Summary
肥満の発生率が上昇していると慢性肺疾患のリスクを増加させます。根本的なメカニズムと予防戦略、明確に定義された動物を確立するには、モデルが必要です。ここでは、我々 は (ブドウ糖負荷試験、体の脈、肺固定) マウスにおける肺の成果に対する肥満の影響を研究する 3 つの方法を提供します。
Abstract
肥満と呼吸器系疾患は、主要な健康上の問題です。肥満は、こうして社会経済的負担の増大を表す 2030 以上 10 億肥満の個人の世界的な数が期待される新たな流行をなっています。同時に、肥満関連の合併症、糖尿病と同様に心や慢性肺疾患などが継続的に増加しています。肥満は喘息の増悪のリスクの増加に関連付けられている、呼吸器症状、およびコントロール不良の悪化肥満や慢性肺疾患の発症機序における摂動代謝の機能的役割がしばしば過小評価、その分子メカニズムのとらえどころのないままです。この記事は、代謝と同様に肺の構造と機能に対する肥満の影響を評価する手法を提示する目指しています。ここでは、マウスの調査の 3 つの技術について述べる: 腹腔内グルコース耐性 (ipGTT); 糖代謝に対する肥満の影響を分析するための (1) の評価(気道抵抗 (Re) と呼吸器系コンプライアンス (Cdyn) 肺機能に対する肥満の影響を分析するための測定 2)(3) の作製とその後定量組織学的評価のため肺の固定。肥満関連肺疾患は、おそらく、潜在的悪影響肺機能および治療への反応に影響を与える全身の炎症と代謝不全から生じる多因子性。したがって、分子メカニズムと新しい治療法の効果を検討する標準化された方法論が不可欠です。
Introduction
よると、世界保健機関 (WHO) 2008 年に、20 歳以上、以上 14 億の大人たち、ボディマス指数 (BMI); 25 以上を太りすぎさらに、以上 2 億人、ほぼ 3 億女性肥満 (BMI≥30)1。肥満やメタボリック シンドロームは、多数の病気のための主要な危険因子です。肥満と併用の白色脂肪組織増加中質量密接にリンクされているタイプ 2 糖尿病2,3, 冠状動脈性心臓病 (CHD)、心不全 (心不全)、心房細動4 を含む心臓血管疾患変形性関節症5、呼吸器系疾患の病態における機能的な役割のままかり。ただし、疫学的研究は、肥満が労作時呼吸困難、睡眠時無呼吸症候群 (OSAS) 肥満低換気症候群 (OHS) 慢性を含む慢性の呼吸器の条件に強く関連付けられているを示しています。閉塞性肺疾患 (COPD)、肺塞栓症、誤嚥性肺炎、気管支喘息6,7,8,9。リンク肥満と摂動代謝潜在的なメカニズム、例えば、インスリン抵抗性、タイプ II 糖尿病は、慢性肺疾患の病態だけでなく構成重量の機械および物理的な結果も換気益亜急性炎症状態が慢性化10,11を誘発します。肥満と効果的な予防戦略と治療アプローチの欠如と相まって、過去 10 年間の間に肺疾患の増加肥満関連肺を管理するための新しい道を定義する分子メカニズム解明のための必要性を強調します。病気。
ここでは、肥満とマウス モデルにおける肺の構造と機能への影響を調査するための重要な基礎である 3 つの標準的なテストについて述べる: (1) 腹腔内グルコース耐性 (ipGTT) (2) 気道抵抗 (Re) の測定と呼吸システム コンプライアンス (Cdyn);(3) の作製とその後定量組織学的評価のため肺の固定。IpGTT は、メジャー グルコース取り込みと代謝に及ぼす肥満への堅牢なスクリーニング テストです。方法のシンプルさは、研究所間標準化、その結果の比較可能性をできます。代謝表現型12の詳細な分析、血糖クランプや膵島の研究より高度な方法を使用できます。ここでは、肺の結果にさらなる研究のための基礎として全身性および代謝障害の肥満準の状態を定義する耐糖能を評価します。肥満と代謝性疾患の肺機能に及ぼす影響を評価するためには、気道抵抗 (Re) と呼吸器系コンプライアンス (Cdyn) を測定しました。肺疾患の特徴、気ままなとして拘束された肺機能の評価手法も利用できます。動物を自由に移動で気ままな脈波呼吸パターンを反映して、自然な状態を模倣しています。対照的に、動的肺力学を評価するために解像度、および深く麻酔下マウスにおける cDyn の入力インピー ダンス測定などの侵襲的な方法より正確な13です。慢性の呼吸器疾患が肺組織の組織学的変化が反映されているので、さらなる分析のための適切な肺固定が迫っています。ティッシュの固定および準備の方法の選択は、勉強になります、例えば、気道や肺実質14肺のコンパートメントに依存します。ここでは、喘息発症に対する肥満の影響を研究する導電性の気道の定性的および定量的な評価を可能にする手法について述べる。
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Protocol
動物のすべてのプロシージャは地方自治体によって承認されたプロトコルに準拠して実施された (nrw 州、アリゾナ州の土地: 2012.A424)、ドイツの動物福祉法および、実験のために使用される動物の福祉に関する法令に従い、他の科学的な目的。肺機能解析肺構造に影響を与える可能性がありますので、したがってそれに続く組織学的分析解像度と強度のため肺の固定と Cdyn 準備の測定は異なった動物で行わなければなりません。ただし、解像度、次の ipGTT Cdyn の測定が可能です。IpGTT 中のストレスを妨げる可能性がありますので、肺機能に必要な麻酔は ipGTT、体重減少から回復するマウスお勧め後約 2 週間の回復期間をテストし、血液パラメーター12に変更します。
1. 腹腔内ブドウ糖負荷試験 (ipGTT) のための準備
注: 空腹時の 12 時間後完全な ipGTT は約 2 時間かかります。
- ストレスは血糖値に大幅影響を与えるので、マウスの両方の適応だけでなく、科学者のトレーニングを実行することを確認します。
- 静かでストレスのない条件下で実験エリアに動物を転送します。
- マウスの肥満を誘発する hypercaloric 食事療法の適用を検討してください。さらにアドバイスは、ディスカッションを参照してください。
- 12 h の速い動物は、水へのアクセスを制限することがなく一晩します。次の日、断食の 12 h 準備血糖測定器は、メーカーによると後 's (材料の表参照) によるプロトコル テスト ストリップ ポートに新しいテスト ストリップを挿入します。
- そっとしっぽでマウスを維持しながら滅菌はさみを使って尻尾先端を切開し、すぐに血ブドウ糖メートルのテスト ストリップを自由に流れる血の滴 (最小サンプル サイズ 0.5 μ L) を適用することによって絶食時の血糖を測定します。
注: 十分な血液サンプルの後画面にカウント ダウン タイマーを開始します。後 4 s、テスト結果が表示されます。 - その後、重量を量るし、個別にカラー マーキングを使用して動物のラベルします。
- 2 g グルコース/kg 本体重量を介して腹腔内注入を管理します。注入量が 0.1 mL/10 g 本体重量 (27 G 針と 1 cc 注射器) であることを確認します。
- その後、新しいテスト ストリップに自由に流れる血の滴を適用することによって、15、30、60、120 分後血糖値を測定します。
注: 尻尾先端病棟の優しいマッサージによって血流を増加できます。尾巻き encrusts 場合、0.9% 塩化ナトリウム溶液を浸した滅菌綿棒を使用してそれをきれいに。 - 水の測定値との間に無制限のアクセスとホームの檻の中で残りの部分に動物を許可します。
2. 肺機能分析測定解像度と cDyn
注: 解像度と cDyn の妨げられていない測定用マウスの深麻酔下で換気する必要があります。ストレス フリーの動物取扱と麻酔の適切な監視が不可欠です。生殖不能の技術を使用して一般的な手順、ホーホストラーテン ミラーらによって記事をご覧15
- 実験の各セットの前に脈を調整し、ソフトウェア内で研究設定を準備 (材料の表を参照してください)。
- 手術前に麻酔キシラジン (10 mg/kg 体重) とケタミン (100 mg/kg 体重) の腹腔内投与で動物が深く (27 G 針と 1 cc シリンジ)。注入量が体重あたり 0.1 mL/10 グラムであることを確認します。
注: ケタミンは、マウスの適切な鎮痛効果、追加の痛みの治療は必要ありません。侵襲的な気管カテーテル/脈プロシージャは約 5-7 分、その後、データ集録を開始することができます。 - 体温を維持するために加熱パッドの仰臥位の位置にマウスを配置します。
- 麻酔下での乾燥を防ぐために軟膏で目をカバーします。
- つま先ピンチ応答を用いた麻酔の深さを常に監視します。
注: 麻酔薬の追加投与は麻酔外科平面を維持するために必要かもしれない。 - 70% エタノールで甲状腺領域の外科領域の毛皮を湿らせます。
- 慎重にピンセットで持ち上げて、鈍はさみ (図 1 a) を使用して目視検査の下の皮膚をクリッピングによって胸骨の頚静脈切欠きとオトガイの塊茎 symphyses 間約 1 cm の正中の皮膚を切開します。
- 基になる皮下脂肪と甲状腺を視覚化します。
- 地峡と甲状軟骨と胸骨甲状筋 (図 1 b) の郭清で両方の甲状腺葉を慎重に鈍的に分離することで気管を公開します。すべての血管を傷つけるし、心血管系への悪影響が生じるので、出血を引き起こすしないように注意し、最終的に測定。
- その後、気管と食道の鈍い鉗子を使用して 4-0 の編みこみ手術縫合糸を渡します。慎重にマイクロはさみで気管軟骨間喉頭の近くに気管を切開します。
- ビジュアル コントロール (図 1) の下で気管チューブ (0.04 インチ/1.02 mm 径) を挿管します。システムで任意の漏れを避けるために手術縫合糸で結紮を介してチューブを修正します。
- 次に、体室の温水ベッドに動物を移動フェイス プレート (図 1) に気管チューブを接続し、換気コント ローラー (図 1E) のフロント パネルに換気ボタンを押して電源を入れます。
- 換気量と同時期の胸郭運動を観察することによって、換気を調査します。気管チューブの適切な位置を確認するため、胸郭の両側が同時に移動することを確認します。
- 圧力を見るコンピューターの画面 (図 1 f) 信号。換気曲線が均一であることを確認します。ない場合は、動物を切り離す手術側を確認してください。血や粘液は、気管チューブをブロックの注意してください。
注: 20-25 g の体重と大人動物は、図 2に示すように、人工呼吸器の設定は製造元の推奨事項に従って示されます。 - 換気中に経肺動脈圧の変化を制御するため肺のレベルに近い深さで食道に食道チューブ (0.04 インチ/1.02 mm 径) を挿入します。チューブを配置しながら画面を見る。最大圧力たわみと最小限のハート アイテムを画面上で見ることができるチューブを配置します。
- 手術後に、測定のため動物を準備します。ケタミン (100 mg/kg 体重) 27 G 針と 1 cc シリンジを使用してを介して腹腔内注射麻酔を膨らませてください。注入量が体重あたり 0.1 mL/10 グラムであることを確認します。
注: 気管支 hyperreagibility を評価するために, メサコリン誘発気道攣縮の副交感神経の非選択的ムスカリン受容体アゴニストを nebulize します。データ集録は、(図 3) の 4 つの異なるフェーズで実行されます。 - Manufacturer´s プロトコルに従ってデータ集録を開始します。
注: ソフトウェアは自動的に取得プロセスを通じてユーザーをガイドします。 - ネブライザーに 10 μ L の PBS (車両) を適用し、順化の 5 分後にネブライザーを開始します。次に、3 分の応答位相解像度 (cmH2O/mL/s)、cDyn (mL/cmH2O) を測定します。最後に、3 分の復旧フェーズを次のネブライザーの前に動物に提供します。
- 換気扇の上 (2.5 μ g/10 μ L、6.25 μ g ・ 10 μ、12.5 μ g ・ 10 μ L) メタコリン濃度の増加の 10 μ L の段階的適用によるソフトウェアに従ってください。
- すべての測定を実行し、記録すると、頚部転位によって動物を犠牲に。
3. 成体マウスの定量的組織計量解析のため肺分離
- 深くキシラジン (10 mg/kg 体重) とケタミン (100 mg/kg 体重) の動物を介して腹腔内注射の麻酔 (27 G 針と 1 cc シリンジ)。注入量は体重あたり 0.1 mL/10 グラムにする必要があります。
注: 外科的寛容の状態に達すると後の準備 30 分固定のため、臓器灌流が続く約 5 分かかります。 - 動物は、手術許容値 (負つま先ピンチ-応答) の状態に達したら、70% エタノールで動物を消毒して、動物をパッドにサージカル テープで固定.
- 心臓穿刺、出血による動物を犠牲に。簡単に言えば、皮膚と鋏は使いよう 】 を使用して腹膜切開の内側と腹部を開きます。
- 肝臓のダイヤフラム ヘッド病棟を検索し、慎重に横隔膜から肝臓を分離します。
- 鈍のはさみを使用して横隔膜の小切開を行い、2 mL の注射器に接続されている点状 20 G 針で心臓の左心室。ゆっくりと動物を exsanguinate します。
注: ゆっくりと慎重のデスメタルは心室の負圧、妨げられていない血流を阻害するために崩壊を防ぐために重要です。 - 曲線、鈍のはさみを使用して胸郭の全体の長さに沿って胸骨切開を通して優しく胸郭を開くことによって肺を解剖します。
- その後、胸腔 (図 3) を公開する胸郭を持ち上げます。心臓や肺を参照してくださいに胸腺を削除します。
注: 右心室、肺血管系氷冷 PBS とし、[例えば4% (質量/体積) パラホルムアルデヒド (PFA)] 固定液の灌流が続く省略可能な注入は可能です。歯槽 septae を破裂し、このメソッドを使用して肺の構造に悪影響を与えるリスクがあることに注意してください。 - まず肺を慎重に分析、心を削除します。
- その後、気管と食道の鈍い鉗子を使用して 4-0 の編みこみ手術縫合糸を渡します。
- 次に、慎重に気管軟骨の喉頭の近くに気管を切開、静脈カニューレ (26 G) を挿管し、20 cm H2O の一定の圧力で圧固定によって肺を膨らませる定着性エージェント [例えば4% (質量を使用してPFA の/volume)]。
- PFA 固定のため室温で 30 分の定着剤を残します。その後、気管を結紮し、カニューレを削除します。組織を損なうことがなく慎重に肺を切除し、一晩 4 ° C で定着性のエージェントにそれを格納します。
注: また、ATS/ETS によるとコンセンサス ペーパー 2.5 %ga バッファー OsO4、ウラシルのソリューションを使用して適切な組織安定のため。さらにティッシュの準備、夏らによるコンセンサス ペーパーを参照してください。14
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Representative Results
腹腔内のブドウ糖負荷試験 (ipGTT) (図 4) の代表的な結果は、ヘマトキシリンとエオシンを示す肺関数テスト (図 5)、および代表画像ステンド肺 (図 6)。
IpGTT は、高脂肪食 (HFD) の 7 週間後 (青) 肥満のマウスで行われました。標準的な食事供給のマウス コントロール (ブラック) を務めた。肥満マウス腹腔内ブドウ糖注射液後に、増加した血中グルコース レベル 15 と 30 分を示した細胞のグルコース取り込み (図 4) が障害を示します。
肥満が肺機能に及ぼす影響を調べる (青) 肥満マウス高脂肪食 (HFD) の 7 週間後の侵襲的な肺機能解析を行った。肥満マウスは、コントロール マウス (ブラック) (図 5) と比較された気道抵抗の最大 1.5 倍の増加を示した。
圧力固定定着剤の気管内投与中に肺実質の効果を視覚化するには、ヘマトキシリンとエオシン染色肺標本の代表的なイメージには (図 6) が表示されます。少なすぎる圧力は破壊歯槽 septae (C) 以上に膨張した肺気腫のような分野であまりにも多くの圧力の結果、複数の非膨張領域、厚い歯槽 septae と多角形の形をした肺胞 (A) に します。肺固定時に適切な圧力を適用は、丸い形をした肺胞 (B) 完全に膨張した肺に します。
図 1: 侵襲的な肺機能の概略図。(A ~ C)気管切開術の手順を実行します。(D) 、脈のフェイス プレートには、動物の接続。侵襲的な肺機能の(E)ハードウェアのセットアップ。データ集録(F)のスクリーン ショット。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 気管支 hyperreagibility を評価するためにデータ集録のスキーム。データ集録を含む 30 続いて初期順応期間 (5 分)、物質ネブライザー、応答フェーズの 3 分、次の物質濃度の回復段階前ネブライザーの 3 分の s。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 準備手順の概略図。(A ~ D)気管切開術の手順を実行します。(A)皮膚の切開。(B)胸腔内の内臓。胸郭を除去した後(C)表示します。中心部を除去した後(D)表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的な腹腔内ブドウ糖負荷試験 (ipGTT) です。C57Bl/6 n マウスは 6-8 週間高脂肪食を与えられました。マウスは、標準的な食事を受け取った。n = 3;± Sem;ボンフェローニ ポストテスト双方向テストの分散分析に統計解析を実行.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 代表的な肺関数テストC57Bl/6 n マウスは 6-8 週間高脂肪食を与えられました。マウスは、標準的な食事を受け取った。n = 3;± Sem;ボンフェローニ ポストテスト双方向テストの分散分析に統計解析を実行.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 代表的なサステナビリ ティーをヘマトキシリン ・ エオジン染色肺。気管内のインフレ率の 3 つの異なる等級: (A) 少なすぎる圧力があり、(B) 適切な圧力、(C) であまりにも多くの圧力です。UIA;折りたたまれた領域、イア。水増しの領域;画像は、下の 20 倍の倍率を撮影されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 人工呼吸器の設定 | Spalte1 |
| Max。ストローク量 | 0.25 ml |
| Max。口圧力 | 30cmH2O |
| 深いインフレ最大。ボリューム | 0.5 ml |
| 深いインフレ最大。圧力 | 30cmH2O |
| レート | 毎分 160 息 |
表 1: アダルト マウスの人工呼吸器設定します。小動物の場合換気パラメーターを調整する必要があります。
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Discussion
このレポートでは、糖代謝、呼吸器アウトカムに対する肥満の影響を分析する 3 つの異なる方法の 3 つのプロトコルを提供します。まず、ブドウ糖負荷試験はグルコースの細胞内取り込みを分析する機会を提供しています、インスリン抵抗性を示すことができます。第二に、全身脈は肺機能を測定する技術、それにより新しい治療法の有効性をテストすると便利です。第三に、標準化された固定プロトコルと構造変化に対する肥満の影響を評価するために定量的な形態解析のために不可欠です。
動物研究では食餌誘導性肥満
既存の方法と将来のアプリケーションに関しての意義: 肥満の結果、人間の食べる習慣を模倣する食餌誘導性肥満 (DIO) モデルは齧歯動物で広く使用されています。代謝性疾患を模倣した遺伝子組み換えマウスの使用と比較しては、DIO モデルは、病因・病理学・将来の治療法の選択肢の分析を有効にします。Heydemannら、による最近の検討は、糖尿病研究16の異なるマウス高脂肪食モデルの概要を示します。肥満の分子メカニズムとそれによって肺の構造と機能、栄養成分の特定の変更はマイクロおよびマクロ栄養素の影響の将来の研究の可能性を提供します。
変更とトラブルシューティング: 様々 なレポートを示す栄養素16知識は、ターンでは、ここ数年、たとえば、さまざまなダイエットの開発につながったの組成の異なる変化による肥満することができます脂肪や炭水化物の内容またはいわゆる西部の食事療法16である両方の食事の組み合わせで高い食事療法。最後に、研究のための食事の選択肢は、研究課題と研究の目的に依存します。これらの重要な要因を制御する、以外適切な制御食事療法の選択は非常に重要です。それ以外の場合、結果の解釈は、制限されます。それにもかかわらず、表現型のみ原因がダイエットの一種ではないがまた給餌期間、性別およびマウスの結果ひずみ17。
技術の制限: 結果と肥満の誘導により観察された表現型を占める可能性が動物や背景ひずみの応答の食事の様々 な栄養素の組成、横に。たとえば、それが示されて、BALB/C マウスは C57Bl/6 マウス18と比較して脂肪肝になりやすい。わずかな遺伝の変化、例えば、遺伝的浮動 (c57bl/6 j C57Bl/6 n 対)、ためまた、肥満19への感受性に影響を与えます。これは、ひずみも、マウスが得られたベンダー結果に影響可能性がありますので遺伝的背景の異なる系統の遺伝子改変マウスの操作手法の限界を強調表示します。
プロトコルの中で重要なステップ: 実験の信頼性、再現性と対等な結果を得るのためのコントロールを生成する制御グループ、できれば同腹子を使用して、実験マウス、環境要因とストレスであるべき回避、コントロール マウス実験的マウス12と並行して検討すべきと。
腹腔内のグルコース負荷試験 (ipGTT)
既存の方法と将来のアプリケーションに関しての意義: DIO のマウスの代謝に及ぼす影響を決定する別のスクリーニング検査が存在します。マウス代謝フェノタイピング センター (MMPC) コンソーシアム マウスにおける代謝の表現型を評価するための標準的な方法を提案して設立され、記述およびグルコースの代謝テストを実行するための標準操作手順書を公開していますマウス12の恒常性。GTT は体の細胞がインスリン分泌とインスリン効果を示すものは、砂糖の指定された量を摂取した後グルコース取り込みすることがどれだけを測定するグローバルなアプローチです。血中インスリン濃度の違いは多くの場合耐糖能の変化を考慮します。したがって、GTT は糖尿病と肥満のマウス ・ モデルを特徴付ける最も広く使用されている生理学的なテストの 1 つになっています。以来、ipGTT は、高速かつ簡単な方法は、それ使用できます将来の研究の標準化された方法としてダイエットや代謝に治療の効果を分析します。
変更とトラブルシューティング:20マウスの血糖値を均等に夜通し高速を次の GTT を定期的に実行します。以来、断食期間中調査のパラメーターに対する強い効果があり、したがって比較とその結果の解釈のための大きい重要性の断食期間年齢に適応する、マウスの体重します。考慮したマウスは夜行性動物、合計の毎日の食物摂取の 3 分の 2 の消費は一晩、一晩絶食異化状態を誘発します。したがって、開始時点と断食の期間の結果に関連性の高い影響がある、従ってこれらのパラメーターは、標準化された12をする必要があります。また、絶食肝グリコーゲン貯蔵を使い果たす、したがって基準血糖値の変動を削減します。結論としては後、マウスにおけるインスリン刺激によるグルコース利用が強化されたために長期断食期間215 〜 6 時間絶食期間はインスリン作用を評価するためにお勧めします一方、一晩絶食ブドウ糖利用12,20,22をテストするのに十分です。グルコースは、通常投与で投与した群と、本体重量 (通常 1 または 2 g/kg 体重)20,22にブドウ糖の投与量を調整しました。DIO モデルで体重は増加、主に高い脂肪;ただし、グルコース取り込みに筋肉、脳、肝臓で主に発生します。これらの組織の量は DIO で変わらない一般的に、肥満マウスを受け取る順番にデータの解釈に影響を与えることができるし、誤診されるグルコース不耐症22 につながる無駄のないマウスに比べてブドウ糖の不釣合いに高い量.このため、絶食期間は標準化される必要があるし、身体組成が GTT 結果23の解釈の間に考慮される必要があります。したがって、コンピューター断層撮影 (CT) または磁気共鳴 imaging(MRI) スキャンが適用されます。例えば、手持ちの全血ブドウ糖モニター (材料の表を参照) によってグルコース測定値があり、これらのモニターは、血漿グルコース分析装置よりもより一般的に使用されてです。少量の血液によりボリュームが必要 - 通常 5 μ L またはプラズマ分析装置より実用的なより。
技術の制限: 絶食マウス断食の期間への依存を展示し、遊離脂肪酸レベルとケトン体などの血清パラメーターの変更と同様、体重、体温、血液量と心拍数の重要な損失が表示24. この代謝ストレスは動物施設におけるマウスの住宅温度がおよそ 23 ° C の標準化された熱中立温度 30 ° C の25の下、したがっているという事実によって引き起こされます。Subthermo 中性温長期断食は冬眠、代謝率26,27の減少によって特徴づけられるで起因できます。
プロトコルの中で重要なステップ: 前述のように、実験の間で信頼性の高い結果と制御グループ、同腹子をできれば研究と絶食の期間の間に使用して時間点は標準化される必要があります。
肺機能解析
このプロトコルでは、脈は直接呼吸と気道のうち結果フローを運転している圧力の変化を測定します。フローは、脈の壁にある pneumotachograph で表されます。気道を開く圧力 (口圧力) と次 (食道チューブ) 圧力の測定、胸壁から抵抗を除外して気道抵抗および動的コンプライアンスが計算されます。動的コンプライアンスは計算を介して流れを通して分けられる最小値と最大の肺気量の違いです。
既存の方法と将来のアプリケーション: 脈に関して意義は、したがって、肺の機械的性質を分析し、今後の研究で肺の病態と治療のオプションの分析に使用する標準的な手順です。グループと研究を比較するため、標準化されたアプローチは不可欠です。
変更とトラブルシューティング: 一般的に、この手法は気ままで拘束された全身の脈に分類できます。気ままなメソッドは、強化された一時停止 (プノンペン) を決定し、拘束された、侵襲的な方法は直接圧力、流れ、またはボリュームを測定しながら、正常な呼吸パターンの解析を有効にします。肺の機械的特性、抵抗とエラスタンス; によって決まります抵抗は流れへの圧力の比率として計算されます、エラスタンス ボリューム28への圧力の比率を表しています。対照的に、気ままな全身の脈は、脈内の圧力を計測するだけ、したがって抵抗とエラスタンスの計算は不可能です。2007 年、Lundbladらは、プノンペンは気道の抵抗を測定する正しいパラメーターではありませんが、呼吸パターン29の非特異的な反射を表すを表明しています。したがって、肺力学の適切な推定は、侵襲的脈は欠かせない29,30,31です。
呼吸パラメーターは、年齢とマウスのサイズに依存しているので換気パラメーターを調整する必要があります。たとえば、一回換気量は体重に関連しているし、10 μ L/g 体重分あたり 120 250 呼吸呼吸周波数に設定する必要があります。これらのパラメーターを調整して、捜査官が呼吸周波数32平均の一回換気量を逆に関連しているアカウントに取る必要があります。以来、自発呼吸圧、フロー、およびボリュームに影響を与える、麻酔の深さが監視して換気曲線は常に観察する必要があります。ただし、麻酔自体は直接悪影響肺機能に影響を与えます。たとえば、プロポ フォール、ケタミンは部分的チオペン タール33と比較して誘発気道収縮を防ぐ。さらに、臨床研究では、ケタミンが抗コリン効果には、重度の喘息34で潜在的な気管支拡張剤として使用できますを示しています。痛みの治療と組み合わせてイソフルランなどの吸入麻酔薬は、注射麻酔を制御可能な代替とみなされるただし、揮発性麻酔薬の気道刺激が報告され、したがって代替35として吸入麻酔薬を除きます。
技術の制限: 肺の機械的性質を測定する拘束された侵襲的なメソッドは必要な気管切開術、最後の手順のため、それによって病気を調査するオプションなしの単一点分析する研究を制限進行。侵襲性のレベルを減らすためには、それによってできる縦方向の研究、意識した動物の伝達インピー ダンスの測定を実行できます。ただし、非 tracheotomized の動物の呼吸の力学を測定するとき鼻の抵抗は総呼吸抵抗に貢献し、メサコリン誘発13後測定をそれにより複雑になります。
プロトコルの中で重要なステップ: 侵襲的な肺機能の 1 つだけの方法を示します。いくつかの確立された侵襲的な肺関数メソッドが存在しているので研究と方法の詳細な説明内の標準化を使用するグループと出版物で麻酔体制研究を比較する必要があります。
組織計量解析に対する肺切除術
既存の方法と将来のアプリケーションに関しての意義: 定量的組織計量解析は侵襲的で得られた結果を解釈する肺構造 (気管支と肺胞) に対する肥満の影響を調査する使用ことができます脈、肺の結果の可能な治療法の選択肢を検討します。組織学的評価からのデータは、固定剤と使用される固定方法によって異なります。肥満にも、細胞外マトリックスと細胞成分として、肺胞や気管支の構造に影響を及ぼすことが示されているので、将来の研究の研究の質問に適切な手法を決定する必要です。公平な定量的形態、次の固定処理組織がアメリカ胸部学会 (ATS) の基準によると実行してください/肺の定量的評価のため欧州呼吸器学会 (ERS) 構造14.
変更とトラブルシューティング: 2010 年夏ら肺分離と固定する前に考慮する必要がある肺構造の定量的に評価基準を設定する ATS/ERS の公式声明を発表14. 肺組織36を膨らませるため気管内の横にある定着剤、その場で固定、固定ボリューム固定または真空のインフレの注入を実行できます。インフレとなる空域の拡大、固定法と固定の間に適用される圧力のグレードによって異なります。たとえば、高圧では、肺胞壁の破壊につながるし、それにより結果に影響できます。換気パラメーターと同様に、理想的な固定パラメーターは、年齢、サイズ、およびマウスの表現型に依存します。固定は、化学薬品および/または凍結を含む化学か物理的な手段によって実現できます。適切な定着剤の気管内投与は、組織体内の状況を反映して、呼吸時にインフレを模倣し、つまり、広く使用されている37。十分な圧力を広く、短いチューブを使用して、迅速かつ均一な浸透14を許可するには、肺の最高点以上 20-25 cm をお勧めします。固定の主な目的は、変性プロセスを防ぐために、肺実質のアーキテクチャの整合性を維持しながら「生きているような状態」の組織・細胞を維持するためにです。さらに、組織は、反応性の抗体、汚れ、および核酸プローブを維持する必要があります。通常の自己分解の効果に加え加工、ホット ワックスの浸透を含む組織の悪影響スライス、脱脂、防がれるべき。定着剤の選択だけでなく、例えば経由で埋め込み、組織のさらなる処理組織の収縮は、腫れとさまざまなコンポーネントの硬化が発生し、増加蛍光38などの人工物をもたらします。たとえば、10% 固定バッファリング ホルマリン、収縮まで 20-30% の最初のボリューム39基準を引き起こす可能性がありますさらに処理します。したがって、2.5% の ATS/ERS 推奨使用 2010年コンセンサス答案夏らグルタルアルデヒドは、四酸化オスミウムと組織収縮を避けるために酢酸ウラン バッファー。肺気量、内部アーキテクチャ、組織の微細構造、細胞構造はこの固定試薬14気道投与後保持されます。蛋白と架橋形成の変性は、ティッシュの固定に重要な 2 つの主要なメカニズムです。脱水の化合物または凝集剤、アルコールやアセトンなど疎水性結合を不安定化によるタンパク質立体構造の変更を伴うタンパク質の変性を引き起こします。パラホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドのような非凝集剤固着剤は蛋白質と化学的に反応、分子間および分子内フォーム クロスリンクします。いくつかの染色法ヘマトキシリンなどとエオシン染色、分子間相互作用に依存している、染色の結果が固定エージェントに応じて、貧しい人々 にすることができます。免疫の抗原検索方法は固定の反応が可逆的で、示されているホルムアルデヒド40の特にそれら。
技術の制限: 気管内注入定着剤の解釈、歯槽アーキテクチャなど、粘液貯留による肺胞の表面被覆を削除または炎症性細胞の移動を操作することができますので41,42,43。
プロトコルの中で重要なステップ: 4% の気管内投与を示す呼吸器アウトカムに対する肥満の影響を視覚化するための広範なアプローチとして PFA。前述のように、プロトコルは、ATS/ERS 推奨14によると、研究の質問に応じて変更しなければなりません。
前述のようにパラメーターに加えストレスが研究結果に影響を与える主な要因です。したがって、両方のマウスを訓練、科学者は不可欠であります。マウスは、抑制に適応する必要があり、44静かな条件下の実験的領域に転送する必要があります。ストレスに影響を及ぼす代謝、例えばストレス ホルモン放出の結果として、リリースされたブドウ糖のレベルを増加している、として誤って解釈されることができる効果は、耐糖能障害。ストレス ホルモン分泌も特に麻酔薬に対する感受性を変更、麻酔薬の投与量が増加し、手術許容値に到達する時間が長引きます。前述のように、麻酔薬の量に気道収縮、影響ストレス自体は気管支拡張症を引き起こす可能性が、です。
要約すると、この記事は肥満マウスにおける肺の構造と機能における代謝の影響を評価する 3 つの方法を提供します。すべてのメソッドは、他の疾患モデルや肥満のため遺伝の修正やラットのモデルなどのげっ歯類に移すことが記載。これらの技術のアプリケーションは、特定の遺伝子アブレーションと DIO モデルの新しい分子メカニズムを定義するまたは治療/肥満の慢性肺疾患への悪影響を防ぐために新しい治療法をテストするのには便利です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
実験に支えられたマルガとウォルター ・ ボル ・財団、ドイツ;210-02-16 (MAAA) 210-03-15 (MAAA) プロジェクトをプロジェクト、ドイツの研究基礎 (DFG;AL1632-02MAAA)、ボン、ドイツ;分子医学ケルン (CMMC; の中心大学病院ケルン;キャリアの進歩プログラム;MAAA) フォーチュン ケルン (ケルンの大学の医学部KD)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
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