Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

بناء منصة فرز الفائق لتقييم عدم تجانس التضخيم الجين HER2 في سرطان الثدي

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

التوزيع غير متجانسة من الخلايا إيجابية HER2 يمكن ملاحظتها في مجموعة فرعية سرطانات الثدي ويولد المعضلات السريرية. وهنا، نقدم بروتوكول موثوق بها وفعالة من حيث التكلفة لتحديد وقياس ومقارنة HER2 الورم داخل التغاير الوراثي في سلسلة كبيرة من سرطان الثدي بين المجهزة.

Abstract

العلاجات الموجهة ضد مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2) قد تغيرت تغيرا جذريا النتيجة للمرضى الذين يعانون من سرطان الثدي إيجابية HER2. ومع ذلك، يعرض أقلية حالات توزيعاً غير متجانسة من الخلايا إيجابية HER2، الذي يولد التحديات السريرية الكبرى. وحتى الآن، وقد اقترحت لا بروتوكولات موحدة وموثوقة للتوصيف والتحديد الكمي ل HER2 التضخيم الجيني غير متجانسة في أفواج كبيرة. وهنا، نقدم منهجية الفائق لتقييم حالة HER2 في وقت واحد عبر مختلف المناطق الطبوغرافية من سرطانات الثدي متعددة. على وجه الخصوص، نحن لتوضيح الإجراءات المختبرية لبناء الأنسجة معزز [ميكروارس] (طرفية) تتضمن تعيين مستهدفة من الأورام. لقد تم تحسين كافة معلمات الجمعية التونسية للأمهات على وجه التحديد للفضة في الموقع التهجين (سيش) الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) أنسجة الثدي. يجب إجراء تحليل المناعي المؤشرات الحيوية التنبؤية وتنبؤاتها (أي، ER، العلاقات العامة، Ki67 و HER2) باستخدام إجراءات التشغيل الآلي. تم تنفيذ بروتوكول سايش مخصصة للسماح بتحليل الجزيئات عالية الجودة عبر الأنسجة المتعددة التي خضعت لإجراءات التثبيت وتجهيز وتخزين مختلفة. في هذه الدراسة، ونحن نقدم دليلاً لمبدأ أن تسلسل الحمض النووي معين يمكن أن يكون سرطان الثدي بين المجهزة ومترجمة في نفس الوقت في مناطق طبوغرافية متميزة متعددة باستخدام وسيلة كفؤة وفعالة من حيث التكلفة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HER2 هو بروتوونكوجيني أوفيريكسبريسيد وتضخيمه في 15-30 ٪ من سرطانات الثدي الغازية كل1،2. HER2 overexpression يتم الاستدلال بالوجود > الخلايا 10% بغشاء قوي المناعي (المدينة) تلوين (3 +)، بينما يمكن تقييم التضخيم الجيني عند نسبة HER2/السنترومير لا إيه تو أو عدد نسخ الجينات هو إيه سيكس، في فرز الأصوات في خلايا أقل 20 في الموقع التهجين (العش)3.

التغاير الوراثي داخل ورم وصفت على نطاق واسع في سرطان الثدي، كونه من مساهمين ضارة المحتملة لتقييم المؤشرات الحيوية وعلاجات الاستجابة4. وفقا لكلية الأطباء الأمريكية (CAP) تغاير HER2 موجود إذا كان يتم تضخيمه HER2 في > 5% و < % 50 من التسلل إلى ورم الخلايا5. ومن المؤسف أن الإصابة الفعلية بالتغاير HER2 المكانية في سرطان الثدي يبقى موضع جدل بين علماء ومع بعض المؤلفين الحفاظ على أن حدث نادر جداً والبعض الآخر مما يوحي بأن تصل إلى 40% من الحالات HER2 متغايرة1،5،،من67،،من89،10. وعلى الرغم من الآليات البيولوجية التي يرتكز عليها هذا الشرط لا بعد بالكامل تتضح، آثار الورم داخل HER2 التغايرية السريرية وتنبؤاتها حاسمة بالنسبة ل مرضى سرطان الثدي11.

في الآونة الأخيرة، ظهرت التقنيات الجزيئية مشرق الحقل، مثل ايش اللونية (CISH) والعش الفضي (سيش)، كوسائل موثوق بها للكشف عن تغاير HER2 في الأنسجة FFPE، مع بعض المزايا مقارنة الفلورية العش (الأسماك)12. وللأسف، لا يزال تحليل الجزء الأكبر من حالات فردية غير عملي في دراسات بحثية كبيرة الأتراب. وقد اقترح العديد من المجموعات أن مزيج هيستوتشيميستري، المدينة، والعش مع التكنولوجيات الجمعية التونسية للأمهات يمكن أن تمثل استراتيجية قيمة في دراسة سرطان علم الأحياء13،14،،من1516. مع هذا الأسلوب معتمداً على نطاق واسع، وعينات الأنسجة من مختلف المرضى يمكن تحليلها في الوقت ذاته، تقليل الأنسجة والكواشف المستخدمة، ومما يعزز تحليل موحد لمجموعة كبيرة من الحالات14. ومع ذلك، لا يوجد أية بروتوكولات متاحة متزامنة الفائق الجزيئية توصيف عينات الأنسجة المتعددة التي خضعت للتجهيز من حيث الكواشف وأوقات التثبيت، وأساليب الحفظ العاملون بهذه المحفوظات كما مختلفة كتل.

النظر إلى الآثار السريرية وتنبؤاتها للتباين المكاني HER2 في سرطان الثدي، قمنا بتطوير منصة جزيئية متكاملة لتقييم ذلك في سلسلة كبيرة من الحالات تقوم المجهزة. هنا، نحن تصور استراتيجيات معمل لتوليد وتحليل التباين داخل ورم التضخيم HER2 في طرفية عالية الغلة من سرطان الثدي عن طريق سايش. تم وضع بروتوكول التالية للأورام قياس > 5 ملم (> pT1b وفقا لعام 2017 تنم)17. لآفات أصغر، نوصي بإجراء التحليل على مقاطع المسلسل قلق. لدينا إجراء يسمح لتحليل المدينة وسيش المتزامن لسرطان الثدي يصل إلى 30، يشمل متوسط 6 مجالات متميزة (مجموعة 4-8) لكل حالة على حدة. بالإجمال، سيتم إنشاء 180 النوى الأنسجة من 1 مم في القطر، مع 500 ميكرومتر بين النوى، ومم 2 بين الشبكة والحواف لكل كتلة الجمعية التونسية للأمهات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وأقر هذه الدراسة "مجالس المراجعة المؤسسية" من "كاليفورنيا إيرككس" ' مؤسسة غراندا، مستشفى Policlinico، ميلانو، إيطاليا.

1-اختيار المرضى وعينات الأنسجة

  1. استرداد الشرائح المحفوظات لجميع الحالات تحليلها، بما في ذلك جميع الهيماتوكسيلين المتاحة وويوزين (H & E) والشرائح المدينة من التشخيص الأصلي، وإذا كان حاضرا، ح واحد & ه لمطابقة لانسجة الثدي غير الورمية (مثلاً، الهامش الجراحية) .
  2. إجراء عمليات استعراض الحالة.
    ملاحظة: للقيام بهذه المهمة، ينبغي مناقشة الشرائح التشخيص وحل الخلافات تضامنية الباثولوجيا اثنين على الأقل مع خبرة في أمراض الثدي. استخدام مجهر تقليدية أو أدوات هذا (لصالح هذا الأخير في الدراسات مولتيسينتريك). إذا كان هناك أي استبعاد جميع الحالات المتنافرة.
    1. إجراء إعادة التصنيف النسيجي لجميع الحالات وفقا لأحدث طبعة من تصنيف منظمة الصحة العالمية (WHO) لاورام الثدي18.
    2. ضمان أن أنسجة طبيعية لكل حالة، إذا كانت موجودة في العينات السريرية المحفوظات، تضم واحداً على الأقل وحدة الأقنية مفصص المحطة الطرفية غير الورمية.
    3. تحديد جميع المناطق الورمية التي تظهر غير متجانسة الخلوية، والهندسة المعمارية، أو ميزات المدينة باستخدام مجهر مشرق الميدان (التي ستؤديها معا أخصائي و technician(s) الذين سيتم بناء طرفية).
  3. تسليط الضوء على مجالات الطبوغرافية المنفصلة مع علامة على الشريحة الزجاجية أو مع الأداة المناسبة على برمجيات شريحة رقمية (الشكل 1A).
  4. وبناء على الشرائح المحددة، استرداد كتل FFPE المقابلة من المحفوظات.
    ملاحظة: لتحسين الجمعية التونسية للأمهات البناء، لتجنب نضوب الأنسجة، والحفاظ على الجمعية التونسية للأمهات لكمه السلامة الهيكلية، الحالات مع < 1 مم سميكة الأنسجة المتبقية ينبغي استبعادها.

2-تصميم وتشييد طرفية استناداً إلى تقنية كونونين

  1. إنشاء وفتح ملف جدول بيانات جديد إدراج سجلات مجالات متميزة لكل حالة على حدة. وتشمل البيانات التالية في أعمدة منفصلة، كما يتضح من الجدول 1: حالة معرف، كتلة معرف معرف المنطقة، نوع الأنسجة (مثلاً، أنسجة طبيعية، هيستوتيبي المكونات الغازية، في الموقع هيستوتيبي المكون)، والطوبوغرافيا(مثلاً الورم الأساسية، الجبهة الغازية)، مورفولوجيا (مثلاً، الصف النووية، الهندسة المعمارية، وميتوسيس، وميزات الخلوية)، ووضع المؤشرات الحيوية (أي، مستقبلات الإستروجين (ER)، مستقبلات البروجسترون (PR)، Ki67، و HER2)، وجميع ملامح المدينة الأخرى المتاحة.
    1. قم بحفظ المستند.
  2. إنشاء مشروع الجمعية التونسية للأمهات.
    1. تثبيت وفتح البرنامج مصمم الجمعية التونسية للأمهات.
    2. تحديد مستلم الجمعية التونسية للأمهات block(s): الوصول من خلال القائمة ملف > جديد > كتلة أو باستخدام CTRL + "باء"
    3. انقر في الحقل الأول لملء أو اضغط على المفتاح Tab، واكتب في أبعاد كتلة البارافين: العرض 35 (ملم)، وارتفاع 20 (مم). نوع "2" كقيمة "الهامش" (أي، المسافة من حافة البارافين في مم) (الشكل 1B). حفظ البيانات بالنقر فوق الزر المناسب. يتم الآن حفظ القالب الجديد من كتلة المتلقية وعلى استعداد لاستخدامها في قوالب الصفيف أنسجة جديدة.
    4. إنشاء مشروع مجموعة أنسجة: الوصول إلى القائمة ملف > جديد > "مجموعة الأنسجة" أو باستخدام CTRL + t.
    5. ملء اسم الصفيف الأنسجة وتعليقات مقدم البلاغ، ثم انقر فوق "التالي". انقر فوق رمز "استيراد" واختر ملف القالب من كتلة المتلقية التي تم إنشاؤها مسبقاً وانقر فوق "التالي".
    6. اختر 1 ملم كحجم البقعة بواسطة النقر فوق الزر جولة. اختر 500 ميكرومتر كبقعة التباعد الذي هو المسافة بين اثنين من مراكز البقع المجاورة. انقر على أيقونة آلة حاسبة لحساب العدد الإجمالي للنقاط التي تم إنشاؤها، التي ينبغي أن تكون 231. انقر فوق "التالي".
    7. تحديد وضع الترقيم الموضعي بالنقر فوقه مرة واحدة. انقر فوق الزر "تحديد" لإنشاء الشبكات والشبكات الفرعية. حذف الخط المركزي (السطر 6) والأعمدة 8 و 15. الحفاظ على البقع 3 سطر 1 للتوجيه. وينبغي أن يشمل الخريطة النهائية عدد إجمالي من البقع 183، كما هو ممثل في الشكل 2.
    8. تحديد قائمة بأنواع الأنسجة: الوصول من خلال القائمة ملف > جديد > قائمة أنواع الأنسجة، أو باستخدام المفاتيح CTRL + "l."
    9. قم بإدراج وصف الأنسجة تم تعريفها مسبقاً. اضغط على سهم لأسفل أو انقر فوق الزر لإضافة سطر +.
    10. تعريف المشروع: الوصول من خلال القائمة ملف > جديد > المشروع الداعم أو باستخدام CTRL + "ص"
    11. ملء اسم الصفيف الأنسجة، والتعليقات، والكاتب، ثم انقر فوق "التالي". استيراد ملف جدول البيانات، وقائمة بأنواع الأنسجة، ونموذج الصفيف الأنسجة سابقا التي تم إنشاؤها بواسطة النقر فوق الرموز المناسبة.
    12. انقر فوق "تحديد الكل"، وتحديد عدد النقاط لكل نوع من أنواع النسيج؛ انقر فوق الزر "مطابقة" لتطبيق الإعدادات. سوف تظهر قائمة بالعدد الإجمالي للنوى التي سيتم أخذ عينات منها وتحويلها إلى كتل المستفيدة في هذا المشروع. قم بحفظ المشروع، وأغلق البرنامج.
  3. إعداد block(s) يقبلون (الشكل 1B).
    1. ملء قوالب معدنية المطهرة مع البارافين الجزء عند 65 درجة مئوية.
    2. ترك كتل البارافين لتبرد في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها داخل قوالب معدنية.
    3. استخراج كتل البارافين من قوالب معدنية. في حالة حدوث الشقوق، تجاهل الكتلة وكرر الخطوات 2.3.1-2.3.3.
  4. بناء الجمعية التونسية للأمهات باستخدام أررايير الآلي أو شبه الآلية19.
    1. تحديد استرداد كافة كتل فب والأقسام المناظرة ح & ه مع شروح.
    2. قم بتشغيل في أررايير وإدراج block(s) يقبلون على دائري أررايير.
    3. فتح برنامج محطة السيطرة أررايير وانقر على "مجموعة أنسجة جديدة"، وتحميل المشروع التي تم إنشاؤها مسبقاً (الشكل 1).
    4. انقر فوق "متابعة"، وحدد موضع block(s) المانحة من القائمة.
    5. تحديد موضع البداية على كل كتلة المستفيدة: استخدام مفاتيح الأسهم للتحرك على ضوء الليزر ومواءمته مع الحافة العلوية على البارافين كتلة المتلقية.
    6. انقر فوق "التالي"، وكرر للمحاذاة العمودية.
    7. انقر فوق "التالي" لخلق ثقب تلقائياً في تنسيق محدد مسبقاً من كتلة المستلم (acceptor).
    8. إفراغ لكمه.
    9. ضع كتلة المانحة لأخذ العينات وإزالة أنسجة أساسية من منطقة المشروح سابقا للفائدة.
    10. إدراج الأساسية الأنسجة المانحين في الحفرة في كتلة المستلم (acceptor).
    11. إزالة كتلة المانحة من أرايير.
    12. كرر الخطوات 2.4.5-2.4.11 حتى يتم إكمال الجمعية التونسية للأمهات.
  5. وضع الجانب الأنسجة كتلة الجمعية التونسية للأمهات الذي تم إنشاؤه حديثا على شريحة فارغة عقيمة ووضعها في فرن المختبر في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. اضغط برفق في الكتلة على الشريحة 5 s تسطيح النوى الأنسجة. كرر هذه العملية مرة واحدة (لما مجموعة 2 مرات).
  7. إزالة كتلة الجمعية التونسية للأمهات إلى جانب الشريحة من الفرن وانعكاسها، وفصل الكتلة من الشريحة بلطف.
  8. تغطية سطح الأنسجة الشفافة مع طبقة رقيقة من البارافين الجزء عند 65 درجة مئوية.
  9. ترك كتلة الجمعية التونسية للأمهات في درجة حرارة الغرفة ح 2.
  10. نقل كتلة الجمعية التونسية للأمهات في 4 درجات مئوية عن 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن تخزين كتلة الجمعية التونسية للأمهات في 4 درجات مئوية حتى استنفاد.

3-histochemical وتحليلات المناعي

  1. قص الأجزاء الشفافة.
    1. Block(s) مكان يقبلون الجمعية التونسية للأمهات مع البارافين-الجانب الأسفل على سطح-10 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لالبرد في البارافين.
    2. ملء حمام التعويم مع الماء عالي النقاوة وضبط الحرارة إلى 38 درجة مئوية.
    3. شفرة جديدة على مبضع روتاري وإدراج الكتلة تشاك مبضع حيث يواجه بليد كتلة الشمع وهو الانحياز في الطائرة العمودية.
    4. نهج الكتلة بعناية مع بليد وقطع المقاطع رقيقة قليلة لضمان تحديد المواقع بشكل صحيح؛ تعديل إذا لزم الأمر.
    5. قص 3 ميكرومتر سميكة المقاطع.
    6. التقاط المقاطع باستخدام الملقط وتعويم لهم على السطح حمام الماء.
    7. اختيار المقاطع من حمام الماء على الشرائح الزجاجية العادية والمدينة/العش.
    8. ضع الشرائح على رف وتخزينها في الفرن عند 45 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: بمجرد إعدادها، ينبغي الملون فروع الجمعية التونسية للأمهات خلال 24 ساعة.
  2. القيام بتلوين histochemical (H & E) باستخدام أوتوستاينير.
    1. إدراج الشرائح في الرف أوتوستاينير ووضعها في 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. فتح درج تحميل أوتوستاينير وإدراج الشرائح على الرف مع الجمعية التونسية للأمهات في أحد مراكز التحميل مع قصاصة ح & ه قياسية التي تواجه الخارج.
    3. بمجرد الدرج مغلق وسيتم الاعتراف القصاصة تلقائياً بالنظام وسوف تبدأ بروتوكول التالية: محطة فرن في 37 درجة مئوية (6 دقيقة)، زيلين نفط (2 دقيقة)، زيلين نفط (2 دقيقة)، الإيثانول 100% (2 دقيقة)، الإيثانول 100% (2 دقيقة)، الإيثانول 95% (2 دقيقة)، الإيثانول 95% (2 دقيقة) ، المقطر المياه (4 دقيقة)، توضع في كرزي (9 دقيقة)، المياه الجارية الضغط المنخفض (2 دقيقة)، ثم 1% (1 دقيقة)، المياه الجارية الضغط المنخفض (2 دقيقة)، الإيثانول 95% (20 s)، الإيثانول 95% (20 s)، الإيثانول 95% (20 s)، الإيثانول 95% (20 s)، الإيثانول 100% (15 ق)، الإيثانول 100% (15 ق) ، زيلين نفط (30 ثانية)، زيلين نفط (30 ثانية).
    4. إلغاء تحميل الرفوف من الدرج وجبل الشريحة مع زلة الغطاء.
      1. جمع قطره جبل مع ماصة ووضعه على حافة الشريحة الغطاء خارجي.
      2. ضع الجانب الرطب من كشف الغطاء عن الشريحة واسمحوا جبل الجاف لمدة 30 دقيقة.
  3. أداء المدينة تلطيخ ER PR، Ki67 و HER2 باستخدام إيمونوستاينير الآلي.
    ملاحظة: قبل بدء تشغيل المصبوغة، بدء تشغيل النظام، والتحقق من الزجاجات كاشف المواد الاستهلاكية (جدول المواد)، وحاويات النفايات.
    1. ضع الشرائح الشفافة لتحليل عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. بدء تشغيل أداة إيمونوستاينير والبرمجيات.
    3. في "عرض الصفحة الرئيسية"، انقر فوق الزر البروتوكولات، ومن ثم انقر فوق "بروتوكولات" إنشاء/تحرير.
    4. حدد الدأب القياسية (3، 3 '-ديامينوبينزيديني) المدينة إجراءات لتعديل القالب الأساسي.
    5. وضع علامة "ديبارافينيزيشن" في مربع القائمة وضبط "درجة حرارة متوسطة" في 72 درجة مئوية.
    6. العلم الحل تعرية cc1، تعيين "درجة الحرارة المتوسطة" في 95 درجة مئوية، وفترة الحضانة في 36 دقيقة.
    7. وضع علامة على المربع "جسم الأولية"، وإدراج معرف موزع مضمنة ER (البرامج الصك سوف تعترف الموزع على دائري كاشف) وتعيين وقت الحضانة في 16 دقيقة.
    8. وضع علامة على مربع كونتيرستينينج، حدد الهيماتوكسيلين الأول، وتعيين وقت الحضانة في 12 دقيقة.
    9. انقر فوق الزر "حفظ باسم" واسم البروتوكول.
    10. كرر 3.3.3-3.3.9 خطوات للأجسام المضادة تبقى استخدام أوقات الاحتضان الأجسام الأولية التالية: العلاقات العامة 16 دقيقة ودقيقة Ki67 16 HER2 12 دقيقة استخدام الأجسام المضادة قبل المخفف جاهزة للاستخدام (RTU).
    11. في "عرض الصفحة الرئيسية"، انقر فوق الزر "إنشاء تسمية".
    12. انقر فوق الزر البروتوكولات وإضافة بروتوكولات HER2 و Ki67، ER والعلاقات العامة لكل من نقابة الأطباء التركية لتحليل.
    13. انقر فوق الزر إغلاق/Print.
    14. يظهر كالتسمية القالب، قم بإدخال "معرفات الجمعية التونسية للأمهات" للتسمية.
    15. انقر فوق الزر "طباعة" طباعة التسميات ومن ثم تطبيقها على الشرائح الشفافة.
    16. انقر فوق رمز أداة وتعيين وضع بدء تشغيل أداة "جاهزة".
    17. افتح غطاء يغطي دائري الكواشف ووضع نظام الكشف عن الأجسام المضادة الأولية، ثم أغلق غطاء محرك السيارة.
    18. انقر فوق الزر الجبهة على درج شريحة فتحه وتحميل الشرائح الشفافة، وقم بإغلاق الدرج بالنقر فوق الزر نفسه.
    19. قم بتعيين وضع بدء التشغيل الصك كما "تشغيل" واتبع التعليمات.
    20. في نهاية تفريغ التشغيل، الجمعية التونسية للأمهات الشرائح عن طريق الضغط على "جميع الإدراج مفتوحة" مع زر "أكملت الشرائح" على أداة "التحكم الشريحة" وشطف الحارة لهم في الماء والصابون لإزالة أي الكواشف المتبقية.
    21. يغسل الشرائح تحت الضغط المنخفض الباردة المياه الجارية ويذوي الشرائح الشفافة، وتطبق زجاج ساترة لكل شريحة.
  4. إجراء تحليل المدينة ER، والعلاقات العامة، و HER2 عقب أمريكا المجتمع من سريرية علم الأورام (اسك)/كاب المبادئ التوجيهية، ومن Ki67 وفقا لتوصيات Ki67 الدولية في الفريق العامل "سرطان الثدي" (الجدول 2).
    ملاحظة: هذا يجب إجراء التحليل كل على حدة في البقع الأنسجة المنفصلة بأخصائي مع خبرة في أمراض الثدي.
    1. تقييم التعبير ER إيجابيا إذا كان ≥ 1% من نواة خلية الورم إيمونوريكتيفي20،21،،من2223.
    2. تقييم تعبير العلاقات العامة إيجابية إذا كان ≥ 1% من نواة خلية الورم إيمونوريكتيفي20،21،،من2223.
    3. تقييم التعبير HER2 ك: أ) نقاط 3 + إذا الغشاء كفافى تلطيخ صورة كاملة ومكثفة، ب) نقاط 2 + إذا الغشاء كفافى تلطيخ غير مكتملة و/أو ضعف/معتدلة وضمن > 10% من خلايا السرطان الغازية أو كاملة و غشاء كفافى تلطيخ مكثفة وداخل ≤ 10% من خلايا الورم الغازية، ج) نقاط 1 + إذا كان غشاء غير مكتمل تلطيخ خافت يكاد يلمس وضمن > 10% من خلايا الورم الغازية، د) سلبية إذا لم تلطيخ غير موجود أو الغشاء تلوين غير كاملة وخافت يكاد يلمس وداخل ≤ 10% الورم الغازية الخلايا3،24.
    4. تقييم مؤشر Ki67 حسب النسبة المئوية للخلايا مع تلطيخ النووية في خلايا الورم على الأقل 1,000 عشوائياً تحديد ما يزيد على 10 حقول عالية القدرة (التكبير، 400 X)25.

4. تحليل سايش HER2

  1. قص فروع الجمعية التونسية للأمهات (كرر الخطوة 3.1).
  2. أداء سايش HER2 لاستخدام إيمونوستينير الآلي.
    1. ضع الشرائح الشفافة لتحليل عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. بدء تشغيل أداة إيمونوستاينير والبرمجيات.
    3. في "عرض الصفحة الرئيسية"، انقر فوق الزر البروتوكولات، ومن ثم انقر فوق "بروتوكولات" إنشاء/تحرير.
    4. حدد الإجراء "ش ككت ايش المزدوج" لتعديل القالب الأساسي.
    5. وضع علامة "التجفيف" في مربع القائمة وضبط درجة الحرارة عند 63 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    6. وضع علامة "تكييف الخلية" في مربع القائمة، ثم "خلية تكييف CC2"، وتعيين درجة الحرارة في وقت 86 درجة مئوية والحضانة في دقيقة 4.
    7. العلم CC2 خفيفة (الدورة 1) ومعيار (2 دورة)، والموسعة (دورة 3) دقيقة 8 و 12 دقيقة بدقيقة 8، على التوالي.
    8. وضع علامة "العش-حوزتي 3" في قائمة مربع وتعيين وقت الحضانة في 16 دقيقة.
    9. حدد المسابير HER2DNP و CHR17DIG وتعيين وقت الحضانة في ح 6.
    10. تعيين الغسيل في 76 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
    11. تعيين وقت الحضانة سايش مولتيمير (HRP التثقيف العش سيل) في 32 دقيقة.
    12. تعيين وقت الحضانة chromogen الفضة (SIL العش DNP CHRC) في 4 دقيقة.
    13. تعيين وقت حضانة مولتيمير أحمر (AP حفر العش الأحمر) في 24 دقيقة.
    14. تعيين وقت الحضانة chromogen أحمر (FR حفر العش الأحمر) في 8 دقيقة.
    15. علم "كونتيرستاينينج" في مربع القائمة، حدد "الهيماتوكسيلين الثانية"، وتعيين وقت الحضانة في 8 دقيقة.
    16. علم "ما بعد كونتيرستاينينج" في مربع القائمة، حدد "كاشف لالتشطيب"، وتعيين وقت الحضانة في 4 دقيقة.
    17. كرر الخطوات من 3.3.11-3.3.15 (حدد تعديل البروتوكول ش ككت ايش المزدوج).
    18. فتح غطاء يغطي دائري الكواشف، مكان الغسيل ونظم الكشف عن العش، ثم أغلق غطاء محرك السيارة.
    19. كرر الخطوات من 3.3.18-3.3.21.
  3. إجراء تحليل سايش ل HER2: تقييم التضخيم الجين HER2 إيجابية إذا كانت نسبة/CEP17 HER2≥2.0 متوسط HER2 نسخة رقم ≥4.0 إشارات كل خلية، وسلبية إذا كانت نسبة/CEP17 HER2< 2.0 مع متوسط HER2 نسخ رقم < 4.0 إشارات/الخلية3،24.
    ملاحظة: مشابهة للمدينة، هذا التحليل ينبغي أن يؤديها كل على حدة في البقع الأنسجة المنفصلة أخصائي خبرة في أمراض الثدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وعموما، 444 الثدي الغازية السرطان قد أدرجت في طرفية 15 على وجه التحديد الأمثل لتحليلات العش. بين البقع 2,664 عينات، 2,651 (99.5%) ممثلة للمناطق المحددة سابقا ولذلك تعتبر قابلة للتحاليل اللاحقة. تقرر عدم التجانس داخل الورم عن طريق المدينة وسيح، مع تركيز بوجه خاص على التوزيعات غير متجانسة من استنساخ HER2 الإيجابي في مجالات طبوغرافية متميزة من الأورام. ويصور الجدول 3 الخصائص البيولوجية للحالات التي تم تحليلها، مع التركيز على حالة ER والعلاقات العامة و Ki67 و HER2 داخل هيستوتيبيس مختلفة. على وجه الخصوص، تم العثور على 18 في المائة من الحالات عرض الخلايا إيجابية HER2 في > 10% خلايا السرطانية، وذلك مطابقة الصفات المميزة للتقييم الإيجابية HER2. من المثير للاهتمام، أن هذه القيمة أقرب إلى النهاية السفلي لسرطان الثدي تتراوح من إيجابية HER2 حالات الإصابة المبلغ عنها. من ناحية أخرى، تم وضع HER2 متغير في مجالات منفصلة من HER2-الإيجابية والسلبية HER2 سرطان الثدي (الشكل 3، الجدول 4)، توفير مصداقية إضافية للفكرة القائلة بأن سرطان الثدي مرض متغايرة جداً في مستوى الجينوم. وكان معدل فشل تحليل سايش 0.8 في المائة، مع عدد إجمالي للبقع 2,629/2,651 فيها ملزمة التحقيق معلم dinitrophenol إلى تسلسل الهدف.

Figure 1
الشكل 1 : مراحل التمثيل من حجر الزاوية في تحقيق منصة الفائق لتحليل التغاير HER2 في أفواج كبيرة من سرطانات الثدي. (أ) اختيار المجالات عينة ينبغي أن تشمل تحديد وتمييز في جميع المجالات مع الخلوية، والهندسة المعمارية، أو عدم التجانس في المدينة. (ب) إحدى الخطوات الأكثر أهمية لهذا الإجراء هو إنشاء كتلة يقبلون عالية الجودة، نظراً لأن يمكن الاستدلال حتى صدع مجهرية اتساق التحليلات التهجين اللاحقة في الموقع . (ج) من المهم أن تستخدم أرايير رقمياً المصحوبة بإبرة مم 1 بناء الجمعية التونسية للأمهات عالية الغلة استناداً إلى تقنية كونونن. (د) ينبغي أن تبدأ إنشاء مشروع الجمعية التونسية للأمهات من تعريف أبعاد وحدود الجمعية التونسية للأمهات. ينبغي إجراء التحاليل (ه) جميع المدينة والعش استخدام الأدوات الرقمية في علم الأمراض، للتنقل بسرعة عبر الجمعية التونسية للأمهات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تمثيل المتعلقة للجمعية التونسية للأمهات تتحقق لهذا البروتوكول- عدد إجمالي من البقع 180 من 1 مم، 500 ميكرومتر أربا، تسمح تهجين أمثل في الموقع . طرفية أكثر كثافة توفر نتائج غير المنتجة من حيث الجودة الشاملة والتوحيد من ردود الفعل عبر جميع النقاط، مع ارتفاع معدل فشل على أساس بقعة واحدة. ملاحظة البقع "التوجه" في أعلى والأوسط-يمين الشبكة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الممثل ميكروجرافس عرض الفضية في الموقع تحليل التهجين سرطان الثدي غير متجانسة HER2. في هذا المثال النموذجي، مركزين متميزة من سرطان الثدي الغازية عالية الجودة من لا نوع خاص (BR_121) أظهرت نتائج مختلفة من حيث HER2 التضخيم الجيني (أسود) مقارنة بتعداد سينتروميريك التحقيق 17 (أحمر). على وجه الخصوص، أحد المنتمين إلى صلب الورم ويظهر تلطيخ نمط كان سيتوكيراتين 7 غير النظامية HER2 تضخيم (A)، بينما بقعة واحدة من الجبهة الغازية (أي، حافة الورم) عرض منطقة البرية من نوع HER2 نمط (ب). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر (20 ميكرومتر في insets). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

معرف الحالة كتلة معرف معرف المنطقة الأنسجة طبوغرافيا مورفولوجيا ER العلاقات العامة Ki67 HER2 ميزات المدينة الأخرى
BR_121 A5 أ عادي هامش الجراحية
BR_121 A1 أ NST ورم الأساسية G2 CK7 +
BR_121 A1 ب NST ورم الأساسية G3 CK7 +/-
BR_121 A3 أ NST ورم الأساسية ستروما موسينوس 90 100 12 2 +
BR_121 A3 ب NST الجبهة الغازية أنبوبي 100 100 35 2 +
BR_121 A4 أ NST الجبهة الغازية G3
BR_121 A3 ج دسيس (إييك +) الجبهة المتاخمة للغازية عالي الجودة 100 100 45 2 +

الجدول 1: سجل الممثل لحالة واحدة شملت الدراسة. وكان هذه الحالة (BR_121) سرطان الغازية عالية الجودة من لا نوع خاص مع تركيز ستروما ميكسويد، عرض مكون أنبوبي طفيفة في محيط الآفة، وفقدان التنسيق شاذة من إيممونوكسبريسيون CK7. ميزات المناعي، بما في ذلك المؤشرات الحيوية الإبلاغ، يشير إلى التحليلات التي أجريت في وقت التشخيص. NST، سرطان الغازية من لا نوع خاص؛ دسيس، سرطان الأقنية في الموقع؛ ترشد +، مكون intraductal واسعة النطاق؛ CK7، سيتوكيراتين 7.

علامة استنساخ الشركة تمييع ديواكسينج استرجاع مستضد حضانة جسم سجل النظام
ER حزمة الخدمة SP1 نافذة RTU الإعدادية لوبيس في 72 درجة مئوية cc1 عند 95 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة 16 دقيقة اسك/كاب المبادئ التوجيهية23
العلاقات العامة 1E2 نافذة RTU الإعدادية لوبيس في 72 درجة مئوية cc1 عند 95 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة 17 دقيقة اسك/كاب المبادئ التوجيهية23
HER2 4B5 نافذة RTU الإعدادية لوبيس في 72 درجة مئوية cc1 عند 95 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة 18 دقيقة اسك/كاب المبادئ التوجيهية3
Ki67 30-9 نافذة RTU الإعدادية لوبيس في 72 درجة مئوية cc1 عند 95 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة 12 دقيقة Ki67 الدولي في "سرطان الثدي" وتعمل مجموعة التوصيات25

الجدول 2: قائمة بالأجسام المضادة واستنساخ وتخفيف، أساليب استرجاع مستضد ونظم التسجيل المعتمدة لتحليلات المناعي. ER، مستقبلات الإستروجين؛ العلاقات العامة، مستقبلات البروجسترون؛ RTU، جاهزة للاستخدام.

هيستوتيبي n (%) + ER (%) العلاقات العامة + (%) Ki67-منخفض (%) أن كي-67-عالية (%) HER2 + (%)
سرطان الغازية من لا نوع خاص 344 (77.5) 301 (87.5) 257 (74.7) 85 (24.7) 259 (75.3) 71 (20.6)
سرطان مفصص الغازية 53 (11.9) 53 (100.0) 44 (83.0) 36 (67.9) 17 (32.0) 4 (7.5)
سرطان الغازية، مختلطة من نوع 9 (2.0) 8 (88.9) 6 (66.7) 0 (0.0) 9 (100.0) 1 (11.1)
سرطان أنبوبي 8 (1.8) 8 (100.0) 8 (100.0) 8 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
سرطان موسينوس 11 (2.4) 11 (100.0) 9 (81.8) 7 (63.6) 4 (36.4) 0 (0.0)
سرطان ميكروبابولاري 7 (1.6) 7 (100.0) 7 (100.0) 5 (71.4) 2 (28.6) 2 (28.6)
سرطان الغازية مع فيتويريس المفترزه 5 (1.1) 3 (60.0) 1 (20.0) 1 (20.0) 4 (80.0) 3 (60.0)
سرطان حليمي 1 (0.2) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0)
سرطان النخاع 4 (0.9) 0 (0.0) 1 (25.0) 0 (0.0) 4 (100.0) 0 (0.0)
أعراض سرطان 2 (0.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0)
المجموع 444 391 (88.0) 333 (75.0) 142 (32.0) 302 (68.0) 81 (18.2)

الجدول 3: سرطان الثدي سرطان هيستوتيبيس وحالة مستقبلات HER2 حالة عدم التجانس. ER، مستقبلات الإستروجين؛ العلاقات العامة، مستقبلات البروجسترون؛ Ki67-منخفض، Ki67 الفهرس < 18%؛ Ki67-عالية، Ki67 > 18%.

البقع الورمية التفسير نقاط إيجابية HER2 (%) حالة مستقبلات هرمون الحالات غير متجانسة HER2
6 5 (83) إيجابية 10
6 5 (83) السلبية 1
6 4 (67) إيجابية 7
6 4 (67) السلبية 1
6 2 (33) السلبية 1
6 1 (17) إيجابية 1
5 3 (60) إيجابية 10
5 1 (20) إيجابية 2
4 3 (75) إيجابية 9
4 2 (50) إيجابية 8
4 1 (25) السلبية 1
3 2 (67) إيجابية 5
3 1 (33) إيجابية 2
46 25 (54) 53 (93) 57

الجدول 4: HER2 التعبير وحالة مستقبلات هرمون والحالات غير متجانسة HER2. كان 4 حالات (7%) من بين 57 حالة HER2 متغايرة، ER-سالب وسالب للعلاقات العامة، تأكيدا لأهمية سريرية لتقييم التغايرية HER2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا، نحن تفصيلية استراتيجيات مختبر لإجراء تحليلات سايش الجين HER2 والسنترومير المقابلة لها في طرفية عالية الغلة من سرطان الثدي بين المجهزة. هذا الأسلوب هو فعالة من حيث التكلفة، ويمكن أن تنفذ في معظم المختبرات لدراسة التغاير التضخيم الجين HER2 في أفواج كبيرة من الثدي السرطان استرداد النموذج الباثولوجيا المحفوظات.

نظراً لأهمية سريرية من HER2 الاختبار في سرطان الثدي والتحديات الناتجة عن التعبير غير المتجانسة، قمنا بتطوير بروتوكول اختبار الفائق لتقييم داخلها-وبينها-تأمر التغاير الوراثي HER2 . وتشمل مجالات تحليل المكونات الغازية مسبقاً والغازية، على أساس محدد الخلوية، والهندسة المعمارية، وملامح المدينة.

وهناك العديد من المراحل الحاسمة التي ينبغي أن تدار بعناية في هذا البروتوكول. خطوة أساسية واحدة هي تحديد المناطق ذات الأهمية. لقد حددنا أن شروح المناطق الطبوغرافية المختلفة من خلال نهج متعدد التخصصات أمر حيوي لضمان جودة التحليل الجزيئي النهائي. على وجه الخصوص، مراجعة مشتركة للشرائح التشخيصية التي يؤديها أخصائي وفني زيادة هائلة عدد البقع المناسبة (أي، البقع التي تعكس في مجال التعرف على الشريحة) وبعد ذلك خفض معدل الفشل تحليل البقع واحد. ومع ذلك، العديد من المواقع الورم يمكن أن تضيع بعد مقاطع المسلسل لتحليلات متعددة للمدينة والعش. للتغلب على هذا الإزعاج، نوصي بتشييد طرفية في تكرار أو ثلاث نسخ، إذا كان ممكناً على الإطلاق استناداً إلى توافر الأنسجة. وعلاوة على ذلك، نسلط الضوء على أهمية تحديد الإجراءات المختبرية صارمة لإنشاء كتل FFPE يقبلون لطرفيه. وفي الواقع، أننا لاحظنا أن صدع الحد أدنى في كتلة الجمعية التونسية للأمهات يمكن أن يستنتج التحليل العش كامل من حيث الجودة وإمكانية تكرار نتائج، والوضوح من رد فعل. إذا تحدث الشقوق، وينبغي إغفال كتلة المانحين لبناء الجمعية التونسية للأمهات. ينبغي الاعتراف، مع ذلك، أن المدينة يمكن أن تتم حتى في طرفية دون المستوى الأمثل، ولم تلاحظ أي دليل على وجود مشاكل فنية خلال هذا التحليل في تجربتنا.

على الرغم من أن هذا البروتوكول هو على وجه التحديد الأمثل لتحليلات سايش HER2 للثدي الغلة طرفية، فإنها علما أن التحاليل الأخرى، مثل الأسماك والمدينة، يمكن إجراء موثوق بها في عدة أنواع من الأنسجة، كما هو موضح سابقا14، ،من 1926. ومع ذلك، حددنا هنا العدد المثالي للبقع والخصائص الطبوغرافية للجمعية التونسية للأمهات لضمان تحليلات سيش عالية الجودة واستنساخه للجين HER2 في عينات سرطان الثدي. ويمثل نقطة هامة أخرى بإعادة تشكيل البروتوكولات القياسية سيش الخاص لتتناسب مع خصوصية نماذج متعددة يتم تحليلها. وفي الواقع، المبادئ التوجيهية للشركات المصنعة مصنوعة عموما للتحليلات الجزيئية لأقسام قلق التقليدية، وبالتالي لا قادرة على الوصول إلى مستويات عالية في عينات الأنسجة بين المجهزة، كما هو الحال في طرفية من المحفوظات FFPE كتل. وتحقيقا لهذه الغاية، قدمنا وصف خطوة بخطوة لبروتوكول مخصصة موثوقة لتحليلات سايش في هذه العينات إشكالية.

أنه سيكون من المفيد للغاية لاستكشاف تباين التعبير HER2 والتضخيم الجيني فيما يتعلق بالتوزيع غير متجانسة أخرى المؤشرات الحيوية الجزيئية عملي سريرياً في سرطان الثدي. وتحقيقا لهذه الغاية، كذلك يلزم الدراسات البحثية متعدية لاستكشاف صلاحية أسلوبنا لغيرها من التحليلات الجزيئية ذات الصلة سريرياً، مثل الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين الكتلي التصوير (استخدام-MSI)27. في الآونة الأخيرة، إدارة الأنسجة FFPE لتحليل استخدام MSI أصبح ممكناً، أن كانت صعبة. يسمح هذا الأسلوب البروتين في الموقع لتصور التوزيع المكاني للبروتينات والببتيدات في أقسام الأنسجة المرضية، بما في ذلك سرطان الثدي.

هذا البروتوكول له العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن يحتمل أن تتدخل التحليل النهائي. ينبغي إيلاء اهتمام أولاً، خاصة تجاه مختلف الآليات الكامنة وراء التضخيم HER2 . على سبيل المثال، هو كروموسوم 17 بوليسومي انحراف وراثية التي قد تحدث في الثدي السرطان11، تمثل إليه بديلة معروفة لزيادة عدد نسخ HER2 . قد يؤثر هذا الشرط، أن كانت غير متكررة، السمات البيولوجية السرطان وإدارة المرضى بل أيضا تحليلات العش. وثانيا، فقد وصف أن التغاير الوراثي داخل ورم يحدث أيضا على مستوى الخلايا المفردة، وليس فقط في مختلف المجالات الورمية. هذا البروتوكول غير قادرة على زيادة قوة الكشف عن هذا الشرط على وجه الخصوص بالمقارنة مع أقسام قلق. وعلاوة على ذلك، من المهم تسليط الضوء على أن الدراسة القائمة على الجمعية التونسية للأمهات من عدم التجانس المكاني له بعض القيود الجوهرية، بما في ذلك عدم إجراء تحليل شامل للقسم كله. هذه الدراسة، ومع ذلك، ينبغي النظر في إثبات لمبدأ أن عدم تجانس التضخيم الجين HER2 يمكن تقييمها عن طريق منصة عالية الإنتاجية والفعالية من حيث التكلفة، واستخدام معدات المختبرات القياسية. سوف يلزم إجراء مزيد من الدراسات تحليل المقاطع قلق المسلسل من الحالات غير متجانسة HER2، إلى جانب الدراسات الجزيئية المتطورة، والبيانات السريرية المرضى للتحقق من صحة هذا البروتوكول.

وفي الختام، رسم خرائط شاملة لمركز HER2 في عينات سرطان الثدي HER2 غير متجانسة والتحقيق المحتملة سائق الطفرات الوراثية في مكونات HER2 السلبية ينبغي أن تعتمد على تحليل عدة مناطق الورم. وسيتطلب هذا التحليل تكاليف لا تطاق وجهود استخدام مرافق التشخيص القياسية. ويمثل هذا الأسلوب أداة موثوقة لتوصيف HER2 التغاير الوراثي في مجموعات كبيرة متعددة وسرطان الثدي بين المعالجة المتزامنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا تعارض المصالح.

Acknowledgments

لا شيء.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136, (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232, (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31, (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12, (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133, (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54, (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64, (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25, (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136, (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25, (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27, (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15, (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10, (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68, (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16, (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26, (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68, (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29, (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70, (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28, (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22, (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103, (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14, (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11, (6), 1507-1514 (2015).
بناء منصة فرز الفائق لتقييم عدم تجانس التضخيم الجين HER2 في سرطان الثدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter