per animali adulti con un peso corporeo di 20-25 g, le impostazioni di ventilazione come mostrato nella Figura 2 sono suggerite in conformità con le raccomandazioni del produttore. - Per controllare cambiamenti nella pressione trans-polmonare durante la ventilazione, è necessario inserire un tubo esofageo (0,04 pollici/1,02 mm di diametro) nell'esofago alla profondità che approssima i livelli dei polmoni. Guardare lo schermo durante il posizionamento del tubo. Disporre il tubo dove deflessione di pressione massima e minima cuore artefatti possono essere visto sullo schermo.
- Dopo l'intervento chirurgico, è necessario preparare l'animale per la misurazione. Effettua l'anestesia tramite iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) utilizzando un ago 27 G e siringa da 1 cc. Assicurarsi che il volume di iniezione è 0,1 mL/10 g per peso corporeo.
Nota: Per valutare hyperreagibility bronchiale, nebulizzare methacholine, un agonista del recettore muscarinico non selettivi del sistema nervoso parasimpatico, che induce broncocostrizione. Acquisizione dei dati viene eseguita in quattro diverse fasi (Figura 3). - Avviare l'acquisizione di dati secondo il protocollo del produttore.
Nota: Il software automaticamente Guida gli utenti attraverso il processo di acquisizione. - Applicare 10 µ l di PBS (veicolo) il nebulizzatore e iniziare a nebulizzazione dopo 5 min di acclimatazione. Successivamente, seguire una fase di risposta di 3 min, dove la Res (cmH2O/mL/s) e CDIN (mL/cmH2O) sono misurate. Alla fine, è necessario fornire una fase di recupero di 3 minuti per l'animale prima della successiva nebulizzazione.
- Seguire il software di applicazione graduale di 10 µ l di aumento delle concentrazioni di methacholine (2,5 µ g/10 µ l, 6,25 µ g/10 µ l e 12,5 µ g/10 µ l) sul ventilatore.
- Una volta che tutte le misurazioni sono state eseguite e registrate, sacrificare l'animale di dislocazione cervicale.
3. polmone isolamento per analisi quantitativa di Histomorphometric di topi adulti
- Profondamente anestetizzare l'animale tramite iniezione intraperitoneale di xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) (27 G ago e siringa da 1 cc). Il volume di iniezione dovrebbe essere 0,1 mL/10 g per peso corporeo.
Nota: Dopo aver raggiunto lo stato di tolleranza chirurgico, la preparazione richiede circa 5 minuti, seguito da perfusione d'organo e 30 min per la fissazione. - Una volta che l'animale ha raggiunto lo stato di tolleranza chirurgica (negativo punta pizzico-risposta), disinfettare l'animale con etanolo al 70% e fissare l'animale su un pad con nastro chirurgico.
- Sacrificare l'animale dalla puntura cardiaca e sanguinamento. Brevemente, aprire l'addome con un'incisione mediale attraverso la pelle ed il peritoneum utilizzando forbici smussate.
- Individuare i reparti di testa diaframma del fegato e separare con cura il fegato dal diaframma.
- Praticare una piccola incisione nel diaframma utilizzando forbici smussate e punctate il ventricolo sinistro del cuore con un ago di 20 G collegato ad una siringa 2 mL. Lentamente prosciugare l'animale.
Nota: Dissanguamento lento ed accurato è importante per prevenire i ventricoli crollando a causa della pressione negativa, inibendo un flusso sanguigno indisturbato. - Sezionare il polmone con l'apertura del torace delicatamente attraverso un'incisione parasternal lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica utilizzando forbici curve, smussate.
- In seguito, sollevare la gabbia toracica per esporre la cavità pleurica (Figura 3). Rimuovere il timo per vedere il cuore ed i polmoni.
Nota: Facoltativo iniezione del ventricolo destro, seguito da perfusione del sistema vascolare del polmone con PBS ghiacciata e poi con una soluzione fissante [ad es., paraformaldeide al 4% (massa/volume) (PFA)] è possibile. Essere consapevoli che c'è un aumento del rischio di rottura septae alveolari e influenzare negativamente la struttura del polmone usando questo metodo. - Sezionare il polmone di primo accuratamente rimuovendo il cuore.
- Successivamente, passare una sutura chirurgica intrecciato 4-0 tra la trachea e l'esofago usando il forcipe smussato.
- Successivamente, accuratamente incise la trachea vicino la laringe tra le cartilagini tracheale, intubare con una cannula endovenosa (26 G) e gonfiare il polmone tramite la fissazione di pressione ad una pressione costante di 20 cm H2O tramite agente fissativo [ad es., 4% (massa /volume) di PFA].
- Per la fissazione di PFA, lasciare il fissativo per 30 min a temperatura ambiente. In seguito, legare la trachea e rimuovere la cannula. Quindi, asportare il polmone con cautela senza danneggiare il tessuto e memorizzarlo nell'agente fissativo a 4 ° C durante la notte.
Nota: In alternativa, secondo l'ATS/ETS consenso carta 2,5% GA tamponata OsO4, soluzione di uracile è utilizzato per la stabilizzazione del tessuto adeguato. Per ulteriore preparazione dei tessuti, vedere il documento di consenso di Hsia et al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Risultati rappresentativi del test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (ipGTT) (Figura 4), polmone funzione test (Figura 5) e rappresentante immagini che illustrano ematossilina ed eosina macchiato polmoni (Figura 6).
Il ipGTT è stato effettuato in topi obesi (blu) dopo 7 settimane di dieta-alta-grassi (HFD). Standard topi di dieta-federazione hanno serviti da comandi (nero). I topi obesi ha mostrato aumentato del siero glucosio livello 15 e 30 min dopo l'iniezione intraperitoneale di glucosio, che indica alterato l'assorbimento cellulare del glucosio (Figura 4).
Per esaminare l'effetto dell'obesità sulla funzione polmonare, analisi di funzione polmonare dilagante è stato effettuato in topi obesi (blu) dopo 7 settimane di dieta-alta-grassi (HFD). I topi obesi hanno mostrato un aumento fino a 1,5 volte della resistenza delle vie respiratorie rispetto ai topi di controllo (nero) (Figura 5).
Per visualizzare l'effetto della fissazione di pressione durante l'instillazione intratracheale di fissativi il parenchima polmonare, immagini rappresentative di ematossilina ed eosina macchiato le sezioni del polmone sono mostrati (Figura 6). Troppo poca pressione conduce a più aree non-gonfiati, spessi septae alveolari e alveoli a forma poligonali (A), mentre genera troppa pressione eccessivamente gonfiate enfisema-come le zone con destructed septae alveolari (C). Applicazione della pressione appropriata durante la fissazione del polmone conduce ad un polmone completamente gonfiato con alveoli a forma rotondi (B).
Figura 1: rappresentazione schematica della funzione polmonare invasiva. (A-C) A pochi passi di tracheotomia. (D) la connessione dell'animale per la piastra di faccia del pletismografo. Installazione di Hardware (E) per la funzione polmonare invasiva. (F) schermata di acquisizione dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schema di acquisizione dati per valutare bronchiale hyperreagibility. Acquisizione dati include un periodo di acclimatazione iniziale (5 min), seguito da 30 s di nebulizzazione di sostanza, 3 di fase di risposta e 3 min della nebulizzazione preventiva fase di recupero della successiva concentrazione della sostanza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rappresentazione schematica delle fasi di preparazione. (A-D) A pochi passi di tracheotomia. (A) incisione della pelle. (B) Situs della cavità toracica. (C) vista dopo la rimozione della gabbia toracica. (D) Vedi dopo rimozione del cuore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: test di tolleranza al glucosio intraperitoneale rappresentante (ipGTT). Topi C57BL/6N sono stati alimentati una dieta ad alta percentuale di grassi per 6-8 settimane; i topi di controllo hanno ricevuto una dieta standard. n = 3; Media ± SEM; analisi statistiche eseguite erano il test ANOVA a due vie e post-test di Bonferroni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: test di funzione polmonare rappresentante Topi C57BL/6N sono stati alimentati una dieta ad alta percentuale di grassi per 6-8 settimane; topi di controllo hanno ricevuto la dieta standard. n = 3; Media ± SEM; analisi statistiche eseguite erano il test ANOVA a due vie e post-test di Bonferroni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: immagini rappresentative che illustrano ematossilina ed eosina macchiato polmoni. Tre diversi gradi di inflazione intratracheale: (A) troppo poca pressione, pressione appropriata (B) e (C) troppa pressione. UIA; area compressa, OIA; sull'area gonfiato; Immagini sono state scattate sotto i 20 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Regolazioni del ventilatore | Spalte1 |
| Max. volume sistolico | 0,25 ml |
| Max. pressione di bocca | 30cmH2O |
| Profonda inflazione max. volume | 0,5 ml |
| Profonda inflazione max. pressione | 30cmH2O |
| Tasso | 160 respiro al minuto |
Tabella 1: le regolazioni del ventilatore per topi adulti. Per animali più piccoli, i parametri di ventilazione devono essere regolati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo rapporto fornisce tre protocolli per tre diversi metodi analizzare l'impatto dell'obesità sul metabolismo del glucosio e gli esiti polmonari. In primo luogo, il test di tolleranza al glucosio offre la possibilità di analizzare l'assorbimento intracellulare del glucosio e può essere indicativo di insulino-resistenza. In secondo luogo, pletismografia di tutto il corpo è una tecnica per misurare la funzione polmonare ed è quindi utile per testare l'efficacia di nuovi trattamenti. In terzo luogo, un protocollo standardizzato di fissazione è essenziale per l'analisi morfometrica quantitativa valutare l'impatto dell'obesità sui cambiamenti strutturali.
Obesità indotta da dieta nella ricerca animale
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti e future applicazioni: per simulare umane abitudini alimentari, che provocano l'obesità, modelli di obesità indotta da dieta (DIO) sono ampiamente usati nei roditori. Rispetto all'uso di topi geneticamente modificati che imita la malattia metabolica, modelli DIO consentono analisi dell'eziologia, la patologia ed opzioni future di trattamento. Una recente revisione di Heydemann et al., fornisce una panoramica dei modelli differenti murino grassi dieta diabete ricerca16. Modifiche specifiche di componenti nutrienti forniscono la possibilità di futuri studi sull'impatto della micro - e macro-nutrienti sui meccanismi molecolari dell'obesità e quindi sulla funzione e struttura del polmone.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi: vari rapporti mostrano che l'obesità può essere indotta da diversi cambiamenti nella composizione delle sostanze nutrienti dietetiche16, conoscenza che ha, a sua volta, ha portato allo sviluppo di una varietà di diete negli ultimi anni, ad esempio, diete alte in grassi o carboidrati contenuti o una combinazione di entrambe le diete, che è la cosiddetta dieta occidentale16. Alla fine, la scelta della dieta per uno studio dipende dalla domanda di ricerca e le finalità dello studio. Oltre a controllare per questi importanti fattori, la scelta di una dieta di controllo corretto è di fondamentale importanza; in caso contrario, l'interpretazione dei risultati sarà limitato. Tuttavia, il fenotipo non è solo causato dal tipo di dieta, ma è anche un risultato di alimentazione periodo, genere e mouse ceppo17.
Limiti della tecnica: accanto la composizione dei vari nutrienti della dieta, la risposta dell'animale e il ceppo di sfondo potrebbe spiegare i risultati e il fenotipo osservato tramite l'induzione di obesità. Ad esempio, è stato dimostrato che topi BALB/C sono più suscettibili di steatosi del fegato rispetto ai topi di C57Bl/618. Lievi variazioni genetiche, per esempio, a causa della deriva genetica (C57Bl/6J contro C57Bl/6N), possono anche influenzare la suscettibilità alla obesità19. Questo mette in evidenza le limitazioni della tecnica lavorando con topi geneticamente modificati con ceppi diversi background genetico, poiché anche il ceppo e il fornitore da cui sono stati ottenuti i topi possono influenzare i risultati.
Fasi critiche all'interno del protocollo: per ottenere risultati affidabili, riproducibili e comparabili tra la sperimentale e gruppi di controllo, preferibilmente littermates devono essere utilizzati per generare il controllo e topi sperimentali, fattori ambientali e stress dovrebbero essere evitato, e topi di controllo dovrebbero essere studiati in parallelo con topi sperimentali12.
Test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (ipGTT)
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti e future applicazioni: per determinare l'effetto di DIO sul metabolismo murino, test di screening diversi esistono. Il Consorzio di Mouse metabolica Phenotyping Center (MMPC) è stato stabilito di proporre metodi standard per la valutazione metabolici fenotipi in topi e ha pubblicato le procedure operative standard per la descrizione e l'esecuzione di test metabolici del glucosio omeostasi in topi12. Una GTT è un approccio globale per misurare quanto bene le cellule del corpo sono in grado al glucosio di assorbimento dopo l'ingestione di una determinata quantità di zucchero, che a sua volta è indicativo della secrezione dell'insulina e l'effetto dell'insulina. Differenze nei livelli dell'insulina del siero rappresentano spesso la tolleranza al glucosio alterata. Pertanto, la GTT è diventata uno dei test fisiologici più ampiamente usati per la caratterizzazione di modelli murini di diabete e obesità. Poiché il ipGTT è un approccio semplice e veloce, può essere utilizzato negli studi futuri come un metodo standardizzato per analizzare l'effetto della dieta e/o trattamento sul metabolismo.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi: il GTT è effettuata ordinariamente dopo un digiuno notturno di equalizzare i livelli di glucosio nel sangue in topi20. Poiché la durata del periodo di digiuno ha forti effetti sui parametri studiati ed è pertanto di grande importanza per il confronto e l'interpretazione dei risultati, il periodo di digiuno dovrebbe essere adattato all'età e peso corporeo del topi. Prendendo in considerazione che i topi sono animali notturni e due terzi dell'assunzione alimentare giornaliera totale viene consumato durante la notte, durante la notte il digiuno provoca uno stato catabolico. Così, il punto di tempo dell'iniziazione e la durata del digiuno hanno un impatto molto rilevante sui risultati, e così questi parametri dovrebbero essere standardizzato12. Inoltre, digiuno prolungato vuota i depositi del glicogeno del fegato e di conseguenza riduce la variabilità basale del glucosio nel sangue. In conclusione, dal momento che l'utilizzo del glucosio insulina-stimolata nei topi è migliorato dopo prolungato digiuno periodi21, un 5-6 ore durata digiuno raccomanda di valutare l'azione dell'insulina; considerando che, durante la notte il digiuno è sufficiente per testare l'utilizzo di glucosio12,20,22. Il glucosio è normalmente somministrato tramite iniezione i.p. e la dose di glucosio è per il corpo peso (di solito 1 o 2 g/kg di peso corporeo)20,22. Nei modelli DIO, peso corporeo è aumentato, principalmente a causa di una maggiore massa grassa; l'assorbimento del glucosio, tuttavia, si presenta principalmente nel muscolo, cervello e fegato. Poiché la quantità di questi tessuti è generalmente non alterata da DIO, topi obesi ricevono un importo sproporzionatamente elevato di glucosio rispetto ai topi magri, che a sua volta potrebbero influenzare l'interpretazione dei dati e portare a un'intolleranza al glucosio mal diagnosticata22 . Per questo motivo, periodi di digiuno necessario essere standardizzata e composizione corporea deve essere considerato durante l'interpretazione di GTT risultati23. Di conseguenza, la tomografia computerizzata (TC) o risonanza magnetica imaging(MRI) scansioni sono applicabili. Per esempio, misure di glucosio da monitor di portatili glucosio nel sangue intero (Vedi Tabella materiali) sono disponibili, e questi monitor sono più comunemente usati di analizzatori di glucosio del plasma. A causa del sangue di piccolo volumi richiesto - in genere 5 µ l o meno - che sono più pratici di analizzatori di plasma.
Limiti della tecnica: topi digiunati dipendenza durata del digiuno di esporre e mostrare una perdita significativa in peso corporeo, temperatura corporea, frequenza cardiaca e volume del sangue, così come cambiamenti nei parametri del siero, quali livelli di acidi grassi liberi e corpi chetonici 24. questo stress metabolico viene attivato dal fatto che la temperatura di alloggiamento dei topi in strutture per animali è standardizzata a circa 23 ° C ed è quindi sotto la loro temperatura di termo-neutrale di 30 ° C25. Digiuno prolungato a temperature subthermo-neutro può provocare torpore, caratterizzata da una diminuzione del tasso metabolico26,27.
Fasi critiche all'interno del protocollo: come accennato in precedenza, per ottenere risultati affidabili tra la sperimentale e gruppi di controllo, littermates preferibilmente devono essere usati durante lo studio e i periodi di digiuno, e punti di tempo devono essere standardizzati.
Analisi di funzione polmonare
In questo protocollo, il pletismografo direttamente misura i cambiamenti di pressione che guidano la respirazione e il risultante scorre dentro e fuori le vie respiratorie. I flussi sono misurati da un pneumotachograph situato nella parete del pletismografo. Per escludere resistenza dalla parete toracica, delle vie respiratorie (bocca pressione) e la pressione transpolmonare (tubo esofageo) di apertura sono misurate e resistenza delle vie aeree e conformità dinamici vengono calcolati. Conformità dinamico è calcolato tramite la differenza del volume polmonare minima e massima divisa attraverso il flusso.
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti e futura applicazioni: pletismografia è la procedura standard per analizzare le proprietà meccaniche del polmone e può, pertanto, essere utilizzato negli studi futuri per analizzare le opzioni di trattamento e di patologia del polmone. Per confrontare gruppi e studi, è indispensabile un approccio standardizzato.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi: In generale, questa tecnica può essere classificata come pletismografia sfrenato e trattenuto tutto il corpo. Metodi sfrenati determinano pausa avanzata (Penh) e consentono l'analisi di modelli di respirazione normale, mentre metodi invasivi, trattenuti direttamente misurano pressione, flusso o volume. Proprietà meccaniche del polmone sono determinati dalla resistenza ed elastanza; mentre la resistenza è calcolata come il rapporto tra la pressione al flusso, elastanza riflette il rapporto tra la pressione per il volume28. Al contrario, sfrenato corpo intero pletismografia solo sta misurando la pressione all'interno del pletismografo, e quindi un calcolo di resistenza e di elastanza è impossibile. Nel 2007, Lundblad et al hanno dichiarato che Penh non è il giusto parametro per misurare la resistenza delle vie aeree, ma rappresenta una riflessione non specifica della respirazione modello29. Così, per la corretta stima della meccanica polmonare, pletismografia invasiva è indispensabile29,30,31.
Poiché parametri respiratori dipendono l'età e le dimensioni dei topi, i parametri di ventilazione devono essere regolata. Ad esempio, il volume corrente è relativo al peso corporeo e deve essere impostato su peso corporeo di 10 µ l/g con una frequenza di respirazione di 120-250 respiri al minuto. Quando la regolazione di questi parametri, l'investigatore dovrebbe tener conto che il volume medio di marea è collegato inversamente con la frequenza respiratoria32. Poiché la respirazione spontanea influenza pressione, flusso e volume, la profondità dell'anestesia deve essere monitorata e curve di ventilazione devono essere osservate costantemente. Tuttavia, l'anestesia stessa può direttamente influire negativamente sulle funzionalità polmonare. Ad esempio, Propofol e ketamina parzialmente proteggono da riduzione indotta della via aerea rispetto a Thiopental33. Inoltre, studi clinici hanno dimostrato che la ketamina ha un effetto anticolinergico e può essere usato come un broncodilatatore potenziale nell'asma severa34. Anestetici da inalazione, come isoflurano in combinazione con il trattamento di dolore, sono considerati come un'alternativa controllabile all'anestesia di iniezione; Tuttavia, irritazione delle vie respiratorie dopo anestetici volatili è segnalato ed esclude pertanto anestetici per inalazione come un' alternativa35.
Limiti della tecnica: il metodo invasivo trattenuto per misurare le proprietà meccaniche del polmone è dovuto la tracheotomia necessaria, una procedura finale e quindi limita lo studio ad un'analisi di singolo-punto, senza la possibilità di studiare la malattia progressione. Per ridurre il livello di invasività, misura dell'impedenza di trasferimento in animali coscienti può essere eseguita, che consente quindi di studi longitudinali. Tuttavia, quando si misura la meccanica respiratoria in animali non-tracheotomized, la resistenza del naso contribuisce alla resistenza respiratoria totale e quindi complica misure dopo la provocazione di methacholine13.
Fasi critiche all'interno del protocollo: Qui dimostriamo un solo metodo di funzione polmonare invasiva. Poiché esistono diversi metodi di funzione polmonare invasiva stabilito, standardizzazione all'interno degli studi e una descrizione dettagliata del metodo usato, gruppi, e un regime di anestetico in pubblicazioni è necessario confrontare gli studi.
Asportazione del polmone per analisi istomorfometriche
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti e future applicazioni: analisi istomorfometriche quantitativa può essere utilizzato per studiare l'impatto dell'obesità sulla struttura dei polmoni (bronchi e alveoli), interpretare i risultati ottenuti da invasiva pletismografia e a studiare le possibili opzioni di trattamento sull'outcome polmonare. Dati dalle valutazioni istologiche possono variare a seconda di fissativi agenti e la procedura di fissazione usati. Poiché è stato dimostrato che l'obesità ha un effetto sulla struttura alveolare e bronchiale, come bene come extracellulare composizione matrice e cellulari, è necessario determinare una tecnica appropriata in base alla domanda di ricerca negli studi futuri. Per imparziale morfometria quantitativa, lavorazione a seguito di fissazione del tessuto deve essere eseguito secondo le norme dell'American Thoracic Society (ATS) / European Respiratory Society (ERS) per la valutazione quantitativa del polmone struttura14 .
Le modifiche e la risoluzione dei problemi: nel 2010 Hsia et al ha presentato una dichiarazione ufficiale dei standard ATS/ERS impostazione per la valutazione quantitativa della struttura del polmone, che dovrebbe essere presi in considerazione prima dell'isolamento del polmone e la fissazione 14. al lato intratracheale instillazione di fissativi, fissazione in situ , fissazione di volume fisso o inflazione vuoto può essere eseguita per gonfiare il tessuto polmonare36. L'inflazione, e quindi l'allargamento dello spazio aereo, dipende le procedure di fissaggio e il grado di pressione applicata durante la fissazione. Ad alta pressione, ad esempio, può portare alla rottura della parete alveolare e quindi influenzare i risultati. Simile ai parametri di ventilazione, i parametri di fissazione ideale dipendono l'età, la dimensione e il fenotipo dei topi. La fissazione può essere realizzata con mezzi chimici o fisici, compresi gli agenti chimici e/o crioconservazione. Instillazione intratracheale di fissativi adatti imita l'inflazione del tessuto durante la respirazione, che riflette condizioni in vivo ed è quindi ampiamente usato37. 20-25 cm sopra il punto più alto del polmone è consigliato per una pressione sufficiente, usando un tubo largo e corto per consentire la penetrazione rapida e uniforme14. Degli obiettivi principali della fissazione è per impedire il processo di degenerazione e di preservare le cellule e tessuto in uno "stato di vita-come", preservando l'integrità architettonica del parenchima polmonare. Inoltre, tessuto deve conservare la sua reattività agli anticorpi, macchie e sonde di acido nucleico. Oltre all'effetto di autolisi normale, gli effetti negativi del tessuto elaborazione, compresi l'infiltrazione con cera calda, affettare e deparaffinazione, deve essere evitata. La scelta di fissativo così come ulteriore elaborazione del tessuto, per esempio tramite l'incorporamento, può causare il restringimento del tessuto, gonfiore e indurimento dei vari componenti e portare a manufatti, come autofluorescence aumentato38. Ad esempio, fissazione in 10% tamponata formalina e ulteriore elaborazione può causare il restringimento di fino a 20% - 30% rispetto al volume iniziale39. Di conseguenza, Hsia et nel loro documento di consenso di 2010 della consigliamo l'uso ATS/ERS del 2,5% glutaraldeide tamponata con acetato di uranile per evitare il restringimento del tessuto e tetrossido di osmio. Volume polmonare, architettura d'interni, struttura fine del tessuto e delle cellule struttura è stata conservata dopo l'instillazione delle vie respiratorie di questo reagente fissante14. Denaturazione delle proteine e cross-link formazione sono due meccanismi principali che sono importanti nella fissazione del tessuto. Disidratante composti o coagulanti, come alcool o acetone, causano denaturazione delle proteine, con conseguente cambiamenti della struttura terziaria della proteina di destabilizzare associazioni idrofobiche. Non-coagulante fissatori come paraformaldeide o glutaraldeide reagiscono chimicamente con le proteine e legami incrociati forma inter- molecolare e intra-molecolare. Poiché diversi che macchia le procedure, quali ematossilina ed eosina, dipendono dalle interazioni inter-molecolari, i risultati di macchiatura possono essere povero, a seconda dell'agente fissativo. Metodi di ricupero dell'antigene in immunoistochimica hanno dimostrato che alcune delle reazioni di fissazione sono reversibili, in particolare quelli di formaldeide40.
Limiti della tecnica: poiché il rivestimento di superficie alveolare viene rimosso mediante instillazione intratracheale di fissativi, l'interpretazione di, per esempio, alveolare microarchitettura, accumulo di muco, o la migrazione delle cellule infiammatorie possa essere manipolati 41 , 42 , 43.
Fasi critiche all'interno del protocollo: qui vi mostriamo l'instillazione intratracheale di 4% PFA come un approccio di ampio respiro per visualizzare l'effetto dell'obesità sui risultati polmonari. Come accennato in precedenza, il protocollo deve essere modificato in base alla domanda di ricerca, secondo le raccomandazioni ATS/ERS14.
Oltre ai parametri menzionati in precedenza, lo stress è un fattore importante che influenza i risultati della ricerca. Formazione di conseguenza, entrambi i topi e lo scienziato è indispensabile. Topi devono essere adattati a trattenere e devono essere trasferiti l'area sperimentale sotto condizioni di tranquillità44. Lo stress influenza il metabolismo, ad es. in conseguenza del rilascio di ormone dello stress, sono aumentati i livelli del glucosio rilasciato, un effetto che può essere interpretato come alterata tolleranza al glucosio. Rilascio dell'ormone dello stress altera anche suscettibilità ai farmaci anestetici, in particolare, si aumenta la dose di anestetici e il tempo per raggiungere la tolleranza chirurgica è prolungato. Come accennato, la quantità aumentata di anestetici può influenzare broncocostrizione, mentre lo sforzo stesso può causare dilatazione bronchiale.
In sintesi, questo articolo fornisce tre metodi per valutare l'impatto dell'obesità e metabolismo sulla struttura del polmone e sulla funzione in topi. Tutti questi metodi possono essere trasferiti ad altri modelli di malattia e la specie di roditori, quali l'obesità a causa di modificazioni genetiche o modelli del ratto. L'applicazione di queste tecniche può essere utile per definire nuovi meccanismi molecolari nei modelli DIO con l'ablazione gene specifico, o per testare nuovi approcci terapeutici per trattare/prevenire gli effetti negativi dell'obesità su malattie polmonari croniche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli esperimenti sono stati supportati da Marga e Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Germania; Progetto 210-02-16 (Manno), progetto 210-03-15 (MAAA) e dalla Fondazione di ricerca tedesca (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Germania; Centro di medicina molecolare Colonia (CMMC; Ospedale universitario di Colonia; Programma di avanzamento di carriera; MAAA), Fortuna Köln (facoltà di medicina, Università di Colonia; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
References
- Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
- Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes? International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
- Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
- Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
- Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
- Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
- Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
- Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
- Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
- McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 12 11-11 12-14 (2008).
- Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
- Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
- Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
- Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
- Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
- Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
- Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance! Eur Respir J. 30, 805 (2007).
- Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
- Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
- Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
- Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
- Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
- Rolls, G. Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
- Winsor, L. Tissue processing. Laboratory histopathology. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
- Histochemistry, theoretical and applied. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).
- Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
- Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).
