Summary
A incidência da obesidade está aumentando e aumenta o risco de doenças pulmonares crônicas. Estabelecer os mecanismos subjacentes e estratégias preventivas, animal bem definido modelos são necessários. Aqui, nós fornecemos três métodos (teste de tolerância à glicose, pletismografia de corpo e fixação do pulmão) para estudar o efeito da obesidade sobre os resultados pulmonares em camundongos.
Abstract
Obesidade e distúrbios respiratórios são problemas de saúde. A obesidade está se tornando uma epidemia emergente com um número esperado de indivíduos obesos mais 1 bilhão em todo o mundo em 2030, representando assim um peso crescente socioeconômico. Simultaneamente, comorbidades relacionadas à obesidade, incluindo diabetes, bem como o coração e doenças pulmonares crônicas, estão continuamente a aumentar. Embora a obesidade tem sido associada com aumento do risco de exacerbações da asma, agravamento dos sintomas respiratórios e controle pobre, o papel funcional de obesidade e metabolismo perturbado na patogênese da doença de pulmão crônica é muitas vezes subestimado, e mecanismos moleculares subjacentes permanecem indescritíveis. Este artigo tem como objetivo apresentar métodos para avaliar o efeito da obesidade no metabolismo, bem como a estrutura do pulmão e função. Aqui, descrevemos três técnicas para estudos de ratos: (1) avaliação de tolerância de glicose intraperitoneal (ipGTT) para analisar o efeito da obesidade no metabolismo da glicose; (2) medição da resistência das vias aéreas (Res) e conformidade do sistema respiratório (Cdyn) para analisar o efeito da obesidade sobre a função pulmonar; e (3) preparação e fixação do pulmão para posterior avaliação histológica quantitativa. Doenças pulmonares relacionadas com a obesidade são provavelmente multifatoriais, decorrentes da sistêmica desregulação metabólica e inflamatória que potencialmente negativamente influenciam a função pulmonar e a resposta à terapia. Portanto, uma metodologia padronizada para estudar os mecanismos moleculares e o efeito de tratamentos romance é essencial.
Introduction
De acordo com a Saúde Organização Mundial (OMS) em 2008, mais de 1,4 bilhões de adultos, com idades entre 20 e mais velhos, estavam acima do peso com um índice de massa corporal (IMC) maior ou igual a 25; Além disso, mais 200 milhões de homens e mulheres de quase 300 milhões eram obesos (BMI≥30)1. Obesidade e síndrome metabólica são importantes fatores de risco para uma infinidade de doenças. Enquanto a obesidade e o concomitante desenvolvimento aumentado de tecido adiposo branco massa tem sido intimamente associada ao tipo 2 diabetes2,3, doenças cardio-vasculares, incluindo doença coronariana (DAC), insuficiência cardíaca (HF), fibrilação atrial4 e osteoartrite5, seus papéis funcionais na patogênese de doenças respiratórias permanecem mal compreendidos. No entanto, estudos epidemiológicos têm demonstrado que a obesidade está fortemente associada com doenças respiratórias crônicas, incluindo esforço dispneia, síndrome de apneia obstrutiva do sono (SAOS), obesidade hipoventilação síndrome (SST), crônica doença pulmonar obstrutiva (DPOC), embolia pulmonar, pneumonia por aspiração e asma brônquica6,7,8,9. Potenciais mecanismos de ligação entre obesidade e metabolismo perturbado, por exemplo, resistência à insulina e diabetes tipo II, para a patogênese da doença de pulmão crônica não só compreendem as consequências físicas e mecânicas de peso ganho na ventilação mas também induzi a um estado inflamatório subagudo crônica10,11. O aumento da obesidade e doenças do pulmão durante a última década, juntamente com a falta de estratégias preventivas eficazes e abordagens terapêuticas, destaca a necessidade de investigar os mecanismos moleculares para definir novas vias para gerenciar o pulmão obesidade doenças.
Aqui, descrevemos três testes padrão, que são princípios importantes para investigar a obesidade e o seu impacto na estrutura do pulmão e função em modelos do rato: glicose (1) intraperitoneal tolerância (ipGTT) (2) medição da resistência das vias aéreas (Res) e respiratória conformidade de sistema (Cdyn); e (3) preparação e fixação do pulmão para posterior avaliação histológica quantitativa. O ipGTT é um teste de rastreio robusto para a absorção de glicose medida e, portanto, o efeito da obesidade no metabolismo. A simplicidade do método permite boa padronização e, portanto, a comparabilidade dos resultados entre os laboratórios. Métodos mais sofisticados, tais como braçadeiras hiperglicêmicos ou estudos sobre ilhotas isoladas, podem ser usados para análise detalhada do fenótipo metabólico12. Aqui nós avaliar a tolerância à glicose para definir um estado de obesidade associada de desordem metabólica e sistêmica como base para estudos adicionais em um resultado pulmonar. Para avaliar o efeito da obesidade e doença metabólica na função pulmonar, medimos a resistência das vias aéreas (Res) e conformidade do sistema respiratório (Cdyn). Para caracterizar a doença pulmonar, desenfreados, bem como comedidos métodos para avaliação da função pulmonar estão disponíveis. Pletismografia desenfreada em movimentando-se livremente animais imita um estado natural, refletindo os padrões de respiração; em contraste, métodos invasivos, tais como a medição de impedância de entrada do Res e cDyn em ratos anestesiados profundamente para avaliar a mecânica pulmonar dinâmica, são mais precisos13. Desde que as condições respiratórias crônicas são refletidas por alterações histológicas do tecido pulmonar, fixação adequada do pulmão, para posterior análise é iminente. A escolha do método de preparação e fixação de tecidos varia de acordo com o compartimento do pulmão que será estudado, por exemplo, realização de vias aéreas ou de parênquima pulmonar14. Aqui, descrevemos um método que permite a avaliação qualitativa e quantitativa das vias aéreas conduzindo para estudar o efeito da obesidade sobre o desenvolvimento de asma.
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Protocol
Todos os procedimentos de animais foram conduzidos em conformidade com os protocolos aprovados por autoridades do governo local (Land NRW, AZ: 2012.A424) e estavam em conformidade com a lei alemã de bem-estar animal e os regulamentos sobre o bem-estar dos animais utilizados para experiências ou para outros fins científicos. Desde que a análise de função pulmonar pode afetar a estrutura do pulmão e portanto subsequentes analisa histológica, a medição de Res Cdyn e a preparação e fixação do pulmão por Histomorfometria deve ser executada em animais diferentes. No entanto, medição de Res e Cdyn ipGTT a seguir é possível. Desde que o stress durante o ipGTT poderia interferir com a anestesia necessária para a função pulmonar testa, um período de recuperação de aproximadamente 2 semanas depois de ipGTT é recomendado para permitir que os ratos para recuperar da perda de peso corporal e mudanças no sangue parâmetros12.
1. preparação para o teste de tolerância à glicose Intraperitoneal (ipGTT)
Nota: Após 12 h de jejum, o ipGTT completo leva aproximadamente 2 h.
- Desde que o stress influencia significativamente a glicemia, certifique-se de que ambos adaptação dos ratos, bem como a formação do cientista, são executadas.
- Transferi os animais para a área experimental em condições tranquilos e sem stress.
- Considere a aplicação de uma dieta hypercaloric para induzir obesidade em ratos. Consulte a seção de discussão para mais conselhos.
- Animais rápidos para 12 h durante a noite, sem limitar o acesso à água. No dia seguinte, após 12 h de jejum, preparar o medidor de glicose de sangue de acordo com o fabricante do protocolo (ver tabela de materiais), inserindo uma nova tira de teste na porta da tira de teste.
- Incise a ponta da cauda usando tesoura estéril, mantendo-se suavemente o mouse em sua cauda e imediatamente medir a glicemia de jejum, aplicando uma gota de sangue fluxo livre (mínimo de amostra tamanho 0,5 µ l) para a tira de teste do medidor de glicose no sangue.
Nota: Uma contagem regressiva começa na tela após a aplicação da amostra de sangue suficiente. Após 4 s, o resultado do teste aparece na tela. - Depois, pesar e etiquetar os animais individualmente usando cor de marcação.
- Administre 2G glicose/kg corpo peso através de injeção intraperitoneal. Certifique-se de que o volume de injeção é de 0,1 mL/10 g de massa corporal (1 cc de seringa e agulha 27G).
- Posteriormente, medir a glicose no sangue após 15, 30, 60 e 120 min, aplicando uma gota de sangue fluindo livremente sobre uma nova tira de teste.
Nota: O fluxo sanguíneo pode ser aumentado por massageando suave de cauda ponta-alas. Se a ferida de cauda incrustado, limpá-lo usando um cotonete estéril embebido em solução de cloreto de sódio 0,9%. - Permitir que os animais possam descansar em suas gaiolas em casa com acesso ilimitado a água entre as medições.
2. análise de função pulmonar a medida Res e cDyn
Nota: Para a medição não perturbada de Res e cDyn, ratos precisam ser ventilado sob anestesia profunda. Estresse animal manipulação e um acompanhamento adequado da anestesia são essenciais. Para obter instruções gerais usando técnicas estéreis, por favor, reveja o artigo por Hoogstraten-Miller et al . 15
- Calibrar a pletismografia antes de cada set de experimentos e preparar as configurações de estudo dentro do software (consulte a Tabela de materiais).
- Antes da cirurgia, profundamente anestesiar animais através de injeção intraperitoneal de xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (100 mg/kg de peso corporal) (1 cc de seringa e agulha 27G). Certifique-se de que o volume de injeção é de 0,1 mL/10g por peso corporal.
Nota: Desde que a ketamina tem um efeito analgésico adequado nos ratos, nenhum tratamento de dor adicional é necessário. O procedimento invasivo cateter traqueal/pletismografia leva aproximadamente 5-7 minutos, em seguida, pode começar a aquisição de dados. - Posicione o mouse na posição supina sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo.
- Cubra os olhos com pomada para evitar ressecamento sob anestesia.
- Monitore constantemente a profundidade da anestesia, usando a dedo pitada-resposta.
Nota: Administração adicional de anestésico pode ser necessária manter um plano cirúrgico da anestesia. - Umedece a pele da área cirúrgica na região da tireoide com etanol a 70%.
- Cuidadosamente, faça uma incisão da pele na linha média para cerca de 1 cm entre o entalhe na jugular do esterno e os symphyses do tubérculo do mentum levantá-la com a pinça e encaixando a pele por inspeção visual, usando a tesoura sem corte (figura 1A).
- Visualize o tecido adiposo subcutâneo subjacente e a glândula tireoide.
- Expor a traqueia, cuidadosamente sem corte separando ambos os lobos da tireoide no istmo e dissecação do esternotireoideo e músculos esternotireoideo (figura 1B). Tenha cuidado para não prejudicar qualquer vasos e causar sangramento, pois pode causar efeitos adversos sobre o sistema cardiovascular e, finalmente, nas medidas.
- Posteriormente, passe uma sutura cirúrgica trançada de 4-0 entre a traqueia e o esófago usando fórceps rombudo. Incise cuidadosamente a traqueia perto da laringe entre as cartilagens traqueais com micro tesouras.
- Entube com tubo traqueal (0,04 polegadas/1,02 mm de diâmetro) sob o controle visual (Figura 1). Fixe a tubo através da ligadura com a sutura cirúrgica para evitar qualquer vazamento no sistema.
- Em seguida, mover o animal para a cama aquecida da câmara corpo e ligar o tubo traqueal para a placa de cara (Figura 1) e ligue a ventilação, pressionando o botão de ventilação do painel frontal do controlador (Figura 1E).
- Levantamento da ventilação, observando o movimento do tórax simultaneamente com a taxa de ventilação. Para confirmar a correcta colocação do tubo traqueal, certifique-se de que ambos os lados do tórax se mover simultaneamente.
- Cuidado com a pressão de sinal na tela do computador (Figura 1F). Certifique-se de que as curvas de ventilação são uniformes. Se isso não for o caso, retire o animal e verificar o lado da cirurgia. Cuidado com sangue ou muco, bloqueando o tubo traqueal.
Nota: Para animais adultos com um peso de 20-25 g, as configurações do ventilador como mostrado na Figura 2 são sugeridas em conformidade com as recomendações do fabricante. - Para controlar as alterações na pressão trans-pulmonar durante a ventilação, inserir um tubo esofágico (0,04 polegadas/1,02 mm de diâmetro) para o esôfago na profundidade que se aproxima dos níveis dos pulmões. Assista a tela enquanto a colocação do tubo. Coloca o tubo onde a deflexão de pressão máxima e mínima coração artefatos podem ser vistos na tela.
- Após a cirurgia, prepare o animal para a medição. Reinjeção anestesia através de injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) 1 cc seringa e uma agulha de 27-G. Certifique-se de que o volume de injeção é de 0,1 mL/10g por peso corporal.
Nota: Para avaliar hyperreagibility brônquica, nebuliza metacolina, um agonista não-seletivo de receptores muscarínicos do sistema nervoso parassimpático, que induz broncoconstrição. Aquisição de dados é realizada em quatro fases distintas (Figura 3). - Inicie a aquisição de dados de acordo com o protocolo manufacturer´s.
Nota: O software automaticamente orienta os usuários através do processo de aquisição. - Aplicar 10 µ l de PBS (veículo) sobre o nebulizador e começar a nebulização após 5min de aclimatação. Em seguida, siga uma fase de resposta de 3 min, onde o Res (cmH2O/mL/s) e cDyn (mL/cmH2O) são medidos. No final, fornece uma fase de recuperação de 3 min para o animal antes da próxima nebulização.
- Siga o software de aplicação gradual de 10 µ l de concentrações crescentes de metacolina (2,5 µ g/10 µ l, 6,25 µ l µ g/10 e 12,5 µ g/10 µ l) sobre o ventilador.
- Uma vez que todas as medições foram realizadas e gravadas, sacrifica o animal por deslocamento cervical.
3. pulmão isolamento para análise histomorfométrica quantitativa de ratos adultos
- Profundamente anestesiar a animal através de injeção intraperitoneal de xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (100 mg/kg de peso corporal) (1 cc de seringa e agulha 27G). O volume de injeção deve ser 0,1 mL/10g por peso corporal.
Nota: Depois de atingir o estado de tolerância cirúrgica, a preparação leva cerca de 5 min, seguido por perfusão de órgão e 30 min para fixação. - Uma vez que o animal atingiu o estado de tolerância cirúrgico (pitada-resposta negativa do dedo do pé), desinfectar o animal com 70% de etanol e corrigir o animal em uma almofada com fita cirúrgica.
- Sacrifica o animal por punção cardíaca e hemorragia. Brevemente, abra o abdômen com uma incisão medial através da pele e o peritônio usando tesoura sem corte.
- Localize as enfermarias de cabeça do diafragma do fígado e cuidadosamente separar o fígado do diafragma.
- Faça uma pequena incisão no diafragma com uma tesoura sem corte, e punctate do ventrículo esquerdo do coração com uma agulha 20g anexado a uma seringa de 2 mL. Lentamente, extrair sangue do animal.
Nota: Sangramento lento e cuidadoso é importante para evitar que os ventrículos em colapso devido a pressão negativa, inibindo um fluxo sanguíneo sem ser perturbado. - Disse o pulmão, abrindo o tórax suavemente através de uma incisão paraesternal ao longo de todo o comprimento da caixa torácica com uma tesoura curva, sem corte.
- Depois, levante a caixa torácica para expor a cavidade pleural (Figura 3). Remova o timo para ver o coração e os pulmões.
Nota: Injeção opcional do ventrículo direito, seguido de perfusão do sistema vascular pulmonar com PBS gelado e, em seguida, com uma fixador solução [por exemplo, paraformaldeído 4% (massa/volume) (PFA)] é possível. Esteja ciente de que há um risco aumentado de ruptura de septos alveolares e afectar negativamente a estrutura pulmonar usando esse método. - Dissecar o pulmão pelo primeiro cuidadosamente removendo o coração.
- Posteriormente, passe uma sutura cirúrgica trançada de 4-0 entre a traqueia e o esófago usando fórceps rombudo.
- Em seguida, cuidadosamente faça uma incisão na traqueia perto da laringe entre as cartilagens traqueais, entubar com uma cânula intravenosa (26 G) e insufle o pulmão por fixação de pressão a uma pressão constante de 20 cm H2O usando agente fixador [por exemplo, 4% (em massa /volume) de PFA].
- Para fixação de PFA, deixe o fixador por 30 min à temperatura ambiente. Depois, ligam a traqueia e remover a cânula. Em seguida, impostos especiais de consumo do pulmão cuidadosamente sem prejudicar o tecido e armazená-lo em agente fixador a 4 ° C durante a noite.
Nota: Em alternativa, de acordo com o ATS/ETS consenso papel 2,5% GA em buffer OsO4, Uracil solução é usada para estabilização adequada do tecido. Para ainda mais preparação do tecido, consulte o documento de consenso por Hsia et al 14
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Representative Results
Resultados representativos de teste de tolerância à glicose intraperitoneal (ipGTT) (Figura 4), produtos de imagens de teste (Figura 5) e representante de função pulmonar ilustrando a hematoxilina e eosina manchado pulmões (Figura 6).
O ipGTT foi realizado em ratos obesos (azuis) depois de 7 semanas de alta--dieta rica em gordura (HFD). Padrão ratos alimentados com dieta servidos como controles (preto). Ratinhos obesos mostraram aumento de soro glicose níveis 15 e 30 min após a injeção intraperitoneal de glicose, indicando prejudicada a captação celular de glicose (Figura 4).
Para examinar o efeito da obesidade sobre a função pulmonar, análise de função pulmonar invasiva foi realizado em ratos obesos (azuis) depois de 7 semanas de alta--dieta rica em gordura (HFD). Ratinhos obesos apresentaram um aumento de até 1.5-fold de resistência das vias aéreas, em comparação com ratos controle (preto) (Figura 5).
Para visualizar o efeito de fixação de pressão durante a instilação intratraqueal de fixadores no parênquima pulmonar, imagens representativas de hematoxilina e eosina manchado seções de pulmão são mostradas (Figura 6). Muito pouca pressão leva a várias áreas de un-infladas, grossos septos alveolares e alvéolos em forma poligonais (A), enquanto os demais resultados de pressão em áreas de enfisema, como super infladas com septos alveolares destructed (C). Aplicação da pressão adequada durante a fixação de pulmão leva a um pulmão completamente inflado com alvéolos em forma redondos (B).
Figura 1: representação esquemática da função pulmonar invasiva. (A-C) Etapas de traqueotomia. (D) a conexão do animal para a placa de cara da pletismografia. (E) instalação de Hardware para função pulmonar invasiva. (F) Screenshot de aquisição de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: esquema de aquisição de dados para avaliar hyperreagibility brônquica. Aquisição de dados inclui um período de aclimatação inicial (5 min), seguido por 30 s de nebulização de substância, 3 min da fase de resposta e 3 min de nebulização prévia de recuperação fase de concentração da substância na próxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: representação esquemática das etapas de preparação. (A-D) Etapas de traqueotomia. (A) incisão da pele. (B) Situs da cavidade torácica. (C) visão após a remoção da caixa torácica. (D) visão após a remoção do coração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: teste de tolerância à glicose intraperitoneal representativa (ipGTT). Camundongos C57Bl/6N foram alimentados com uma dieta high-fat para 6-8 semanas; controle de ratos receberam uma dieta padrão. n = 3; Quer dizer SEM ±; análises estatísticas realizadas foram a duas vias teste ANOVA e Bonferroni depois do teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: teste de função pulmonar representante Camundongos C57Bl/6N foram alimentados com uma dieta high-fat para 6-8 semanas; controle de ratos receberam uma dieta padrão. n = 3; Quer dizer SEM ±; análises estatísticas realizadas foram a duas vias teste ANOVA e Bonferroni depois do teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: imagens representativas, ilustrando a hematoxilina & eosina manchado pulmões. Três classes diferentes de inflação intratraqueal: (A) pouca pressão, pressão adequada (B) e (C) pressão demais. UIA; área colapsada, OIA; sobre área inflada; Imagens foram tomadas com menos de 20 ampliação de X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Configurações de ventilador | Spalte1 |
| Max. volume de curso | 0,25 ml |
| Max. pressão de boca | O 30cmH2 |
| Inflação de profundidade máx. volume de | 0,5 ml |
| Inflação de profundidade máx. pressão | O 30cmH2 |
| Taxa de | respiração de 160 por minuto |
Tabela 1: configurações de ventilador para ratos adultos. Para pequenos animais, os parâmetros de ventilação precisam ser ajustado.
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Discussion
Este relatório fornece três protocolos para três diferentes métodos analisar o impacto da obesidade no metabolismo da glicose e resultados pulmonares. Primeiro, o teste de tolerância à glicose oferece a oportunidade de analisar a absorção de glicose intracelular e pode ser indicativo de resistência à insulina. Em segundo lugar, pletismografia de corpo inteiro é uma técnica para medir a função pulmonar e é assim útil para testar a eficácia de novos tratamentos. Em terceiro lugar, um protocolo padronizado de fixação é essencial para Análise morfométrica quantitativa avaliar o impacto da obesidade sobre as mudanças estruturais.
Obesidade induzida por dieta em pesquisas com animais
Importância no que diz respeito a métodos existentes e futuras aplicações: para imitar hábitos alimentares humanos, que resultam em obesidade, modelos de obesidade induzida por dieta (DIO) são amplamente utilizados em roedores. Em comparação com o uso de camundongos geneticamente modificados, imitando a doença metabólica, DIO modelos permitem análise da etiologia, patologia e opções de tratamento no futuro. Uma recente revisão por Heydemann et al., fornece uma visão geral dos modelos de dieta de alto teor de gordura diferentes murino em diabetes pesquisa16. Modificações específicas de componentes nutrientes fornecem a possibilidade de futuros estudos do impacto de micro-macronutrientes e sobre os mecanismos moleculares da obesidade e, assim, na função e estrutura do pulmão.
Modificações e solução de problemas: vários relatórios mostram que a obesidade pode ser induzida por diferentes mudanças na composição dos nutrientes dietéticos16, conhecimento que tem, por sua vez, levou ao desenvolvimento de uma variedade de dietas nos últimos anos, por exemplo, dietas ricas em gordura ou carboidratos de conteúdo ou uma combinação de ambas as dietas, que é a chamada dieta ocidental,16. No final, a escolha da dieta para um estudo depende da pergunta de pesquisa e os objetivos do estudo. Além de controlar por estes fatores importantes, a escolha de uma dieta de controle adequado é de extrema importância; caso contrário, a interpretação dos resultados será limitada. No entanto, o fenótipo não é causado apenas pelo tipo de dieta... mas é também um resultado do período de alimentação, sexo e rato Coe17.
Limitações da técnica: ao lado da composição de vários nutrientes da dieta, a resposta do animal e da estirpe de fundo pode contribuir para os resultados e o fenótipo observado por indução da obesidade. Por exemplo, tem sido demonstrado, que camundongos BALB/C são mais suscetíveis a esteatose hepática em comparação com o de camundongos C57Bl/618. Pequenas variações genéticas, por exemplo, devido à deriva genética (C57Bl/6J contra C57Bl/6N), também podem afetar a susceptibilidade a obesidade19. Isto destaca as limitações da técnica trabalhando com ratos geneticamente modificados com cepas de fundo genético diferente, uma vez que nem a tensão e o vendedor do qual foram obtidos os ratos podem influenciar os resultados.
Passos críticos dentro do protocolo: para obter resultados fiáveis, reprodutíveis e comparáveis entre o experimental e grupos de controle, de preferência littermates devem ser usados para gerar o controle e experimentais ratos, fatores ambientais e stress devem ser evitada, e ratos do controle devem ser estudados em paralelo com ratos experimentais12.
Testes de tolerância de glicose intraperitoneal (ipGTT)
Importância no que diz respeito a métodos existentes e futuras aplicações: para determinar o efeito do DIO no metabolismo murino, existem testes de rastreio diferente. O consórcio de Mouse metabólica fenotipagem Center (MMPC) foi criado para propor métodos padrão para a avaliação metabólicos fenótipos em ratos e publicou de procedimentos operacionais padrão para a descrição e realizando testes metabólicos de glicose homeostase em ratos12. Um GTT é uma abordagem global para medir o quanto as células do corpo são capazes de glicose absorção após ingerir uma determinada quantidade de açúcar, que por sua vez, é indicativo de secreção de insulina e o efeito da insulina. Diferenças nos níveis de insulina soro frequentemente responsáveis por tolerância à glicose alterada. Portanto, o GTT tornou-se um dos testes fisiológicos mais amplamente utilizados para caracterizar modelos de rato de diabetes e obesidade. Desde que o ipGTT é uma abordagem rápida e fácil, ele pode ser usado em estudos futuros como um método padronizado para analisar o efeito da dieta e/ou tratamento sobre o metabolismo.
Modificações e solução de problemas: O GTT é realizada de rotina após um jejum durante a noite para equalizar os níveis de glicose em ratos20. Desde que a duração do período de jejum tem fortes efeitos sobre os parâmetros investigados e é, portanto, de grande importância para a comparação e interpretação dos resultados, o período de jejum deve ser adaptada à idade e peso dos ratos de corpo. Levando em consideração que os ratos são animais noturnos, e dois terços da alimentação diária total é consumido durante a noite, a noite jejum provoca um estado catabólico. Assim, o ponto de tempo de início e a duração do jejum tem um impacto altamente relevante sobre os resultados, e assim esses parâmetros devem ser padronizadas12. Além disso, o jejum prolongado esgota Glicogênio hepático e, portanto, reduz a variabilidade da glicemia de linha de base. Em conclusão, desde que a utilização da glicose estimulada por insulina em ratos é reforçada após o prolongado jejum períodos21, um 5 a 6 horas de duração do jejum é recomendada para avaliar a ação da insulina; Considerando que, durante a noite de jejum é suficiente para testar glicose utilização12,20,22. Glicose é normalmente administrado através de injeção i.p. e a dose de glicose é ajustada para o corpo de peso (geralmente 1 ou 2 g/kg de peso de corpo)20,22. Em modelos DIO, peso do corpo é aumentado, principalmente devido a uma maior massa gorda; absorção de glicose, no entanto, ocorre predominantemente no músculo, cérebro e fígado. Desde que a quantidade desses tecidos geralmente não é alterada por DIO, ratos obesos recebem uma quantidade desproporcionalmente elevada de glicose, em comparação com ratos magros, que por sua vez podem afetar a interpretação dos dados e levar a uma intolerância de glicose diagnosticada22 . Por esta razão, os períodos de jejum precisam ser padronizado e composição corporal deve ser considerado durante a interpretação de resultados GTT23. Portanto, o computador tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética imaging(MRI) scans são aplicáveis. Por exemplo, medições de glicose por monitores portáteis glicose de sangue total (ver Tabela de materiais) estão disponíveis, e estes monitores são mais comumente usados que analisadores de glicose do plasma. Devido o sangue de pequeno volumes necessários - normalmente 5 µ l ou menos - eles são mais práticos do que analisadores de plasma.
Limitações da técnica: ratos jejuados apresentam dependência na duração do jejum e mostram uma perda significativa de peso corporal, temperatura corporal, volume de sangue e frequência cardíaca, bem como alterações nos parâmetros do soro, tais como os níveis de ácidos graxos livres e corpos cetônicos 24. este estresse metabólico é desencadeado pelo fato de que a temperatura da carcaça de ratos em instalações animais é padronizada para cerca de 23 ° C e, portanto, abaixo da temperatura de 30 ° C25seu thermo-neutro. Jejum prolongado em temperaturas subthermo neutro pode resultar em torpor, caracterizada por uma diminuição da taxa metabólica26,27.
Passos críticos dentro do protocolo: como mencionado acima, para obter resultados confiáveis entre o experimental e grupos de controle, littermates preferencialmente devem ser utilizados durante os períodos de jejum e estudo, e pontos de tempo precisam ser padronizado.
Análise de função pulmonar
Neste protocolo, a pletismografia diretamente mede mudanças de pressão que estão dirigindo a respiração e a resultante flui dentro e fora das vias aéreas. Os fluxos são medidos por uma carragenana localizada na parede da pletismografia. Para excluir resistência da parede torácica, medem-se as vias aéreas abertura pressão (boca) e a pressão transpulmonar (tubo esofágico) e resistência das vias aéreas e conformidade dinâmica são calculados. Conformidade dinâmica é calculado através da diferença do volume mínimo e máximo de pulmão dividida pelo fluxo de.
Importância no que diz respeito a métodos existentes e futura aplicações: pletismografia é o procedimento padrão para analisar as propriedades mecânicas do pulmão e pode, portanto, ser usado em futuros estudos para analisar as opções de tratamento e patologia do pulmão. Para comparar grupos e estudos, é indispensável uma abordagem padronizada.
Modificações e solução de problemas: em geral, esta técnica pode ser classificada como a pletismografia de corpo inteiro desenfreada e contida. Desenfreado métodos determinar pausa reforçada (Penh) e habilitar a análise de padrões de respiração normal, enquanto métodos invasivos, comedidos diretamente medem pressão, fluxo ou volume. Propriedades mecânicas do pulmão são determinadas pela resistência e elastância; enquanto a resistência é calculada como a relação entre a pressão ao fluxo, elastância reflete a relação entre a pressão e o volume28. Em contraste, desenfreada pletismografia de corpo inteiro é só medir a pressão no interior a pletismografia, e, portanto, um cálculo de resistência e elastância é impossível. Em 2007, Lundblad et al afirmaram que Penh não é o parâmetro certo para medir a resistência das vias aéreas, mas representa uma reflexão inespecífica do padrão de respiração29. Assim, para adequada avaliação da mecânica pulmonar, pletismografia invasiva é indispensável29,30,31.
Desde que os parâmetros da respiração dependem da idade e tamanho de ratos, parâmetros de ventilação precisam ser ajustado. Por exemplo, o volume corrente está relacionado com o peso corporal e deve ser definido como 10 µ l/g de massa corporal com uma frequência de respiração de 120-250 respirações por minuto. Quando ajustar esses parâmetros, o investigador deve ter em conta que o volume corrente médio é inversamente relacionado com a frequência respiratória de32. Desde que a respiração espontânea influencia a pressão, fluxo e volume, a profundidade da anestesia deve ser monitorado e curvas de ventilação devem ser observadas constantemente. No entanto, anestesia em si pode diretamente afetar a função pulmonar. Por exemplo, Propofol e cetamina em parte protegem contra constrição das vias respiratórias induzidas em comparação com tiopental33. Além disso, estudos clínicos têm mostrado que a ketamina tem um efeito anticolinérgico e pode ser usada como um potencial broncodilatador na asma grave34. Anestésicos inalatórios, como o isoflurano em conjunto com o tratamento da dor, são considerados como uma alternativa controlável para anestesia de injeção; no entanto, irritação das vias aéreas após anestésicos voláteis é relatada e exclui, portanto, anestésicos de inalação como uma alternativa35.
Limitações da técnica: O comedido método invasivo para medir propriedades mecânicas do pulmão é devido a traqueotomia necessária, um procedimento final e, assim, limita o estudo para uma análise de ponto único, sem a opção para investigar a doença progressão. Para reduzir o nível de invasividade, medição da impedância de transferência em animais conscientes pode ser executada, que desse modo permite estudos longitudinais. No entanto, quando se mede a mecânica respiratória em animais não-tracheotomized, a resistência do nariz contribui para a resistência respiratória total e desse modo complica medições após Broncoprovocação com provocação13.
Passos críticos dentro do protocolo: aqui nós demonstrar apenas um método de função pulmonar invasiva. Uma vez que existem vários métodos de função pulmonar invasiva estabelecida, padronização dentro dos estudos e uma descrição detalhada do método usado, grupos, e um regime anestésico em publicações é necessário comparar os estudos.
Excisão de pulmão para análise histomorfométrica
Importância no que diz respeito a métodos existentes e futuras aplicações: Análise Histomorfométrica quantitativa pode ser usado para investigar o impacto da obesidade na estrutura pulmonar (brônquios e alvéolos), para interpretar os resultados obtidos por invasiva a pletismografia e estudar as opções de tratamento possíveis resultados pulmonar. Dados da avaliação histológica podem diferir dependendo de agentes fixador e o procedimento de fixação utilizado. Uma vez que tem sido demonstrado que a obesidade tem um efeito na estrutura alveolar e brônquico, como bem como extracelular composição celular e matriz, é necessário determinar uma técnica apropriada, baseada sobre a questão de pesquisa em estudos futuros. Para morfometria quantitativa imparcial, tecido processamento após fixação deve ser realizado de acordo com as normas da American Thoracic Society (ATS) / sociedade respiratória Europeia (ERS) para avaliação quantitativa do pulmão estrutura14 .
Modificações e solução de problemas: em 2010 Hsia et al . apresentaram uma declaração oficial ao estabelecimento de normas ATS/ERS para avaliação quantitativa da estrutura pulmonar, que deve ser tida em consideração antes de isolamento de pulmão e fixação 14. ao lado de intratraqueal instilação de fixadores, em situ fixação, fixação de volume fixo ou inflação de vácuo pode ser realizada para inflar o tecido pulmonar36. Inflação, e assim, o alargamento do espaço aéreo, é dependente de procedimentos de fixação e o grau de pressão aplicada durante a fixação. Alta pressão, por exemplo, pode levar a ruptura da parede alveolar e, assim, influenciar os resultados. Semelhante para os parâmetros de ventilação, os parâmetros de fixação ideal dependem da idade, tamanho e fenótipo dos ratos. Fixação pode ser alcançada por meios químicos ou físicos, incluindo agentes químicos e/ou criopreservação. Instilação intratraqueal de fixador apropriado imita a inflação de tecido durante a respiração, refletindo as condições na vivo e, portanto, é amplamente utilizado,37. 20-25 cm acima do ponto mais alto do pulmão é recomendado para uma pressão suficiente, usando um tubo largo e curto para permitir a penetração rápida e uniforme14. Dos principais objectivos da fixação é para impedir que o processo de degeneração e preservar as células e tecidos em um estado de"life-like", preservando a integridade arquitetônica do parênquima pulmonar. Além disso, o tecido deve reter sua reatividade de anticorpos, manchas e sondas de ácidos nucleicos. Além do efeito de autólise normal, os efeitos adversos de tecido de processamento, incluindo infiltração com cera quente, fatiar e desparafinagem, tem que ser evitada. A escolha do fixador bem como a transformação do tecido, por exemplo, através de incorporação, pode causar encolhimento de tecido, inchaço e endurecimento dos vários componentes e levar a artefatos, tais como aumento de autofluorescência38. Por exemplo, a fixação em 10% tamponada de formalina e processamento adicional pode causar encolhimento de até 20% - 30% em relação ao volume inicial39. Portanto, Hsia et al , em seu documento de consenso 2010 de recomendar o ATS/ERS o uso de 2,5% glutaraldeído tamponado com tetróxido de ósmio e acetato de uranilo, para evitar o encolhimento do tecido. Volume pulmonar, arquitetura interna, estrutura fina de tecido e célula estrutura foi preservada após a instilação de vias aéreas deste reagente fixador14. Desnaturação de proteínas e ligações cruzadas de formação são dois mecanismos principais que são importantes na fixação do tecido. Compostos de desidratação ou coagulantes, tais como álcool ou acetona, causam desnaturação das proteínas, resultando em alterações da estrutura terciária da proteína por desestabilizar as ligações hidrofóbicas. Agentes de fixação non-coagulante como paraformaldeído ou glutaraldeído reagem quimicamente com proteínas e forma molecular inter e intra molecular ligações cruzadas. Desde vários coloração procedimentos, tais como a hematoxilina e eosina coloração, dependem de interações inter moleculares, manchar os resultados pode ser pobre, dependendo do agente fixador. Métodos de recuperação do antígeno em imuno-histoquímica mostraram que algumas das reações de fixação são reversíveis, particularmente aqueles de formaldeído40.
Limitações da técnica: desde que o revestimento de superfície alveolar é removido por instilação intratraqueal de fixadores, a interpretação de, por exemplo, alveolar microarquitetura, acúmulo de muco, ou migração de células inflamatórias pode ser manipulada 41 , 42 , 43.
Passos críticos dentro do protocolo: aqui nós mostramos a instilação intratraqueal de 4% PFA como uma abordagem ampla para visualizar o efeito da obesidade sobre os resultados pulmonares. Como mencionado acima, o protocolo deve ser modificado dependendo da questão de investigação, de acordo com as recomendações de ATS/ERS14.
Além dos parâmetros mencionados anteriormente, o estresse é um fator importante que influenciam os resultados da investigação. Portanto, treinamento ambos os ratos e o cientista é indispensável. Os ratos devem ser adaptados à restrição e devem ser transferidos para a área experimental sob condições tranquilas44. Estresse influencia o metabolismo, por exemplo, em consequência da liberação de hormônio do estresse, aumentam os níveis de glicose liberada, um efeito que pode ser interpretado como prejudicada a tolerância à glicose. Liberação de hormônio do estresse também altera a susceptibilidade às drogas anestésicas, especificamente, a dose de anestésicos é aumentada e o tempo para chegar a tolerância cirúrgica é prolongado. Como mencionado, a maior quantidade de anestésicos pode influenciar a broncoconstrição, enquanto o estresse em si pode causar dilatação dos brônquios.
Em resumo, este artigo fornece três métodos para avaliar o impacto da obesidade e metabolismo na estrutura pulmonar e função em camundongos. Tudo mencionado métodos podem ser transferidos para outros modelos de doenças e espécies de roedores, como obesidade, devido as modificações genéticas ou modelos do rato. A aplicação destas técnicas pode ser útil para definir novos mecanismos moleculares em modelos DIO com ablação do gene específico, ou para testar novas abordagens terapêuticas para tratar/prevenir os efeitos adversos da obesidade, doenças pulmonares crônicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os experimentos foram apoiados pelo Marga e Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Alemanha; Projeto 210-02-16 (maaaas), projeto 210-03-15 (maaaas) e pela Fundação de pesquisa alemã (DFG; AL1632-02; MAAAAS), Bonn, Alemanha; Centro de Medicina Molecular Colónia (CMMC; Hospital da Universidade de Colónia; Programa de avanço de carreira; MAAAAS,) Fortuna Köln (Faculdade de medicina, Universidade de Colónia; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
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