Summary
Förekomsten av fetma ökar och ökar risken för kroniska lungsjukdomar. För att fastställa bakomliggande mekanismer och förebyggande strategier, väldefinierade djur modeller behövs. Här, tillhandahåller vi tre metoder (glukos-tolerans-test kropp pletysmografi och lung fixering) att studera effekten av fetma på pulmonell utfall hos möss.
Abstract
Fetma och andningsbesvär är stora hälsoproblem. Fetma blir en framväxande epidemi med ett förväntat antal över 1 miljard överviktiga individer i världen 2030, som alltså representerar en växande socioekonomisk börda. Samtidigt, är andra fetmarelaterade sjukdomar, inklusive diabetes samt hjärta och kroniska lungsjukdomar, kontinuerligt på uppgång. Trots att fetma har associerats med ökad risk för astmaexacerbationer, är försämring av luftvägssymptom och dålig kontroll, den funktionella rollen för fetma och perturbed metabolism i patogenesen av kronisk lungsjukdom ofta underskattat, och molekylära mekanismer bakom förbli svårfångade. Denna artikel syftar till att presentera metoder för att bedöma effekten av fetma på ämnesomsättning, samt lung struktur och funktion. Här, vi beskriver tre tekniker för möss studier: (1) bedömning av intraperitoneal glukostolerans (ipGTT) att analysera effekten av fetma på glukosmetabolismen; (2) mätning av luftvägsmotståndet (Res) och andningsorganen efterlevnaden (Cdyn) för att analysera effekten av fetma på lungfunktionen; och (3) förberedelse och fixering av lungan för efterföljande kvantitativa histologisk utvärdering. Fetmarelaterade lungsjukdomar är troligen multifaktoriell, som härrör från systemiska inflammatoriska och metabola dysreglering som potentiellt negativt påverkar lungfunktionen och svar på behandling. En standardiserad metod att studera molekylära mekanismer och effekten av nya behandlingar är därför viktig.
Introduction
Enligt den Världshälsoorganisationen (WHO) i 2008, var mer än 1,4 miljarder vuxna, över 20 år, överviktiga med ett body mass index (BMI) större än eller lika med 25. vidare över 200 miljoner män och nästan 300 miljoner kvinnor var överviktiga (BMI≥30)1. Fetma och metabolt syndrom är stora riskfaktorer för en mängd sjukdomar. Samtidigt fetma och samtidig ökad vit fettvävnad massa har varit intimt knuten för att typ 2 diabetes2,3, hjärt-kärlsjukdomar inklusive kranskärlssjukdom (CHD), hjärtsvikt (HF), förmaksflimmer4 och artros5, förblir deras funktionella roller i patogenesen av andningsbesvär dåligt förstådd. Epidemiologiska studier har dock visat att fetma är starkt förknippad med kronisk respiratorisk villkor, inklusive ansträngningsutlöst dyspné, obstruktiv sömnapné syndrom (OSAS), obesitas hypoventilationssyndrom (OHS), kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), lungemboli, aspirationspneumoni och bronkial astma6,7,8,9. Potentiella mekanismer länka fetma och perturbed metabolism, t.ex., insulinresistens och diabetes typ II, till patogenesen av kronisk lungsjukdom inte bara omfattar mekaniska och fysiska konsekvenser av vikt vinst på ventilation men också inducera en kronisk subakuta inflammatoriska tillståndet10,11. Ökningen av fetma och lungsjukdomar under det senaste decenniet, tillsammans med bristen på effektiva strategier för förebyggande och terapeutiska metoder, belyser behovet av att undersöka de molekylära mekanismerna för att definiera nya vägar för att hantera fetma lung sjukdomar.
Här, vi beskriver tre standard tester, som är de viktigaste grunderna att undersöka fetma och dess inverkan på lung struktur och funktion i musmodeller: (1) intraperitoneal glukos tolerans (ipGTT) (2) mätning av luftvägsmotståndet (Res) och respiratorisk systemet efterlevnad (Cdyn); och (3) förberedelse och fixering av lungan för efterföljande kvantitativa histologisk utvärdering. IpGTT är en robust screeningtest till åtgärd glukosupptag, och därmed effekten av fetma på ämnesomsättningen. Enkelheten i metoden tillåter bra standardisering och därför jämförbarheten av resultat mellan laboratorier. Mer sofistikerade metoder, såsom hyperglykemiska klämmor eller studier på isolerade öar, kan användas för detaljerad analys av de metabola fenotyp12. Här bedömer vi glukostolerans för att definiera en fetma-associerade tillstånd av systemisk och metabola störning som grund för fortsatta studier på en pulmonell resultatet. För att bedöma effekten av fetma och ämnesomsättningssjukdom på lungfunktion, mätte vi luftvägsmotståndet (Res) och andningsorganen efterlevnaden (Cdyn). För att karakterisera lungsjukdom, finns ohämmat samt återhållen metoder för bedömning av lungfunktion. Ohämmad pletysmografi i fritt rörliga djur härmar ett naturligt tillstånd, vilket återspeglar andningsmönster; invasiva metoder, såsom Ingångsimpedans mätning av Res och cDyn i djupt sövda möss att bedöma dynamisk lung mekanik, är det däremot mer exakt13. Eftersom kroniska luftvägsbesvär reflekteras av histologiska förändringar av lungvävnaden, är rätt lung fixering för vidare analys överhängande. Valet av metoden vävnad fixering och förberedelser beror på fack i lungan som ska studeras, till exempel genomföra luftvägarna eller lungorna parenkymet14. Här beskriver vi en metod som möjliggör kvalitativ och kvantitativ bedömning av ledande luftvägarna att studera effekten av fetma på astma utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden genomfördes i enlighet med protokoll som godkänts av lokala myndigheter (mark NRW, AZ: 2012.A424), och var enligt den tyska djurskydd lag och bestämmelserna om välbefinnande av djur som används för experiment eller för andra vetenskapliga ändamål. Eftersom lung funktionen analys kan påverka lung struktur och därför efterföljande histologiska analyserar, bör mätning av Res och Cdyn och förberedelser och fixering av lungan för histomorphometry utföras i olika djur. Det går dock mätning av Res och Cdyn efter ipGTT. Eftersom stress under ipGTT kunde störa den anestesi behövs för lungfunktionen tester, en återhämtningsperiod cirka 2 veckor efter ipGTT rekommenderas att tillåta möss att återhämta sig från viktminskning och förändringar i blod parametrar12.
1. förberedelse för Intraperitoneal glukostoleranstest (ipGTT)
Obs: Efter 12 timmars fasta, den kompletta ipGTT tar ca 2 h.
- Eftersom stress påverkar blodsockret avsevärt, se till att båda anpassning av möss, samt utbildning av forskare, utförs.
- Överföra djuren till området experimentell lugn och stressfri villkor.
- Beakta tillämpningen av en hypercaloric kost att inducera fetma hos möss. Se diskussionsavsnittet för ytterligare råd.
- Snabb djur för 12 h över natten, utan att begränsa tillgång till vatten. Nästa dag,'s efter 12 h fasta, förbereda blodsockermätaren enligt tillverkaren protokoll (se tabell material) genom att infoga en ny testremsa i test strip porten.
- Incisionsfilm svans spetsen med steril sax, bibehållen försiktigt musen på sin svans, och omedelbart mäta fastande blodsockret genom att tillämpa en lättflytande blod droppe (minsta prov storlek 0,5 µL) provbanespåret blodsockermätaren.
Obs: En timer startar på skärmen efter tillräcklig tillämpningen av blodprovet. Efter 4 s, testresultatet visas på skärmen. - Efteråt, väga och märka djuren individuellt med färg märkning.
- Administrera 2 g glukos/kg kropp vikt via intraperitoneal injektion. Se till att injektionsvolymen 0,1 mL/10 g kroppsvikt (27 G nål och 1 cc spruta).
- Därefter mäta blodsockret efter 15, 30, 60 och 120 min genom att applicera en droppe lättflytande blod på en ny testremsa.
Anmärkning: Blodflödet kan ökas genom att skonsamt massera av tail tip-wards. Om svansen såret encrusts, ren den med en steril kompress indränkt med 0,9% natriumkloridlösning. - Att djuren vila i sina hem burar med obegränsad tillgång till vatten mellan mätningarna.
2. lung funktionen analys åtgärd Res och cDyn
Obs: För ostörd mätning av Res och cDyn, möss behöver ventileras under djup anestesi. Stressfri djurhantering och korrekt övervakning av anestesi är avgörande. Allmänna anvisningar med steril teknik, Läs artikeln genom Hoogstraten-Miller et al. 15
- Kalibrera plethysmograph före varje uppsättning experiment och förbereda studien inställningarna i mjukvaran (se Tabell för material).
- Före operation, djupt söva djur via intraperitoneal injektion av xylazin (10 mg/kg kroppsvikt) och ketamin (100 mg/kg kroppsvikt) (27 G nål och 1 cc spruta). Se till att injektionsvolymen 0,1 mL/10 g per kroppsvikt.
Obs: Eftersom ketamin har en ordentlig analgetiska effekten hos möss, ytterligare krävs ingen smärtbehandling. Invasiva luftrör kateter/plethysmograph proceduren tar ca 5-7 minuter, sedan datainsamling kan börja. - Placera musen i ryggläge på en värmedyna att upprätthålla kroppstemperaturen.
- Täck ögonen med salva för att förhindra torrhet under narkos.
- Ständigt övervaka djup anestesi med tå nypa-svaret.
Obs: Ytterligare administrering av bedövningsmedel kan vara nödvändigt att upprätthålla ett kirurgiskt plan av anestesi. - Fukta pälsen av det kirurgiska området i regionen sköldkörteln med 70% etanol.
- Noggrant incisionsfilm huden i mittlinjen för cirka 1 cm mellan jugular skåran på bröstbenet och de knölen symphyses av mentum genom att lyfta den med pincett och klippning huden under okulärbesiktning med trubbig sax (figur 1A).
- Visualisera de underliggande subkutan fettvävnad och sköldkörteln.
- Exponera luftstrupen genom att noggrant trubbiga separera både sköldkörtel lober vid näset och dissektion av sternothyroid och sternothyroid muskler (figur 1B). Var noga med att inte skada några fartyg och orsaka blödning, eftersom detta kan orsaka negativa effekter på hjärt-kärlsystemet och i slutändan på mätningarna.
- Därefter passera en 4-0 flätad kirurgiska suturen mellan luftstrupen och matstrupen med trubbig pincett. Noggrant incisionsfilm luftstrupen nära struphuvudet mellan de luftrör brosken med micro sax.
- Intubation med en trakeal röret (0,04 tum/1,02 mm diameter) under visuell kontroll (figur 1 c). Fixa den tube via ligering med kirurgisk suturen att undvika eventuella läckor i systemet.
- Nästa, flytta djuret till uppvärmd sängen av kroppen kammaren och ansluta trakeal röret till frontplatta (figur 1 d) och slå på ventilationen genom att trycka på knappen ventilation på framsidan av registeransvarige (figur 1E).
- Undersökning ventilationen genom att observera thorax rörelsen samtidigt med ventilation. För att bekräfta korrekt placering av trakeal röret, se till att båda sidor av bröstkorgen flytta samtidigt.
- Titta på trycket signal på datorskärmen (figur 1F). Se till att ventilation kurvorna är enhetliga. Om detta inte är fallet, djuret och kontrollera den kirurgi-sidan. Akta dig för blod eller slem blockerar trakeal röret.
Obs: För vuxna djur med en kroppsvikt på 20-25 g föreslås ventilatorns inställningar som visas i figur 2 i enlighet med tillverkarens rekommendationer. - För att kontrollera förändringar i trans-pulmonell trycket under ventilation, infoga en esofagus tube (0,04 tum/1,02 mm diameter) i matstrupen på djupet som approximerar nivåerna av lungorna. Titta på skärmen medan placera röret. Placera röret där maximal press deformationen och minimal hjärtat artefakter kan ses på skärmen.
- Efter operation, förbereda djuret för mätning. Återfå anestesi via intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg/kg kroppsvikt) med en 27-G nål och 1 cc spruta. Se till att injektionsvolymen 0,1 mL/10 g per kroppsvikt.
Obs: För att bedöma bronkial hyperreagibility, finfördela metakolin, en icke-selektiv muskarin receptoragonist av parasympatiska nervsystemet, som inducerar bronkokonstriktion. Datainsamling sker i fyra olika faser (figur 3). - Starta dataförvärv enligt tillverkarens protokollet.
Obs: Programvaran automatiskt vägleder användarna genom förvärvsprocessen. - Tillsätt 10 µL av PBS (fordon) på nebulisatorn och starta nebulisering efter 5 min av acklimatisering. Därefter följ en svar fas 3 min, där Res (cmH2O/mL/s) och cDyn (mL/cmH2O) mäts. På slutet, ge en återhämtningsfas 3 min till djuret före den nästa nebuliseringen.
- Följ programvaran genom stegvis tillämpning av 10 µL ökande koncentrationer av metakolin (2,5 µg/10 µL, 6,25 µg/10 µL och 12,5 µg/10 µL) på ventilatorn.
- När alla mätningar har utförts och registrerats, offra djur av cervikal dislokation.
3. lung isolering för kvantitativa Histomorfometriska analyser av vuxna möss
- Djupt söva djur via intraperitoneal injektion av xylazin (10 mg/kg kroppsvikt) och ketamin (100 mg/kg kroppsvikt) (27 G nål och 1 cc spruta). Injektionsvolymen bör 0,1 mL/10 g per kroppsvikt.
Obs: Efter att ha nått delstaten kirurgiska tolerans, förberedelsen tar cirka 5 minuter följt av orgel perfusion och 30 min för fixering. - När djuret har uppnått tillståndet av kirurgiska tolerans (negativ toe nypa-svar), desinficera djuret med 70% etanol och fixa djuret på en pad med kirurgisk tejp.
- Offra djur av hjärt punktering och blödning. Kort, öppna buken med en medial snitt genom huden och bukhinnan med trubbig sax.
- Leta upp membranen huvud wards i levern och försiktigt separera levern från membranet.
- Gör ett litet snitt i membranen med trubbig sax och punktuell vänster kammare i hjärtat med en 20 G nål bifogas med en 2 mL spruta. Långsamt exsanguinate djuret.
Obs: Långsam och försiktig exsanguination är viktigt att förhindra ventriklarna kollapsar på grund av det negativa trycket, att hämma en ostörd blodflödet. - Dissekera lungan genom att öppna bröstkorgen försiktigt genom ett parasternal snitt längs hela längden av bröstkorgen med böjda, trubbiga sax.
- Efteråt, lyft bröstkorgen för att exponera den pleural håligheten (figur 3 c). Ta bort tymus för att se hjärta och lungor.
Obs: Valfria injektion av höger kammare, följt av perfusionen i lungorna kärlsystemet med iskall PBS och sedan med en fixativ lösning [e.g., 4% (massa/volym) PARAFORMALDEHYD (PFA)] är möjligt. Tänk på att det finns en ökad risk att brista alveolära septae och negativt påverka lung struktur med hjälp av denna metod. - Dissekera lungan genom att först noggrant ta bort hjärtat.
- Därefter passera en 4-0 flätad kirurgiska suturen mellan luftstrupen och matstrupen med trubbig pincett.
- Nästa, noggrant incisionsfilm luftstrupen nära struphuvudet mellan luftrör brosken, intubation med en intravenös kanyl (26 G) och blåsa upp lungan av trycket fixering vid ett konstant tryck på 20 cm H2O använda fixativ agent [e.g., 4% (massa /Volume) av PFA].
- För PFA fixering, låt fixeringsvätskan i 30 min i rumstemperatur. Efteråt, ligera luftstrupen och ta bort kanylen. Sedan punktskatt lungan försiktigt utan att skada vävnaden, och lagra den i fixativ agent vid 4 ° C över natten.
Obs: Alternativt enligt ATS/ETS samförstånd papper 2,5% GA buffrade OsO4, Uracil lösning används för korrekt vävnad stabilisering. För ytterligare vävnad förberedelse, se samförstånd uppsatsen av Hsia o.a. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat av intraperitoneal glukostoleranstest (ipGTT) (figur 4), lung funktion test (figur 5), och representativa bilder som illustrerar hematoxylin och eosin målat lungorna (figur 6).
IpGTT utfördes i feta möss (blå) efter 7 veckors hög-fett-kost (HFD). Vanliga kost-matade möss fungerade som kontroller (svart). Feta möss visade förhöjt glukos nivåer 15 och 30 min efter intraperitoneal glukos för injektion, vilket indikerar nedsatt cellulär glukosupptag (figur 4).
För att undersöka effekten av fetma på lungfunktion, utfördes invasiva lung funktionen analys i feta möss (blå) efter 7 veckors hög-fett-kost (HFD). Feta möss visade en upp till 1,5 ökning av luftvägsmotståndet jämfört med kontroll möss (svart) (figur 5).
För att visualisera effekten av trycket fixering vid intratrakeal instillation av fixativ på lungparenkym, visas representativa bilder av hematoxylin och eosin målat lung avsnitten (figur 6). För lite tryck leder till flera un-uppblåsta områden, tjocka alveolära septae och polygona formade alveolerna (A), medan för mycket tryck leder till alltför uppblåsta emfysem-liknande områden med förstörs alveolära septae (C). Tillämpningen av det lämpliga trycket under lungan fixation leder till en helt uppblåsta lungan med runda formade alveolerna (B).
Figur 1: Schematisk bild av invasiva lungfunktionen. (A-C) Steg om trakeotomi. (D) anslutning av djuret att nätverkskortets frontplatta i plethysmograph. (E) Hardware setup för invasiv lungfunktion. (F) skärmdump av datainsamling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: system för datainsamling för att bedöma bronkial hyperreagibility. Datainsamling inkluderar en inledande acklimatisering period (5 min), följt av 30 s substansen nebulisering, 3 min svar fas och 3 min av återhämtning fas tidigare nebulisering av nästa ämne koncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk framställning av förberedelser. (A-D) Steg om trakeotomi. (A) snitt i huden. (B) Situs av brösthålan. (C) Visa efter avlägsnande av bröstkorgen. (D) se efter avlägsnande av hjärtat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa intraperitoneal glukostoleranstest (ipGTT). C57BL/6N möss matades en fettrik diet för 6-8 veckor; kontroll möss fick en vanlig kost. n = 3; Menar ± SEM; statistiska analyser utförda var tvåvägs ANOVA-test och Bonferroni posttest. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa lung funktion test. C57BL/6N möss matades en fettrik diet för 6-8 veckor; kontroll möss fick vanlig kost. n = 3; Menar ± SEM; statistiska analyser utförda var tvåvägs ANOVA-test och Bonferroni posttest. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativa bilder som illustrerar hematoxylin och eosin målat lungorna. Tre olika kvaliteter av intratrakeal inflationen: (A) för lite tryck, (B) lämpligt tryck och (C) för mycket tryck. UIA; kollapsade område, OIA; över uppblåsta område; Bilderna togs under 20 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Ventilatorns inställningar | Spalte1 |
| Max. Slagvolym | 0,25 ml |
| Max. munnen trycket | 30cmH2O |
| Djupa inflationen max. volym | 0,5 ml |
| Djupa inflationen max. Tryck | 30cmH2O |
| Ränta | 160 andetag per minut |
Tabell 1: ventilatorns inställningar för vuxna möss. För mindre djur behöver ventilation parametrarna justeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport ger tre protokoll för tre olika metoder för att analysera effekterna av fetma på glukosmetabolismen och pulmonell utfall. Först glukostoleranstest ger möjlighet att analysera intracellulära glukosupptag och kan vara vägledande för insulinresistens. För det andra, hela kroppen pletysmografi är en teknik att mäta lungfunktion och är därmed bra att testa effekten av nya behandlingar. För det tredje, ett standardiserat fixering protokoll är viktigt för kvantitativa morfometriska analys för att bedöma effekterna av fetma på strukturella förändringar.
Kost-inducerad fetma i djurförsök
Betydelse med avseende på befintliga metoder och framtida tillämpningar: för att efterlikna människors matvanor, som resulterar i fetma, kost-inducerad fetma (DIO) modeller används i stor utsträckning gnagare. I jämförelse med användning av genetiskt modifierade möss härma ämnesomsättningssjukdom, möjliggör DIO modeller analys av etiologi, patologi och framtida behandlingsalternativ. En senaste översyn av Heydemann et al., ger en översikt över olika murina fettrik kost modeller i diabetes forskning16. Specifika ändringar av näringsämnen komponenter ger möjligheten att framtida studier av effekterna av mikro - och makro-näringsämnen på molekylära mekanismer för fetma, och därmed på lung struktur och funktion.
Modifieringar och felsökning: olika rapporter visar att fetma kan induceras av olika förändringar i sammansättningen av kosten näringsämnen16, kunskap som har, i sin tur ledde till utvecklingen av en mängd olika dieter under de senaste åren, till exempel kost hög i fett eller kolhydrater innehållet eller en kombination av både kost, som är den så kallade västerländska kost16. I slutet beror valet av kost för en studie på forskningsfrågan och syftet med studien. Förutom att styra dessa viktiga faktorer så är valet av en ordentlig kontroll kost av yttersta vikt; annars begränsas tolkningen av resultaten. Dock fenotypen orsakas inte bara av vilken typ av kost men är också ett resultat av utfodring period, kön och mus stam17.
Begränsningar av tekniken: bredvid sammansättning av olika näringsämnen i kosten, djuret och bakgrunden stammen svar kunde redogöra för resultaten och fenotypen observeras av induktion av fetma. Till exempel, har det visats att BALB/C-möss är mer mottagliga för leversjukdom steatos jämfört C57Bl/6 möss18. Vissa genetiska variationer, t.ex., på grund av genetisk drift (C57Bl/6J kontra C57Bl/6N), kan också påverka känsligheten för fetma19. Detta belyser begränsningarna av den teknik som arbetar med genetiskt modifierade möss med olika genetisk bakgrund stammar, eftersom även stammen och säljaren som mössen erhölls kan påverka resultaten.
Kritiska steg inom protokollet: för pålitlig, reproducerbar och jämförbara resultat mellan den experimentella och kontrollgrupper, helst littermates bör användas för att generera kontroll och experimentella möss, miljöfaktorer och stress bör undvikas, och kontroll möss bör studeras parallellt med experimentella möss12.
Intraperitoneal glukos tolerans tester (ipGTT)
Betydelse med avseende på befintliga metoder och framtida tillämpningar: för att avgöra effekten av DIO på murina metabolism, finns olika screeningtest. Konsortiet mus metabola fenotypning Center (MMPC) inrättades för att föreslå standardiserade metoder för att bedöma metabola fenotyper hos möss och har publicerat standardrutiner för att beskriva och utföra metaboliska tester av glukos homeostas i möss12. En GTT är en global metod att mäta hur väl kroppens celler är att upptag glukos efter intag av en viss mängd socker, vilket i sin tur är vägledande insulinutsöndringen och insulin effekt. Skillnader i serum insulinnivåer utgör ofta förändrad glukostolerans. Därför har GTT blivit en av de vanligaste fysiologiska testerna att karakterisera mus-modeller av diabetes och fetma. Eftersom ipGTT är en snabb och enkel metod, kan det användas i framtida studier som en standardiserad metod för att analysera effekten av kost och/eller behandling på metabolism.
Modifieringar och felsökning: The GTT utförs rutinmässigt efter en natts fasta att utjämna blodsockernivån i möss20. Eftersom längden på perioden fastande har starka effekter på de undersökta parametrarna och är bör därför av stor betydelse för jämförelse och tolkning av resultaten, fasta perioden anpassas till ålder och kroppsvikt hos möss. Med hänsyn till att möss är nattdjur och två tredjedelar av samlade dagliga födointaget förbrukas över natten, provocerar fasta över natten en katabola tillstånd. Således, tidpunkten om inledande och varaktigheten av fasta har en mycket relevant inverkan på resultaten, och således dessa parametrar bör vara standardiserade12. Dessutom utdragen fasta utarmar leverns glykogen butiker och därför minskar variabiliteten i baslinjen blodglukos. Sammanfattningsvis, eftersom insulin-stimulerad glukos utnyttjande hos möss är förbättrad efter långvarig fasta perioder21, en 5 till 6 timmar fastande Spellängd rekommenderas att bedöma insulinets verkan; fasta under natten är tillräcklig för att testa glukos utilization12,20,22. Glukos är normalt administrerade via i.p.-injektion och glukos-dosen justeras till kropp vikt (vanligen 1 eller 2 g/kg kroppsvikt)20,22. I DIO modeller ökar kroppsvikt, främst på grund av en högre fettmassa; glukosupptag, sker dock huvudsakligen i muskel, hjärnan och levern. Eftersom beloppet av dessa vävnader inte påverkas vanligtvis av DIO, får feta möss en oproportionerligt stor mängd glukos jämfört med lean möss, som i sin tur kan påverka tolkningen av data och leda till en målgruppsinsikter glukosintolerans22 . Av denna anledning, fasta perioder behöver standardiseras och kroppssammansättning behöver övervägas under tolkningen av GTT resultat23. Datortomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging(MRI) skanningar är därför tillämplig. Exempelvis glukos mätningar av handhållna helblod glukos bildskärmar (se Tabell för material) finns, och dessa monitorer är mer vanligt förekommande än plasma glukos analysatorer. På grund av små blodet volymer krävs - vanligtvis 5 µL eller mindre - de är mer praktisk än plasma analysatorer.
Begränsningar av tekniken: fastande möss uppvisar beroende på längd av fasta och visa en betydande förlust i vikt, kroppstemperatur, blodvolym, och puls samt förändringar i serumparametrar, såsom nivåer av fria fettsyror och ketonkroppar 24. denna metabola stress utlöses av att möss i djurens faciliteter bostäder temperatur är standardiserat till ca 23 ° C, och är därför under deras thermo-neutral temperatur 30 ° C25. Utdragen fasta på subthermo-neutrala temperaturer kan resultera i dvala, kännetecknas av en minskning av de ämnesomsättning26,27.
Kritiska steg inom protokollet: som nämnts ovan, för tillförlitliga resultat mellan den experimentella kontrollgrupper, littermates bör helst användas under studien och fasta perioder och tidpunkter behöver standardiseras.
Lungan funktionen analys
I detta protokoll mäter plethysmograph direkt tryckförändringar som driver andning, och de resulterande flödena in och ut ur luftvägarna. Flödet mäts av en pneumotachograf som ligger i väggen av plethysmograph. Uteslut motstånd från bröstkorgen genom luftvägarna öppna tryck (mun trycket) och transpulmonellt (esofagus tub) trycket mäts och beräknas luftvägsmotståndet och dynamisk efterlevnad. Dynamisk efterlevnad är beräknat via skillnaden mellan den lägsta och högsta lungvolymen uppdelad genom flödet.
Betydelse med avseende på befintliga metoder och framtida tillämpningar: pletysmografi är det normala förfarandet att analysera de mekaniska egenskaperna av lungan, och kan därför, att användas i framtida studier för att analysera alternativ för patologi och behandling av lungcancer. För att jämföra grupper och studier, är en standardiserad metod oumbärlig.
Modifieringar och felsökning: I allmänhet denna teknik kan klassificeras som ohämmat och återhållsam hela kroppen pletysmografi. Ohämmad metoder bestämma förbättrade paus (Penh) och möjliggöra analys av normal andningsmönster, medan återhållen, invasiva metoder direkt mäta tryck, flöde, eller volym. Lungan mekaniska egenskaper bestäms av motstånd och elastans; medan motstånd beräknas som förhållandet mellan trycket till flödet, speglar elastans förhållandet mellan trycket till volym28. Däremot ohämmad hela kroppen pletysmografi endast mäter trycket inuti plethysmograph, och en beräkning av motstånd och elastans är därför omöjligt. I 2007, har Lundblad et al. sagt att Penh är inte parametern rätt att mäta luftvägsmotståndet, men representerar en ospecifik reflektion av andning mönster29. För korrekt uppskattning av lung mekanik är således invasiva pletysmografi oumbärlig29,30,31.
Eftersom andningen parametrar är beroende av ålder och storlek av möss, behöver ventilation parametrar justeras. Till exempel tidalvolymen är relaterad till ormens vikt och bör sättas till 10 µL/g kroppsvikt med en andning frekvens av 120-250 andetag per minut. När du justerar dessa parametrar, bör utredaren beakta att medelvärdet tidalvolymen är omvänt relaterad till respiratorisk frekvens32. Eftersom spontan andning påverkar tryck, flöde och volym, djup anestesi har övervakas och ventilation kurvor måste följas kontinuerligt. Anestesi själv kan dock direkt negativt påverka lungfunktionen. Till exempel, skyddar Propofol och ketamin delvis mot inducerad luftvägarna sammandragning jämfört med tiopental33. Kliniska studier har dessutom visat att ketamin har antikolinerga effekt och kan användas som en potentiell bronkdilaterare i svår astma34. Via inhalation bedövningsmedel, såsom isofluran i samband med behandling av smärta, betraktas som en kontrollerbar alternativ till injektion anestesi; dock efter flyktiga anestetika irritation i luftvägarna redovisas och därför utesluter inandning bedövningsmedel som ett alternativt35.
Begränsningar av tekniken: den återhållsamma invasiv metoden att mäta lung mekaniska egenskaper är på grund av den nödvändiga trakeotomi, ett sista förfarande, och därmed begränsar studien till en enda punkt analys, utan möjlighet att utreda sjukdom progression. För att minska nivån invasivt, kan mätning av Överföringsimpedans medvetna djur utföras, vilket därmed gör longitudinella studier. Men vid mätning av respiratoriska mekanik i icke-tracheotomized djur, motståndet av näsan bidrar till det totala motståndet i luftvägarna och försvårar därmed mätningar efter metakolin provokation13.
Kritiska steg inom protokollet: här visar vi endast en metod av invasiva lungfunktionen. Eftersom det finns flera etablerade invasiva lung funktion metoder, standardisering inom studierna och en detaljerad beskrivning av metoden som används, grupper, och en narkos regim i publikationer är nödvändigt att jämföra studier.
Lungan excision för Histomorfometriska analyser
Betydelse med avseende på befintliga metoder och framtida tillämpningar: kvantitativa Histomorfometriska analyser kan användas för att undersöka effekterna av fetma lung struktur (bronkerna och alveolerna), att tolka resultaten av invasiva pletysmografi, och att studera möjliga behandlingsalternativ på pulmonell resultatet. Data från histologiska bedömningar kan variera beroende på fixativ agenter och förfarandet används fixering. Eftersom det har visat att fetma har en effekt på alveolära och bronkial struktur, som väl som extracellulära matrix och cellulära sammansättning, är det nödvändigt att fastställa en lämplig teknik baserat på forskningsfrågan i framtida studier. Opartisk kvantitativa morfometri, vävnad behandling efter fixering ska utföras enligt standarder av den American Thoracic Society (ATS) / Europeiska Respiratory Society (ERS) för kvantitativ bedömning av lungan struktur14 .
Modifieringar och felsökning: 2010 Hsia et al. presenteras ett officiellt uttalande av ATS/ERS inställningen standarderna för kvantitativ bedömning av lung struktur, som bör beaktas före lung isolering och fixering 14. bredvid intratrakeal instillation av fixativ, i situ fixering, fast volym fixering eller vakuum inflationen kan utföras för att blåsa upp pulmonell vävnad36. Inflationen, och därmed luftrummet utvidgningen, är beroende av fixering förfaranden och grad av trycket under fixering. Högt tryck, till exempel kan leda till alveolära väggen bristning och därmed påverka resultaten. Liknar parametrarna ventilation, perfekt fixering parametrarna beror på ålder, storlek och fenotyp av möss. Fixering kan uppnås genom kemiska eller fysiska medel, inklusive kemiska agens eller frysförvaring. Intratrakeal instillation av lämplig fixativ härmar vävnad inflationen under andning, vilket återspeglar i vivo villkor, och därför är utbredda37. 20-25 cm över den högsta punkten av lungan rekommenderas för tillräckligt tryck, med en bred och kort slang för att möjliggöra snabb och enhetlig penetration14. Ett viktigt mål för fixering är att förhindra degeneration processen och att bevara celler och vävnad i ett ”liv-liknande tillstånd”, samtidigt bevara lungparenkym arkitektonisk integritet. Dessutom måste vävnad behålla dess reaktivitet till antikroppar, fläckar och nukleinsyra sonder. Förutom effekten av normala autolys, biverkningar av vävnad bearbetning, inklusive infiltration med heta vax, skivning, och dewaxing, måste förhindras. Valet av fixativ samt vidareförädling av vävnad, t.ex. via inbäddning, kan orsaka vävnad krympning, svullnad och förhårdnad av olika komponenter och leda till artefakter, såsom ökad autofluorescens38. Till exempel fixering i 10% buffrad formalin och vidare bearbetning kan orsaka krympning av upp till 20% - 30% i förhållande till ursprunglig volym39. Därför Hsia et al. i deras 2010 samförstånd papper av den ATS/ERS rekommenderar användning av 2,5% glutaraldehyd buffras med osmium vanligtvis och uranyl acetat att undvika vävnad krympning. Cell, vävnad finstruktur, lungvolym och inre arkitektur struktur bevarades efter den luftvägarna instillationen av denna fixativ reagens14. Denaturering av proteiner och korslänk bildandet är två stora mekanismer som är viktiga för fixering av vävnad. Uttorkande föreningar eller koaguleringsmedel, såsom alkoholer eller aceton, orsaka denaturering av proteiner, vilket resulterar i ändringar av tertiär proteinstruktur av destabiliserande hydrofoba bindningar. Icke-koaguleringsmedlet fastställande agenter som PARAFORMALDEHYD eller glutaraldehyd reagerar kemiskt med proteiner och form mellan molekylär och inom molekylär cross-links. Eftersom flera färgning förfaranden, såsom hematoxylin och eosin färgning, beroende mellan molekylära interaktioner, kan färgning resultat bli dålig, beroende på fixativ agenten. Antigen-hämtning metoder i immunohistokemi har visat att vissa av fixering reaktioner är reversibla, särskilt de av formaldehyd40.
Begränsningar av tekniken: eftersom den alveolära ytskikt avlägsnas vid intratrakeal instillation av fixativ, tolkning av, t.ex. alveolära mikroarkitektur, slem ackumulering eller inflammatoriska cellmigration kan manipuleras 41 , 42 , 43.
Kritiska steg inom protokollet: här visar vi de intratrakeal instillationen av 4% PFA som en bred strategi att visualisera effekten av fetma på pulmonell utfall. Som nämnts ovan, måste protokollet ändras beroende på forskningsfrågan, enligt ATS/ERS rekommendationer14.
Förutom de tidigare nämnda parametrarna är stress en viktig faktor som påverkar forskningsresultat. Därför utbildning både möss och vetenskapsmannen är oumbärlig. Möss bör anpassas till besöksförbud och bör överföras till området experimentell under lugna förhållanden44. Stress påverkar ämnesomsättningen, t.ex. till följd av stress hormon release, släppt glukosnivåerna ökar, en effekt som kan misstolkas som nedsatt glukostolerans. Stress hormon release förändrar också känslighet för anestetika droger, specifikt, dosen av anestetika höjs och att nå kirurgiska tolerans förlängs. Som nämnts, kan den öka mängden bedövningsmedel påverka bronkokonstriktion, medan stress själv kan orsaka astmaliknande dilatation.
Sammanfattningsvis innehåller den här artikeln tre metoder för att bedöma effekterna av fetma och metabolism på lung struktur och funktion hos möss. Alla nämnda metoder kan överföras till andra sjukdomsmodeller och gnagare, såsom fetma på grund av genetiska modifieringar eller råtta modeller. Tillämpningen av dessa tekniker kan vara användbart att definiera nya molekylära mekanismer i DIO modeller med specifik gen ablation, eller för att testa nya terapeutiska metoder för att behandla/förebygga de negativa effekterna av fetma på kroniska lungsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Experimenten var stöds av Marga och Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Tyskland; Projektet 210-02-16 (MAAA), projektet 210-03-15 (MAAA) och av den tyska forskningsfondens (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Tyskland; Centrum för molekylär medicin Köln (CMMC; Universitetssjukhuset Cologne; Karriär befordranprogram; MAAA), Köln Fortune (fakulteten, universitetet i Köln; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
References
- Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
- Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes? International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
- Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
- Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
- Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
- Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
- Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
- Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
- Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
- McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 12 11-11 12-14 (2008).
- Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
- Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
- Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
- Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
- Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
- Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
- Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance! Eur Respir J. 30, 805 (2007).
- Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
- Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
- Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
- Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
- Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
- Rolls, G. Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
- Winsor, L. Tissue processing. Laboratory histopathology. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
- Histochemistry, theoretical and applied. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).
- Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
- Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).
