Summary
비만의 발생률 상승 하 고 만성 폐 질환의 위험을 증가 시킵니다. 설정 기본 메커니즘 및 예방 전략, 잘 정의 된 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리는 세 가지 방법 (포도 당 내성 검사, 몸 plethysmography, 및 폐 고정) 쥐에서 폐 결과에 비만의 효과 연구를 제공 합니다.
Abstract
비만 호흡기 장애는 주요 건강 문제입니다. 비만 따라서 성장 사회 경제적 부담을 나타내는 2030 1 십억 이상의 비만 개인 전세계의 예상된 번호와 신흥 유행 되고있다. 동시에, 비만 관련 comorbidities, 당뇨병, 만성 폐 질환으로 심장 등은 지속적으로 증가입니다. 비록 비만 천식 exacerbations에 대 한 위험 증가와 관련 있다, 호흡기 증상, 그리고 가난한 컨트롤의 악화 비만 만성 폐 질환의 병 인에서 교란된 물질 대사의 기능적 역할은 종종 과소 평가, 그리고 근본적인 분자 메커니즘 애매 남아 있다. 이 기사 물질 대사로 폐의 구조와 기능에 비만의 효과 평가 하는 방법을 제시 하는 것을 목표로. 여기, 우리가 쥐 연구에 대 한 세 가지 기술 설명: 포도 당 대사;에 비만의 효과 분석 하 복 포도 당 포용 력 (ipGTT)의 (1) 평가 (기도 저항 (해상도) 및 호흡기 시스템 준수 폐 기능;에 비만의 효과 분석 (Cdyn)의 측정 2) (3) 준비 및 후속 양적 조직학 평가 대 한 폐의 고정. 비만 관련 된 폐 질환은 아마 multifactorial, 조직의 염증 성 및 대사 dysregulation 잠재적으로 부정적인 영향을 주고 폐 기능 치료에 대 한 응답에서에서 형태소 분석. 따라서, 분자 메커니즘 및 새로운 치료의 효과 공부 하는 표준화 된 방법론은 필수적입니다.
Introduction
에 세계 보건 기구 (WHO) 2008 년에, 1.4 십억 이상의 성인, 세 20, 신체 질량 지 (수 BMI) 25; 보다 크거나와 체중 했다 또한, 이상의 200 백만 남자 그리고 거의 300 백만 여성 비만 (BMI≥30)1. 비만 대사 증후군 주요 위험 요소는 다양 한 질병에 대 한 있습니다. 비만 수 반하는 증가 백색 지방 조직 동안 대량 속속들이 연결 되었습니다 입력 2 당뇨병2,3, 관상 동맥 심장 질환 (CHD), 심장 마비 (HF), 심 방 세 동4 포함 하 여 심장 혈관 질병 관절염5, 호흡기 질환의 병 인에 그들의 기능 역할 제대로 이해 남아. 그러나, 역학 학문은 설명 했다 비만 강하게 exertional 호흡, 폐쇄성 수 면 무 호흡 증 증후군 (수), 비만 것 증후군 (OHS), 만성을 포함 한 만성 호흡기 조건, 연관 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 색 전 증, 포부 폐 렴 및 기관지 천식6,7,,89. 비만 대사 교란된 연결 잠재적인 메커니즘, 예를 들어인슐린 저항, 유형 II 당뇨병, 만성 폐 질환의 병 인에는 뿐만 아니라 구성 한다 무게의 기계적 및 물리적 결과 환기에 뿐만 아니라 얻을 유도 subacute 만성 염증 상태10,11. 비만 효과적인 예방 전략 및 치료 접근의 부족으로 결합 된 지난 10 년 동안 폐 병의 비만 관련 폐를 관리 하기 위해 새로운도 정의 하는 분자 메커니즘을 조사할 필요가 강조 질병입니다.
여기, 비만 및 폐 구조와 마우스 모델에서 기능에 미치는 영향을 조사 하기 위해 중요 한 기초는 3 개의 표준 테스트 설명: 기도 저항 (입술)의 (1) 복 포도 당 내성 (ipGTT) (2) 측정 및 호흡기 시스템 준수 (Cdyn); (3) 준비 및 후속 양적 조직학 평가 대 한 폐의 고정. ipGTT 측정 포도 당 통풍 관, 그리고 따라서 비만의 신진 대사에 영향을 강력한 검사입니다. 방법의 단순 실험실 사이 좋은 표준화, 그리고 그러므로 결과의 comparability을 수 있습니다. Hyperglycemic 클램프 또는 격리 된 독도 대 한 연구와 같은 보다 정교한 방법은 대사 표현 형12의 자세한 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 폐 결과에 추가 연구에 대 한 기준으로 조직 및 대사 장애의 비만 관련 된 상태를 정의 하는 포도 당 포용 력을 평가 합니다. 폐 기능에 비만 대사 장애의 영향을 평가 하기 위해 우리는 기도 저항 (해상도) 및 호흡기 시스템의 규정 준수 (Cdyn) 측정. 폐 질환의 특성, 폐 기능 평가 대 한 억제 뿐만 아니라 절제 된 방법을 사용할 수 있습니다. 자유롭게 이동 하는 동물에 억제 plethysmography 모방한 자연 상태를 반영 하는 호흡 패턴; 반면, 동적 폐 역학 평가 입술 깊은 마 취 쥐에서 cDyn의 입력된 임피던스 측정 등 침입 방법, 더 정확한13있습니다. 만성 호흡기 질환의 폐 조직 조직학 변경 반영 됩니다, 이후 추가 분석을 위해 적절 한 폐 고정 임박입니다. 것입니다 공부 될, 예를 들어 항공 또는 폐 실질14실시 폐의 조직 고정 및 준비 방법의 선택에 의하여 달려 있다. 여기, 우리가 실시 항공 천식 개발에 비만의 효과 연구의 질적, 양적 평가 허용 하는 방법을 설명 합니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 지방 정부 당국에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 실시 되었다 (토지 NRW, AZ: 2012.A424), 그리고 독일 동물 복지 법률 및 실험 또는 사용 하는 동물의 복지에 규정 했다 다른 과학적인 용도입니다. 폐 기능 분석 폐 구조에 영향을 미칠 수 있기 때문에 따라서 연속적인 조직학 분석, 입술 및 Cdyn 준비 및 histomorphometry에 대 한 폐의 정착의 측정 다른 동물에서 수행 되어야 합니다. 그러나, 해상도 Cdyn ipGTT 다음의 측정 가능 하다. ipGTT 동안 스트레스를 방해할 수 있기 때문에 폐 기능에 필요한 마 취 테스트, 복구 기간 약 2 주 후 ipGTT 쥐 몸 무게 손실 로부터 복구할 수 있도록 것이 좋습니다 하 고 혈액 매개 변수12에서 변경.
1. 복 포도 당 내성 검사 (ipGTT)에 대 한 준비
참고: 후 금식의 12 h, 완전 한 ipGTT는 약 2 시간 걸립니다.
- 때문에 스트레스는 혈당을 크게 영향, 마우스의 두 적응 뿐만 아니라 과학자의 훈련 수행 됩니다 확인 합니다.
- 조용 하 고 스트레스 없는 조건 하에서 실험 지역에 동물을 전송 합니다.
- 생쥐에서 비만 유발 하는 hypercaloric 규정식의 응용 프로그램을 고려 하십시오. 추가 조언에 대 한 토론 섹션 참조.
- 12 h에 대 한 빠른 동물 하룻밤 물에 대 한 액세스를 제한 하지 않고. 다음 날, 12 h 금식, 혈액 포도 당 미터 제조 업체에 따라 준비 후의 프로토콜 ( 재료의 표참조) 테스트 스트립 포트에 새로운 테스트 스트립을 삽입 합니다.
- 꼬리 끝의 꼬리에서 마우스를 부드럽게 유지 하면서 살 균가 위를 사용 하 여 incise 하 고 즉시 혈액 포도 당 미터의 테스트 스트립을 자유롭게 흐르는 혈액 드롭 (최소 샘플 크기 0.5 µ L)를 적용 하 여 단식된 혈액 포도 당을 측정 한다.
참고: 카운트 다운 타이머는 혈액 샘플의 충분 한 적용 후 화면에 시작 됩니다. 4 후 s, 테스트 결과가 화면에 나타납니다. - 이후에, 무게 및 레이블 색 표시를 사용 하 여 개별적으로 동물.
- 2 g 포도 당/kg 몸 무게를 통해 복 주입을 관리 합니다. 주입 량 0.1 mL/10 g 몸 무게 (27 G 바늘과 1 cc 주사기) 인지 확인 합니다.
- 그 후, 새로운 테스트 스트립에 자유롭게 흐르는 피 한 방울을 적용 하 여 15, 30, 60, 120 분 후 혈당을 측정 합니다.
참고: 혈 꼬리 팁-워드의 부드러운 마사지 하 여 늘릴 수 있습니다. 꼬리 상처 encrusts, 0.9% 염화 나트륨 용액으로 젖은 멸 균 면봉을 사용 하 여 청소 합니다. - 자신의 집 새 측정 사이 물에 대 한 무제한 액세스와 나머지 동물 허용.
2. 폐 기능 분석 측정 해상도를 cDyn
참고: 해상도 cDyn의 평온한 측정, 쥐 해야 깊은 마 취 통풍이. 스트레스 없는 동물 처리 및 마 취의 적절 한 모니터링이 필수적입니다. 무 균 기술을 사용 하 여 일반 지침을 보려면, 제발 Hoogstraten 밀러 그 외 여러분 에 의해 문서를 참조 15
- 실험의 각 세트 이전 plethysmograph를 보정 하 고 소프트웨어 연구 설정 준비 ( 재료의 표참조).
- 수술 전에 깊이 anesthetize Xylazine (10 mg/kg 체중)와 케 타 민 (100mg/kg 체중)의 복 주사를 통해 동물 (27 G 바늘과 1 cc 주사기). 주입 량 0.1 mL/10 g 몸 무게 당 인지 확인 합니다.
참고: 때문에 케 타 민 쥐에 적절 한 진통 효과가지고, 아무 추가 통증 치료 필요 하다. 침략 tracheal 카 테 테 르/plethysmograph 절차 5-7 분 정도 걸립니다 다음 데이터 수집을 시작할 수 있습니다. - 체온을 유지 하기 위해가 열 패드에 부정사 위치에 마우스를 놓습니다.
- 연 고 마 취 건조 방지와 함께 눈을 커버.
- 끊임없이 발가락 핀치-응답을 사용 하 여 마 취의 깊이 모니터링 합니다.
참고: 마 취의 추가 관리는 마 취의 수술 평면을 유지 하기 위해 필요할 수 있습니다. - 70% 에탄올과 갑 상선 지역에서 외과 영역의 모피 축
- 조심 스럽게 집게와 그것을 해제 하 고 무딘가 위 (그림 1A)를 사용 하 여 육안 검사에서 피부를 클리핑 하 여 흉 골의 jugular 노치와 괴 경 symphyses는 mentum의 대략 1 cm에 대 한 중간에 피부를 incise.
- 시각화는 기본 피하 지방 조직을 상선.
- 신중 하 게 무딘 지협 및 sternothyroid 및 sternothyroid 근육 (그림 1B)의 해 부에 모두 갑 상선 엽을 구분 하 여 기도 노출 합니다. 어떤 혈관 손상 원인과 출혈,이 심장 혈관 시스템에 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 하지 조심 및 궁극적으로 측정에.
- 그 후, 기관지와 식도 무딘 집게를 사용 하 여 4-0 꼰된 외과 봉합 사를 전달 합니다. 신중 하 게 incise 마이크로 위 tracheal 연골 사이 후 두에 가까운 기도.
- 시각적 컨트롤 (그림 1C) 아래 tracheal 튜브 (0.04 인치/1.02 m m 직경) 넣어야. 시스템에 어떤 누출을 피하기 위해 수술 봉합 사로 결 찰을 통해 튜브를 수정 합니다.
- 다음, 동물 시체 실의 온수 침대에 이동 하 고 얼굴 플레이트 (그림 1D) tracheal 튜브를 연결 컨트롤러 (그림 1E)의 전면 패널에 환기 버튼을 눌러 환기에 설정.
- 설문 조사 환기 속도와 동시성 흉부 움직임을 관찰 하 여 환기. Tracheal 튜브의 적절 한 배치를 확인 하려면 가슴의 양쪽 모두 동시에 이동 해야 합니다.
- 압력을 시계 컴퓨터 화면 (그림 1 층)에 신호. 환기 곡선 유니폼 인지 확인 합니다. 이 경우가 아니라, 동물을 분리 하 고 수술 쪽을 확인. 혈액 이나 점액 tracheal 튜브를 차단의 조심 하십시오.
참고: 20-25 g의 몸 무게로 성인 동물에 대 한 그림 2 와 같이 송풍기 설정은 제조업체의 권장 사항을 따라 건의 된다. - 환기 동안 트랜스 폐 압력에 변화를 제어 하는 식도 튜브 (0.04 인치/1.02 m m 직경) 폐의 수준에 근접 하는 깊이에서 식도에 삽입 합니다. 튜브를 배치 하는 동안 화면을 시계. 최대 압력 편향과 최소한의 심장 아티팩트를 화면에서 볼 수 있는 튜브에 놓습니다.
- 수술 후 측정을 위해 동물을 준비 합니다. 마 취를 통해 복 주입 마 취 제 (100 mg/kg 체중) 27-G 바늘과 1 cc 주사기를 사용 하 여의 reinject 주입 량 0.1 mL/10 g 몸 무게 당 인지 확인 합니다.
참고: 기관지 hyperreagibility 평가를 nebulize methacholine 유도 기관지는 부 교감 신경의 선택적 비 muscarinic 수용 체 주 작동 근. 데이터 수집 4 개의 다른 단계 (그림 3)에서 수행 됩니다. - Manufacturer´s 프로토콜에 따라 데이터 수집을 시작 합니다.
참고: 소프트웨어는 자동으로 인수 과정을 통해 사용자를 안내합니다. - 분무기에 10 µ L의 PBS (차량)를 적용 하 고 새 환경 순응의 5 분 후 nebulization 시작. 다음, 입술 (cmH2O/mL/s) 및 cDyn (mL/cmH2O) 측정은 3 분의 응답 단계를 따릅니다. 끝에, 다음 nebulization 전에 동물에 3 분의 복구 단계를 제공 합니다.
- 호흡기에 methacholine (2.5 µ g/10 µ L, 6.25 µ g/10 µ L, 및 12.5 µ g/10 µ L)의 농도 증가의 10 µ L의 stepwise 응용 프로그램 소프트웨어에 따라.
- 일단 모든 측정 수행 되었고 기록, 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 희생.
3. 폐 절연 성인 쥐의 양적 Histomorphometric 분석에 대 한
- 깊이 동물 을 통해 복 주입 Xylazine (10 mg/kg 체중)와 케 타 민 (100mg/kg 체중)의 anesthetize (27 G 바늘과 1 cc 주사기). 주입 량 0.1 mL/10 g 몸 무게 당 해야 합니다.
참고: 외과 관용의 상태에 도달, 후 준비 기관 관류 및 고정을 위한 30 분 약 5 분 걸립니다. - 동물 수술의 상태에 도달 했습니다 일단 공차 (부정적인 발가락 핀치-응답), 70% 에탄올과 동물을 소독 하 고 외과 테이프와 패드에 동물을 해결.
- 심장 빵 꾸 및 출혈 동물을 희생. 간단히, 복 부 피부와 복 막 무딘가 위를 사용 하 여 통해 중간 절 개를 엽니다.
- 간, 개 구 횡 경 막 머리 찾아서 조심 스럽게 간 횡 경 막에서 분리 합니다.
- 무딘가 위를 사용 하 여 횡 경 막에 작은 절 개를 만들고 punctate 20 G 바늘으로 심장의 좌 심 실 2 mL 주사기에 부착 된. 천천히 exsanguinate 동물.
참고: 느리고 조심 exsanguination 심 그대로 혈 억제 부정적인 압력 때문에 붕괴를 방지 하기 위해 중요 하다. - 부드럽게 곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 흉 곽의 전체 길이 따라 parasternal 절 개를 통해 가슴을 열고 폐를 해 부.
- 이후에, 흉 곽 흉 막 캐비티 (그림 3C) 노출 들어올립니다. 심 혼 및 폐를 보러 thymus를 제거 합니다.
참고: 우 심 실, 폐 혈관 시스템 얼음 처럼 차가운 PBS 그리고 통 솔루션 [예를 들어, 4% (질량/볼륨) paraformaldehyde (PFA)]의 관류 다음의 선택적 주입 가능 하다. 치경 septae 파열 하 여이 메서드를 사용 하 여 폐 구조 저하 위험 증가 다는 것을 유의 하십시오. - 처음으로 폐를 신중 하 게 부는 마음을 제거.
- 그 후, 기관지와 식도 무딘 집게를 사용 하 여 4-0 꼰된 외과 봉합 사를 전달 합니다.
- 다음, 신중 하 게 가까이 tracheal 연골 사이 후 두 기관지 incise는 정 맥 캐 뉼 러 (26 G)와 함께 넣어야, 20 cm H2O의 일정 한 압력에서 압력 고정 하 여 폐를 팽창 통 에이전트 [예를 들어, 4% (질량을 사용 하 여 PFA의 /volume)].
- PFA 고정을 위한 실 온에서 30 분 동안 정착 액을 둡니다. 이후에, 기관지 선 고는 정을 제거 합니다. 그리고, 조직에 손상을 주지 않고 폐를 신중 하 게 소비 세 하룻밤 4 ° C에서 통 에이전트에 저장 합니다.
참고: 또는, ATS/ETS에 따르면 합의 종이 2.5%가 버퍼링 OsO4, Uracil 솔루션 적절 한 조직 안정화를 위해 사용 된다. 추가 조직 준비 Hsia 외. 여 합의 종이 참조 14
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Representative Results
복 포도 당 내성 검사 (ipGTT) (그림 4)의 대표적인 결과, 폐 기능 시험 (그림 5), 그리고 대표 이미지 보여주는 되며 오신 스테인드 폐 (그림 6).
ipGTT 높은 지방 다이어트 (HFD)의 7 주 후 (파란색) 비만 생쥐에서 수행 되었다. 표준 다이어트 먹이 마우스 컨트롤 (블랙) 역임. 비만 쥐 복 포도 당 주입 후 증가 된 혈 청 포도 당 레벨 15와 30 분을 보여주었다 세포 포도 당 통풍 관 (그림 4) 손상 나타내는.
폐 기능에 비만의 효과 검토, 침략 적 폐 기능 분석 비만 쥐 (파란색) 높은 지방 다이어트 (HFD)의 7 주 후에 수행 되었다. 비만 쥐의 기도 저항 제어 마우스 (블랙) (그림 5)에 비해 최대 1.5-fold 증가 보였다.
폐 실질에 fixatives의 intratracheal 점 중 고정은 압력의 효과 시각화할 hematoxylin와 오신 스테인드 폐 섹션의 대표 이미지 (그림 6) 표시 됩니다. 너무 작은 압력 잠기거나 치경 septae (C)와 over-inflated 기종 같은 지역에서 너무 많은 압력 결과 동안 여러 유엔 비정상적으로 두꺼운 치경 septae 지역과 다각형 모양의 포 (A), 리드. 폐 고정 하는 동안 적절 한 압력의 응용 둥근 모양의 포 (B)와 완전히 팽창 된 폐 이끌어 낸다.
그림 1: 침략 적 폐 기능의 도식 대표. (A-C) 기관 절제술의 단계입니다. (D)는 plethysmograph의 얼굴 플레이트에 동물의 연결. (E) 침략 폐 기능에 대 한 하드웨어 설정. 데이터 수집의 (F) 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 기관지 hyperreagibility를 평가 하기 위해 데이터 수집의 계획. 초기 새 환경 순응 기간 (5 분), 30 다음을 포함 하는 데이터 수집의 물질 nebulization, 응답 단계의 3 분 및 다음 물질 농도의 복구 단계 이전 nebulization의 3 분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 준비 단계의 도식 대표. (A-D) 기관 절제술의 단계입니다. 피부 절 개 (A) . (B) 사이트의 흉 강. (C) 흉 곽의 제거 후 볼 수 있습니다. (D)는 심장의 제거 후 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표 복 포도 당 내성 검사 (ipGTT). 마우스 C57Bl/6N; 6-8 주 동안 높은 지방 다이어트 지 루 했다 컨트롤 마우스는 표준 식단을 받았다. n = 3; 의미 ± SEM; 통계 분석 수행 양방향 ANOVA 테스트와 Bonferroni posttest를 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 대표적인 폐 기능 테스트 마우스 C57Bl/6N; 6-8 주 동안 높은 지방 다이어트 지 루 했다 컨트롤 마우스는 표준 식단을 받았다. n = 3; 의미 ± SEM; 통계 분석 수행 양방향 ANOVA 테스트와 Bonferroni posttest를 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 대표 이미지 설명 되며 & 오신 스테인드 폐. Intratracheal 물가의 3 개의 다른 급료: (A) 너무 작은 압력, (B) 적절 한 압력, 그리고 (C) 너무 많은 압력. UIA; 축소 된 영역, OIA; 팽창 된 지역; 이미지 20 배 확대를 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 송풍기 설정 | Spalte1 |
| 최대입니다. 선 볼륨 | 0.25 ml |
| 최대입니다. 입 압력 | 30cmH2O |
| 깊은 인플레이션 최대. 볼륨 | 0.5 ml |
| 깊은 인플레이션 최대. 압력 | 30cmH2O |
| 속도 | 분당 160 숨 |
표 1: 성인 쥐에 대 한 인공 호흡기 설정. 작은 동물에 대 한 환기 매개 변수를 조정 될 필요가 있다.
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Discussion
이 보고서는 포도 당 대사 및 폐 결과 비만 미치는 영향을 분석 하는 세 가지 다른 방법에 대 한 세 가지 프로토콜을 제공 합니다. 첫째, 포도 당 내성 검사 세포내 포도 당 통풍 관을 분석 하는 기회를 제공 하 고 인슐린 저항을 나타내는 수 있습니다. 둘째, 전체 몸 plethysmography 폐 기능을 측정 하는 기술 이며 그로 인하여 소설 치료의 효능을 테스트 도움이 됩니다. 셋째, 표준화 된 고정 프로토콜 비만 구조 변화에 미치는 영향을 평가 하기 위해 양적 형태학 분석을 위해 필수적 이다.
동물 연구에서 다이어트 유발 된 비만
기존의 방법 및 미래의 응용 프로그램 의미: 인간의 식습관, 비만, 결과 모방 하기 위해 다이어트 유발 된 비만 (DIO) 모델에서에서 널리 이용 된다 설치류. 신진 대사 질환을 흉내 낸 유전자 변형된 쥐를 사용 하 여, 비교 DIO 모델 병 인, 병 리, 그리고 미래의 치료 옵션의 분석을 사용 합니다. Heydemann 그 외 여러분, 검토 하 여 최근 당뇨병 연구16다른 murine 높은 지방 다이어트 모델에 대 한 개요를 제공 합니다. 영양소 구성 요소의 특정 수정 비만, 분자 기계 장치에 그리고 그로 인하여 폐 구조와 기능에 영향 마이크로-와 매크로 영양소의 미래 연구의 가능성을 제공합니다.
수정 및 문제 해결: 비만 식이 영양분16, 있다, 차례 차례로, 최근 몇 년 동안, 예를 들어 다양 한 다이어트의 개발을 주도하는 지식 구성에 다른 변화에 의해 유도 될 수 있는 다양 한 보고서 표시 지방 이나 탄수화물 내용 또는 소위 서양 다이어트16은 두 다이어트의 조합에 높은 다이어트. 결국, 연구에 대 한 다이어트의 선택은 연구 질문과 연구의 목적에 따라 달라 집니다. 이러한 중요 한 요소에 대 한 제어, 게다가 적절 한 제어 다이어트의 선택은 매우 중요; 그렇지 않으면, 결과의 해석에 제한 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 표현 형만 다이어트의 종류에 의해 발생 하지 않습니다 하지만 또한 먹이 기간, 성별 및 마우스의 결과 변형17.
기술의 한계: 다이어트의 다양 한 영양소의 구성 옆에 있는 동물 및 배경 긴장의 응답 결과 비만 유도 하 여 관찰 하는 형에 대 한 계정 수 있다. 예, 그것은 보였다, BALB/C 마우스는 간 steatosis C57Bl/6 마우스18에 비해 더 취약. 약간의 유전자 변형, 예를 들어, 때문에 유전적 부동 (C57Bl/6J C57Bl/6N 대), 수 있습니다 또한 비만19민감성에 영향을. 이 기술도 긴장과 쥐를 가져온 공급 업체가 결과 영향을 미칠 수 있기 때문에과 다른 유전 배경 종자, 유전자 변형된 마우스 작업의 한계를 강조 표시 합니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계: 실험 사이 신뢰성, 재현성, 비교 결과 대 한 컨트롤을 생성 하 선호 littermates 컨트롤 그룹을 사용 해야 합니다 및 실험 쥐, 환경 요인과 스트레스 해야 통제 쥐 실험 쥐12동시에 공부 한다.
복 포도 당 내성 검사 (ipGTT)
기존의 방법 및 미래의 응용 프로그램 의미: murine 신진 대사에 DIO의 영향을 확인 하려면 다른 스크린 테스트 존재. 마우스 대사 형질 센터 (MMPC) 컨소시엄 쥐에서 대사 고기를 평가 하기 위한 표준 방법을 제안 하 고 설명 하 고 포도 당의 신진 대사 테스트를 수행 하기 위한 표준 운영 절차를 발표 했습니다. 쥐12항상성입니다. GTT 주어진된 양의 설탕에는 인슐린 분 비와 인슐린 효과 섭취 후 신체의 세포는 포도 당 통풍 관 수 얼마나 잘 측정 하는 세계적인 접근 이다. 혈 청 인슐린 수준에 차이 종종 변경 된 포도 당 포용 력을 위한 계정. 따라서, 당뇨병 및 비만 모델 마우스의 특성을 가장 널리 사용 되 생리 테스트 중 하나는 GTT 되고있다. IpGTT는 빠르고 쉬운 접근 때문에, 그것은 사용할 수 있습니다 미래의 연구에 표준화 된 방법으로 다이어트 및 신진 대사에 치료의 효과 분석 하.
수정 및 문제 해결: The GTT는 정기적으로 수행 쥐20에 피 포도 당 레벨을 맞춰야 하는 하룻밤 빠른. 금식 기간의 기간 조사 매개 변수에 강한 영향 때문 따라서 비교 및 결과의 해석에 대 한 중요성의 금식 기간 해야 시대에 적응 되며 생쥐의 체중. 마우스는 야행성 동물 및 총 일일 음식 섭취 량의 2/3는 밤새 소비 고려, catabolic 상태를 불러 일으키 하룻밤 금식. 따라서, 개시의 시간 포인트 금식의 기간, 결과에 관련성이 높은 영향을 미칠 고 따라서 이러한 매개 변수는 표준된12이어야 한다. 또한, 장기간 금식 간 glycogen 상점을 고갈 시킨다 고 따라서 기준선 혈액 포도 당에 있는 가변성을 감소 시킨다. 결론적으로, 쥐에 있는 인슐린 자극 포도 당 이용 후 향상 된 이후 기간21, 금식 기간 인슐린 작업;을 평가 하는 것이 좋습니다 5 ~ 6 시간 금식을 연장 반면, 하룻밤 금식 하는 것은 포도 당 이용12,,2022테스트 충분 합니다. 포도 i.p. 주입 일반적으로 관리 를 통해 고 혈당의 복용량 몸 무게 (보통 1 또는 2 g/kg 체중)20,22에 조정 됩니다. DIO 모델, 체중 증가, 주로 때문에 더 높은 지방 질량; 그러나 포도 당 통풍 관,, 주로 근육, 뇌, 그리고 간에서 발생합니다. 일반적으로 이러한 조직 양의 DIO에 의해 변경 되지, 비만 쥐 차례로 데이터의 해석에 영향을 미칠 수 있고 오진 포도 당 편협22 이어질 마른 쥐에 비해 포도 당의 어울리지 않게 높은 금액을 받습니다. . 이러한 이유로, 금식 기간 표준화 되어야 하 고 신체 구성 GTT 결과23의 해석 도중 고려 될 필요가. 따라서, 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 또는 자기 공명 imaging(MRI) 검사 적용 됩니다. 예를 들어, 휴대용 전체 혈당 모니터 ( 재료의 표참조)에 의해 포도 당 측정, 사용할 수 있으며 이러한 모니터 플라스마 포도 당 분석기 보다 더 일반적으로 사용 됩니다. 때문에 작은 혈액 볼륨 필요-일반적으로 5 µ L 또는 덜-그들은 플라즈마 분석기 보다 더 실용적 이다.
기술의 한계: 단식된 쥐 금식의 기간에 대 한 의존도 전시 하 고 몸 무게, 체온, 혈액 량, 심장 박동 뿐만 아니라 혈 청 등의 매개 변수, 자유로운 지방산 수준 및 케 톤 시체 에에서 변화에 중요 한 손실을 표시 24.이 대사 스트레스는 사실 동물 시설에 쥐의 주택 온도 약 23 ° C, 표준화 이며 따라서 그들의 온도-중립 온도 30 ° C25의 아래에 의해 트리거됩니다. Subthermo-중립 온도에서 장기간 금식 하는 것은 휴면, 신진 대사 속도26,27의 감소에 의해 특징 귀 착될 수 있다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계: 실험 간의 신뢰할 수 있는 결과 위해, 위에서 언급 한 대로 제어 그룹, littermates 선호 연구 및 금식 기간 동안 사용 해야 하 고 시간 포인트 표준화 될 필요가.
폐 기능 분석
이 프로토콜에는 plethysmograph는 직접 호흡, 그리고 기도와 결과 흐름 운전 압력 변화를 측정 합니다. 흐름은 plethysmograph의 벽에 있는 pneumotachograph에 의해 측정 됩니다. 기도 개방 압력 (입 압력) 및 transpulmonary (식도 튜브) 압력 측정 가슴 벽에서 저항을 제외 하 고 기도 저항 및 동적 준수 계산 됩니다. 동적 준수는 계산을 통해 흐름을 통해 분할 최소 및 최대 폐 볼륨의 차이입니다.
기존의 방법 및 미래의 응용 프로그램: Plethysmography 의미 따라서 폐, 고 수의 기계적 특성을 분석, 미래 연구에 폐 병 리 및 치료 옵션을 분석 하는 데 사용 수는 표준 절차입니다. 비교 그룹 및 연구, 표준화 된 접근은 불가결.
수정 및 문제 해결: 일반적으로,이 기술은 억제 하 고 절제 된 전체 몸 plethysmography로 분류 될 수 있다. 억제 방법 향상 된 일시 (프놈펜)를 결정 하 고 절제 된, 침략 적 방법을 직접 압력, 흐름, 또는 볼륨 측정 하는 동안 정상적인 호흡 패턴의 분석을 사용. 폐 기계적 특성 저항 및 elastance;에 의해 결정 됩니다. 저항을 흐름에 압력의 비로 계산 하는 동안 elastance 볼륨28에 압력의 비율을 반영 한다. 반면, 억제 전체-몸 plethysmography plethysmograph, 내부 압력을 측정 하 고 단지 그리고 그러므로 저항 및 elastance의 계산 가능 하다. 2007 년에, Lundblad 그 외 프놈펜은 아니라 바로 기도 저항을 측정 하지만 호흡 패턴29의 일반적인 반영을 나타냅니다 명시 했습니다. 따라서, 폐 역학의 적절 한 추정에 대 한 침략 plethysmography 필수29,,3031이다.
이후 호흡 매개 변수는 연령과 쥐의 크기에 따라 달라 집니다, 환기 매개 변수 조정 될 필요가 있다. 예를 들어 해 일 볼륨와 몸 무게 관련은 10 µ L/g 체중 분당 120-250 호흡의 호흡 주파수로 설정 되어야 합니다. 이러한 매개 변수를 조정할 때는 탐정 한다 고려 의미 해 볼륨을 호흡 주파수32를 반비례 관련이. 자발적인 호흡 압력, 흐름, 그리고 볼륨 영향, 이후 마 취의 깊이 모니터링 하 고 환기 곡선 끊임없이 관찰 해야. 그러나, 자체 마 취 수 직접 저하 폐 기능. 예를 들어 Propofol 및 마 취 제 부분 Thiopental33에 비해 유도 기도 수축에 대 한 보호. 또한, 임상 연구 케 타 민 anticholinergic 효과가 있으며, 심한 천식34에 잠재적인 bronchodilator로 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 통증 치료와 함께에서 isoflurane 같은 inhalational 마 취약 주입 마 취; 제어 대 안으로 간주 됩니다. 그러나, 휘발성 마 취약 후 기도 염증 보고 되 고 따라서 대체35로 흡입 마 취약을 제외.
기술의 한계: 폐 기계적 성질을 측정 하기 위해 절제 된 침입 방법 필요한 기관 절제술, 마지막 절차 때문 이며 질병을 조사 하는 옵션 없이 단일 포인트 분석, 연구 함으로써 제한 진행입니다. 침입의 수준을 줄이기 위해, 의식 동물에서 이동 임피던스의 측정 수행할 수 있습니다, 그로 인하여 경도 연구 수 있습니다. 그러나, 비 tracheotomized 동물의 호흡 역학 측정, 코의 저항 총 호흡 저항에 기여 하 고 methacholine 도발13후 측정을 그로 인하여 복잡.
중요 한 단계는 프로토콜 내에서: 여기 침략 폐 기능에의 한 방법 보여 줍니다. 이후 여러 설립된 침략 폐 기능 방법 존재, 표준화 연구와 방법에 대 한 자세한 설명, 그룹, 사용 그리고 간행물에서 마 취 정권 비교 연구 하는 데 필요한.
Histomorphometric 분석에 대 한 폐 절단
기존의 방법 및 미래의 응용 프로그램 의미: 양적 histomorphometric 분석 비만 폐 구조 (기관지와 폐 포), 침략 하 여 얻은 결과를 해석에 미치는 영향을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 plethysmography, 폐 결과에 가능한 치료 옵션을 공부 하 고. 조직학 평가에서 데이터 통 대리인 및 사용된 고정 절차에 따라 달라질 수 있습니다. 비만 잘으로 세포 외 매트릭스와 세포 구성으로 치경과 기관지 구조에 영향을 있다는 표시 되었습니다 이후 그것은 미래 연구에 연구 문제에 따라 적절 한 기술을 결정 하는 데 필요한. 편견된 양적 morphometry에 대 한 미국 흉부 학회 (ATS)의 기준에 따라 조직 고정 다음과 같은 처리를 수행 / 유럽 호흡기 학회 (ERS)는 폐의 양적 평가 대 한 구조14 .
수정 및 문제 해결: 2010에서 Hsia 외. 폐 격리 및 고정 하기 전에 고려 사항으로가지고 야 한다 폐 구조의 양적 평가 대 한 기준 설정 ATS/ERS의 공식 성명 발표 14. intratracheal 옆에 fixatives, 제자리에 고정, 고정 볼륨 고정 또는 진공 인플레이션의 문제는 폐 조직36급증 수행할 수 있습니다. 인플레이션, 그로 인하여 영공 확대, 정착 절차와 고정 하는 동안 적용 되는 압력 등급에 따라 달라 집니다. 높은 압력, 예를 들어 치경 벽 파열으로 이어질 고 그로 인하여 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 환기 매개 변수 마찬가지로 이상적인 고정 매개 변수는 나이, 크기, 및 쥐의 표현 형에 따라 다릅니다. 고정은 화학 약품 이나 cryopreservation 화학적 또는 물리적 방법에 의해 얻을 수 있습니다. 적합 한 fixatives의 Intratracheal 점 호흡, vivo에서 조건을 반영 하는 동안 조직 인플레를 모방 이며 따라서 널리 사용된37. 폐의 가장 높은 지점 위에 20-25 cm는 넓고 짧은 튜브를 사용 하 여 신속 하 고 균일 한 침투14수 있도록 충분 한 압력에 대 한 것이 좋습니다. 고정의 주요 목적은 변성 과정을 방지 하 고 세포와 조직 "같은 상태", 폐 실질의 건축 무결성을 유지 하면서 보존 이다. 또한, 조직 항 체, 얼룩, 및 핵 산 프로브를 그것의 반응성을 유지 해야 합니다. 일반 autolysis 효과 외 조직 처리, 뜨거운 왁 스 침투 등의 부작용 슬라이스, 그리고 dewaxing, 막을 수 있습니다. 정착 액의 선택 뿐만 아니라 조직, 예를 들어 통해 포함, 추가 처리 조직 수축, 팽창, 그리고 다양 한 부품의 경화를 일으킬 하 고 증가 autofluorescence38같은 이어질 수 있습니다. 예를 들어 10%에서 고정 버퍼 말린 고 추가 처리 수축 최대 20%-30%의 초기 볼륨39를 기준으로 발생할 수 있습니다. 따라서, 2.5%의 ATS/ERS 추천 사용의 그들의 2010 일치 신문에 Hsia 외 도 오스뮴 tetroxide와 조직 수축 방지 하려면 uranyl 아세테이트 버퍼링. 폐, 내부 아키텍처, 조직의 미세 구조, 볼륨과 셀 구조는이 통 시 약14의 기도 주입 후 보존 되었다. 단백질 및 상호 형성의 변성은 조직의 고정에 중요 한 두 가지 주요 메커니즘. 탈수 화합물 또는 coagulants, 알콜 이나 아세톤, 소수 바인딩을 불안정 하 여 단백질 3 차 구조 변경의 결과로 단백질의 변성을 일으킬. Paraformaldehyde 또는 같은 비 응집 고정 에이전트 화학적으로 단백질으로 반작용 하 고 양식 간 분자와 분자 내부 크로스 링크. 이후 여러 되며 등 절차를 얼룩이 지 고 오신 얼룩, 분자 간의 상호 작용에 따라 달라 집니다, 얼룩 결과 가난 하 고, 통 에이전트에 따라 될 수 있습니다. 항 원 복구 방법 immunohistochemistry에 정착의 반응 중 일부는 가역, 나타났습니다 포름알데히드40의 특히 그들.
기술의 한계: 치경 표면 안 감 intratracheal fixatives의 해석, 예를 들어, 치경 마이크로아키텍처, 점액 축적의 주입에 의해 제거 또는 염증 성 세포 마이그레이션 조작할 수 있습니다 41 , 42 , 43.
중요 한 단계는 프로토콜 내에서: 여기에 우리가 4%의 intratracheal 점 표시 폐 결과에 비만의 효과 시각화 하는 광범위 한 접근으로 PFA. 위에서 설명 했 듯이 프로토콜 연구 질문의 ATS/ERS 추천14에 따라 수정 해야 합니다.
이전에 언급 한 매개 변수 외에 스트레스 연구 결과 영향을 미치는 주요 요소 이다. 따라서, 두 쥐를 훈련 과학자는 불가결. 마우스 금지에 적응 해야 하 고 조용한 조건44에서 실험 영역을 전송 해야 합니다. 스트레스 영향 물질 대사, 예를 들면 스트레스 호르몬 방출의 결과로, 출시 된 포도 당 수준을 증가, 효과로 잘못 해석 될 수 있는 포도 당 포용 력을 손상. 스트레스 호르몬 릴리스 또한 특별히 마 취 약물 민감성을 변경, 마 취약의 복용량 증가 하 고 수술 허용 오차를 도달 하는 시간이 연장. 앞에서 언급 했 듯이, 마 취약의 증가 수량 자체가 스트레스 기관지 팽창 하면 동안 기관지, 좌우할 수 있다.
요약 하자면,이 문서에는 비만 및 대사 폐 구조와 쥐에 기능에 미치는 영향을 평가 하기 위해 세 가지 방법을 제공 합니다. 모든 언급 하는 방법을 다른 질병 모델 및 설치류 종, 비만 유전 수정 또는 쥐 모델에 전송할 수 있습니다. 이러한 기술의 응용 프로그램 특정 유전자 제거와 DIO 모델에 새로운 분자 메커니즘을 정의 하거나 만성 폐 질환에 부작용 비만 치료/방지 하기 위해 새로운 치료 접근을 테스트 하려면 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
실험은 Marga 월터 볼이 네 재단, 케르 펜, 독일;에 의해 지원 되었다 210-02-16 (MAAA), 프로젝트 210-03-15 (MAAA) 프로젝트와 독일 연구 재단 (DFG; AL1632-02; MAAA), 본, 독일; 분자 의학 쾰른 (CMMC;의 센터 대학 병원 쾰른; 경력 발전 프로그램; MAAA), 쾰른 재산 (학부 의학, 쾰른 대학; KD)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
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